Name: Wykrywanie genomu i transkryptów przetrwałego wirusa DNA w tkankach neuronalnych za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ połączonej z barwieniem immunologicznym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-23T14:45:00.000+00:00
Duration: 13 min 22 s
Description: Poznaj metodę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ do wykrywania genomu wirusa HSV-1 w tkankach neuronalnych myszy. Technika ta umożliwia wizualizację genomu wirusowego w jądrach pojedynczych neuronów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy N. Sawtellowi (Cincinnati Children's Hospital Medical Center, Cincinnati, Ohio, USA), S. Efstathiou (University of Cambridge, Wielka Brytania) i Jamesowi Hillowi (LSU Health Sciences Center, Nowy Orlean, USA) za dostarczenie próbek od myszy i królików zakażonych HSV-1 oraz za odczynniki; H. Masumoto (Kazusa DNA Research Institute, Chiba, Japonia) i S. Khochbin (Institut Albert Bonniot, Grenoble, Francja) w celu pomocnych dyskusji.
Ta praca została sfinansowana z grantów Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) (program ATIP, dla PL, http://www.cnrs.fr), Francuskiej Narodowej Agencji Badawczej (ANR) (ANR-05-MIIM-008-01, CENTROLAT, <a href="http://www.agencenationale-recherche.fr">http://www.agencenationale-recherche.fr</a>), Fundacji FINOVI (<a href="http://www.finovi.org/:fr:start">http://www.finovi.org/:fr:start</a>), LabEX DEVweCAN (ANR-10-LABX-61) Uniwersytetu w Lyonie, w ramach programu "Investissements d'Avenir" (ANR-11-IDEX-0007) prowadzonego przez ANR (<a href="http://www.agence-nationale-recherche.fr">http://www.agence-nationale-recherche.fr</a>), l'Association pour la Recherche contre le Cancer (ARC-7979 i ARC-4910, <a href="http://www.arc-cancer.net">http://www.arc-cancer.net</a>), la Ligue Nationale Contre le Cancer (LNCC, <a href="http://www.ligue-cancer.net">http://www.ligue-cancer.net</a>) i INCa (program EPIPRO, <a href="http://www.e-cancer.fr">http://www.e-cancer.fr</a>). FC i PL są badaczami CNRS.

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Opisany tutaj protokół pozwala na wykrycie utajonego genomu HSV-1 w neuronach wycinków tkanki neuronalnej myszy. Nasza wiedza na temat szlaków regulujących ekspresję genów wirusa była ograniczona przez brak metody wykrywania genomowego DNA HSV-1 in situ w tkankach neuronalnych. Informacje na temat liczby kopii genomu i odsetka zakażonych neuronów pochodziły głównie z analizy PCR na zdysocjowanych neuronach11,12. Wyjaśniając rolę architektury jądrowej komórki gospodarza w latencji HSV-1, postanowiliśmy...

Wirus opryszczki pospolitej typu 1 (HSV-1) jest trwałym ludzkim wirusem neurotropowym, ustanawiającym długotrwałą utajoną infekcję w neuronach zwojów nerwu trójdzielnego (TG) obwodowego układu nerwowego, z których okresowo reaktywuje się, aby się replikować i rozprzestrzeniać. Genom HSV-1 to 150 kb dsDNA zlokalizowany w jądrze neuronu gospodarza, gdzie pozostaje jako wielokopijne chromatynowe plazmidy, które nie integrują się z genomem komórki gospodarza1,2. Podczas latencji program genetyczny cyklu replikacyjnego HSV-1 jest silnie stłumiony, a ekspresja genów jest ograniczona do locus transkryptu związanego z latencją (LAT), od ustanowienia latencji do zainicjowania reaktywacji3. LAT wytwarza długie, niekodujące RNA o długości 8,5 kb przetworzone na główny stabilny lariat o wielkości 2 kb i kilka miRNA4-7. Latencja HSV-1 charakteryzuje się zatem obecnością wirusowego genomowego DNA, RNA LAT i brakiem wykrywalnych białek cyklu replikacyjnego.
Modele zwierzęce, głównie myszy i króliki, są eksperymentalnymi modelami podsumowującymi kilka cech latencji u człowieka. Jedną z głównych zalet tych modeli jest to, że pozwalają one badać fizjologiczne aspekty latencji HSV-1 u immunokompetentnych gospodarzy. W ciągu ostatnich dziesięcioleci opracowano wiele narzędzi eksperymentalnych, takich jak genetycznie zmodyfikowane wirusy i myszy, do badania fizjologii, genetyki i biologii komórkowej latencji HSV-1 z tkanek zwierzęcych. Do tej pory genomowe DNA wirusa wykrywano i oznaczano ilościowo za pomocą Southern blot i qPCR ze zdysocjowanych TG. Jednak obecnie nie ma dostępnej metody wykrywania genomu HSV-1 poprzez hybrydyzację in situ na odcinkach tkanek8. W związku z tym latencja jest rutynowo oceniana na odcinkach histologicznych poprzez wykrywanie LAT RNA przez hybrydyzację RNA in situ, a nie wykrywanie genomu wirusa. Ponieważ niemożliwe było scharakteryzowanie zakażonych komórek na podstawie obecności genomów wirusa, to techniczne ograniczenie było główną wadą analizy wielu aspektów interakcji gospodarz-wirus, takich jak związek między genomem wirusa a ekspresją genów komórkowych i wirusowych lub odpowiedź immunologiczna za pośrednictwem komórki gospodarza9,10.
Najważniejsze, niejednorodność między komórkami utajonej infekcji pozostaje stosunkowo niezbadana i okazała się kluczową cechą latencji u myszy i ludzkich neuronów zwojowych czuciowych wszczepionych myszomSCID 11-17. Zazwyczaj za pomocą qPCR wykazano, że liczba kopii genomu HSV-1 na komórkę waha się od 5 do kilkuset. Chociaż LAT wydaje się być kluczowym regulatorem latencji i reaktywacji, dane qPCR dotyczące izolowanych neuronów i PCR in situ wykazały, że tylko podzbiór utajonych zainfekowanych neuronów, zaledwie 30%, wyraża locus LAT11,12,18-21. Nie jest jasne, w jaki sposób komórka gospodarza i środowisko komórkowe w tkance wpływają na tworzenie się latencji wirusa i ekspresję genów wirusa. W tym miejscu opisujemy solidną metodę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) do skutecznego wykrywania genomowego DNA HSV-1 o niskiej kopii w skrawkach tkanki neuronalnej zwierząt. Metoda ta została zaprojektowana i wykorzystana przez nas w celu uzyskania dostępu do obrazowania mikroskopowego o wysokiej rozdzielczości, które jest niezbędne do badania interakcji genomu wirusa ze składnikami wewnątrzjądrowymi komórki gospodarza22. Dodatkowo opisujemy metodę wielokrotnego barwienia do jednoczesnego wykrywania DNA wirusa z RNA i białkami, co jest unikalnym narzędziem do opisu interakcji wirus-gospodarz, które regulują ekspresję genów wirusa. Metoda ta może być również stosowana w szerokim zakresie analiz wymagających wykrycia utajonego genomu HSV-1, takich jak ilościowe określanie zakażonych neuronów w dużej liczbie odcinków. Kluczowym krokiem jest zastosowanie leczenia polegającego na odzyskiwaniu antygenu, aby DNA wirusa było dostępne do hybrydyzacji. W związku z tym protokół ten może być również skuteczny w wykrywaniu innych wirusów dsDNA, które obecnie nie są wykrywalne za pomocą konwencjonalnych metod DNA-FISH w tkankach zwierzęcych.

<table><tbody><tr><td>Myszy Balb/c</td><td>Janvier, Francja</td><td></td><td>6-tygodniowe samice</td></tr><tr><td>Szczepy HSV-1</td><td>Szczep SC16 (typ dziki)</td><td></td><td>Patrz Labetoule, M. et al. Invest. Oftalmol. Vis. Sci 44, 217&ndash; 225 (2003) w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat przygotowania szczepu HSV-1 i wirusa.</td></tr><tr><td>Chlorowodorek ketaminy</td><td>Sigma</td><td>K2753</td><td>Dootrzewnowe wstrzyknięcie roztworu zawierającego ketaminę (100 mg/kg) i ksylazynę (10 mg/kg)</td></tr> <tr><td>Chlorowodorek ksylazyny</td><td>Sigma</td><td>X1251</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td> <td>Sigma</td><td>158127</td><td>Zawiesić 4 g PFA w 90 ml wody. Dodaj 50 &mikro; l 1N NaOH i ogrzewać w temperaturze 60 & stopni; C w łaźni wodnej z mieszaniem. PFA rozpuszcza się w ciągu około 30 minut. Dodać 10 ml 10x PBS. Roztwór ten można przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać w temperaturze -20 & deg; C w probówkach o pojemności 5 ml. Ostrożność. Manipuluj pod wyciągiem.</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna</td><td>Sigma</td><td>07982-100TAB-F</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS, pH 7,4 (sterylna)</td><td>Life Technologies</td><td>10010-015</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma</td><td>84100</td><td>Przygotuj 20% roztwór sacharozy w 1x PBS.</td></tr><tr><td>Podłoże do zatapiania do kriosekcji - Tissue-Tek OCT Compound</td><td>SAKURA</td><td>4583</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania DNA z dużym wektorem</td><td>Qiagen</td><td>12462</td><td>Do oczyszczania wektora Cosmid lub BAC zawierającego genom HSV-1 i przechowywania w temperaturze -20 & stopni; C</td></tr><tr><td>Nick zestaw tłumaczeniowy</td><td>Roche Applied Sciences</td><td>10 976 776 001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cy3-dCTP</td><td>GE Healthcare</td><td>PA53021</td><td>Ochrona przed światłem</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>G50 Mini kolumna obrotowa</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5330-01</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DNA nasienia łososia 10 mg/ml</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>15632-011</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Etanol biologia molekularna klasa</td><td>Sigma</td><td>87047</td><td>Przygotuj 70% roztwór</td></tr><tr><td>DNA plemnika łososia</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>15632-011</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Formamid Biologia molekularna klasa</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td>Uwaga. Manipulować pod wyciągiem.</td></tr><tr><td>Biotynylowana sonda komercyjna HSV-1&nbsp;</td><td>Enzo Nauki Przyrodnicze</td><td>ENZ-40838</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Długopis hydrofobowy ImmEdge</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>20x Sól fizjologiczna Cytrynian Sodu (SSC)</td><td>Sigma</td><td>S6639</td><td>Przygotuj 2x roztwór SSC w ddH20.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Przygotować 10% roztwór podstawowy w wodzie i przechowywać w temperaturze +4 stopni Celsjusza. Przygotować 0,5% roztwór w 1x PBS bezpośrednio przed użyciem.</td></tr><tr><td>10 mM Cytrynian sodu pH 6,0</td><td>Sigma</td><td>S1804</td><td>Przygotować 100 mM roztwór podstawowy (10x). Odważyć 10,5 g kwasu cytrynowego (MW 210,14). Uwaga, drażniący i toksyczny, nosić odpowiednią maskę i rękawiczki) i rozpuścić w 400 ml wody. Dostosuj pH na 6,0 za pomocą 1 N NaOH (uwaga, drażniące, nosić rękawiczki). Dodać do 500 ml z wodą destylowaną. Przed użyciem rozcieńczyć 10x w wodzie destylowanej.</td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sigma</td><td>320099</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Metanol, klasa biologii molekularnej</td><td>Sigma</td><td>322415</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Siarczan dekstranu - MW 500,000</td><td>Euromedex</td><td>EU0606-A</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Rozwiązanie firmy Denhardt (100x)</td><td>Euromedex</td><td>1020-A</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cement kauczukowy "FixoGum"</td><td>Marabut</td><td>290110000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania DNA&nbsp; - Zestaw do oczyszczania Qiaquick PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw do transkrypcji T7 in vitro</td><td>Ambion Life Technologies</td><td>AM1314</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Biotin-16-UTP</td><td>Roche Nauki Stosowane</td><td>11388908910</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Minikolumna oczyszczania RNA</td><td>Qiagen</td><td>73404</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kompleks rybonukleozydów wanadylowych New</td><td>England Biolabs</td><td>S1402S</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma</td><td>H3410</td><td>Przygotować 3% roztwór w wodzie destylowanej. Przechowywać w temperaturze +4 & deg; C i chronić przed światłem.</td></tr><tr><td>Drożdże tRNA</td><td>Invitrogen</td><td>15401011</td><td>przygotować roztwór 10 mg/ml w wodzie wolnej od RNAzy</td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Invitrogen</td><td>PCN5000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Przeciwciała pierwszorzędowe</td><td>dowolny dostawca</td><td></td><td>W sekcji wyników zastosowano następujące przeciwciała pierwszorzędowe: anty-mysie CENP-A (mAb królika C51A7, Cell Signaling Technologies) i anty-ATRX H-300 (Santa Cruz Biotechnology)</td></tr> <tr><td>Przeciwciała drugorzędowe</td><td>Invitrogen Life Technologie</td><td></td><td>Fluorescencyjne przeciwciała drugorzędowe rutynowo stosowane w naszym protokole to przeciwciała kozie znakowane Alexa Fluor (IgG, H+L). Przeciwciało użyte w sekcji wyników to przeciwciało przeciwko kozi królikowi z powłoką Alexa Fluor 488 (odniesienie A11001)</td></tr> <tr><td>Zestaw do wzmacniania sygnału tyramidu (TSA) - Streptawidyna + Alexa Fluor 350 (niebieska fluorescencja)</td> <td>Invitrogen Life Technologies</td><td>#T20937</td><td>Zestawy TSA są również dostępne w zestawie Perkin Elmer</td></tr><tr><td>Tyramide Signal Amplification (TSA) - Streptawidyna + Alexa Fluor 488 (zielona fluorescencja)</td> <td>Invitrogen Life Technologies</td><td>#T20932</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>H3570</td><td>Przygotuj 0,5 i mikro; g/ml roztworu w 1x PBS bezpośrednio przed użyciem. Wyrzuć pozostały roztwór.</td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe 22 mm x 50 mm. n&deg; 1.5 szkło</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>72204-04</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Podłoże montażowe ze środkiem zapobiegającym blaknięciu - VECASHIELD</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>Innym konwencjonalnym produktem jest Fluoromount G firmy Electron Microscopy Science</td></tr><tr><td>Szkiełka szklane Superfrost</td><td>FisherScientific</td><td>12-550-15</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sprzęt/materiał</td><td>Nota referencyjna</td><td></td><td>firmy</td></tr><tr><td>Igła do infekcji</td><td></td><td></td><td>Szklana mikropipeta ciągniona na gorąco. Wykonane na zamówienie.</td></tr><tr><td>Sprzęt do preparacji</td><td>Moria, Francja</td><td></td><td>Nożyczki i kleszcze mikrochirurgiczne</td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>Cole Palmer Instruments</td><td></td><td>Easyload Masterflex</td></tr><tr><td>Pompa mikrostrzykawkowa (Nano Pump)</td><td>kdScientific</td><td>KDS310</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kriostat</td><td>Leica Francja</td><td>CM 1510-1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>-80 stopni Celsjusza; C zamrażarka</td><td>Sanyo</td><td></td><td>Ultra Low -80 &deg; C</td></tr><tr><td>Domowa kuchenka</td><td></td><td></td> mikrofalowa<td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Suchy blok grzewczy</td><td>Eppendorf</td><td>022670204</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Inkubator Fosa ślizgowa</td><td>Boekel Scientific</td><td>240000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Słoik z kopinem</td><td>Dominique Dutscher</td><td>68512</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Pojemnik na witraż</td><td>Dominique Dutscher</td><td>68506</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Obrazy przedstawione w sekcji wyników zostały zebrane za pomocą Zeiss AxioObserver z obiektywem 40X LD NeoFluor N.A 0.6 i 100X PlanApochromat N.A 1.3. Zestaw filtrów #38, #43 i #43. Fluorescencyjne źródło światła HXP 120. Fotometryczna kamera CCD CoolSNAP HQ2. Sygnał będzie łatwiej zaobserwowany na najnowszych mikroskopach o wysokiej wydajności, takich jak seria Zeiss AxioImager/AxioObserver, seria Nikon Ti-E/Ni-E lub seria Leica DM/DMI6000</td></tr></tbody></table>

wykrywanie genomu i transkryptów przetrwałego wirusa dna w tkankach neuronalnych za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ połączonej z barwieniem immunologicznym

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Kodetekcja pojedynczej komórki genu, jego produktu RNA i komórkowych białek regulatorowych jest kluczowa dla badania regulacji ekspresji genów. Jest to wyzwanie w dziedzinie wirusologii; w szczególności w odniesieniu do trwałych wirusów DNA replikujących się jądrowo, które wykorzystują do swoich badań modele zwierzęce. Wirus opryszczki pospolitej typu 1 (HSV-1) powoduje trwającą całe życie utajoną infekcję w neuronach obwodowych. Utajony wirus służy jako rezerwuar, z którego reaktywuje się i indukuje nowy epizod opryszczkowy. Biologia komórki związana z latencją HSV-1 pozostaje słabo poznana, częściowo z powodu braku metod wykrywania genomów HSV-1 in situ w modelach zwierzęcych. Opisujemy podejście do hybrydyzacji DNA i fluorescencji in situ (FISH), skutecznie wykrywające genomy wirusowe o niskiej liczbie kopii w sekcjach tkanek neuronalnych z zakażonych modeli zwierzęcych. Metoda opiera się na demaskowaniu antygenu na bazie ciepła i bezpośrednio znakowanych sondach DNA domowej roboty lub sondach dostępnych na rynku. Opracowaliśmy podejście do potrójnego barwienia, łącząc DNA-FISH z RNA-FISH i immunofluorescencją, wykorzystując wzmocnienie sygnału oparte na peroksydazie, aby spełnić każde wymaganie barwienia. Dużym ulepszeniem jest możliwość uzyskania, w obrębie skrawków tkanek o wielkości 10 μm, sygnałów o niskim tle, które można zobrazować w wysokiej rozdzielczości za pomocą mikroskopii konfokalnej i konwencjonalnej epifluorescencji szerokokątnej. Dodatkowo, potrójne barwienie działało z szerokim zakresem przeciwciał skierowanych przeciwko białkom komórkowym i wirusowym. Pełny protokół trwa 2,5 dnia, aby dostosować się do penetracji przeciwciał i sondy w tkance.

Po kilku miesiącach intensywnych testów odkryliśmy, że chemiczne odsłanianie oparte na obróbce termicznej udostępniło utajony genom HSV-1 do fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ. W trakcie tego procesu przetestowaliśmy różne procedury odsłaniania i tylko zabiegi termiczne (t.j. podgrzewanie skrawków do temperatury poniżej wrzenia w kuchence mikrofalowej) okazały się wydajne. Następnie przetestowaliśmy kilka buforów solnych rutynowo stosowanych w immunohistochemii (IHC) i mikroskopii elektronowej w celu...

Ustaliliśmy protokół fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ do wykrywania trwałego genomu wirusa DNA w sekcjach tkanek modeli zwierzęcych. Protokół ten umożliwia badanie procesu infekcji poprzez kodetekcję genomu wirusa, jego produktów RNA oraz białek wirusowych lub komórkowych w obrębie pojedynczych komórek.

Wykrywanie genomu i transkryptów przetrwałego wirusa DNA w tkankach neuronalnych za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ połączonej z barwieniem immunologicznym

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykrycie genomu wirusa prostego opryszczki typu 1 w przekrojach zwojów trójdzielnych myszy zakażonych w sposób utajniony, przy użyciu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ. Procedurę tę realizuje się poprzez najpierw inokulację wirusa w wargę zwierzęcia, a następnie 28-dniowy okres inkubacji, podczas którego wirus kolonizuje zwoje trójdzielne. Następnie zwoje trójdzielne są pobierane, zatapiane i poddawane kriosekcjonowaniu.Przekroje poddawane są kilku zabiegom przygotowawczym, w tym kluczowemu etapowi ogrzewania w buforze cytrynianu sodu. Następnie przeprowadza się fluorescencyjną hybrydyzację in situ, wykorzystując specyficzne dla herpeswirusów sondy fluorescencyjne. Ostatecznie, dzięki zastosowaniu mikroskopii konfokalnej, wyniki mogą ukazać lokalizację genomu wirusa wewnątrz jądra poszczególnych zainfekowanych neuronów.W wielu przypadkach badanie różnych cykli życiowych wymaga zastosowania modeli zwierzęcych. Główną zaletą prezentowanej tutaj techniki jest dostarczanie danych na poziomie pojedynczych komórek z wykorzystaniem podejścia do intuicyjnej fluentyzacji. Króliczy model zakażeń HS odtwarza większość aspektów naturalnego przebiegu zakażenia HSV 1 u ludzi.Jest to naturalny gospodarz wirusa. Pierwotna infekcja powstaje w tkankach jamy ustnej, a następnie wirus przemieszcza się z warg do zwojów trójdzielnych. Jest to główne miejsce latencji HSV u ludzi. Połączono immunocytochemię i barwienie.Ta metoda może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące latencji wirusa opryszczki, takie jak sposób interakcji wirusa z komponentami jądra komórkowego oraz wpływ tych interakcji na utrzymanie latencji i ostatecznie na reaktywację wirusa. Na początek należy przygotować znieczuplą mysz oraz roztwór zapasowy wirusa HSV 1, resuspendowany w medium bez czerwieni fenolowej.Używając stereomikroskopu dwukierunkowego, wprowadź igłę w warstwę podnabłonkową lewej górnej wargi na granicy błony śluzowej i skóry. Wstrzyknij 0,5 µL roztworu wirusa w ciągu pięciu sekund, a następnie wykonaj drugą iniekcję wirusa w tym samym miejscu. Przenieś mysz do inkubatora lub na matę grzewczą o temperaturze 37 °C aż do momentu wybudzenia.Następnie umieść zwierzę w jego klatce macierzystej na wymagany czas rekonwalescencji przed utrwaleniem perfuzyjnym zgodnie z protokołem tekstowym. Wykonaj nacięcia po każdej stronie żuchwy. Następnie odetnij czubek nosa tuż za siekaczami, aby odsłonić jamę nosową.Przeciąć podniebienie nożyczkami na pół, a następnie odsunąć je na bok. Zwoje nerwu trójdzielnego znajdują się pod podniebieniem. Są to białe, wydłużone masy o długości od dwóch do trzech milimetrów, połączone z nerwem trójdzielnym.Przetnij gałęzie nerwu trójdzielnego po obu stronach zwojów, aby uwolnić je z pnia mózgu. Za pomocą pęsety chirurgicznej wyjmij zwoje i przenieś je do 20%Sucrose w PBS, pozostawiając je do inkubacji na 24 godziny. Następnego dnia, w temperaturze pokojowej, zamknij oba zwoje trójdzielne w jednym bloku do kriosekcjonowania.W medium do zatapiania zamrozić blok w temperaturze -80 °C do momentu wykonania serii skrawków w kriostacie. Zwoje trójdzielne przeciąć wzdłuż na skrawki o grubości 10 µm i zebrać je na szkiełkach SuperFrost rozgrzanych do 30 °C. Na jednym szkiełku można umieścić od czterech do pięciu skrawków.Przydatne może być nadanie preparatowi wielu etykiet serii. Jeśli planowane są kolejne etapy analizy, należy pozostawić skrawki do wyschnięcia na okres od 5 do 10 minut przed ich przechowywaniem w temperaturze -80 °C. W ramach niniejszego protokołu sonda jest przygotowywana poprzez znakowanie cosmidów zawierających fragmenty genomu HSV-1 o długości 30 kb za pomocą SI 3D CTP poprzez translację NIC.Zostaje ono wytrącone i zawieszone w formamidzie dejonizowanym i w pierwszym dniu powinno mieć różowy kolor ze względu na wbudowanie S SI three. Należy umieścić szkiełka na uchwycie w temperaturze pokojowej i pozostawić przekroje do wyschnięcia na 10 minut. Następnie należy rehydratować przekroje w 1x PBS przez 10 minut.Następnie przeprowadź permeabilizację tkanki w 0,5% Triton X 100 w 1x PBS przez 20 minut. Potem wypłucz preparaty trzy razy po 10 minut każdym myciem w 2x SSC i przechowuj je w 2x SSC do czasu podgrzania buforu do odsłaniania epitopów. W celu odsłaniania epitopów podgrzej bufor cytrynianowy w kuchence mikrofalowej, aż do zagotowania.W tym celu należy napełnić tackę na szkiełka przedmiotowe 200 mililitrami buforu. Tackę umieszcza się w większym naczyniu wypełnionym 500 mililitrami wody destylowanej i podgrzewa bufor do momentu wrzenia. Następnie należy przenieść szkiełka do tacki.Upewnij się, że szkiełka są całkowicie przykryte buforem w kuchence mikrofalowej. Podgrzewaj szkiełka w buforze przez około 20 sekund, aż bufor zawrze. Nie dopuść do wykipienia buforu.Następnie schłodzić preparaty w temperaturze pokojowej przez dwie minuty i powtórzyć cykl grzania jeszcze sześć razy. W celu zapewnienia powtarzalności etapu odsłaniania epitopów kluczowe jest empiryczne określenie liczby oraz czasu trwania cykli grzania. Wpływają na to: kuchenka mikrofalowa, taca, pojemnik oraz objętość buforu w tacy.Objętość wody w pojemniku powinna pozostać taka sama po zakończeniu ogrzewania. Przenieś preparaty do dwóch XSSC na pięć minut pod wyciągiem, a następnie inkubuj preparaty w roztworze metanolu, kwasu octowego i PBS w proporcji 3:1:4 przez 15 minut. Następnie inkubuj preparaty w świeżo przygotowanej mieszaninie metanolu i kwasu octowego w proporcji 3:1 przez 15 minut.Następnie odwodnij skrawki poprzez następujące po sobie 10-minutowe inkubacje w 70% etanolu, a następnie dwie 10-minutowe inkubacje w czystym etanolu. Pozostaw preparaty do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby przygotować je do aplikacji sondy. Nanieś kroplowo 80 µL roztworu sondy na wysuszone skrawki i przykryj je szkiełkiem podstawowym.Należy sprawdzić, czy roztwór sondy rozprowadził się po całej powierzchni szkiełka nakrywkowe i czy nie pojawiły się pęcherzyki powietrza. Następnie należy uszczelnić szkiełko nakrywkowe cementem gumowym i pozostawić do wyschnięcia. Następnie należy przeprowadzić denaturację, inkubując preparaty w temperaturze 80 °C przez pięć minut.Następnie szybko przenieś preparaty na metalną tacę umieszczoną na lodzie na pięć minut. Po tym wykonaj hybrydyzację nocną w temperaturze 37°C w następnym dniu. Usuń klej gumowy za pomocą pęsety, trzymając preparaty na bloku grzewczym o temperaturze 37°C.Ostrożnie usuń szkiełko nakrywkowe za pomocą ostrza skalpela. Następnie wielokrotnie przemyj skrawki roztworem SSC. Teraz barw próbki przez 10 minut odpowiednim barwnikiem, takim jak DAPI lub HOECHST 33342 w stężeniu 0,5 µg/mL w 1xPBS.Następnie przemyj preparaty trzykrotnie w roztworze XPBS, przez 10 minut podczas każdego mycia. Po trzecim płukaniu odlej z preparatu jak największą ilość cieczy. Na koniec, na każdą lamkę nanieś 80 µL medium montażowego z substancją zapobiegającą blaknięciu.Powoli przykryj medium szkiełkiem nakrywkowym o wysokiej jakości optycznej, unikając powstawania pęcherzyków powietrza. Następnie zalakuj preparat lakierem do paznokci i przechowuj w ciemności w temperaturze four degrees Celsius. Podczas opracowywania tego protokołu przetestowano kilka buforów solnych do odsłaniania epitopów.Podczas gdy bufory EDTA miały tendencję do uszkadzania tkanki, tris cytrynian sodu, HCl i woda destylowana były odpowiednie do detekcji HSV 1 w celu weryfikacji, czy protokół będzie działać z komercyjnymi sondami. Detekcję latentnego genomu HSV 1 przeprowadzono przy użyciu biotynilowanej sondy PAN HSV 1 otrzymanej z Enzo Biochem; wykryto zarówno pojedyncze, jak i wielokrotne wzorce punktowe dla genomu HSV 1.Ponadto protokół DNA FISH przetestowano na myszach i królikach zakażonych trzema powszechnie stosowanymi szczepami HSV-1. We wszystkich przypadkach genomy HSV-1 wykazały sygnał w postaci plamek o zmiennej jasności i intensywności. Dodatkowo zastosowanie protokołu sprawdzono w cyklu replikacyjnym HSV-1, przeprowadzając badanie DNA FISH na tkankach myszy przechodzących ogólnoustrojową infekcję wirusem opryszczki.W tych zwierzętach w różnych tkankach, w tym w zwojach rdzeniowych (DRG), oczach i mózgu, wykryto duże i jasne agregaty genomów HSV 1. Protokół DNA FISH jest bardzo wszechstronny. Umożliwia on jednoczesne wykrywanie genomu HSV 1 oraz wirusowych lub komórkowych RNA i białek.Na przykład, możliwe jest jednoczesne wykrywanie genomu HSV-1 wraz z lat RNA HSV-1; wykorzystano również jednoczesne wykrywanie genomu HSV-1 wraz z białkami komórkowymi, takimi jak białko centromeryczne CENP-A, a także jednoczesne wykrywanie HSV-1 wraz z chromatyną i jądrowymi ciałkami PML. Białko stowarzyszone ATRX zwizualizowano za pomocą potrójnego barwienia, w którym HSV-1 DNA zaznaczono kolorem czerwonym, jego produkt RNA lat kolorem niebieskim, a ATRX kolorem zielonym.Po zorganizowaniu procesu odmaskowania, procedura DNA FISH jest bardzo odporna na błędy. Można ją przeprowadzić w czasie krótszym niż 24 godziny, przetwarzając serie po 20 lub więcej szkiełek. Opracowanie tej techniki pozwoli badaczom zajmującym się wirusami opryszczki oraz innymi wirusami uporczywymi na zbadanie na poziomie pojedynczych komórek, w jaki sposób komponenty komórkowe i architektura jądra mogą wpływać na biologię tych wirusów.

detection-genome-transcripts-persistent-dna-virus-neuronal-tissues

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Wykrywanie genomu i transkryptów trwałego wirusa DNA w tkankach neuronowych za pomocą fluorescencyjnej in situ hybrydyzacji łączonej z immunobarwieniem

Technika łącząca barwienie tetramerami in situ i hybrydyzację in situ (ISTH) umożliwia wizualizację, mapowanie i analizę bliskości przestrzennej wirusowo-specyficznych limfocytów T CD8+ względem zainfekowanych wirusem komórek docelowych oraz określenie ilościowych zależności między tymi efektorami odpornościowymi a celami w kontekście wyników infekcji.

Technika jednoczesnej wizualizacji wirusowo-specyficznych limfocytów T CD8+ i komórek zainfekowanych wirusem in situ

Opracowano metodę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w celu wizualnej detekcji wirusowego RNA genomowego przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Przygotowano sondę specyficzną dla wirusowego RNA, która może być następnie identyfikowana za pomocą kombinacji technik hybrydyzacji i immunofluorescencji. Technika ta daje możliwość określenia lokalizacji wirusowego RNA lub DNA w stanie stacjonarnym, dostarczając informacji o kontroli procesów wewnątrzkomórkowego transportu wirusa.

Wykrywanie wirusowego RNA za pomocą hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ (FISH)

W tym filmie, komórki zainfekowane wirionami MCPyV zostały poddane reakcji łańcuchowej hybrydyzacji in situ w celu wykrycia specyficznych genomów MCPyV. Co więcej, technikę DNA-HCR połączono z FISH w celu wizualizacji DNA MCPyV w zakażonych ludzkich komórkach skóry.

HCR-DNA FISH: Technika fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ do wykrywania wirusowego DNA w zakażonych komórkach

Ten film demonstruje metodę monitorowania zakażonego białka komórkowego 0, ICP0 w zakażeniu wirusem opryszczki pospolitej-1. Po syntezie de novo ICP0 przemieszcza się do jądra, a następnie przemieszcza się do cytoplazmy podczas progresji infekcji. Mikroskopia immunofluorescencyjna ujawnia i analizuje subkomórkową lokalizację białka, oferując wgląd w jego transport w różnych fazach infekcji.

Technika immunofluorescencji lokalizacji białek wirusowych w zakażonych komórkach

Źródło: Baleriola, J.,  et. al., Wykrywanie aksonalnie zlokalizowanych mRNA w sekcjach mózgu przy użyciu hybrydyzacji in situ o wysokiej rozdzielczości.  J. Vis. Exp. (2015)Ten film demonstruje wykrywanie mRNA w aksonach cholinergicznych w utrwalonych mysich wycinkach hipokampa przy użyciu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ i barwienia przeciwciałami. Mikroskopia fluorescencyjna ujawnia przestrzenną lokalizację znakowanych sondą mRNA i acetylotransferazy choliny w neuronach cholinergicznych.

Barwienie immunologiczne neuronów w wycinkach mózgu myszy po fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ

Lokalizacja ekspresji genów w określonych typach komórek może być trudna ze względu na brak specyficznych przeciwciał. W tym miejscu opisujemy protokół jednoczesnego potrójnego wykrywania ekspresji genów poprzez połączenie hybrydyzacji in situ RNA z podwójną fluorescencją z barwieniem immunologicznym.

Połączenie podwójnej fluorescencji hybrydyzacji in situ z immunoznakowaniem w celu wykrycia ekspresji trzech genów w wycinkach mózgu myszy

Fabryki transkrypcji wirusa to odrębne struktury, które są wzbogacone o komórkową polimerazę RNA II w celu zwiększenia transkrypcji genów wirusa podczas reaktywacji. W tym miejscu opisano metodę lokalizacji miejsc aktywnej transkrypcji chromatyny wirusowej w przestrzeni jądrowej 3D poprzez połączenie barwienia immunofluorescencyjnego i hybrydyzacji RNA in situ.

Obrazowanie funkcjonalne fabryk transkrypcji wirusów przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej 3D

Opisujemy protokół wykorzystujący fluorescencyjną hybrydyzację in situ (FISH) do wizualizacji wielu herpeswirusowych RNA w litycznych infekowanych komórkach ludzkich, zarówno w zawiesinie, jak i w adherentach. Protokół ten obejmuje kwantyfikację fluorescencji wytwarzającą stosunek nukleocytoplazmatyczny i może być rozszerzony o jednoczesną wizualizację białek gospodarza i wirusa za pomocą immunofluorescencji (IF).

Ilościowa fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) i immunofluorescencja (IF) specyficznych produktów genowych w komórkach zakażonych KSHV

Ten protokół opisuje metodę łączenia fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) i immunohistochemii fluorescencji (IHC) zarówno w świeżo mrożonych, jak i stałych sekcjach mózgu myszy, w celu uzyskania wieloznakowego sygnału FISH i fluorescencji IHC. IHC celował w białka cytoplazmatyczne i przyłączone do błony.

Połączenie hybrydyzacji fluorescencji in situ multipleksowej z immunohistochemią fluorescencyjną na świeżo zamrożonych lub utrwalonych wycinkach mózgu myszy

Prezentowany tutaj jest protokół dla metody obrazowania fluorescencyjnego, multiplex immunofluorescencyjna metodawykrywania DNA, RNA i proteiny (MICDDRP), metoda zdolna do jednoczesnej fluorescencyjnej wizualizacji pojedynczych komórek białka wirusowego i kwasów nukleinowych o różnym typie i nici. Takie podejście można zastosować do różnych systemów.

Obrazowanie fluorescencyjne z multipleksem pojedynczych komórek w celu wizualizacji wirusowych kwasów nukleinowych i białek oraz monitorowania zakażeń HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika i grypy

Poznaj metodę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ do wykrywania genomu wirusa HSV-1 w tkankach neuronalnych myszy. Technika ta umożliwia wizualizację genomu wirusowego w jądrach pojedynczych neuronów.

Wykrywanie genomu i transkryptów przetrwałego wirusa DNA w tkankach neuronalnych za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ połączonej z barwieniem immunologicznym (Wideo) | JoVE Journal

Wykrywanie genomu i transkryptów przetrwałego wirusa DNA w tkankach neuronalnych za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ połączonej z barwieniem immunologicznym

Przeglądaj więcej filmów