Multipleksowana analiza ekspresji genów siatkówki i dostępności chromatyny przy użyciu scRNA-Seq i scATAC-Seq
March 12th, 2021
Tutaj autorzy prezentują użyteczność MULTI-seq do fenotypowania i kolejnych sparowanych scRNA-seq i scATAC-seq w charakterystyce transkryptomicznej i dostępności chromatyny w siatkówce.
Protokół ten umożliwi wykorzystanie sekwencyjnego RNA pojedynczej komórki do początkowego fenotypowania. A w połączeniu z pojedynczym komórkowym sekwencją ATAC, rekonstrukcja sieci regulacyjnych genów. Zastosowanie MULTI-seq pozwala utrzymać koszty wstępnych badań na niskim poziomie, a mocowanie sparowanych próbek dla jednokomórkowego sekwencjonowania RNA i jednokomórkowego sekwencjonowania ATAC pozwala na analizę przebiegu czasowego sieci regulatorowych genów.
Badacze mogą wykorzystać ten protokół, aby zrozumieć sieci genetyczne kontrolujące rozwój i postęp choroby. Na początek dodaj 20 mikrolitrów roztworu zakotwiczonego kodu kreskowego do każdej próbki i odpipetuj ją w celu wymieszania. Inkubuj go na lodzie przez pięć minut.
Następnie dodaj 20 mikrolitrów roztworu współkotwiczącego do każdej próbki i inkubuj na lodzie przez kolejne pięć minut. Dodać jeden mililitr lodowatego 1% BSA i PBS do każdej próbki i odwirować komórki przy 300 x g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usunąć supernatant bez naruszania osadu komórkowego.
Następnie dodaj 400 mikrolitrów lodowatego 1% BSA i PBS. Wirować przy 300 x g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Określić stężenie komórek dla każdej próbki za pomocą hemocytometru i obliczyć całkowitą liczbę komórek i objętość wymaganą dla żelu w emulsji lub GEM.
Połącz obliczone objętości z każdej próbki w nowej sterylnej probówce o pojemności 1,5 mililitra i określ końcowe stężenie komórek połączonych próbek. Po wygenerowaniu GEM i zakodowaniu kreskowym wykonaj oczyszczanie cDNA ekspresji genów za pomocą wyboru rozmiaru, uważając, aby nie odrzucić supernatantu z pierwszej rundy selekcji, która zawiera kod kreskowy próbki. Przenieść supernatant do nowej sterylnej probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 mililitra i przechowywać ją na lodzie.
Odczynnik do wyboru wielkości na bazie kulek paramagnetycznych należy odwirować i dodać do supernatantu 260 mikrolitrów odczynnika i 180 mikrolitrów 100% izopropanolu. Odpipetować mieszaninę 10 razy i inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym i poczekaj, aż roztwór się usunie.
Gdy roztwór będzie klarowny, usunąć i wyrzucić supernatant. Dodaj 500 mikrolitrów 80% etanolu do kulek przez 30 sekund, a następnie wyrzuć supernatant. Powtórz to w sumie przez dwa prania.
Krótko odwiruj kulki i włóż je z powrotem do stojaka magnetycznego. Ustaw minutnik na dwie minuty. Następnie usuń pozostały etanol za pomocą pipety P10 i wysusz kulki na powietrzu na stojaku magnetycznym przez pozostałe dwie minuty.
Wyjmij kulki ze stojaka magnetycznego i ponownie zawieś je w 100 mikrolitrach buforu elucyjnego. Dokładnie odpipetować do ponownego zawieszenia i inkubować w temperaturze pokojowej przez dwie minuty, a następnie umieścić kulki z powrotem na stojaku magnetycznym i poczekać, aż roztwór się klaruje. Przenieść supernatant do świeżej 1,5 mililitrowej probówki do mikrowirówki.
Powtórzyć czyszczenie, jak pokazano, używając połowy objętości buforu elucyjnego. W przypadku próbek przeznaczonych do sekwencji scATAC należy usunąć płyn z probówki mikrowirówki za pomocą pipety P200 i błyskawicznie zamrozić próbki w suchym lodzie etanolowym. Aby zdysocjować komórki w próbkach przeznaczonych do sekwencjonowania scRNA, należy wykonać etapy dysocjacji za pomocą papainy, zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym.
Odwirować komórki o stężeniu 300 x g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant bez naruszania osadu komórkowego. Dodaj jeden mililitr schłodzonego PBS i mieszaj 10 razy lub do momentu, gdy komórki zostaną całkowicie zawieszone. Ponownie odwirować przy 300 x g przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza i powtórzyć płukanie PBS dwukrotnie.
Rozpocznij wirowanie rurki przy najniższym ustawieniu prędkości i dodawaj 900 mikrolitrów schłodzonego metanolu, kropla po kropli, kontynuując delikatne wirowanie probówki, aby zapobiec zbrylaniu się komórek. Inkubuj komórki na lodzie przez 15 minut. Określić stężenie utrwalonych komórek za pomocą hemocytometru i ocenić skuteczność etapu fiksacji za pomocą błękitu trypanowego.
Przechowuj zamrożoną tkankę i utrwalone komórki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Kodowanie kreskowe MULTI sequence umożliwia połączone sekwencjonowanie wielu próbek i ich późniejszą dekonwolucję obliczeniową. Próbkę pochodzenia można określić dla każdej komórki na podstawie wyrażenia kodu kreskowego.
Te połączone próbki mogą być analizowane jako pojedynczy zestaw danych w celu grupowania komórek i identyfikacji typów komórek. Ponieważ każda komórka jest oznaczona kodem kreskowym przed wygenerowaniem GEM, dublety komórek będą miały wysokie prawdopodobieństwo wykazania ekspresji dla wielu kodów kreskowych sekwencji MULTI, a zatem większość dubletów można zidentyfikować i usunąć przed grupowaniem i identyfikacją typu komórki. Sekwencjonowanie ATAC pojedynczej komórki może być użyte do wygenerowania zestawu danych z typami komórek pasującymi do tych znalezionych przez sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki.
Połączenie ekspresji genów sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki i informacji o dostępności DNA sekwencjonowania ATAC pojedynczej komórki umożliwia rekonstrukcję sieci regulacyjnych genów. Próbując zastosować protokół, należy pamiętać, że dwuminutowy czas parowania etnolu ma kluczowe znaczenie dla odzyskania sekwencji w kolejnych etapach elucji. Rekonstrukcja sieci regulacyjnych genów przy użyciu sparowanego sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki i sekwencjonowania ATAC-seq pojedynczej komórki tworzy cele do badań nad nadekspresją i nokautem genów.
Na tym etapie można zastosować MULTI-seq w celu identyfikacji efektów specyficznych dla typu komórki.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie pokazuje zastosowanie MULTI-seq do fenotypinowania, poprzedzającego pojedyncze sekwencjonowanie RNA (scRNA-seq) i pojedyncze sekwencjonowanie ATAC (scATAC-seq) w celu scharakteryzowania transkryptomu i dostępności chromatyny w komórkach siatkówki. Metoda pozwala na opłacalne wstępne badania w połączeniu z możliwością analizy sieci regulatorowych genów w czasie.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Genomika
- Biologia komórki
Tło
- Sekwencja RNA z pojedynczej komórki wykorzystywana jest do wstępnego fenotypinowania.
- Parowanie z pojedynczym sekwencjonowaniem ATAC umożliwia odtworzenie sieci regulatorowych genów.
- MULTI-seq obniża koszty wstępnych badań.
- Zezwala na analizę przebiegu czasowego sieci regulatorowych genów.
Cel badania
- Zrozumienie sieci genetycznych kontrolujących rozwój.
- Badanie progresji choroby poprzez wgląd na poziomie komórkowym.
- Wykorzystanie opłacalnych metodologii do sekwencjonowania wysokoprzekątowego.
Stosowane metody
- Wykorzystano platformy scRNA-seq i scATAC-seq.
- Skupiono się na reakcjach komórek siatkówki.
- Zastosowano kluczowe kroki, w tym inkubację, wirowanie i kodowanie wielokrotnego sekwencjonowania.
- Szczegółowe procesy przygotowania próbek, fiksacji i kroków sekwencjonowania.
Główne wyniki
- Wykazano skuteczne parowanie scRNA-seq i scATAC-seq do kompleksowego profilowania.
- Zidentyfikowano zmiany w ekspresji genów i dostępności chromatyny w próbkach siatkówki.
- Dostarczono wglądu w dynamikę sieci regulatorowych genów podczas rozwoju i choroby.
Wnioski
- To badanie poprawia zrozumienie sieci regulatorowych genów w komórkach siatkówki.
- Bezpośrednio przyczynia się do wyjaśnienia mechanizmów związanych z rozwojem i chorobami.
- Podkreśla praktyczne implikacje użycia MULTI-seq do analizy pojedynczych komórek o wysokiej wydajności.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Understanding retinal gene regulatory networks is critical for identifying therapeutic targets in ocular diseases. The integration of scRNA-seq and scATAC-seq enables mechanistic de-risking by linking chromatin accessibility to transcriptional output. This approach supports target validation and predictive confidence in preclinical discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through paired gene expression and chromatin accessibility profiling.
- Operational Value: Supports biological de-risking by clarifying regulatory mechanisms in retinal cell types.
- Predictive Value: Identifies targets for overexpression and knockout studies to validate functional relevance.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates matched molecular readouts for compound screening in disease-relevant retinal models.
- Operational Value: MULTI-seq barcoding increases experimental throughput and reduces cost per sample.
- Scalability: Enables time-course analysis of gene regulatory networks across developmental or disease stages.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant system insights by profiling retinal cells across conditions.
- Operational Value: Fixation and barcoding steps allow sample preservation and multi-sample coordination.
- Translational Continuity: Supports biomarker alignment by linking chromatin states to cell-type-specific expression.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to lead identification, enabling hypothesis testing and pathway clarification before compound screening.
- Discovery Biology: Supports reconstruction of gene regulatory networks to clarify mechanism of action.
- Screening: Prepares standardized, barcoded retinal cell systems for reliable compound evaluation.
- Analytics: Delivers quantitative measurements of gene expression and chromatin accessibility for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical validation through matched multi-omic profiles.
- Enterprise Reuse: MULTI-seq enables cost-effective sample multiplexing across projects and time points.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through mechanistic linkage of epigenomic and transcriptomic states.
- Operational Value: Standardization via fixation, barcoding, and cleanup protocols ensures reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by reducing ambiguity in target biology.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of retinal targets based on regulatory network activity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-cell genomics and retinal tissue dissociation.
- Depends on access to scRNA-seq and scATAC-seq platforms and magnetic bead-based size selection.
- Necessitates cross-team standardization for barcode design and sample handling.
- Involves adaptation considerations for fixation efficiency across retinal cell types.
- Limited by doublet formation risk if barcode separation is insufficient during elution.
