Obrazowanie konfokalne dwuniciowego RNA i receptorów rozpoznawania wzorców w zakażeniu wirusem RNA o ujemnym znaczeniu
26 stycznia 2019
Dwuniciowe RNA wytwarzane podczas replikacji wirusa RNA mogą być rozpoznawane przez receptory rozpoznające wzorce, aby wywołać wrodzoną odpowiedź immunologiczną. W przypadku wirusów RNA o ujemnym znaczeniu interakcja między niskim poziomem dsRNA a PRR pozostaje niejasna. Opracowaliśmy metodę mikroskopii konfokalnej do wizualizacji dsRNA i PRR arenawirusa w poszczególnych komórkach.
Tradycyjny dwuniciowy test wykrywania RNA zwykle nie jest wystarczająco czuły, aby wykryć dwuniciowe RNA powstałe w wyniku infekcji wirusem RNA o ujemnym sensie. Dlatego interakcja między dwuniciowym RNA a receptorami rozpoznawania wzorców gospodarza pozostała w dużej mierze nieuchwytna dla tych wirusów. Korzystając z tego protokołu, jesteśmy w stanie zwizualizować i scharakteryzować interakcję między białkiem jądrowym wirusa, dwuniciowym RNA i gospodarzem a PRR na poziomie pojedynczej komórki dla wirusa RNA o ujemnym sensie. Jest to test multipleksowy, który pozwala na jednoczesne barwienie dwuniciowego RNA i dwóch celów białkowych wirusa lub gospodarza w poszczególnych komórkach. W przeciwieństwie do testu RNA-FISH, technika ta jest niezależna od sekwencji RNA i zwykle kompatybilna z wykrywaniem przeciwciał docelowych białek. Rozpocznij 24 godziny przed zakażeniem, wysiewając 200 000 ludzkich komórek nabłonka płuc A549 na szkiełkach pokrywających z poli-D-lizyny na 12-dołkowych płytkach i hodując je w 37
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie bada rozpoznawanie dwuniciowej RNA (dsRNA) produkowanej podczas replikacji wirusa RNA przez receptory rozpoznawania wzorców (PRRs) w celu wywołania wrodzonej odpowiedzi immunologicznej. Koncentracja jest na wirusach RNA o ujemnej polaryzacji, gdzie interakcja między niską ilością dsRNA a PRRs nie jest dobrze zrozumiana. Opracowano metodę mikroskopii konfokalnej do wizualizowaniu dsRNA arenawirusa i PRRs w pojedynczych komórkach.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Immunologia
- Wirusologia
Tło
- Dwuniciowa RNA jest produktem ubocznym replikacji wirusa RNA.
- Receptory rozpoznawania wzorców odgrywają kluczową rolę we wrodzonej odpowiedzi immunologicznej.
- Interakcja między dsRNA a PRRs w wirusach RNA o ujemnej polaryzacji jest słabo zrozumiana.
- Wizualizacja dsRNA i PRRs może zwiększyć zrozumienie uniknięcia odpowiedzi immunologicznej przez wirusy.
Cel badania
- Wyjaśnienie interakcji między dsRNA a PRRs w wirusach RNA o ujemnej polaryzacji.
- Opracowanie metody wizualizowania tych interakcji w pojedynczych komórkach.
- Wkład w zrozumienie wrodzonej odpowiedzi immunologicznej na wirusy RNA.
Stosowane metody
- Mikroskopia konfokalna do wizualizowania dsRNA i PRRs.
- Testy komórkowe do oceny odpowiedzi immunologicznej.
- Analiza poziomów dsRNA podczas replikacji wirusowej.
- Studia porównawcze z różnymi wirusami RNA.
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizację dsRNA arenawirusa i PRRs w pojedynczych komórkach.
- Identyfikację specyficznych interakcji między dsRNA a PRRs.
- Wgląd w mechanizmy odpowiedzi immunologicznej wyzwanej przez dsRNA.
- Wyjaśnienie roli dsRNA w patogenezie wirusowej.
Wnioski
- Opracowany metoda mikroskopii konfokalnej jest skuteczna do badania interakcji dsRNA i PRRs.
- Zrozumienie tych interakcji może prowadzić do nowych strategii terapeutycznych przeciwko wirusom RNA.
- To badanie przyczynia się do szerszej dziedziny immunologii wirusowej.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Visualizing low-abundance double-stranded RNA (dsRNA) in negative-sense RNA virus infection addresses a critical gap in understanding innate immune activation and viral immune evasion. This capability supports target validation and mechanistic de-risking in antiviral discovery by enabling direct observation of pattern recognition receptor (PRR) engagement with viral replicative intermediates. The method enhances predictive confidence in early-stage target selection for arenavirus and related pathogens, informing portfolio prioritization in high-containment pathogen programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing dsRNA-PRR interactions at single-cell resolution in pathogenic virus models.
- Operational Value: Provides a sensitive, sequence-independent detection method compatible with multiplexed protein staining for pathway clarification.
- Predictive Value: Supports biological de-risking of PRR targets by confirming ligand engagement in relevant infection contexts.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative, spatially resolved readouts of dsRNA and PRR colocalization for assay standardization.
- Screening Relevance: Prepares validated biological systems for downstream compound screening by establishing baseline immune activation metrics.
- Platform Utility: Compatible with antibody-based detection, enabling reuse across viral targets and host proteins in imaging workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery observations to preclinical validation by mapping dsRNA distribution and PRR recruitment in disease-relevant systems.
- Mechanistic Insight: Clarifies spatial and temporal dynamics of innate immune signaling, informing biomarker selection for pathway modulation.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables data-driven go/no-go decisions based on visual confirmation of target engagement in high-pathogenicity models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, particularly for immunomodulatory antivirals targeting PRR pathways.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of PRR agonist/antagonist mechanisms by visualizing dsRNA as the endogenous ligand in infected cells.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs that enable comparison of compound effects on dsRNA-PRR interactions.
- Analytics: Provides multiplexed fluorescence readouts (dsRNA, viral protein, PRR) for high-content analysis of immune activation states.
- Translational Research: Connects in vitro observations to preclinical continuity by confirming PRR activation in primary or stem-cell-derived lung epithelial models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized imaging platform applicable to multiple negative-sense RNA viruses and host targets beyond arenaviruses.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing mechanistic ambiguity in PRR-ligand interactions.
- Operational Value: Enhances assay reproducibility and scalability through standardized confocal protocols and sensitive dsRNA detection.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by providing direct visual evidence of pathway modulation, reducing late-stage attrition.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of immunomodulatory candidates based on confirmed target engagement in pathogenic virus contexts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy, immunofluorescence staining, and biosafety-level-appropriate virology techniques.
- Dependent on access to high-sensitivity dsRNA antibodies (e.g., 9D5 clone) and compatible fluorescence imaging infrastructure.
- Necessitates standardization across laboratories for consistent dsRNA signal quantification and colocalization analysis.
- Must account for cell model variability (e.g., A549 vs. primary airway epithelium) in dsRNA production and PRR expression levels.
- Practical limitations include potential antibody cross-reactivity and the need for optimization in high-containment (BSL-3/BSL-4) settings.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:05
Preparation of A549 Cells and JUNV (Junn virus) Infection
2:09
Fixation and Immunostaining
5:10
Results: Distribution and Colocalization Between the Retinoic Acid Like Receptors RLRs (RIG-I and MDA-5) and dsRNA in JUNV-infected Cells
5:52
Conclusion
