Multipleksowana analiza ekspresji genów siatkówki i dostępności chromatyny przy użyciu scRNA-Seq i scATAC-Seq

Protokół ten umożliwi wykorzystanie sekwencyjnego RNA pojedynczej komórki do początkowego fenotypowania. A w połączeniu z pojedynczym komórkowym sekwencją ATAC, rekonstrukcja sieci regulacyjnych genów. Zastosowanie MULTI-seq pozwala utrzymać koszty wstępnych badań na niskim poziomie, a mocowanie sparowanych próbek dla jednokomórkowego sekwencjonowania RNA i jednokomórkowego sekwencjonowania ATAC pozwala na analizę przebiegu czasowego sieci regulatorowych genów.

Badacze mogą wykorzystać ten protokół, aby zrozumieć sieci genetyczne kontrolujące rozwój i postęp choroby. Na początek dodaj 20 mikrolitrów roztworu zakotwiczonego kodu kreskowego do każdej próbki i odpipetuj ją w celu wymieszania. Inkubuj go na lodzie przez pięć minut.

Następnie dodaj 20 mikrolitrów roztworu współkotwiczącego do każdej próbki i inkubuj na lodzie przez kolejne pięć minut. Dodać jeden mililitr lodowatego 1% BSA i PBS do każdej próbki i odwirować komórki przy 300 x g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usunąć supernatant bez naruszania osadu komórkowego.

Następnie dodaj 400 mikrolitrów lodowatego 1% BSA i PBS. Wirować przy 300 x g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Określić stężenie komórek dla każdej próbki za pomocą hemocytometru i obliczyć całkowitą liczbę komórek i objętość wymaganą dla żelu w emulsji lub GEM.

Połącz obliczone objętości z każdej próbki w nowej sterylnej probówce o pojemności 1,5 mililitra i określ końcowe stężenie komórek połączonych próbek. Po wygenerowaniu GEM i zakodowaniu kreskowym wykonaj oczyszczanie cDNA ekspresji genów za pomocą wyboru rozmiaru, uważając, aby nie odrzucić supernatantu z pierwszej rundy selekcji, która zawiera kod kreskowy próbki. Przenieść supernatant do nowej sterylnej probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 mililitra i przechowywać ją na lodzie.

Odczynnik do wyboru wielkości na bazie kulek paramagnetycznych należy odwirować i dodać do supernatantu 260 mikrolitrów odczynnika i 180 mikrolitrów 100% izopropanolu. Odpipetować mieszaninę 10 razy i inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym i poczekaj, aż roztwór się usunie.

Gdy roztwór będzie klarowny, usunąć i wyrzucić supernatant. Dodaj 500 mikrolitrów 80% etanolu do kulek przez 30 sekund, a następnie wyrzuć supernatant. Powtórz to w sumie przez dwa prania.

Krótko odwiruj kulki i włóż je z powrotem do stojaka magnetycznego. Ustaw minutnik na dwie minuty. Następnie usuń pozostały etanol za pomocą pipety P10 i wysusz kulki na powietrzu na stojaku magnetycznym przez pozostałe dwie minuty.

Wyjmij kulki ze stojaka magnetycznego i ponownie zawieś je w 100 mikrolitrach buforu elucyjnego. Dokładnie odpipetować do ponownego zawieszenia i inkubować w temperaturze pokojowej przez dwie minuty, a następnie umieścić kulki z powrotem na stojaku magnetycznym i poczekać, aż roztwór się klaruje. Przenieść supernatant do świeżej 1,5 mililitrowej probówki do mikrowirówki.

Powtórzyć czyszczenie, jak pokazano, używając połowy objętości buforu elucyjnego. W przypadku próbek przeznaczonych do sekwencji scATAC należy usunąć płyn z probówki mikrowirówki za pomocą pipety P200 i błyskawicznie zamrozić próbki w suchym lodzie etanolowym. Aby zdysocjować komórki w próbkach przeznaczonych do sekwencjonowania scRNA, należy wykonać etapy dysocjacji za pomocą papainy, zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym.

Odwirować komórki o stężeniu 300 x g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant bez naruszania osadu komórkowego. Dodaj jeden mililitr schłodzonego PBS i mieszaj 10 razy lub do momentu, gdy komórki zostaną całkowicie zawieszone. Ponownie odwirować przy 300 x g przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza i powtórzyć płukanie PBS dwukrotnie.

Rozpocznij wirowanie rurki przy najniższym ustawieniu prędkości i dodawaj 900 mikrolitrów schłodzonego metanolu, kropla po kropli, kontynuując delikatne wirowanie probówki, aby zapobiec zbrylaniu się komórek. Inkubuj komórki na lodzie przez 15 minut. Określić stężenie utrwalonych komórek za pomocą hemocytometru i ocenić skuteczność etapu fiksacji za pomocą błękitu trypanowego.

Przechowuj zamrożoną tkankę i utrwalone komórki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Kodowanie kreskowe MULTI sequence umożliwia połączone sekwencjonowanie wielu próbek i ich późniejszą dekonwolucję obliczeniową. Próbkę pochodzenia można określić dla każdej komórki na podstawie wyrażenia kodu kreskowego.

Te połączone próbki mogą być analizowane jako pojedynczy zestaw danych w celu grupowania komórek i identyfikacji typów komórek. Ponieważ każda komórka jest oznaczona kodem kreskowym przed wygenerowaniem GEM, dublety komórek będą miały wysokie prawdopodobieństwo wykazania ekspresji dla wielu kodów kreskowych sekwencji MULTI, a zatem większość dubletów można zidentyfikować i usunąć przed grupowaniem i identyfikacją typu komórki. Sekwencjonowanie ATAC pojedynczej komórki może być użyte do wygenerowania zestawu danych z typami komórek pasującymi do tych znalezionych przez sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki.

Połączenie ekspresji genów sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki i informacji o dostępności DNA sekwencjonowania ATAC pojedynczej komórki umożliwia rekonstrukcję sieci regulacyjnych genów. Próbując zastosować protokół, należy pamiętać, że dwuminutowy czas parowania etnolu ma kluczowe znaczenie dla odzyskania sekwencji w kolejnych etapach elucji. Rekonstrukcja sieci regulacyjnych genów przy użyciu sparowanego sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki i sekwencjonowania ATAC-seq pojedynczej komórki tworzy cele do badań nad nadekspresją i nokautem genów.

Na tym etapie można zastosować MULTI-seq w celu identyfikacji efektów specyficznych dla typu komórki.