Name: Obrazowanie fluorescencyjne z multipleksem pojedynczych komórek w celu wizualizacji wirusowych kwasów nukleinowych i białek oraz monitorowania zakażeń HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika i grypy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Poznaj metodę wielokanałowego obrazowania immunofluorescencyjnego pojedynczych komórek do jednoczesnej wizualizacji DNA, RNA i białek wirusowych. Technika umożliwia śledzenie infekcji HIV, HBV, HCV i Zika z wysoką specyficznością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana w całości lub w części przez National Institutes of Health (R01 AI121315, R01 AI146017, R01 AI148382, R01 AI120860, R37 AI076119 i U54 AI150472). Dziękujemy dr Raymondowi F. Schinazi i Sadie Amichai za dostarczenie komórek zakażonych wirusem grypy typu A.

1. Komórki nasienne (Zawiesina vs. Komórki przylegające) na szkiełkach nakrywkowych lub szkiełkach komorowych (przedstawiony protokół używa szkiełek nakrywkowych).
<ol>
	<li>Wysiew komórek zawiesinowych
	<ol>
		<li>Przygotować szkiełka nakrywkowe pokryte poli-D-lizyną (PDL) (ułatwia przyleganie komórek zawiesiny do szkiełka nakrywkowego) poprzez uprzednią inkubację szkiełek nakrywkowych w etanolu (EtOH) przez 5 minut (sterylizuje szkiełka nakrywkowe i usuwa wszelkie pozostałości). Następnie przemyć 2x w buforze fosforanowym (PBS) przed inkubacją szkiełek nakrywkowych w PDL (20 μg/ml) przez 30 minut (min) w temperaturze pokojowej (RT).</li>
		<li>Usuń PDL i umyj 2x w PBS. Komórki osadkowe (wcześniej zakażone/leczone w oparciu o pożądane warunki obrazowania) i ponownie zawiesić 106komórek w 50 μl PBS. Umieścić 50 μl komórek na szkle (pokrytym PDL) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysiew komórek przylegających
	<ol>
		<li>Hoduj komórki na sterylnym szkiełku nakrywkowym umieszczonym w 6-dołkowym naczyniu i infekuj komórki cząstkami wirusa lub traktuj interesującym ich związkiem. Pozwól komórkom osiągnąć 50-70% zbieżności przed przygotowaniem próbki do eksperymentów obrazowych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Utrwalenie komórkowe: Aby zachować morfologię komórkową do badań obrazowania fluorescencyjnego
UWAGA: Utrzymuj 4% PFA i PBS w temperaturze RT przez co najmniej 30 minut przed utrwaleniem komórkowym.
<ol>
	<li>Odessać pożywkę komórkową, przemyć komórki na szkiełkach nakrywkowych 3x w PBS i utrwalić komórki w 4% paraformaldehydzie (PFA) przez 30 min. Odessać PFA i przepłukać komórki w PBS 2x. 
	UWAGA: Komórki mogą być teraz odwodnione i przechowywane, jeśli eksperymentator chce wznowić eksperyment w innym terminie. Utrwalone komórki można odwodnić w EtOH przed przechowywaniem.
	<ol>
		<li>Usuń PBS po umyciu po utrwaleniu komórkowym i zastąp 500 μl 50% EtOH (v/v w wodzie). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
		<li>Usuń 50% EtOH i zastąp 500 μl 70% EtOH. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
		<li>Usuń 70% EtOH i zastąp 500 μl 100% EtOH. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
		<li>Usuń 100% EtOH i zastąp świeżym 100% EtOH. 
		UWAGA: Odwodnione komórki można przechowywać w temperaturze -20 °C przez 6 miesięcy. Przed przechowywaniem uszczelnij płytki taśmą lub parafilmem, aby zapobiec parowaniu EtOH.</li>
		<li>Uwodnić komórki, aby przejść do multipleksowanego znakowania fluorescencyjnego komórek/wirusa.</li>
		<li>Usuń 100% EtOH i zastąp 500 μl 70% EtOH. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 min. 
		UWAGA: W żadnym momencie nie pozwól, aby komórki wyschły. Zawsze używaj wystarczającej ilości roztworu, aby zanurzyć wszystkie komórki.</li>
		<li>Usuń 70% EtOH i zastąp 500 μl 50% EtOH. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.</li>
		<li>Usuń 50% EtOH i zastąp 1x PBS. 
		UWAGA: Przygotuj rozcieńczenie proteazy, sondy hybrydyzacyjne i bufor do płukania przed leczeniem proteazą (Krok 4) i aplikacją sondy docelowej (Krok 5). Szczegółowe instrukcje dotyczące przygotowania odczynnika znajdują się na początku każdego odpowiedniego kroku.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Odczynniki</td>
			<td>Inne notatki</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór proteazy</td>
			<td>Przygotuj w 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Docelowa sonda(-y) oligonukletodyjna(e)</td>
			<td>Rozcieńczyć w buforze hybrydyzacyjnym</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor do płukania</td>
			<td>Myje się zgodnie z docelowymi etapami hybrydyzacji</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor hybrydyzacyjny</td>
			<td>Receptura przedstawiona w tabeli 3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Kluczowe odczynniki w protokole MICDDRP.
3. Przepuszczalność komórek: Zwiększa dostęp do komórki i organelli komórkowych dla wejścia dużych cząsteczek (przeciwciała, sondy hybrydyzacji kwasów nukleinowych)
<ol>
	<li>Usuń 1x PBS po utrwaleniu komórkowym lub ponownym nawodnieniu i zastąp 500 μl 0,1% (v/v) Tween-20 w 1x PBS. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Wymień jeden po drugim. Umyj raz 500 μl 1x PBS i dodaj świeży 1x PBS.</li>
</ol>
4. Unieruchomienie szkiełka nakrywkowego na szkiełku podstawowym i leczenie proteazą w celu usunięcia białek wiążących kwasy nukleinowe z utrwalonego wirusowego/komórkowego kwasu nukleinowego w celu poprawy efektywności hybrydyzacji
UWAGA: Przygotuj rozcieńczony roztwór Proteazy III (zobacz szczegóły odczynnika w Tabeli Materiałów) podczas przepuszczalności komórkowej. Pozwól proteazie dotrzeć do RT przez 10 minut przed przepuszczalnością.
<ol>
	<li>Umieść małą kroplę lakieru do paznokci na wysterylizowanym szkiełku podstawowym. Wysusz z powrotem (strona bez warstwy komórek) i umieść krawędź szkiełka nakrywkowego na kropli lakieru do paznokci, stroną z przylegającymi komórkami do góry. Dodaj kilka kropli PBS na unieruchomione szkiełko nakrywkowe, aby zapobiec wysuszeniu.
	<ol>
		<li>Narysuj okrąg (około 3 mm od szkiełka nakrywkowego) wokół obwodu szkiełka nakrywkowego, teraz przyklejonego do szkiełka, za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego (wodoodpornego pisaka, który utrzymuje odczynniki zlokalizowane na komórkach).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozcieńczyć proteazę III w 1x PBS (100 μl / szkiełko nakrywkowe). 
	UWAGA: Stężenie proteazy może wymagać dostosowania w zależności od różnic w typach komórek, sondach lub docelowych kwasach nukleinowych poprzez optymalizację empiryczną (patrz dyskusja). Aby uzyskać najbardziej efektywne znakowanie RNA / DNA w różnych systemach wirusowych, odnieśliśmy sukces z następującymi rozcieńczeniami przedstawionymi w tabeli 2 poniżej z rozcieńczeniami w zakresie od (1 do 2)-(1 do 15) (proteaza do 1x PBS).</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cele sondy</td>
			<td>Rozcieńczenie proteazy w 1X PBS (proteaza III do 1X PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA/RNA wirusa HIV-1</td>
			<td>od 1 do 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTLV-1 DNA/RNA</td>
			<td>od 1 do 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wirus HBV pgRNA i całkowity RNA HBV</td>
			<td>od 1 do 15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Życiodajne RNA (IAV)</td>
			<td>od 1 do 15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA ZIKV</td>
			<td>Od 1 do 2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Rozcieńczenia proteazy III w PBS do hybrydyzacji wirusowych kwasów nukleinowych.
<ol start="3">
	<li>Zdekantować 1x PBS na szkiełko nakrywkowe po unieruchomieniu i nałożyć rozcieńczoną Proteazę III.</li>
	<li>Inkubować w wilgotnym piecu w temperaturze 40 °C przez 15 minut.</li>
	<li>Zdekantuj roztwór proteazy i zanurz szkiełka w 1x PBS. Mieszać naczyniem kołyszącym przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Powtórzyć mycie nowym 1x PBS.
	<ol>
		<li>Tylko w przypadku wykrywania DNA należy przemyć próbki trzykrotnie wodą wolną od nukleaz przez 2 minuty każda, a następnie inkubować z 5 mg/ml RNazy A rozcieńczonej w PBS przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Zdekantować roztwór RNazy A i przemyć 3x przez 2 minuty ultraczystą wodą. Kontynuuj z ISH sondy (sond) docelowej. 
		UWAGA: Bufor hybrydyzacyjny poprawia wykrywanie vDNA bez wpływu na wydajność barwienia vRNA dla prezentowanych wyników (wyniki reprezentatywne). Rozcieńczone sondy kanału DNA 1 (C1) 1:1 z sondą hybrydyzacyjną. Rozcieńczyć sondy RNA C2 i C3 w buforze hybrydyzacyjnym. Sondy C2 i C3 używane w naszych badaniach obrazowych są w roztworach 50X (1:50; sonda docelowa do bufora hybrydyzacyjnego).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj bufor hybrydyzacyjny w wodzie wolnej od nukleaz, postępując zgodnie z poniższą procedurą krok po kroku:
	<ol>
		<li>W probówce o pojemności 15 ml dodaj 700 μl wody wolnej od nukleaz, 300 μl 50% (wagowo-objętościowo (w/v)) siarczanu dekstranu, 300 μl 5 M NaCl, 125 μl 200 mM cytrynianu sodu (pH 6,2) i 375 mg (proszek) węglanu etylenu.</li>
		<li>Dobrze wymieszaj za pomocą wiru do rozpuszczenia węglanu etylenu (upewnij się, że cały proszek jest rozpuszczony i klarowny roztwór).</li>
		<li>Dodaj 25 μl 10% (objętość/objętość (v/v)) Tween-20 i tyle wody wolnej od nukleaz, aby uzupełnić 2,5 ml (2x roztwór). 
		UWAGA: Przedstawiona receptura buforu hybrydyzacyjnego znajduje się w tabeli 3 poniżej. Roztwór jest stabilny przez tydzień. Upewnij się, że detergent Tween-20 jest odpowiednio wymieszany, uważając, aby zapobiec bulgotaniu roztworu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>Koncentracja zapasów</td>
			<td>Dodatkowe uwagi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woda wolna od nukleaz</td>
			<td>nie</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siarczan dekstranu</td>
			<td>50% (w/v)</td>
			<td>Bardzo lepki</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chlorek sodu</td>
			<td>5 mln</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytrynian sodu (pH 6,2)</td>
			<td>200 mM</td>
			<td>Przechowywać w temperaturze 4 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Węglan etylenu</td>
			<td>nie</td>
			<td>proszek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20 (Kanał Telewizyjny)</td>
			<td>10% (v/v)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Lista odczynników bufora hybrydyzacji.
5. Inkubacja za pomocą sond do hybrydyzacji DNA/RNA: Docelowe sondy oligonukleotydowe wiążą się z regionem (regionami) zainteresowania, tworząc molekularne rusztowanie dla przedwzmacniaczy, wzmacniaczy i sond fluorescencyjnych.
UWAGA: Ogrzewaj sondy DNA/RNA w temperaturze 40 °C przez 10 minut (podczas Permeabilizacji Komórek) i schładzaj do RT przez co najmniej 10 minut, jeśli nie zastosowano leczenia RNazą. Jeśli przed hybrydyzacją sondy docelowej konieczne jest traktowanie RNazą lub dalsza obróbka próbki, należy odpowiednio rozgrzać sondy. Po podgrzaniu odkręcić sondy C2 i C3 i rozcieńczyć w buforze hybrydyzacyjnym. Po rozcieńczeniu sondy C2 i C3 można krótko podgrzać. Ciepły 50x bufor do płukania (więcej szczegółów w Tabeli Materiałów) w temperaturze 40 °C przez 10-20 minut i rozcieńczyć do 1x w wodzie klasy biologii molekularnej.
<ol>
	<li>Inkubować 200 μl buforu do hybrydyzacji w temperaturze 67 °C przez 10 minut przed dodaniem sondy(-ek) hybrydyzacyjnej(-ych). Rozcieńczyć sondę w buforze hybrydyzacyjnym (receptura wymieniona w tabeli 2). Dodać 50 μl/szkiełko nakrywkowe.</li>
	<li>Inkubować w nawilżonym piecu w temperaturze 40 °C przez 2 godziny (h). Sondy dekantacyjne i szkiełka zanurzeniowe w 1x buforze myjącym. Mieszać, kołysząc naczynie przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Powtórz mycie nowym 1x buforem do mycia.</li>
</ol>
6. Wzmacniacz (Amp) Hybrydyzacja 1-FL: Dodanie przedwzmacniacza, który jest komplementarny do sekwencji ogonowej docelowych sond DNA/RNA (Krok 5)
UWAGA: Wzmacniacze powinny być ustawione na RT przed użyciem. Wyjmij każdy wzmacniacz z lodówki na 30 minut przed użyciem i pozostaw na stole w RT.
<ol>
	<li>Wyjmij szkiełka z 1x bufora do mycia i dotknij/wchłoń, aby usunąć nadmiar płynu.</li>
	<li>Dodać 1 kroplę Amp 1-FL na szkiełko nakrywkowe. Inkubować w wilgotnym piecu w temperaturze 40 °C przez 30 min.</li>
	<li>Zdekantuj Amp 1-FL i zanurz w 1x buforze do mycia. Mieszać, kołysząc naczynie przez 2 minuty w temperaturze RT. Powtórz mycie z nowym buforem do mycia 1x.</li>
</ol>
7. Hybrydyzacja Amp 2-FL: Inkubacja ze wzmacniaczem sygnału z pokrewną sekwencją rozpoznawania do przedwzmacniaczy (Amp 1-FL)
<ol>
	<li>Wyjmij szkiełka z 1x bufora do mycia i dotknij/wchłoń, aby usunąć nadmiar płynu.</li>
	<li>Dodaj 1 kroplę Amp 2-FL na szkiełko nakrywkowe. Inkubować w nawilżonym piecu w temperaturze 40 °C przez 15 minut.</li>
	<li>Zdekantuj Amp 2-FL i zanurz w 1x buforze do mycia. Mieszać, kołysząc naczynie przez 2 minuty w temperaturze RT. Powtórz mycie z nowym buforem do mycia 1x.</li>
</ol>
8. Hybrydyzacja Amp 3-FL: Inkubacja z drugim wzmacniaczem sygnału
<ol>
	<li>Wyjmij szkiełka z 1x bufora do mycia i dotknij/wchłoń, aby usunąć nadmiar płynu.</li>
	<li>Dodaj 1 kroplę Amp 3-FL na szkiełko nakrywkowe. Inkubować w wilgotnym piecu w temperaturze 40 °C przez 30 min.</li>
	<li>Zdekantuj Amp 3-FL i zanurz w 1x buforze do mycia. Mieszać, kołysząc naczynie przez 2 minuty w temperaturze RT. Powtórz mycie z nowym buforem do mycia 1x.</li>
</ol>
9. Hybrydyzacja Amp 4-FL: Etykieta fluorescencyjna i końcowy etap hybrydyzacji
UWAGA: Po pierwsze, zobacz Tabelę 4, aby wybrać odpowiedni Amp 4 (A,B lub C)- FL w oparciu o kanały sondy docelowej. Oceń, jaki Amp 4-FL jest potrzebny do znakowania interesującego DNA/RNA. Przykład znajduje się w poniższej tabeli:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>ZA</td>
			<td>W</td>
			<td>Z</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanał DNA 1 (C1)</td>
			<td>Z numerem 488</td>
			<td>550</td> szt.
			<td>550</td> szt.
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanał 2 DNA/RNA (C2)</td>
			<td>550</td> szt.
			<td>Z numerem 488</td>
			<td>647</td> TGLI
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanał RNA 3 (C3)</td>
			<td>647</td> TGLI
			<td>647</td> TGLI
			<td>Z numerem 488</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 4: Wybór sondy fluorescencyjnej Amp 4 (A, B lub C)-FL dla multipleksowanego ISH.
UWAGA: Dla multipleksowanych RYB (wiele celów), wybór właściwego Amp 4 (A, B lub C)- FL jest krytyczny dla prawidłowego oznaczenia celu (celów). Sondy docelowe (krok 5) mają różne kanały kolorów (C1, C2 lub C3), które dyktują odpowiednią etykietę fluorescencyjną (Alexa 488, Atto 550 lub Alexa 647), w oparciu o wybrany Amp 4-FL. Przykłady wyboru kombinacji fluoroforów do obrazowania multipleksowego znajdują się w legendach Rysunek 2 i <silna klasa="xfig">Rysunek 3. Jako dodatkowy przykład, wybór Amp 4B-FL spowoduje selektywne znakowanie sond DNA C1 za pomocą Atto 550 i sond RNA C3 za pomocą Alexa 647.
<ol>
	<li>Wyjmij szkiełka z 1x bufora do mycia i dotknij/wchłoń, aby usunąć nadmiar płynu.</li>
	<li>Dodać 1 kroplę Amp 4-FL na szkiełko nakrywkowe. Inkubować w wilgotnym piecu w temperaturze 40 °C przez 15 min. 
	UWAGA: Postępując zgodnie z krokiem 9.2, trzymaj próbki pod przykryciem, chronione przed światłem.</li>
	<li>Zdekantuj Amp 4-FL i zanurz w 1x buforze do mycia. Mieszać, kołysząc naczynie przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Powtórz mycie nowym 1x buforem do mycia. Umyć 1x PBS (2 min) i przechowywać w PBS.</li>
</ol>
10. Barwienie immunologiczne białek: Aby oznaczyć interesujące białko (białka)
<ol>
	<li>Zdekantować PBS i dodać 200 μl buforu blokującego (1% w/v BSA, 10% v/v FBS w PBS z 0,1% v/v Tween-20 (PBST)) do szkiełka nakrywkowego. Inkubować 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zdekantować bufor blokujący i nałożyć 200 μl przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w PBST + 1% w/v BSA. Inkubować 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyć szkiełko dwukrotnie PBST przez 10 minut w temperaturze pokojowej z potrząsaniem.</li>
	<li>Stosować wybrane przeciwciało drugorzędowe przez 1 godzinę w RT w PBST + 1% w/v BSA.</li>
	<li>Myć szkiełko PBST przez 10 minut w temperaturze pokojowej z potrząsaniem.</li>
</ol>
11. Barwienie jądrowe: Przeciw-plamiste jądra po barwieniu immunologicznym
<ol>
	<li>Zdekantować PBST i nałożyć DAPI lub wybraną barwienie jądrową na 1 minutę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyć szkiełko dwukrotnie PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej z potrząsaniem.</li>
</ol>
12. Montaż
<ol>
	<li>Umieść 1 kroplę roztworu zapobiegającego blaknięciu (np. Prolong Gold) na nowym sterylnym szkiełku podstawowym (najpierw wyczyść szkiełko EtOH i pozostaw do wyschnięcia, aby upewnić się, że na szkle nie ma żadnych pozostałości). Tą samą końcówką rozprowadź kroplę roztworu zapobiegającego blaknięciu, aby pokryć obszar o rozmiarze zbliżonym do szkiełka nakrywkowego. 
	UWAGA: Roztwór zapobiegający blaknięciu jest bardzo lepki i może być trudny do pipetowania. Odcięcie końcówki o pojemności 200 μl przed pipetowaniem może złagodzić te problemy.</li>
	<li>Usuń szkiełko nakrywkowe z próbką komórek ze szkiełka i zanurz w PBS, aby usunąć resztki lakieru do paznokci z tyłu za pomocą kleszczyków i PBS. Osusz kleszcze i tylną część szkiełka nakrywkowego za pomocą chusteczki Kimwipe.</li>
	<li>Delikatnie zanurzyć szkiełko nakrywkowe w kropli roztworu zapobiegającego blaknięciu, umieszczając stronę próbki (strona z warstwą komórek) szkiełka nakrywkowego na kropli).</li>
	<li>Pozostaw próbki do wyschnięcia na noc.</li>
</ol>
13. Obrazowanie
<ol>
	<li>Obraz za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego.</li>
</ol>

<ol><li>Zheng, Q., Lavis, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+photostable+fluorophores+for+molecular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Development of photostable fluorophores for molecular imaging.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 39, 32-38 (2017).</li>
<li>Marini, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+architecture+dictates+HIV-1+integration+site+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection.</a> Nature. 521 (7551), 227-231 (2015).</li>
<li>Puray-Chavez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+single-cell+visualization+of+nucleic+acids+and+protein+during+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Multiplex single-cell visualization of nucleic acids and protein during HIV infection.</a> Nature Communications. 8 (1), 1882(2017).</li>
<li>Ukah, O. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+HIV-1+RNA+Transcription+from+Integrated+HIV-1+DNA+in+Reactivated+Latently+Infected+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Visualization of HIV-1 RNA Transcription from Integrated HIV-1 DNA in Reactivated Latently Infected Cells.</a> Viruses. 10 (10), (2018).</li>
<li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+Positive+and+Negative+Sense+Viral+RNA+for+Probing+the+Mechanism+of+Direct-Acting+Antivirals+against+Hepatitis+C+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Visualization of Positive and Negative Sense Viral RNA for Probing the Mechanism of Direct-Acting Antivirals against Hepatitis C Virus.</a> Viruses. 11 (11), (2019).</li>
<li>Achuthan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capsid-CPSF6+Interaction+Licenses+Nuclear+HIV-1+Trafficking+to+Sites+of+Viral+DNA+Integration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Capsid-CPSF6 Interaction Licenses Nuclear HIV-1 Trafficking to Sites of Viral DNA Integration.</a> Cell Host & Microbe. 24 (3), 392-404 (2018).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).</li>
<li>Xia, C., Babcock, H. P., Moffitt, J. R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+detection+of+RNA+using+MERFISH+and+branched+DNA+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Multiplexed detection of RNA using MERFISH and branched DNA amplification.</a> Scientific Reports. 9 (1), 7721(2019).</li>
<li>Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-copy+gene+detection+using+branched+DNA+%28bDNA%29+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).</li>
<li>Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+transcriptomics+in+thousands+of+single+human+cells+at+single-molecule+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution.</a> Nature Methods. 10 (11), 1127-1133 (2013).</li>
<li>Bushnell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ProbeDesigner%3A+for+the+design+of+probesets+for+branched+DNA+%28bDNA%29+signal+amplification+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ProbeDesigner: for the design of probesets for branched DNA (bDNA) signal amplification assays.</a> Bioinformatics. 15 (5), 348-355 (1999).</li>
<li>Stultz, R. D., Cenker, J. J., McDonald, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+HIV-1+Genomic+DNA+from+Entry+through+Productive+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Imaging HIV-1 Genomic DNA from Entry through Productive Infection.</a> Journal of Virology. 91 (9), (2017).</li>
<li>Brown, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+nuclear+proteins+together+with+transcribed+and+inactive+genes+in+structurally+preserved+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Visualizing nuclear proteins together with transcribed and inactive genes in structurally preserved cells.</a> Methods. 26 (1), 10-18 (2002).</li>
<li>Francis, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+replication+complexes+accumulate+in+nuclear+speckles+and+integrate+into+speckle-associated+genomic+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">HIV-1 replication complexes accumulate in nuclear speckles and integrate into speckle-associated genomic domains.</a> Nature Communications. 11 (1), 3505(2020).</li>
<li>Dharan, A., Bachmann, N., Talley, S., Zwikelmaier, V., Campbell, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+pore+blockade+reveals+that+HIV-1+completes+reverse+transcription+and+uncoating+in+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Nuclear pore blockade reveals that HIV-1 completes reverse transcription and uncoating in the nucleus.</a> Nature Microbiology. 5 (9), 1088-1095 (2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Jednoczesna wizualizacja RNA, DNA i białka często wymaga rozległej optymalizacji. Dwie powszechnie stosowane metody to znakowanie 5-etynylo-2-deoksyurydyną (EdU) i DNA FISH. Znakowanie EdU zostało zastosowane do jednoczesnej wizualizacji DNA i białka wirusa, ponieważ EdU jest włączane do powstającego DNA, a następnie znakowane barwnikami fluorescencyjnymi zawierającymi azydek za pomocą chemii kliknięć. Znakowanie EdU może być zatem wykorzystywane do monitorowania kinetyki replikacji natywnych wirusów DNA lub wir...

Chociaż dostępne są tysiące komercyjnych przeciwciał do specyficznego znakowania białek za pomocą konwencjonalnych metod barwienia immunologicznego, a białka fuzyjne mogą być modyfikowane za pomocą zoptymalizowanych pod kątem fototerapii znaczników fluorescencyjnych do śledzenia wielu białek w próbce1, mikroskopowa wizualizacja białka często nie jest kompatybilna z konwencjonalną fluorescencyjną hybrydyzacją DNA in situ (FISH)2. Ograniczenia techniczne w jednoczesnej wizualizacji DNA, RNA i białka przy użyciu podejść opartych na fluorescencji utrudniły dogłębne zrozumienie replikacji wirusa. Śledzenie zarówno wirusowego kwasu nukleinowego, jak i białka w trakcie infekcji pozwala wirusologom na wizualizację podstawowych procesów, które leżą u podstaw replikacji i montażu wirusa3,4,5,6.
Opracowaliśmy metodę obrazowania, multiplex immunofluorescencyjna detekcjad oparta na DNA, RNA i Proteina (MICDDRP)3, która wykorzystuje technologię rozgałęzionego DNA (bDNA) in situ w celu poprawy czułości wykrywania kwasów nukleinowych7,8,9. Dodatkowo, ta metoda wykorzystuje sparowane sondy dla zwiększenia specyficzności. Sondy specyficzne dla sekwencji bDNA wykorzystują rozgałęzione DNA przedwzmacniacza i wzmacniacza do wytworzenia intensywnego i zlokalizowanego sygnału, ulepszając poprzednie metody hybrydyzacji, które polegały na celowaniu w powtarzające się regiony w klasie DNA9. Zakażone komórki w kontekście klinicznym często nie zawierają obfitego materiału genetycznego wirusa, co stanowi towar dla czułej metody wykrywania fluorescencyjnych kwasów nukleinowych w warunkach diagnostycznych. Komercjalizacja technologii bDNA za pomocą podejść takich jak RNAscope7 i ViewRNA10 wypełniła tę niszę. Czułość obrazowania fluorescencyjnego bDNA ma również ważne zastosowanie w biologii komórki, umożliwiając wykrywanie rzadkich gatunków kwasów nukleinowych w modelach hodowli komórkowych. Ogromna poprawa czułości sprawia, że metody obrazowania oparte na bDNA nadają się do badania wirusów. Potencjalną wadą jest jednak to, że metody te koncentrują się na wizualizacji RNA lub RNA i białka. Wszystkie replikujące się komórki i wiele wirusów ma genomy DNA lub tworzy DNA podczas cyklu replikacji, co sprawia, że metody zdolne do obrazowania zarówno RNA, jak i DNA, a także białka, są bardzo pożądane.
W protokole MICDDRP wykonujemy bDNA FISH do wykrywania wirusowego kwasu nukleinowego za pomocą metody RNAscope, z modyfikacjami7. Jedną z głównych modyfikacji tego protokołu jest optymalizacja leczenia proteazy po utrwaleniu chemicznym. Leczenie proteazą ułatwia usuwanie białek związanych z kwasem nukleinowym w celu poprawy wydajności hybrydyzacji sondy. Po leczeniu proteazą następuje inkubacja z rozgałęzionymi sondami oligonukleotydowymi. Po zastosowaniu sondy (sond) bDNA, próbki są myte, a następnie inkubowane z prewzmacniaczem sygnału i DNA wzmacniacza. Multipleksowana hybrydyzacja in situ (ISH), znakowanie wielu celów genowych, wymaga sond docelowych z różnymi kanałami kolorów do różnicowania spektralnego7. Po inkubacji ze wzmacniaczami DNA następuje immunofluorescencja (IF).
bDNA ISH poprawia stosunek sygnału do szumu poprzez wzmocnienie sygnałów specyficznych dla celu, z redukcją szumu tła z niespecyficznych zdarzeń hybrydyzacji7,11. Sondy docelowe są projektowane przy użyciu publicznie dostępnych programów, które przewidują prawdopodobieństwo wystąpienia niespecyficznych zdarzeń hybrydyzacji, a także obliczają temperaturę topnienia (Tm) hybrydy sonda-cel7,11. Sondy docelowe zawierają region o strukturze od 18 do 25 zasad komplementarny do docelowej sekwencji DNA/RNA, sekwencję dystansową i 14-zasadową sekwencję ogonową. Para sond docelowych, z których każda ma odrębną sekwencję ogonową, hybrydyzuje się do regionu docelowego (obejmującego ~50 baz). Dwie sekwencje ogonowe tworzą miejsce hybrydyzacji dla sond przedwzmacniacza, które zawierają 20 miejsc wiązania dla sond wzmacniacza, które dodatkowo zawierają 20 miejsc wiązania dla sondy etykietowej. Na przykład region o wartości jednej kilozasady (kb) na cząsteczce kwasu nukleinowego jest celem 20 par sond, tworząc rusztowanie molekularne do sekwencyjnej hybrydyzacji z przedwzmacniaczem, wzmacniaczem i sondą etykietową. Może to zatem prowadzić do teoretycznej wydajności 8000 znaczników fluorescencyjnych na cząsteczkę kwasu nukleinowego, umożliwiając wykrywanie pojedynczych cząsteczek i znaczne ulepszenia w porównaniu z konwencjonalnymi metodami FISH7 (Zobacz <silna klasa="xfig">Rysunek 1A dla schematu amplifikacji sygnału bDNA). Aby skonfigurować sondy dla multipleksowanego ISH, każda sonda docelowa musi znajdować się w innym kanale kolorów (C1, C2 lub C3). Te sondy docelowe z różnymi kanałami kolorów mają wyraźne 14-podstawowe sekwencje ogonowe. Te sekwencje ogonowe będą wiązać różne wzmacniacze sygnału z różnymi sondami fluorescencyjnymi, umożliwiając w ten sposób łatwe różnicowanie widma w wielu obiektach. W przedstawionym Protokole, Tabela 4 w Kroku 9 zawiera dalsze informacje na temat znakowania fluorescencyjnego sond docelowych. Ponadto Rysunek 2 i Rysunek 3 przedstawia przykłady, w jaki sposób wybraliśmy odpowiedni wzmacniacz 4-FL (A, B lub C) (sonda fluorescencyjna i końcowy etap hybrydyzacji), aby uzyskać specyficzne znakowanie fluorescencyjne wielu celów wirusowych kwasów nukleinowych po zakażeniach HIV-1 i HTLV-1.
Pokazaliśmy kilka zastosowań jednoczesnej fluorescencyjnej wizualizacji RNA, DNA i białek, obserwując krytyczne etapy replikacji wirusa z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną3,4,5. Na przykład, jednoczesna wizualizacja RNA wirusa, cytoplazmatycznego i jądrowego DNA oraz białka w pojedynczej komórce pozwoliła nam na wizualizację kluczowych zdarzeń podczas infekcji HIV-1, w tym śledzenia RNA zawierającego rdzenie w cytoplazmie przed wejściem jądra i integracją prowirusowego DNA3. Ponadto zastosowaliśmy MICDDRP do scharakteryzowania wpływu czynników gospodarza i leczenia farmakologicznego na infekcję wirusową i replikację4,5. W Ukah i wsp. śledziliśmy reaktywację transkrypcji HIV-1 w modelach komórek latencji traktowanych różnymi środkami odwracającymi opóźnienie, aby uwidocznić transkrypcję HIV i odwrócenie opóźnienia4. Ponadto MICDDRP może pozwolić nam na wizualizację zmian fenotypowych związanych z hamowaniem przeciwwirusowym przypisywanym leczeniu małymi cząsteczkami lub ograniczeniem czynnika gospodarza. Jako dowód słuszności koncepcji solidności i szerokiego zastosowania naszego podejścia, wykazaliśmy, że możemy wykorzystać modyfikacje naszego protokołu do skutecznego znakowania wirusowego kwasu nukleinowego w celu śledzenia infekcji nie tylko w ludzkim wirusie niedoboru odporności (HIV)-1, ale także w ludzkim wirusie T-limfotropowym (HTLV)-1, wirusie zapalenia wątroby typu B (HBV), wirusie zapalenia wątroby typu C (HCV), Wirus Zika (ZIKV) i wirus grypy A (IAV). Ponieważ cykl życiowy HIV-1 składa się zarówno z gatunków wirusa DNA, jak i RNA, przeprowadziliśmy większość naszej optymalizacji MICDDRP na podstawie kinetyki replikacji HIV-1. Jednak dodatkowo wykazaliśmy, że możemy śledzić syntezę różnych wirusowych transkryptów RNA o jednej lub obu nici sensowności (+), jak i antysensowności (-) w wirusach takich jak ZIKV, IAV, HBV i HCV, aby monitorować transkrypcję i replikację wirusa3,4,5,6. Badania mają na celu poprawę mechanistycznego zrozumienia kilku procesów wirusowych i służą jako wytyczne do wdrożenia tej technologii obrazowania fluorescencyjnego w szerokim zakresie modeli komórkowych.

<table><tbody><tr><td>4% PFA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50% siarczan dekstranu</td><td>Amreso</td><td>198</td><td>Do buforu hybrydyzacji DNA</td></tr><tr><td>50X bufor do płukania</td><td>ACD Bio</td><td>320058</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowe</td><td></td><td></td><td></td>płytki</tr><tr><td>Wzmacniacz 1-FL</td><td>ACD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio Wzmacniacz 2-FL</td><td>ACD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio Wzmacniacz 3-FL</td><td>ACD </td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio Amplifier 4-FL</td><td>ACD Bio</td><td></td><td>Consult Amp-4 tabela w protokole</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-HCV NS5a</td><td>Abcam</td><td>ab13833</td><td>Mysz monoklonalna; współpracuje z genotypami HCV 1a, 1b, 3 i 4</td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne anty-HIV-1 p24</td><td>Program odczynników NIH AIDS</td><td>3537</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Mov10</td><td>Abcam</td><td>ab80613</td><td>Królik poliklonalny</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-PB1</td><td>GeneTex</td><td>GTX125923</td><td>Przeciwciało przeciwko białku grypy</td></tr><tr><td>Albumina</td><td></td><td></td> surowicy bydlęcej <td>Odczynnik blokujący do barwienia immunologicznego</td></tr><tr><td>Pożywki komórkowe z suplementami Pożywka</td><td></td><td></td><td>odpowiednia dla modelu komórkowego</td></tr><tr><td>Szkiełka</td><td></td><td></td><td></td>nakrywkowe</tr><tr><td>DAPI</td><td>ACD Bio</td><td></td><td>Barwnik jądrowy (zestaw RNAscope firmy ACD Bio)</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (1X PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td>Bez wapnia i magnezu</td></tr><tr><td>Węglan etylenu</td><td>Sigma</td><td>E26258</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td></td><td></td><td>Użyj określonego FBS w zależności od tego, w jakim przeciwciałie wtórnym w surowicy zostało wyhodowane (np. koza FBS)</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe Fisherbrand colorfrost plus</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-17/18/19</td><td>Wstępnie oczyszczone</td></tr><tr><td>Sonda HCV-GT2a-sense-C2 Sonda</td><td>RNA ACD Bio</td><td>441371</td><td>HCV(+) Sonda RNA</td></tr><tr><td>HIV-gagpol-C1</td><td>ACD Bio 317701</td><td></td><td>Sonda cDNA HIV-nongagpol-C3</td></tr><tr><td></td><td>ACD Bio</td><td>317711-C</td><td>Sonda RNA HIV-1</td></tr><tr><td>Piec do hybrydyzacji HybEZ</td><td>ACD Bio</td><td>321710/321720</td><td></td></tr><tr><td>Długopis hydrofobowy ImmEdge</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Lakier</td><td></td><td></td> do paznokci <td>Do immobolizacji szkiełka nakrywkowego do ślizgania się przed leczeniem proteazy</td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Poli-d-lizyna (PDL)</td><td></td><td></td> <td>Powłoka szkiełka nakrywkowe w 20 i mikro; g/ml PDL przez 30 minut</td></tr><tr><td>Rozcieńczalnik do sond</td><td>ACD Bio 300041</td><td></td><td>Do rozcieńczania RNA Sondy C2 lub C3</td></tr><tr><td>Prolong gold antifade</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Proteaza III</td><td>ACD Bio</td><td>322337</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope&reg; &nbsp; Sonda- V-Influenza-H1N1-H5N1-NP</td><td>ACD Bio</td><td>436221</td><td></td></tr><tr><td>RNaza A</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała</td><td></td><td></td><td></td>drugorzędowe</tr><tr><td>Slajdy Chlorek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>sodu</td><td>Do buforu hybrydyzacji DNA</td></tr><tr><td>Cytrynian sodu, pH 6,2</td><td></td><td></td><td>Do buforu hybrydyzacji DNA</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td></td><td></td><td>Do buforu hybrydyzacji DNA i PBS-T</td></tr><tr><td>V-HBV-GTD</td><td>ACD Bio</td><td>441351</td><td>Total HBV RNA</td></tr><tr><td>V-HBV-GTD-01-C2</td><td>ACD Bio</td><td>465531-C2</td><td>HBV pgRNA</td></tr><tr><td>sonda V-HCV-GT2a</td><td>ACD Bio</td><td>441361</td><td>HCV(-) sense RNA sonda</td>V-HTLV-HBZ-sense-C3</tr><tr><td></td><td>ACD Bio</td><td>495071-C3</td><td>HTLV-1 (-) sense sonda RNA celująca HBZ</td></tr><tr><td>V-HTLV1-GAG-C2</td><td>ACD Bio</td><td>495051-C2</td><td>HTLV-1 Sonda DNA</td></tr><tr><td>V-HTLV1-GAG-POL-sense</td><td>ACD Bio</td><td>495061</td><td>HTLV-1 (+) czujnik RNA</td></tr><tr><td>V-Influenza-H1N1-H5N1-NP</td><td>ACD Bio</td><td>436221</td><td>Sonda RNA IAV</td></tr><tr><td>V-ZIKA-PP-O2</td><td>ACD Bio 464531</td><td></td><td>Sonda RNA Zika(+)</td></tr><tr><td>V-ZIKA-pp-O2-sense-C2</td><td>ACD Bio</td><td>478731-C2</td><td>Zika(-) czujnik RNA Sondy</td></tr></tbody></table>

obrazowanie fluorescencyjne z multipleksem pojedynczych komórek w celu wizualizacji wirusowych kwasów nukleinowych i białek oraz monitorowania zakażeń hiv, htlv, hbv, hcv, zika i grypy

Single-Cell Multiplexed Fluorescence Imaging to Visualize Viral Nucleic Acids and Proteins and Monitor HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus, and Influenza Infection

Uchwycenie dynamicznych procesów replikacji i składania wirusów zostało utrudnione przez brak solidnych technologii hybrydyzacji in situ (ISH), które umożliwiają czułe i jednoczesne znakowanie wirusowego kwasu nukleinowego i białka. Konwencjonalne metody hybrydyzacji in situ fluorescencji DNA (FISH) często nie są kompatybilne z barwieniem immunologicznym. W związku z tym opracowaliśmy metodę obrazowania MICDDRP (multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA and p rotein), która umożliwia jednoczesną wizualizację DNA, RNA i białkaw pojedynczych komórkach. W porównaniu z konwencjonalnym DNA FISH, MICDDRP wykorzystuje technologię ISH rozgałęzionego DNA (bDNA), która znacznie poprawia czułość i wykrywanie sondy oligonukleotydowej. Niewielkie modyfikacje MICDDRP umożliwiają obrazowanie białek wirusowych jednocześnie z kwasami nukleinowymi (RNA lub DNA) o różnej nici. Zastosowaliśmy te protokoły do badania cykli życiowych wielu patogenów wirusowych, w tym ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV)-1, ludzkiego wirusa limfotropowego T (HTLV)-1, wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV), wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV), wirusa Zika (ZKV) i wirusa grypy A (IAV). Wykazaliśmy, że możemy skutecznie znakować wirusowe kwasy nukleinowe i białka w różnych wirusach. Badania te mogą zapewnić nam lepsze zrozumienie mechanistyczne wielu systemów wirusowych, a ponadto służyć jako szablon do zastosowania multipleksowanego obrazowania fluorescencyjnego DNA, RNA i białka w szerokim spektrum systemów komórkowych.

Schemat MICDDRP przedstawiono na Rysunku 1. Po znakowaniu DNA i RNA przeprowadza się immunostaining. Zastosowanie wzmacniaczy rozgałęzionych zwiększa sygnał, co umożliwia detekcję pojedynczych cząsteczek kwasów nukleinowych.
<img alt="Multipleksowe obrazowanie fluorescencyjne; schemat hybrydyzacji DNA/RNA HIV-1; etapy amplifikacji sygnału." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61843/61843fig1v5.jpg" data-altupdatedat="1...

Prezentowany tutaj jest protokół dla metody obrazowania fluorescencyjnego, multiplex immunofluorescencyjna metodawykrywania DNA, RNA i proteiny (MICDDRP), metoda zdolna do jednoczesnej fluorescencyjnej wizualizacji pojedynczych komórek białka wirusowego i kwasów nukleinowych o różnym typie i nici. Takie podejście można zastosować do różnych systemów.

Obrazowanie fluorescencyjne z multipleksem pojedynczych komórek w celu wizualizacji wirusowych kwasów nukleinowych i białek oraz monitorowania zakażeń HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika i grypy

Capturing the dynamic replication and assembly processes of viruses has been hindered by the lack of robust in situ hybridization (ISH) technologies that ...

Nasze multipleksowe wykrywanie DNA, RNA i białek w oparciu o komórki immunofluorescencyjne umożliwia nam jednoczesną wizualizację białek i kwasów nukleinowych różnych typów i nicictwa w pojedynczych komórkach. Przed wysiewem inkubować szkiełka nakrywkowe w etanolu przez pięć minut, a następnie dwa dwuminutowe płukania w PBS. Po drugim praniu całkowicie zanurz szkiełko nakrywkowe w 20 mikrogramach na mililitr poli-D-lizyny na 30 minut w temperaturze pokojowej.Pod koniec inkubacji usunąć nadmiar roztworu matrycy za pomocą dwóch przemyć PBS i rozcieńczyć interesujące komórki w proporcjach 1 x 10 do szóstych komórek na 50 mikrolitrów PBS na stężenie szkiełka nakrywkowego. Następnie wysiewaj 50 mikrolitrów interesujących komórek na każdym szkiełku nakrywkowym pokrytym poli-D-lizyną na 30-minutową inkubację w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji umyj komórki trzy razy w PBS, a następnie utrwal je w 4% paraformaldehydzie na 30 minut.Pod koniec inkubacji umyj komórki dwa razy w PBS, a następnie przesiąknij komórki 500 mikrolitrami 0,1% Tween 20 w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji przemyć każde szkiełko nakrywkowe dwa razy 500 mikrolitrami świeżego PBS na pranie. Aby unieruchomić szkiełko nakrywkowe na szkiełku podstawowym, umieść niewielką kroplę przezroczystego lakieru do paznokci na wysterylizowanym szkiełku podstawowym i umieść jedną krawędź bezkomórkowej strony szkiełka nakrywkowego na kropli lakieru do paznokci i opuść szkiełko nakrywkowe na stronę komórki przesuwnej skierowaną do góry.Dodaj kilka kropli PBS na unieruchomione szkiełko nakrywkowe, aby zapobiec odwodnieniu komórek, i użyj hydrofobowego pisaka barierowego, aby narysować okrąg wokół zewnętrznej strony szkiełka nakrywkowego. Po narysowaniu bariery zastąp PBS 100 mikrolitrami proteazy III i umieść szkiełko w inkubatorze o temperaturze 40 stopni Celsjusza na 15 minut. Pod koniec inkubacji umyć szkiełka dwa razy w świeżym PBS przez dwie minuty na mycie z kołysaniem.Po drugim płukaniu rozcieńczyć sondę w 200 mikrolitrach buforu hybrydyzacyjnego w temperaturze 67 stopni Celsjusza przez 10 minut. Pod koniec inkubacji dodać 50 mikrolitrów roztworu sondy do każdego szkiełka nakrywkowego i umieścić szkiełka w nawilżonym piekarniku o temperaturze 40 stopni Celsjusza na dwie godziny. Pod koniec inkubacji umyj szkiełka dwa razy świeżym buforem do płukania i kołysząc przez dwie minuty na mycie.Po drugim płukaniu postukaj w szkiełka, aby usunąć nadmiar buforu i sekwencyjnie potraktuj szkiełka nakrywkowe jedną kroplą amplifiers dla kanałów fluorescencyjnych 1, 2 i 3 przez 30 minut inkubacji w temperaturze 40 stopni Celsjusza na amplifier z dwoma dwuminutowymi płukaniami w buforze świeżego płukania z kołysaniem na pranie między zabiegami. Po ostatnim przepłukaniu dodać kroplę wzmacniacza kanału fluorescencyjnego 4 do szkiełka nakrywkowego na 15-minutową inkubację w piecu o temperaturze 40 stopni Celsjusza i umyć szkiełko dwa razy buforem do przemywania i raz PBS, jak pokazano. W celu barwienia immunologicznego badanych białek, po ostatnim praniu, należy potraktować każde szkiełko nakrywkowe 200 mikrolitrami buforu blokującego przez jedną godzinę inkubacji w temperaturze pokojowej.Pod koniec inkubacji zdekantować bufor blokujący i dodać 200 mikrolitrów badanego przeciwciała pierwszorzędowego, rozcieńczonego w PBS plus Tween 20, uzupełnionego 1% albuminą surowicy bydlęcej. Po godzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej umyć szkiełka dwoma 10-minutowymi płukaniami w świeżym PBS plus Tween 20 z wstrząsaniem na mycie, a następnie oznaczyć próbki odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji umyć szkiełka dwa razy świeżym PBS plus Tween 20 przez 10 minut z potrząsaniem przy każdym myciu.Po drugim płukaniu przeciwbarwić jądra odpowiednim barwnikiem jądrowym przez jedną minutę w temperaturze pokojowej, a następnie dwa płukania w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem. Aby zamontować próbki do obrazowania, należy umieścić jedną kroplę roztworu zapobiegającego blaknięciu na jednym nowym sterylnym szkiełku podstawowym na próbkę i rozprowadzić roztwór, aby pokryć obszar o rozmiarze zbliżonym do szkiełek nakrywkowych. Odłącz kartki okładki od ich szkiełek i zanurz je w PBS.Użyj kleszczyków, aby usunąć resztki lakieru do paznokci i osusz tylną część szkiełka nakrywkowego chusteczką laboratoryjną. Następnie delikatnie umieść każdą próbkę szkiełka nakrywkowego stroną do dołu na roztworze zapobiegającym blaknięciu i pozostaw próbki do wyschnięcia na noc. Jako dowód słuszności tej procedury, DNA, RNA i białko HIV-1 zostały jednocześnie znakowane i wizualizowane mikroskopowo na poziomie pojedynczej komórki.W tym przykładzie dwa genomy DNA HIV-1 można zwizualizować w jednej komórce, ponieważ aktywnie transkrybują wirusowe RNA. Wirusowe RNA zostało wyeksportowane przez kompleks porów jądrowych, a białko wirusowe zostało zsyntetyzowane w cytoplazmie. Jak zaobserwowano, obserwuje się bardzo małą lub żadną reaktywność krzyżową między zestawami sond w odniesieniu do dwóch wirusów, pomimo znakowania dwoma retrowirusami z potencjałem do reaktywności krzyżowej sondy.Ponadto barwienie wirusowego RNA można wyeliminować, jeśli komórki zostaną potraktowane RNazą podczas przygotowywania próbki. Średnia zintegrowana intensywność fluorescencji sygnału przeciwciała na komórkę na każdym obrazie może być następnie określona ilościowo. Jak zaobserwowano, ilość pregenomowego RNA HBV i całkowitego RNA HBV wzrasta w trakcie zakażenia HBV.Obrazowanie zakażenia HCV można również wykonać za pomocą mikroskopii konfokalnej przy użyciu 60-krotnego obiektywu zanurzeniowego w oleju w celu wykrycia interesujących fluoroforów. To wysoce specyficzne podejście pozwala również na śledzenie procesów wirusowych lub komórkowych z wysoką rozdzielczością przestrzenną czasową. Ponadto technika ta może być wykorzystywana do badania wielu wirusów i innych patogenów.

single-cell-multiplexed-fluorescence-imaging-to-visualize-viral

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Technika łącząca barwienie tetramerami in situ i hybrydyzację in situ (ISTH) umożliwia wizualizację, mapowanie i analizę bliskości przestrzennej wirusowo-specyficznych limfocytów T CD8+ względem zainfekowanych wirusem komórek docelowych oraz określenie ilościowych zależności między tymi efektorami odpornościowymi a celami w kontekście wyników infekcji.

Technika jednoczesnej wizualizacji wirusowo-specyficznych limfocytów T CD8+ i komórek zainfekowanych wirusem in situ

Niniejszy eksperyment w formie wizualizacji jest przewodnikiem po wykorzystaniu fluorescencyjnego klonu molekularnego HIV do eksperymentów z obrazowaniem konfokalnym żywych komórek.

Wizualizacja transferu HIV między komórkami z wykorzystaniem fluorescencyjnych klonów HIV oraz konfokalnej mikroskopii żywych komórek

Metoda ta opisuje zastosowanie systemu obrazowania opartego na barwnikach w podczerwieni do wykrywania H1N1 w płyku z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL) zakażonych myszy z wysoką czułością. Metodykę tę można przeprowadzić na płytce 96- lub 384-dołkowej, wymaga ona objętości materiału badawczego &lt;10 μl i umożliwia jednoczesny screening wielu patogenów.

Metoda wysokoprzepustowego wykrywania wirusa grypy

Opracowano metodę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w celu wizualnej detekcji wirusowego RNA genomowego przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Przygotowano sondę specyficzną dla wirusowego RNA, która może być następnie identyfikowana za pomocą kombinacji technik hybrydyzacji i immunofluorescencji. Technika ta daje możliwość określenia lokalizacji wirusowego RNA lub DNA w stanie stacjonarnym, dostarczając informacji o kontroli procesów wewnątrzkomórkowego transportu wirusa.

Wykrywanie wirusowego RNA za pomocą hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ (FISH)

Fabryki transkrypcji wirusa to odrębne struktury, które są wzbogacone o komórkową polimerazę RNA II w celu zwiększenia transkrypcji genów wirusa podczas reaktywacji. W tym miejscu opisano metodę lokalizacji miejsc aktywnej transkrypcji chromatyny wirusowej w przestrzeni jądrowej 3D poprzez połączenie barwienia immunofluorescencyjnego i hybrydyzacji RNA in situ.

Obrazowanie funkcjonalne fabryk transkrypcji wirusów przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej 3D

Obecna diagnostyka multipleksowa do wykrywania wirusów Zika, chikungunya i denga wymaga skomplikowanego przygotowania próbek i kosztownego oprzyrządowania, a także jest trudna do użycia w środowiskach o niskich zasobach. Pokazujemy diagnostykę, która wykorzystuje amplifikację izotermiczną z sondami z przemieszczonymi niciami specyficznymi dla celu, aby wykryć i zróżnicować te wirusy z wysoką czułością i swoistością.

Multipleksowana platforma diagnostyczna oparta na amplifikacji izotermicznej do wykrywania wirusów Zika, Chikungunya i Denga 1

Opisana jest metodologia ilościowego oznaczania ekspresji 96 genów i 18 białek powierzchniowych przez pojedyncze komórki ex vivo, pozwalająca na identyfikację genów i białek o zróżnicowanej ekspresji w komórkach zakażonych wirusem w stosunku do komórek niezainfekowanych. Stosujemy podejście do badania limfocytów T CD4 + zakażonych SIV wyizolowanych od makaków rezusów.

Kwantyfikacja mRNA i ekspresji białek powierzchniowych w pojedynczych komórkach w limfocytach T CD4 + zakażonych małpim wirusem niedoboru odporności wyizolowanych od makaków rezusów

Opisujemy metodę szybkiego barwienia do wykonywania obrazowania wielospektralnego na zamrożonych tkankach.

Szybka metoda wielospektralnego obrazowania fluorescencyjnego zamrożonych skrawków tkanek

Tutaj prezentujemy protokół, w którym pojedyncze komórki są monitorowane pod kątem ostrych zdarzeń i produktywnego zakażenia HIV-1 na urządzeniu nanofluidycznym. Dane obrazowe definiują interakcje wirus-receptor gospodarza i dynamikę szlaku sygnałowego. Jest to pierwsza metoda nanofluidycznej, wysokoprzepustowej, podłużnej hodowli pojedynczej komórki i obrazowania w celu zbadania kinetyki sygnalizacji i interakcji molekularnych.

Jednokomórkowa charakterystyka napływu wapnia i zakażenia HIV-1 przy użyciu wieloparametrowej platformy optofluidycznej

Tutaj opisujemy nowo opracowany multipleksowy fluorescencyjny test immunologiczny, który wykorzystuje system cytometrii z podwójnym przepływem reporterowym do jednoczesnego wykrywania dwóch unikalnych epitopów białka kolca na nienaruszonych cząsteczkach wirusa SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2) zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej, które zostały wychwycone przez mikrosfery magnetyczne sprzężone z enzymem konwertującym angiotensynę.

Profilowanie epitopów białek powierzchniowych na cząsteczkach wirusa za pomocą strategii multipleksu dual-reporter

Poznaj metodę wielokanałowego obrazowania immunofluorescencyjnego pojedynczych komórek do jednoczesnej wizualizacji DNA, RNA i białek wirusowych. Technika umożliwia śledzenie infekcji HIV, HBV, HCV i Zika z wysoką specyficznością.

Obrazowanie fluorescencyjne z multipleksem pojedynczych komórek w celu wizualizacji wirusowych kwasów nukleinowych i białek oraz monitorowania zakażeń HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika i grypy (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie fluorescencyjne z multipleksem pojedynczych komórek w celu wizualizacji wirusowych kwasów nukleinowych i białek oraz monitorowania zakażeń HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika i grypy

Przeglądaj więcej filmów