Wykrywanie genomu i transkryptów przetrwałego wirusa DNA w tkankach neuronalnych za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ połączonej z barwieniem immunologicznym

Ogólnym celem tej procedury jest wykrycie genomu wirusa opryszczki pospolitej, typu pierwszego w odcinkach zwojów nerwu trójdzielnego od utajonych zakażonych myszy poprzez fluorescencyjną hybrydyzację in situ. Osiąga się to poprzez najpierw zaszczepienie wirusa w wardze zwierzęcia, a następnie 28-dniowy okres inkubacji, podczas którego wirus osadza się w zwojach nerwu trójdzielnego. Następnie zwoje nerwu trójdzielnego są zbierane, osadzane i kriowycinane.

Skrawki poddawane są kilku zabiegom przygotowawczym, w tym kluczowemu etapowi, jakim jest podgrzanie ich w buforze cytrynianu sodu. Wreszcie, fluorescencyjna hybrydyzacja in situ jest przeprowadzana przy użyciu szlafroków fluorescencyjnych specyficznych dla opryszczki. Ostatecznie wyniki mogą pokazać umiejscowienie genomu wirusa w jądrze indywidualnie zakażonych neuronów dzięki zastosowaniu mikroskopii konfokalnej.

W wielu przypadkach badanie różnych cykli życia wymaga użycia modeli zwierzęcych. Główną zaletą tej techniki jest to, że dostarcza ona danych na poziomie pojedynczej komórki przy użyciu podejścia płynnego instytutu. Królewski model zakażeń HS odtwarza większość aspektów naturalnej historii zakażenia HSV One u ludzi.

To jest naturalny gospodarz wirusa. Pierwotne zakażenie odbywa się w tkankach jamy ustnej, a następnie wirus rozwija się z warg do dwóch zwojów al. To jest główna strona latencji HS V u ludzi Połączone dwie immuno i barwienie.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące opóźnienia wirusa opryszczki, takie jak sposób, w jaki wirus oddziałuje ze składnikami jądrowymi i jak te interakcje wpłynęłyby na utrzymanie latencji i ostatecznie reaktywację wirusa. Na początek znieczulenie należy użyć znieczulonej myszy i roztworu podstawowego wirusa HSV jeden. Zawieszony w podłożu wolnym od czerwieni fenolowej.

Za pomocą stereoskopu dwuokularowego wprowadzić igłę w warstwę podnabłonkową lewej górnej wargi na granicy śluzówkowo-skórnej. Wstrzyknij 0,5 mikrolitra roztworu wirusa w ciągu pięciu sekund, a następnie wykonaj drugie wstrzyknięcie wirusa w to samo miejsce. Przenieś mysz do inkubatora lub poduszki grzewczej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż się obudzi.

Następnie umieść go w klatce domowej na wymagany czas rekonwalescencji przed perfu naprawieniem go zgodnie z protokołem tekstowym. Wytnij z każdej strony dolnej szczęki. Następnie odetnij czubek nosa tuż za siekaczami, aby odsłonić jamę nosową.

Przetnij podniebienie na pół nożyczkami, a następnie odłóż je na bok. Zwoje nerwu trójdzielnego znajdują się poniżej podniebienia. Są to białe, podłużne masy o długości od dwóch do trzech milimetrów i są połączone z nerwem trójdzielnym.

Przetnij gałęzie nerwu trójdzielnego po obu stronach zwojów, aby uwolnić je z pnia mózgu. Za pomocą szczypiec chirurgicznych usuń zwoje i przenieś je do 20% sacharozy w PBS, pozwól im inkubować przez 24 godziny. W temperaturze pokojowej następnego dnia osadź oba zwoje nerwu trójdzielnego w jednym bloku kriosekcji.

Osadzając pożywkę, zamroź blok w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż zostanie podzielony na kriostat. Przetnij zwoje nerwu trójdzielnego wzdłuż na odcinki o wielkości 10 mikronów i zbierz je na szkiełkach super frost rozgrzanych do 30 stopni Celsjusza. Na jednej prowadnicy może zmieścić się od czterech do pięciu sekcji.

Przydatne może być nadanie slajdowi wielu etykiet serii. Jeśli planowanych jest kilka dalszych zastosowań, pozostaw plastry do wyschnięcia na pięć do 10 minut przed przechowywaniem ich w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Dla tego protokołu sonda jest przygotowywana przez znakowanie kosmów zawierających 30 kilozasadowych części jednego genomu HSV za pomocą SI 3D CTP przez translację NIC.

Jest wytrącany i zawieszony w dejonizowanej formie amidu i powinien wydawać się różowy z powodu inkorporacji S SI trzy pierwszego dnia. Umieść szkiełka na uchwycie na szkiełko w temperaturze pokojowej i pozostaw sekcje do wyschnięcia na 10 minut. Następnie ponownie nawodnij sekcje w jednym XPBS przez 10 minut.

Następnie wykonaj permelinię tkanki w 0,5% Triton X 100 w jednym XPBS przez 20 minut. Następnie umyj szkiełka trzy razy przez 10 minut na mycie dwoma XSS i trzymaj je w dwóch XSSC, aż bufor demaskujący zostanie podgrzany. W celu zdemaskowania podgrzej bufor cytrynianu w kuchence mikrofalowej, aż bufor się zagotuje.

Odbywa się to poprzez napełnienie szklanej tacki szkiełkowej 200 mililitrami buforu. Umieść tackę w większym pojemniku wypełnionym 500 mililitrami wody destylowanej i podgrzej bufor do wrzenia. Następnie przenieś szkiełka do tacy.

Sprawdź, czy są całkowicie pokryte buforem w kuchence mikrofalowej. Podgrzewać szkiełka w buforze przez około 20 sekund, aż bufor osiągnie wrzenie. Nie dopuścić do wykipienia buforu.

Następnie schłodzić szkiełka w temperaturze pokojowej przez dwie minuty i powtórzyć cykl grzania jeszcze sześć razy. Kluczowe znaczenie ma empiryczne określenie liczby i czasu trwania cykli jedzenia dla odtwarzalności etapu demaskowania. Kuchenka mikrofalowa, taca, pojemnik, objętość bufora w tacy.

Objętość wody w pojemniku powinna być taka sama Po zakończeniu podgrzewania. Przenieś szkiełka w dwóch XSSC przez pięć minut pod wyciągiem, inkubuj szkiełka w roztworze metanolu, kwasu octowego i PBS przez 15 minut. Następnie inkubować szkiełka w świeżo przygotowanym mieszance metanolu i kwasu octowego w proporcji trzy do jednego przez 15 minut.

Teraz odwodnić sekcje poprzez kolejne 10-minutowe inkubacje w 70% etanolu, a następnie dwie 10-minutowe inkubacje w czystym etanolu. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia w temperaturze pokojowej na 10 minut, aby przygotować je do sondy. Nanieść kroplami 80 mikrolitrów roztworu sondującego na wysuszone odcinki i przykryć je szkiełkiem nakrywkowym.

Sprawdzić, czy roztwór sondujący rozprowadza się na całej powierzchni szkiełka nakrywkowego i czy nie ma pęcherzyków powietrza. Następnie uszczelnij szkiełko nakrywkowe cementem gumowym i pozostaw do wyschnięcia. Kontynuuj denaturację, inkubując szkiełka w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Następnie szybko przenieś szkiełka na metalową tacę na lodzie na pięć minut. Następnie następnego dnia przeprowadź nocną hybrydyzację w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Usuń cement gumowy za pomocą kleszczy ze szkiełkami na bloku grzewczym o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Delikatnie usuń szkiełko nakrywkowe końcówką ostrza skalpela. Następnie kilkakrotnie umyj sekcje za pomocą SSC. Teraz barwić próbki przez 10 minut odpowiednim barwnikiem, takim jak DAPI lub haczyki 3 3 3 4 2 w ilości 0,5 mikrograma na mililitr w jednym XPBS.

Następnie umyj szkiełka trzy razy jednym XPBS przez 10 minut na pranie. Po trzecim praniu spuść jak najwięcej płynu ze szkiełka. Następnie na końcu każdego szkiełka nałóż 80 mikrolitrów podłoża montażowego ze środkiem zapobiegającym blaknięciu.

Powoli przykryj podłoże szkiełkiem nakrywkowym o wysokiej jakości optycznej, unikając tworzenia się pęcherzyków. Następnie uszczelnij szkiełko lakierem do paznokci i przechowuj je w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Opracowując ten protokół, przetestowano kilka soli pod kątem demaskowania.

Podczas gdy EDTA miały tendencję do uszkadzania tkanki. Tris cytrynianu sodu, HCL i woda destylowana były odpowiednie do wykrywania HSV w celu sprawdzenia, czy protokół będzie działał z komercyjnymi sondami. Wykrywanie jednego utajonego genomu HSV przeprowadzono za pomocą biotynylowanej sondy PAN HSV uzyskanej od Enzo Biochem, można było wykryć zarówno pojedyncze, jak i wielokrotne wzorce plamek dla jednego genomu HSV.

Ponadto protokół DNA ryb został przetestowany na myszach i królikach zakażonych trzema powszechnie stosowanymi szczepami HSV one. We wszystkich przypadkach genomy HSV one wykazywały nierówny sygnał o zmiennej jasności i intensywności. Ponadto przetestowano możliwość zastosowania protokołu w cyklu replikacyjnym HSV one, wykonując DNA ryb na tkankach myszy poddawanych ogólnemu zakażeniu opryszczką.

U tych zwierząt wykryto duże i jasne agregaty genomów HSV one w różnych tkankach, w tym w oczach i mózgu DRG. Protokół DNA ryb jest bardzo wszechstronny. Pozwala na jednoczesne wykrywanie jednego genomu HSV oraz wirusowych lub komórkowych RNA i białek.

Na przykład, kodetekcja jednego genomu HSV wraz z jednym latem RNA HSV jest wykonalna, kodetekcja jednego genomu HSV z białkami komórkowymi, takimi jak białko Centro MERIC CE NPA A została wykorzystana do jednoczesnej detekcji HSV jeden z chromatyną i ciałami jądrowymi PML. Powiązane białko A TRX wizualizowano za pomocą potrójnego barwienia pokazującego HSV 1D NA na czerwono. Jego produkt RNA jest niebieski, a TRX zielony.

Po skonfigurowaniu demaskowania procedura ryb DNA jest bardzo solidna. Można to zrobić w mniej niż 24 godziny w partiach po 20 lub więcej slajdów. Opracowanie tej techniki umożliwi naukowcom badającym wirusy opryszczki i inne uporczywe wirusy zbadanie na poziomie pojedynczej komórki, w jaki sposób składniki komórkowe i architektura jądrowa mogą wpływać na biologię tych wirusów.