Genetyczne kody kreskowe z białkami fluorescencyjnymi do zastosowań multipleksowych

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest fluorescencyjne kodowanie kreskowe komórek ssaków w celu ulepszenia multipleksowanych testów biologicznych o wysokiej przepustowości, które opierają się na odrębnych odczytach fluorescencyjnych. W tym celu cząstki retrowirusowe są wykorzystywane do stabilnej ekspresji białek fluorescencyjnych w komórkach ssaków, a tym samym do ich kodowania kreskowego. Następnie przeprowadza się sortowanie komórek aktywowanych fluorescencyjnie w celu uzyskania klonalnych populacji z kodami kreskowymi.

Populacje klonów są następnie amplifikowane, łączone i analizowane za pomocą cytometrii przepływowej w celu potwierdzenia, że można je od siebie odróżnić, a zatem stosować jednocześnie. Na koniec linie komórkowe z kodami kreskowymi są transdukowane za pomocą znakowanego testu. Białka i aktywność biologiczną są monitorowane za pomocą kanałów fluorescencyjnych odrębnych od kanałów z kodami kreskowymi.

Wyniki wskazują na przydatność fluorescencyjnego powlekania komórek ssaków w zastosowaniach multipleksowych w środowisku o wysokiej przepustowości. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, które wymagają starannej kalibracji przeciwciała lub barwnika, jest to, że po ustaleniu genetycznie oznaczonych linii komórkowych nie wymagają one dalszej manipulacji, a ponieważ białko będące przedmiotem zainteresowania ulega ekspresji przez długi czas, są one dalej wykorzystywane do adaptacji biologicznych. Sprzężenie fluorescencyjnych, genetycznie kodowanych linii komórkowych z testami powierzchniowymi pozwala nam na niezależne badanie funkcji biologicznych lub efektów w formacie hydroprzepustowości.

W naszym przykładzie używamy fluorescencyjnej genetycznej powłoki prętowej do monitorowania rozszczepienia różnych substratów wirusowych. Test może być dalej wykorzystywany do badania mechanizmów zaangażowanych w rozszczepianie i do odkrywania leków o wysokiej przepustowości. Dzień przed transfekcją wysiewaj 10-centymetrową płytkę z 2,5 razy 10 do szóstych komórek Phoenix GP w DMEM z 10% FBS.

Ta pakowająca linia komórkowa stabilnie wyraża białka gag i biegun do tworzenia cząstek retrowirusowych w transie. W dniu transfekcji użyj mikroskopu jasnego pola, aby zbadać komórki. Komórki muszą być zdrowe i przylegać do płytki w jednej warstwie, aby można je było wykorzystać do transfekcji.

Następnie przygotuj mieszaninę transfekcji DNA do 125 mikrolitrów surowicy wolnej. DMEM. Dodać trzy mikrogramy wektora otoczki otoczki wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej, P-C-I-V-S-V-G i trzy mikrogramy wektora transferowego przenoszącego interesujący nas gen białka fluorescencyjnego, dodać 15 mikrolitrów odczynnika do transfekcji polieteroaminy i wymieszać, aby uzyskać cząstki wirusa niosące różne fluorescencyjne markery białkowe. Każdą transfekcję należy wykonać niezależnie za pomocą wybranego markera, aby to zrobić.

Inkubować każdą mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 15 minut po transfekcji inkubacji, dodając mieszaninę do komórek. Kroplami, a następnie inkubować płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Opcjonalnie po 24 godzinach zastąp pożywkę siedmioma mililitrami świeżej pożywki.

Chociaż może to poprawić zdrowie komórek, może zmniejszyć miano wirusa w supernatancie. 48 godzin po transfekcji użyj pipetera, aby przenieść supernatant, który zawiera cząsteczki wirusa, do 10-mililitrowej strzykawki. Wyposażony w 0,20 mikromolowy filtr politetrafluoroetylenowy do naciskania tłoka w celu dozowania filtratu do dwóch mililitrowych mikroprobówek wirówkowych.

Odłóż na bok podwielokrotność dwóch mililitrów do natychmiastowego użycia. Umieść pozostały wirus i podwielokrotności na lodzie i przenieś je do ujemnych 80 stopni Celsjusza, aż zostaną zużyte 24 godziny przed transdukcją w każdym dołku nasion sześciodołkowych płytek 2,0 do 3,0 razy 10 do piątych przylegających komórek, tutaj 2, 9, 3 limfocyty T są używane następnego dnia. Aby przetransdukować przylegające komórki, usuń istniejące podłoże z płytki.

Dodaj pięć mikrogramów na mililitr poli mózgu do dwóch mililitrów wcześniej zebranego wirusowego sinusa i ostrożnie dodaj mieszaninę do komórek. Uszczelnij płytki perfumami. Następnie umieść talerze w wiszącym wiadrze.

Wirować wirować w temperaturze 1500 razy G przez 120 minut w temperaturze 32 stopni Celsjusza. Po wirowaniu inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po 24 godzinach wymień podłoże ogniw na co najmniej 72 godziny.

Po transdukcji. Przygotuj się do analizy transdukowanych komórek za pomocą cytometrii przepływowej w celu ilościowego określenia procentowej szybkości transdukcji. Po pierwsze, używając porównywalnej linii komórkowej transdukowanej nont jako kontroli negatywnej, upewnij się, że bramki są prawidłowo ustawione we właściwych kanałach.

Ustaw parametr napięcie kanału tak, aby populacja ujemna była poniżej wartości od 10 do trzeciej na każdej interesującej nas osi fluorescencyjnej. Następnie ustaw bramki dla dodatniej fluorescencji jako zdarzenia, które pojawiają się poza kontrolą negatywną. Następnie, korzystając z transdukowanych komórek, określ procent dodatni dla określonego kanału fluorescencyjnego.

Posortuj komórki do 15-mililitrowych stożkowych probówek zawierających jeden mililitr 100% FBS. Następnie odkręć posortowane populacje w wiszącym wiadrze. Wirować wirować w temperaturze 524 razy G w temperaturze 32 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Po wirowaniu ponownie zawieś komórki w jednym mililitrze świeżej pożywki, a następnie wysiewaj dwa razy 10 do sześciu komórek w dwóch mililitrach DMEM na sześciocentymetrowej płytce. Przy tym stężeniu zbieg wynosi poniżej 60% i pozwoli na wzrost i podział przez co najmniej dwa dni. Umieść komórki w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na kilka dni, aby dać czas na amplifikację.

Populacje klonalne mogą być generowane zarówno z pierwotnie transdukowanych, jak i posortowanych komórek. Sortowanie ścisłych populacji na podstawie wybranej fluorescencji, a nie pojedynczych klonów na tym etapie, zapewnia populację zapasową dla przyszłej selekcji. W razie potrzeby ustaw bramki do sortowania według interesujących populacji, upewnij się, że bramki są oddalone od siebie o co najmniej jedną skalę logarytmiczną Aby uzyskać rozróżnialne populacje za pomocą automatycznej jednostki osadzania komórek, sortuj pojedyncze komórki na płytki 96-dołkowe, zwróć uwagę, że na dołek będzie średnio jedna komórka.

Niektóre studnie mogą nie mieć żadnych komórek, a inne mogą mieć więcej niż jedno obserwowanie. Sortowanie, inkubacja komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej dwa tygodnie W celu amplifikacji poszczególnych klonów. Regularnie badaj komórki pod mikroskopem, aby upewnić się, że rosnące populacje powstają z pojedynczych komórek, a nie z więcej niż jednej.

Upewnij się również, że komórki nie zarosną po upływie dwóch tygodni. Przeprowadź badania przesiewowe przypuszczalnych populacji klonów za pomocą cytometrii przepływowej i porównaj je z populacją kontroli ujemnej. Prawdziwe populacje klonów powinny mieć bardzo ścisłe wzorce fluorescencji.

Wybierz najbardziej wyraźnie oddzielone populacje na podstawie średniej intensywności i ciasnoty populacji. Wzmocnij je w razie potrzeby lub przechowuj zapasy w podłożu zamrażającym z 10% DMSO w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez krótki czas lub ciekłym azotem przez dłuższy czas. Następnie, aby sprawdzić, czy populacje klonalne mogą być z powodzeniem wykorzystywane w multipleksowym systemie badań przesiewowych o wysokiej przepustowości.

Wybierz zestaw klonów z rozróżnialnymi widmami absorpcji, emisji i/lub różnymi intensywnościami i połącz je w jednym ziarnie probówki. 50 000 połączonych komórek w 200 mikrolitrach uzupełnionego DMEM w każdym dołku 96-dołkowej płytki w oddzielnych probówkach. Przygotuj ujemne i pojedyncze kontrole barwy do użycia przy ustawianiu parametrów i wartości kompensacji na cytometrze przepływowym.

Ustaw wartości wynagrodzenia. Następnie przeanalizuj próbkę, aby upewnić się, że można rozróżnić każdą z niezależnych ustalonych fluorescencyjnych linii komórkowych. Aby dostosować linie komórkowe z kodami kreskowymi do aplikacji biologicznej, najpierw wybierz elementy testu, które zostały zaprojektowane w taki sposób, że są sprzężone ze znacznikiem lub białkiem fluorescencyjnym jako fuzja lub przez wewnętrzne miejsce wejścia rybosomu.

Ires, który umożliwia łatwe wykrycie za pomocą cytometrii przepływowej Western blotting lub mikroskopii. Zastosowany tutaj system składa się z testu biologicznego, w którym białko otoczki HIV ulega ekspresji na powierzchni komórki, odsłaniając jego znaczniki HA i flagowe. Białko testowe ulega ekspresji w komórce z kodem kreskowym, która wyraża pomidora TD.

Rozszczepienie białka można monitorować poprzez barwienie przeciwciałem Anti-Flag znakowanym FSE. Kiedy białko nie jest rozszczepione, widoczne jest barwienie, ale gdy białko jest rozszczepione, zielone znakowanie fluorescencyjne nie jest już widoczne. Aby ustalić test biologiczny w komórkach z kodem kreskowym, należy je transdukować cząstkami wirusa, które zawierają wybrane elementy testu.

Dodaj wirusową natynę SUP do wybranych komórek i odwiruj przez odwirowanie. Następnie inkubuj komórki z fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami anty HA. Następnie posortuj komórki z kodami kreskowymi, aby wyizolować te, które zawierają elementy testu, które są dodatnie dla ha.

Na koniec połączono odrębne linie komórkowe z kodami kreskowymi. Każdy z nich zawiera test z innym substratem. Inkubować mieszaninę komórek z przeciwciałem sprzężonym Anti-Flag i ZI i analizować je za pomocą cytometrii przepływowej, aby określić, czy nastąpiło rozszczepienie białka, aby prześledzić test, przeanalizować lub zdekodować populacje w odpowiednim kanale, w którym można tutaj odróżnić odrębne genetycznie kodowane linie komórkowe.

Kanał PE dla pomidora TD następnie dekoduje naturę substratu, analizując go w kanale fite, aby ujawnić populację dodatnią do testu na rozszczepienie białek o ekspresji powierzchniowej w szlaku wydzielniczym. Sub T one komórki do fluorescencyjnego kodu kreskowego w celu ekspresji pomidora TD i posortowane na trzy populacje o różnej intensywności. Każda z populacji została następnie transdukowana innym retrowirusem w celu wywołania ekspresji białka otoczki HIV typu dzikiego, zmutowanego białka otoczki HIV lub wirusa dengi.

Białko graniczne PRM, z których każde jest otoczone flagą i znacznikami HA. Transdukowane komórki inkubowano z przeciwciałami anty HA i Anti-Flag. Przeprowadzono barwienie anty HA, aby potwierdzić obecność zmodyfikowanego białka testowego, podczas gdy barwienie Anti-Flag przeprowadzono w celu ustalenia, czy zostało ono rozszczepione.

Gdy niebarwione połączone populacje analizowano za pomocą cytometrii przepływowej, populacje klonalne były rozróżnialne na podstawie kodu kreskowego pomidora TD, ale nierozróżnialne w kanale fite. W przeciwieństwie do tego, gdy te same populacje zostały wybarwione przeciwciałem flage, jedna populacja była dodatnia dla flagg. Na podstawie kodów kreskowych populację tę można łatwo zidentyfikować jako populację posiadającą zmutowany substrat otoczki wirusa HIV.

Teraz powinieneś mieć bardzo dobre zrozumienie, jak wykorzystać technologię zaworów retro wraz z cytometrią przepływową. W celu ustanowienia fluorescencyjnych genetycznie kodowanych linii komórkowych, czterech zastosowań biologicznych w formacie multipleksu, Możliwość łączenia fluorescencyjnych genetycznie oznaczonych komórek z kodami kreskowymi z testami komórkowymi w formacie multipleksu znacznie zwiększa możliwości wysokiej przepustowości. Po wygenerowaniu linii komórkowych ważne jest, aby je zamrozić.

Następnie okresowo je rozmrażaj, ponownie analizuj i uwalniaj z powrotem. Podczas gdy generowanie fluorescencyjnych genetycznie oznaczonych kodów kreskowych linii komórkowych może być początkowo czasochłonne, po ustaleniu znacznie zwiększają powtarzalność i solidność przyszłych zastosowań.