Name: Obrazowanie konfokalne dwuniciowego RNA i receptorów rozpoznawania wzorców w zakażeniu wirusem RNA o ujemnym znaczeniu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: Poznaj metodę mikroskopii konfokalnej do wizualizacji dwuniciowego RNA i receptorów rozpoznawania wzorców w zakażeniach wirusami RNA o ujemnym znaczeniu. Ta technika umożliwia badanie interakcji na poziomie pojedynczych komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować głównym obiektom obrazowania UTMB oraz Maksymowi Ivannikovowi za pomoc mikroskopową.
Ta praca była wspierana przez dotację Publicznej Służby Zdrowia RO1AI093445 i RO1AI129198 przyznaną SP, UTMB Commitment Fund P84373 do CH, oraz T32 AI007526 do EM.

1. Przygotowanie komórek A549 i infekcja JUNV
<ol>
	<li>Wysiewaj 2 x 105 komórek ludzkiego nabłonka płuc A549 na szkiełka nakrywkowe pokryte poli-D-lizyną (PDL) w 12-dołkowych płytkach na 24 godziny przed zakażeniem.</li>
	<li>Przygotować podwielokrotności 150 μl JUNV13 przy mnożeniu infekcji (MOI) 1,0 jednostki tworzącej płytkę miażdżycową na komórkę rozcieńczoną w pożywce Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) uzupełnionej 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) oraz 1% penicyliny i streptomycyny (P/S).</li>
	<li>Usuń pożywkę z hodowli komórkowej. Dodać inokulum wirusa do każdej studzienki zawierającej szkiełko nakrywkowe i inkubować przez 1,5 godziny w temperaturze 37 °C. Wstrząsać płytkami co 15 minut.</li>
	<li>Usunąć inokulum wirusa, dodać 1 ml DMEM uzupełnionego 5% FBS i 1% P/S. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C do żądanego punktu czasowego.</li>
</ol>
2. Utrwalenie i barwienie immunologiczne
<ol>
	<li>Zassać media. Przepłucz komórki, dodając do każdej studzienki 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) uzupełnionej wapniem i magnezem.</li>
	<li>Usuń PBS. Dodać 1 ml metanolu (MeOH) wstępnie schłodzonego w temperaturze -20 °C i inkubować w temperaturze -20 °C lub na suchym lodzie przez 15 minut.</li>
	<li>Usuń MeOH.</li>
	<li>Dodać 1 ml PBS do każdego dołka i myć próbki w temperaturze 4 °C, delikatnie kołysząc przez 5 minut. Powtórzyć mycie w sumie 4 razy.</li>
	<li>Przemyć utrwalone komórki na szkiełkach nakrywkowych w 1 ml 0,2% t-oktylofenoksypolietylenu przez 5 minut w temperaturze 4 °C, delikatnie kołysząc.</li>
	<li>Dodaj 1 ml PBS do każdej studzienki. Próbki należy myć w temperaturze 4 °C przez 5 minut, delikatnie kołysząc. Powtórz krok prania w sumie 4 razy.</li>
	<li>Aby wykryć dsRNA i MDA5, należy inkubować próbki w 200 μl przeciwciał pierwszorzędowych rozcieńczonych w 3% albuminie surowicy bydlęcej (BSA). Rozcieńczyć przeciwciało anty-dsRNA 9D5 w rozcieńczeniu 1:2 i rozcieńczyć przeciwciało anty-MDA-5 w stosunku 1:250. Inkubować z delikatnym kołysaniem w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Usuń przeciwciała pierwszorzędowe i przemyj każdą studzienkę 1 ml PBS przez 5 minut, delikatnie kołysząc w temperaturze pokojowej. Powtórz to płukanie jeszcze cztery razy.</li>
	<li>Dodać 200 μl przeciwciał drugorzędowych (rozcieńczenie 1:2 000) rozcieńczonych w 3% BSA i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Usuń przeciwciała wtórne i przemyj każdą studzienkę 1 ml PBS przez 5 minut, delikatnie kołysząc w temperaturze pokojowej. Powtórz to płukanie jeszcze cztery razy.</li>
	<li>Aby wykryć nukleoproteinę JUNV (NP) i RIG-I, dodaj 200 μl sprzężonych przeciwciał rozcieńczonych w 3% BSA. Rozcieńczyć sprzężony anty-JUNV NP (AG-12) w stosunku 1:1 000 i inkubować próbki przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z delikatnym kołysaniem. Rozcieńczyć sprzężone przeciwciało anty-RIG-I w stosunku 1:500 i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc, delikatnie kołysząc.</li>
	<li>Usuń sprzężone przeciwciała i przemyj każdą studzienkę 1 ml PBS przez 5 minut, delikatnie kołysząc w temperaturze pokojowej. Powtórz to płukanie jeszcze cztery razy.</li>
	<li>Przeciwbarwić szkiełka nakrywkowe za pomocą DAPI (1:1 000) przez 3 minuty, delikatnie kołysząc w temperaturze RT.</li>
	<li>Szkiełka nakrywkowe należy myć 3 razy, za każdym razem przez 5 minut w 1 ml 0,5% t-oktylofenoksypolietylenu z delikatnym kołysaniem w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyć dwukrotnie w 1 ml PBS przez 5 minut za każdym razem z delikatnym kołysaniem w temperaturze RT.</li>
	<li>Umyć raz w 1 ml ddH2O przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, delikatnie kołysząc.</li>
	<li>Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach podstawowych za pomocą nośników montażowych. Pozostaw do utwardzenia na noc.</li>
	<li>Uszczelnij szkiełka lakierem do paznokci i schnij na powietrzu przez 1 godzinę.</li>
	<li>Obraz w mikroskopie konfokalnym z soczewką olejową o aperturze numerycznej 60x/1,42 przy użyciu tych samych emisji laserowych dla każdej próbki.</li>
	<li>Podczas analizowania danych, jeśli to konieczne, dokonaj korekty jasności i kontrastu, używając tej samej korekty liniowej dla wszystkich próbek.</li>
</ol>

<ol><li>Jensen, S., Thomsen, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+of+RNA+viruses%3A+a+review+of+innate+immune+receptors+involved+in+recognizing+RNA+virus+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Sensing of RNA viruses: a review of innate immune receptors involved in recognizing RNA virus invasion.</a> Journal of Virology. 86, 2900-2910 (2012).</li>
<li>Weber, F., Wagner, V., Rasmussen, S. B., Hartmann, R., Paludan, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-stranded+RNA+is+produced+by+positive-strand+RNA+viruses+and+DNA+viruses+but+not+in+detectable+amounts+by+negative-strand+RNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Double-stranded RNA is produced by positive-strand RNA viruses and DNA viruses but not in detectable amounts by negative-strand RNA viruses.</a> Journal of Virology. 80, 6(2006).</li>
<li>Triantafilou, K., Vakakis, E., Kar, S., Richer, E., Evans, G. L., Triantafilou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualisation+of+direct+interaction+of+MDA5+and+the+dsRNA+replicative+intermediate+form+of+positive+strand+RNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Visualisation of direct interaction of MDA5 and the dsRNA replicative intermediate form of positive strand RNA viruses.</a> Journal of Cell Science. 125, 4761-4769 (2012).</li>
<li>Onomoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+an+antiviral+stress+granule+containing+RIG-I+and+PKR+in+viral+detection+and+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Critical role of an antiviral stress granule containing RIG-I and PKR in viral detection and innate immunity.</a> PLoS One. 7, e43031(2012).</li>
<li>Son, K. N., Liang, Z., Lipton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-stranded+RNA+is+detected+by+immunofluorescence+analysis+in+RNA+and+DNA+virus+infections%2C+including+those+by+negative-sense+RNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Double-stranded RNA is detected by immunofluorescence analysis in RNA and DNA virus infections, including those by negative-sense RNA viruses.</a> Journal of Virology. 89, 9383-9392 (2015).</li>
<li>Mateer, E. J., Paessler, S., Huang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+double-stranded+RNA+colocalizing+with+pattern+recognition+receptors+in+arenavirus+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Visualization of double-stranded RNA colocalizing with pattern recognition receptors in arenavirus infected cells.</a> Frontiers Cellular and Infection Microbiology. 8, 251(2018).</li>
<li>Buchmeier, M. J., de la Torre, J. C., Peters, C. J. Arenavirdae: The viruses and their replication. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBuchmeier%2C+MJ+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Lippincott Williams & Wilkins. (2006).</li>
<li>Levis, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+interferon+in+Argentine+hemorrhagic+fever%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Endogenous interferon in Argentine hemorrhagic fever.</a> The Journal of Infectious Diseases. 149, 428-433 (1984).</li>
<li>Levis, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+endogenous+interferon+and+the+clinical+evolution+of+patients+with+Argentine+hemorrhagic+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Interferon+Research%22%5BJournal%5D)">Correlation between endogenous interferon and the clinical evolution of patients with Argentine hemorrhagic fever.</a> Journal of Interferon Research. 5, 383-389 (1985).</li>
<li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+pathogenic+new+world+and+old+world+human+arenaviruses+induce+distinct+interferon+response+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Highly pathogenic new world and old world human arenaviruses induce distinct interferon response in human cells.</a> Journal of Virology. 89, 7079-7088 (2015).</li>
<li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Junin+virus+infection+activates+the+type+I+interferon+pathway+in+a+RIG-I-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Junin virus infection activates the type I interferon pathway in a RIG-I-dependent manner.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 6, e1659(2012).</li>
<li>Huang, C., Kolokoltsova, O. A., Mateer, E. J., Koma, T., Paessler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+pathogenic+new+world+arenavirus+infection+activates+the+pattern+recognition+receptor+protein+kinase+R+without+attenuating+virus+replication+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Highly pathogenic new world arenavirus infection activates the pattern recognition receptor protein kinase R without attenuating virus replication in human cells.</a> Journal of Virology. 91, 20(2017).</li>
<li>Emonet, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+from+cloned+cDNAs+and+in+vivo+characterization+of+recombinant+pathogenic+Romero+and+live-attenuated+Candid%231+strains+of+Junin+virus%2C+the+causative+agent+of+Argentine+hemorrhagic+fever+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Rescue from cloned cDNAs and in vivo characterization of recombinant pathogenic Romero and live-attenuated Candid#1 strains of Junin virus, the causative agent of Argentine hemorrhagic fever disease.</a> Journal of Virology. 85 (4), 1473-1483 (2011).</li>
<li>Child, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonism+of+the+protein+kinase+R+pathway+in+human+cells+by+Rhesus+Cytomegalovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Antagonism of the protein kinase R pathway in human cells by Rhesus Cytomegalovirus.</a> Journal of Virology. 92, 6(2018).</li>
<li>Hobro, A. J., Smith, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+fixation+methods%3A+Spatial+and+compositional+cellular+changes+observed+by+Raman+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Vibrational+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging.</a> Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W przypadku wirusów RNA o dodatnim sensie i wirusów dsDNA, dsRNA jest łatwo wykrywane za pomocą szeroko stosowanego przeciwciała anty-dsRNA J2. Uważa się jednak, że wirusy RNA o ujemnym znaczeniu wytwarzają dsRNA na niskim lub niższym poziomie wykrywania przy użyciu tego samego przeciwciała2. W związku z tym wiele aspektów interakcji wirusowego RNA i PRR jest w dużej mierze niejasnych dla wirusów RNA o ujemnym sensie. Próbowaliśmy wybarwić dsRNA w infekcji arenawirusem przy użyciu przeciwciała J2,...

Początkowym etapem indukcji wrodzonej odpowiedzi immunologicznej jest rozpoznanie przez gospodarza dwuniciowego (ds) RNA przez receptory rozpoznawania wzorców (PRR), takie jak receptory podobne do kwasu retinowego (RIG-I) (RLR), RIG-I i białko związane z różnicowaniem czerniaka 5 (MDA-5)1. W przypadku wirusów RNA o dodatnim sensie, dsRNA można zwykle łatwo wykryć za pomocą przeciwciał monoklonalnych anty-dsRNA J2 lub K1 (Mab)2. Interakcja między dsRNA i PRR w wirusach o dodatniej nici RNA, takich jak pikornawirus, została scharakteryzowana za pomocą mikroskopii konfokalnej3. Jednak w przypadku wirusa RNA o ujemnym sensie, wizualizacja i charakterystyka interakcji PRR i dsRNA była utrudniona przez brak wrażliwych przeciwciał przeciwko dsRNA. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ RNA (FISH) została zastosowana do wizualizacji wirusowego RNA i PRRs4. Niemniej jednak metodologia FISH wymaga znajomości docelowej sekwencji RNA i może nie być kompatybilna z współbarwieniem PRR. Niedawno okazało się, że 9D5 Mab, który został pierwotnie opracowany do diagnozowania infekcji pan-enterowirusem, jest bardziej czuły niż J2 Mab i może łatwo wykryć dsRNA w infekcji wirusem RNA o ujemnym sensie5,6. Tak więc Mab 9D5 jest nowatorskim i użytecznym narzędziem do badania replikacji wirusa i interakcji między PRR a wirusowym RNA dla wirusa RNA o ujemnym sensie.
Arenawirusy to rodzina jednoniciowych wirusów RNA o ujemnym znaczeniu, które zawierają kilka ludzkich patogenów, takich jak wirus Lassa (LASV), wirus Junín (JUNV) i wirus Machupo (MACV), które powodują ciężkie choroby gorączki krwotocznej u ludzi7. Dane kliniczne dotyczące ciężkich i śmiertelnych przypadków argentyńskiej gorączki krwotocznej wywołanej przez arenawirusa Nowego Świata JUNV wykazują niezwykle wysokie poziomy IFN-α8,9. Wykazaliśmy, że patogenne arenawirusy NW (JUNV i MACV), ale nie patogenny arenawirus Starego Świata, LASV, indukują odpowiedź interferonu typu I (IFN) w ludzkich komórkach dendrytycznych pochodzących z monocytów10. Co więcej, RIG-I jest jednym z czujników pośredniczących w odpowiedzi IFN typu I w komórkach zakażonych JUNV11. Odkryliśmy również, że receptor kinazy białkowej R (PKR), który jest tradycyjnie znany z rozpoznawania dsRNA, jest aktywowany w patogennej infekcji arenawirusem NW12. Aby lepiej zrozumieć mechanizm specyficznej dla wirusa odpowiedzi IFN podczas infekcji arenawirusem, naszym celem było opracowanie protokołu wizualizacji interakcji między wirusowym dsRNA a cytoplazmatycznymi PRR.
Eksperymenty z infekcjami patogennymi JUNV, MACV i LASV muszą być przeprowadzane w obiektach o 4 poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL-4). W związku z tym, oprócz przypuszczalnie niskiego poziomu dsRNA powstającego w wyniku infekcji arenawirusowej, spełnienie wymagań bezpieczeństwa biologicznego jest kolejnym wyzwaniem technicznym podczas wykonywania badań obrazowych dla tych wysoce zjadliwych wirusów. Wykorzystując przeciwciało 9D5 i szczep szczepionki Candid1# JUNV, w niniejszym raporcie opisano protokół oparty na mikroskopii konfokalnej, który został z powodzeniem wykorzystany do jednoczesnej wizualizacji dsRNA, białka wirusowego i PRR w komórkach zakażonych arenawirusem w laboratoriach BSL2. Protokół nadaje się również do wizualizacji wewnątrzkomórkowej dystrybucji dsRNA i PRR podczas patogennej infekcji arenawirusem w obiektach BSL4.

<table><tbody><tr><td>Zestaw do znakowania przeciwciał APEX Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A10475</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>Aldrich A4503</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Cell Signaling</td><td>4083</td><td>1:1,000 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>osioł-anty królik Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A-11058</td><td>1:2,000 rozcieńczenie; Część #: 1454437</td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże Eagle's Dulbecco</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td> płodu <td>Atlanta Bio</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Szklane szkiełka mikroskopowe</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Kozioł anty myszy Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11029</td><td>1:2000 rozcieńczenie; Część #: 1874804</td></tr><tr><td>Ludzkie komórki nabłonkowe płuc A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher</td><td>A412</td><td>Przechowywany w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Mysz MAb anty-JUNV NP</td><td>BEI</td><td>NA05-AG12</td><td>sprzężona z Alexa-647 w rozcieńczeniu 1:1,000</td></tr><tr><td>Mysz MAb pan-enterovirus 9D5 Odczynnik</td><td>Millipore Sigma</td><td>3361</td><td>gotowy do użycia; rozcieńczony w stosunku 1:2; Część #: 3067445</td></tr><tr><td>PBS uzupełniony Ca i Mg</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>PDL Szkiełka nakrywkowe</td><td>powlekane Neuvitro</td><td>H-12-1.5-pdl</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold antifade</td><td>Invitrogen</td><td>P10144</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit MAb MDA-5</td><td>Abcam</td><td>ab126630</td><td>1:250 rozcieńczenie; Partia #: GR97758-7</td></tr><tr><td>rekombinowany szczep Candid#1 JUNV</td><td>Lab wygenerowany</td><td>w laboratorium Jak</td><td>opisano wcześniej w odnośniku 13.</td></tr><tr><td>Mysz RIG-I MAb sprzężona z Alexa-594</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-376845</td><td>rozcieńczenie 1:1000; Część #: AO218</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie konfokalne dwuniciowego rna i receptorów rozpoznawania wzorców w zakażeniu wirusem rna o ujemnym znaczeniu

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

Dwuniciowy (ds) RNA jest wytwarzany jako replikacyjny produkt pośredni podczas infekcji wirusem RNA. Rozpoznawanie dsRNA przez receptory rozpoznawania wzorców gospodarza (PRR), takie jak receptory podobne do kwasu retinowego (RIG-I) (RLR), RIG-I i białko związane z różnicowaniem czerniaka 5 (MDA-5), prowadzi do indukcji wrodzonej odpowiedzi immunologicznej. Powstawanie i wewnątrzkomórkowa dystrybucja dsRNA w zakażeniu wirusem RNA o dodatnim sensie została dobrze scharakteryzowana za pomocą mikroskopii. Wiele wirusów RNA o ujemnym sensie, w tym niektóre arenawirusy, wyzwala wrodzoną odpowiedź immunologiczną podczas infekcji. Uważa się jednak, że wirusy RNA o ujemnym znaczeniu wytwarzają niskie poziomy dsRNA, co utrudnia badanie obrazowe rozpoznawania PRR wirusowego dsRNA. Dodatkowo, eksperymenty z infekcjami wysoce zjadliwymi arenawirusami muszą być przeprowadzane w obiektach o wysokim poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL-4). Interakcja między wirusowym RNA a PRR dla wysoce zjadliwego wirusa RNA jest w dużej mierze nieznana ze względu na dodatkowe wyzwania techniczne, z którymi naukowcy muszą się zmierzyć w obiektach BSL-4. Ostatnio odkryto, że przeciwciało monoklonalne (Mab) (klon 9D5) pierwotnie używane do wykrywania pan-enterowirusa specyficznie wykrywa dsRNA z wyższą czułością niż tradycyjne przeciwciała anty-dsRNA J2 lub K1. Tutaj, wykorzystując przeciwciało 9D5, opisujemy protokół mikroskopii konfokalnej, który został z powodzeniem wykorzystany do jednoczesnej wizualizacji dsRNA, białka wirusowego i PRR w pojedynczych komórkach zakażonych arenawirusem. Protokół nadaje się również do badań obrazowych dystrybucji dsRNA i PRR w patogennych komórkach zakażonych wirusem arenawirusowym w obiektach BSL4.

Niniejszy protokół zastosowano w celu zbadania rozkładu i kolokalizacji receptorów RLR (RIG-I i MDA-5) oraz dsRNA w komórkach zakażonych JUNV. Jak pokazano na Rysunku 1 i Rysunku 2, akumulacja dsRNA zwiększa się wraz z postępem infekcji wirusowej. Skoncentrowane sygnały MDA-5 (Rysunek 1) i RIG-I (Rysunek 2) wykazywały kolokalizację z kropkowymi strukturami NP i dsRNA.</p...

Dwuniciowe RNA wytwarzane podczas replikacji wirusa RNA mogą być rozpoznawane przez receptory rozpoznające wzorce, aby wywołać wrodzoną odpowiedź immunologiczną. W przypadku wirusów RNA o ujemnym znaczeniu interakcja między niskim poziomem dsRNA a PRR pozostaje niejasna. Opracowaliśmy metodę mikroskopii konfokalnej do wizualizacji dsRNA i PRR arenawirusa w poszczególnych komórkach.

Obrazowanie konfokalne dwuniciowego RNA i receptorów rozpoznawania wzorców w zakażeniu wirusem RNA o ujemnym znaczeniu

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...

Tradycyjny dwuniciowy test wykrywania RNA zwykle nie jest wystarczająco czuły, aby wykryć dwuniciowe RNA powstałe w wyniku infekcji wirusem RNA o ujemnym sensie. Dlatego interakcja między dwuniciowym RNA a receptorami rozpoznawania wzorców gospodarza pozostała w dużej mierze nieuchwytna dla tych wirusów. Korzystając z tego protokołu, jesteśmy w stanie zwizualizować i scharakteryzować interakcję między białkiem jądrowym wirusa, dwuniciowym RNA i gospodarzem a PRR na poziomie pojedynczej komórki dla wirusa RNA o ujemnym sensie. Jest to test multipleksowy, który pozwala na jednoczesne barwienie dwuniciowego RNA i dwóch celów białkowych wirusa lub gospodarza w poszczególnych komórkach. W przeciwieństwie do testu RNA-FISH, technika ta jest niezależna od sekwencji RNA i zwykle kompatybilna z wykrywaniem przeciwciał docelowych białek. Rozpocznij 24 godziny przed zakażeniem, wysiewając 200 000 ludzkich komórek nabłonka płuc A549 na szkiełkach pokrywających z poli-D-lizyny na 12-dołkowych płytkach i hodując je w 37

confocal-imaging-double-stranded-rna-pattern-recognition-receptors

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opracowano metodę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w celu wizualnej detekcji wirusowego RNA genomowego przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Przygotowano sondę specyficzną dla wirusowego RNA, która może być następnie identyfikowana za pomocą kombinacji technik hybrydyzacji i immunofluorescencji. Technika ta daje możliwość określenia lokalizacji wirusowego RNA lub DNA w stanie stacjonarnym, dostarczając informacji o kontroli procesów wewnątrzkomórkowego transportu wirusa.

Wykrywanie wirusowego RNA za pomocą hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ (FISH)

Source: Mateer, E., et al., Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the confocal imaging of viral double-stranded RNA (dsRNA) and cytoplasmic pattern recognition receptors (PRRs) in virus-infected epithelial cells. It highlights how antibody-based fluorescent labeling reveals the interaction between viral replication intermediates and host immune sensors.

Visualization of Viral Double-Stranded RNA and Host Pattern Recognition Receptors in Infected Epithelial Cells

Ten film demonstruje zastosowanie hybrydyzacji reakcji łańcuchowej (HCR)-fluorescencji in situ (FISH) do wizualizacji przestrzennego rozkładu subgenomowego RNA SARS-CoV-2. Połączenie HCR z technikami immunofluorescencji może dostarczyć informacji na temat interakcji gospodarz-wirus na poziomie pojedynczej komórki.

Wykorzystanie fluorescencji immuno-RNA Hybrydyzacja in Situ do wizualizacji SARS-CoV-2

Ustaliliśmy protokół fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ do wykrywania trwałego genomu wirusa DNA w sekcjach tkanek modeli zwierzęcych. Protokół ten umożliwia badanie procesu infekcji poprzez kodetekcję genomu wirusa, jego produktów RNA oraz białek wirusowych lub komórkowych w obrębie pojedynczych komórek.

Wykrywanie genomu i transkryptów przetrwałego wirusa DNA w tkankach neuronalnych za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ połączonej z barwieniem immunologicznym

Dołączanie wirionów do powierzchni jest wymogiem do obrazowania pojedynczego wirionu za pomocą obrazowania fluorescencyjnego w superrozdzielczości lub mikroskopii sił atomowych (AFM). W tym miejscu demonstrujemy metodę przygotowania próbki do kontrolowanej adhezji wirionów do powierzchni szklanych, odpowiednią do stosowania w obrazowaniu AFM i fluorescencji o wysokiej rozdzielczości.

Przygotowanie próbki do mikroskopii sił atomowych pojedynczego wirionu i obrazowania fluorescencyjnego w superrozdzielczości

Wrodzona obrona przed infekcjami wirusowymi jest wywoływana przez receptory rozpoznawania wzorców (PRR). Dwa cytoplazmatyczne PR, RIG-I I PKR, wiążą się z sygnaturą wirusa RNA, zmieniają konformację, oligomeryzują i aktywują sygnalizację przeciwwirusową. Opisano metody, które pozwalają wygodnie monitorować przełączanie konformacyjne i oligomeryzację tych cytoplazmatycznych PRR.

Monitorowanie aktywacji receptorów rozpoznawania wzorców przeciwwirusowych RIG-I i PKR przez ograniczone trawienie proteazy i natywne PAGE

Fabryki transkrypcji wirusa to odrębne struktury, które są wzbogacone o komórkową polimerazę RNA II w celu zwiększenia transkrypcji genów wirusa podczas reaktywacji. W tym miejscu opisano metodę lokalizacji miejsc aktywnej transkrypcji chromatyny wirusowej w przestrzeni jądrowej 3D poprzez połączenie barwienia immunofluorescencyjnego i hybrydyzacji RNA in situ.

Obrazowanie funkcjonalne fabryk transkrypcji wirusów przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej 3D

Prezentowany tutaj jest protokół dla metody obrazowania fluorescencyjnego, multiplex immunofluorescencyjna metodawykrywania DNA, RNA i proteiny (MICDDRP), metoda zdolna do jednoczesnej fluorescencyjnej wizualizacji pojedynczych komórek białka wirusowego i kwasów nukleinowych o różnym typie i nici. Takie podejście można zastosować do różnych systemów.

Obrazowanie fluorescencyjne z multipleksem pojedynczych komórek w celu wizualizacji wirusowych kwasów nukleinowych i białek oraz monitorowania zakażeń HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika i grypy

Tutaj opisujemy prostą metodę, która łączy fluorescencję RNA hybrydyzację in situ (RNA-FISH) z immunofluorescencją w celu wizualizacji RNA koronawirusa zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2). Protokół ten może zwiększyć zrozumienie charakterystyki molekularnej interakcji RNA-gospodarz SARS-CoV-2 na poziomie pojedynczej komórki.

Wizualizacja SARS-CoV-2 za pomocą hybrydyzacji immuno RNA-fluorescencji in situ

Tutaj opisujemy nowo opracowany multipleksowy fluorescencyjny test immunologiczny, który wykorzystuje system cytometrii z podwójnym przepływem reporterowym do jednoczesnego wykrywania dwóch unikalnych epitopów białka kolca na nienaruszonych cząsteczkach wirusa SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2) zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej, które zostały wychwycone przez mikrosfery magnetyczne sprzężone z enzymem konwertującym angiotensynę.

Profilowanie epitopów białek powierzchniowych na cząsteczkach wirusa za pomocą strategii multipleksu dual-reporter

Poznaj metodę mikroskopii konfokalnej do wizualizacji dwuniciowego RNA i receptorów rozpoznawania wzorców w zakażeniach wirusami RNA o ujemnym znaczeniu. Ta technika umożliwia badanie interakcji na poziomie pojedynczych komórek.

Obrazowanie konfokalne dwuniciowego RNA i receptorów rozpoznawania wzorców w zakażeniu wirusem RNA o ujemnym znaczeniu

Przeglądaj więcej filmów