Wykrywanie genomu i transkryptów przetrwałego wirusa DNA w tkankach neuronalnych za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ połączonej z barwieniem immunologicznym

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykrycie genomu wirusa prostego opryszczki typu 1 w przekrojach zwojów trójdzielnych myszy zakażonych w sposób utajniony, przy użyciu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ. Procedurę tę realizuje się poprzez najpierw inokulację wirusa w wargę zwierzęcia, a następnie 28-dniowy okres inkubacji, podczas którego wirus kolonizuje zwoje trójdzielne. Następnie zwoje trójdzielne są pobierane, zatapiane i poddawane kriosekcjonowaniu.

Przekroje poddawane są kilku zabiegom przygotowawczym, w tym kluczowemu etapowi ogrzewania w buforze cytrynianu sodu. Następnie przeprowadza się fluorescencyjną hybrydyzację in situ, wykorzystując specyficzne dla herpeswirusów sondy fluorescencyjne. Ostatecznie, dzięki zastosowaniu mikroskopii konfokalnej, wyniki mogą ukazać lokalizację genomu wirusa wewnątrz jądra poszczególnych zainfekowanych neuronów.

W wielu przypadkach badanie różnych cykli życiowych wymaga zastosowania modeli zwierzęcych. Główną zaletą prezentowanej tutaj techniki jest dostarczanie danych na poziomie pojedynczych komórek z wykorzystaniem podejścia do intuicyjnej fluentyzacji. Króliczy model zakażeń HS odtwarza większość aspektów naturalnego przebiegu zakażenia HSV 1 u ludzi.

Jest to naturalny gospodarz wirusa. Pierwotna infekcja powstaje w tkankach jamy ustnej, a następnie wirus przemieszcza się z warg do zwojów trójdzielnych. Jest to główne miejsce latencji HSV u ludzi. Połączono immunocytochemię i barwienie.

Ta metoda może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące latencji wirusa opryszczki, takie jak sposób interakcji wirusa z komponentami jądra komórkowego oraz wpływ tych interakcji na utrzymanie latencji i ostatecznie na reaktywację wirusa. Na początek należy przygotować znieczuplą mysz oraz roztwór zapasowy wirusa HSV 1, resuspendowany w medium bez czerwieni fenolowej.

Używając stereomikroskopu dwukierunkowego, wprowadź igłę w warstwę podnabłonkową lewej górnej wargi na granicy błony śluzowej i skóry. Wstrzyknij 0,5 µL roztworu wirusa w ciągu pięciu sekund, a następnie wykonaj drugą iniekcję wirusa w tym samym miejscu. Przenieś mysz do inkubatora lub na matę grzewczą o temperaturze 37 °C aż do momentu wybudzenia.

Następnie umieść zwierzę w jego klatce macierzystej na wymagany czas rekonwalescencji przed utrwaleniem perfuzyjnym zgodnie z protokołem tekstowym. Wykonaj nacięcia po każdej stronie żuchwy. Następnie odetnij czubek nosa tuż za siekaczami, aby odsłonić jamę nosową.

Przeciąć podniebienie nożyczkami na pół, a następnie odsunąć je na bok. Zwoje nerwu trójdzielnego znajdują się pod podniebieniem. Są to białe, wydłużone masy o długości od dwóch do trzech milimetrów, połączone z nerwem trójdzielnym.

Przetnij gałęzie nerwu trójdzielnego po obu stronach zwojów, aby uwolnić je z pnia mózgu. Za pomocą pęsety chirurgicznej wyjmij zwoje i przenieś je do 20%Sucrose w PBS, pozostawiając je do inkubacji na 24 godziny. Następnego dnia, w temperaturze pokojowej, zamknij oba zwoje trójdzielne w jednym bloku do kriosekcjonowania.

W medium do zatapiania zamrozić blok w temperaturze -80 °C do momentu wykonania serii skrawków w kriostacie. Zwoje trójdzielne przeciąć wzdłuż na skrawki o grubości 10 µm i zebrać je na szkiełkach SuperFrost rozgrzanych do 30 °C. Na jednym szkiełku można umieścić od czterech do pięciu skrawków.

Przydatne może być nadanie preparatowi wielu etykiet serii. Jeśli planowane są kolejne etapy analizy, należy pozostawić skrawki do wyschnięcia na okres od 5 do 10 minut przed ich przechowywaniem w temperaturze -80 °C. W ramach niniejszego protokołu sonda jest przygotowywana poprzez znakowanie cosmidów zawierających fragmenty genomu HSV-1 o długości 30 kb za pomocą SI 3D CTP poprzez translację NIC.

Zostaje ono wytrącone i zawieszone w formamidzie dejonizowanym i w pierwszym dniu powinno mieć różowy kolor ze względu na wbudowanie S SI three. Należy umieścić szkiełka na uchwycie w temperaturze pokojowej i pozostawić przekroje do wyschnięcia na 10 minut. Następnie należy rehydratować przekroje w 1x PBS przez 10 minut.

Następnie przeprowadź permeabilizację tkanki w 0,5% Triton X 100 w 1x PBS przez 20 minut. Potem wypłucz preparaty trzy razy po 10 minut każdym myciem w 2x SSC i przechowuj je w 2x SSC do czasu podgrzania buforu do odsłaniania epitopów. W celu odsłaniania epitopów podgrzej bufor cytrynianowy w kuchence mikrofalowej, aż do zagotowania.

W tym celu należy napełnić tackę na szkiełka przedmiotowe 200 mililitrami buforu. Tackę umieszcza się w większym naczyniu wypełnionym 500 mililitrami wody destylowanej i podgrzewa bufor do momentu wrzenia. Następnie należy przenieść szkiełka do tacki.

Upewnij się, że szkiełka są całkowicie przykryte buforem w kuchence mikrofalowej. Podgrzewaj szkiełka w buforze przez około 20 sekund, aż bufor zawrze. Nie dopuść do wykipienia buforu.

Następnie schłodzić preparaty w temperaturze pokojowej przez dwie minuty i powtórzyć cykl grzania jeszcze sześć razy. W celu zapewnienia powtarzalności etapu odsłaniania epitopów kluczowe jest empiryczne określenie liczby oraz czasu trwania cykli grzania. Wpływają na to: kuchenka mikrofalowa, taca, pojemnik oraz objętość buforu w tacy.

Objętość wody w pojemniku powinna pozostać taka sama po zakończeniu ogrzewania. Przenieś preparaty do dwóch XSSC na pięć minut pod wyciągiem, a następnie inkubuj preparaty w roztworze metanolu, kwasu octowego i PBS w proporcji 3:1:4 przez 15 minut. Następnie inkubuj preparaty w świeżo przygotowanej mieszaninie metanolu i kwasu octowego w proporcji 3:1 przez 15 minut.

Następnie odwodnij skrawki poprzez następujące po sobie 10-minutowe inkubacje w 70% etanolu, a następnie dwie 10-minutowe inkubacje w czystym etanolu. Pozostaw preparaty do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby przygotować je do aplikacji sondy. Nanieś kroplowo 80 µL roztworu sondy na wysuszone skrawki i przykryj je szkiełkiem podstawowym.

Należy sprawdzić, czy roztwór sondy rozprowadził się po całej powierzchni szkiełka nakrywkowe i czy nie pojawiły się pęcherzyki powietrza. Następnie należy uszczelnić szkiełko nakrywkowe cementem gumowym i pozostawić do wyschnięcia. Następnie należy przeprowadzić denaturację, inkubując preparaty w temperaturze 80 °C przez pięć minut.

Następnie szybko przenieś preparaty na metalną tacę umieszczoną na lodzie na pięć minut. Po tym wykonaj hybrydyzację nocną w temperaturze 37°C w następnym dniu. Usuń klej gumowy za pomocą pęsety, trzymając preparaty na bloku grzewczym o temperaturze 37°C.

Ostrożnie usuń szkiełko nakrywkowe za pomocą ostrza skalpela. Następnie wielokrotnie przemyj skrawki roztworem SSC. Teraz barw próbki przez 10 minut odpowiednim barwnikiem, takim jak DAPI lub HOECHST 33342 w stężeniu 0,5 µg/mL w 1xPBS.

Następnie przemyj preparaty trzykrotnie w roztworze XPBS, przez 10 minut podczas każdego mycia. Po trzecim płukaniu odlej z preparatu jak największą ilość cieczy. Na koniec, na każdą lamkę nanieś 80 µL medium montażowego z substancją zapobiegającą blaknięciu.

Powoli przykryj medium szkiełkiem nakrywkowym o wysokiej jakości optycznej, unikając powstawania pęcherzyków powietrza. Następnie zalakuj preparat lakierem do paznokci i przechowuj w ciemności w temperaturze four degrees Celsius. Podczas opracowywania tego protokołu przetestowano kilka buforów solnych do odsłaniania epitopów.

Podczas gdy bufory EDTA miały tendencję do uszkadzania tkanki, tris cytrynian sodu, HCl i woda destylowana były odpowiednie do detekcji HSV 1 w celu weryfikacji, czy protokół będzie działać z komercyjnymi sondami. Detekcję latentnego genomu HSV 1 przeprowadzono przy użyciu biotynilowanej sondy PAN HSV 1 otrzymanej z Enzo Biochem; wykryto zarówno pojedyncze, jak i wielokrotne wzorce punktowe dla genomu HSV 1.

Ponadto protokół DNA FISH przetestowano na myszach i królikach zakażonych trzema powszechnie stosowanymi szczepami HSV-1. We wszystkich przypadkach genomy HSV-1 wykazały sygnał w postaci plamek o zmiennej jasności i intensywności. Dodatkowo zastosowanie protokołu sprawdzono w cyklu replikacyjnym HSV-1, przeprowadzając badanie DNA FISH na tkankach myszy przechodzących ogólnoustrojową infekcję wirusem opryszczki.

W tych zwierzętach w różnych tkankach, w tym w zwojach rdzeniowych (DRG), oczach i mózgu, wykryto duże i jasne agregaty genomów HSV 1. Protokół DNA FISH jest bardzo wszechstronny. Umożliwia on jednoczesne wykrywanie genomu HSV 1 oraz wirusowych lub komórkowych RNA i białek.

Na przykład, możliwe jest jednoczesne wykrywanie genomu HSV-1 wraz z lat RNA HSV-1; wykorzystano również jednoczesne wykrywanie genomu HSV-1 wraz z białkami komórkowymi, takimi jak białko centromeryczne CENP-A, a także jednoczesne wykrywanie HSV-1 wraz z chromatyną i jądrowymi ciałkami PML. Białko stowarzyszone ATRX zwizualizowano za pomocą potrójnego barwienia, w którym HSV-1 DNA zaznaczono kolorem czerwonym, jego produkt RNA lat kolorem niebieskim, a ATRX kolorem zielonym.

Po zorganizowaniu procesu odmaskowania, procedura DNA FISH jest bardzo odporna na błędy. Można ją przeprowadzić w czasie krótszym niż 24 godziny, przetwarzając serie po 20 lub więcej szkiełek. Opracowanie tej techniki pozwoli badaczom zajmującym się wirusami opryszczki oraz innymi wirusami uporczywymi na zbadanie na poziomie pojedynczych komórek, w jaki sposób komponenty komórkowe i architektura jądra mogą wpływać na biologię tych wirusów.