Obrazowanie fluorescencyjne z multipleksem pojedynczych komórek w celu wizualizacji wirusowych kwasów nukleinowych i białek oraz monitorowania zakażeń HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika i grypy

Nasze multipleksowe wykrywanie DNA, RNA i białek w oparciu o komórki immunofluorescencyjne umożliwia nam jednoczesną wizualizację białek i kwasów nukleinowych różnych typów i nicictwa w pojedynczych komórkach. Przed wysiewem inkubować szkiełka nakrywkowe w etanolu przez pięć minut, a następnie dwa dwuminutowe płukania w PBS. Po drugim praniu całkowicie zanurz szkiełko nakrywkowe w 20 mikrogramach na mililitr poli-D-lizyny na 30 minut w temperaturze pokojowej.

Pod koniec inkubacji usunąć nadmiar roztworu matrycy za pomocą dwóch przemyć PBS i rozcieńczyć interesujące komórki w proporcjach 1 x 10 do szóstych komórek na 50 mikrolitrów PBS na stężenie szkiełka nakrywkowego. Następnie wysiewaj 50 mikrolitrów interesujących komórek na każdym szkiełku nakrywkowym pokrytym poli-D-lizyną na 30-minutową inkubację w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji umyj komórki trzy razy w PBS, a następnie utrwal je w 4% paraformaldehydzie na 30 minut.

Pod koniec inkubacji umyj komórki dwa razy w PBS, a następnie przesiąknij komórki 500 mikrolitrami 0,1% Tween 20 w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji przemyć każde szkiełko nakrywkowe dwa razy 500 mikrolitrami świeżego PBS na pranie. Aby unieruchomić szkiełko nakrywkowe na szkiełku podstawowym, umieść niewielką kroplę przezroczystego lakieru do paznokci na wysterylizowanym szkiełku podstawowym i umieść jedną krawędź bezkomórkowej strony szkiełka nakrywkowego na kropli lakieru do paznokci i opuść szkiełko nakrywkowe na stronę komórki przesuwnej skierowaną do góry.

Dodaj kilka kropli PBS na unieruchomione szkiełko nakrywkowe, aby zapobiec odwodnieniu komórek, i użyj hydrofobowego pisaka barierowego, aby narysować okrąg wokół zewnętrznej strony szkiełka nakrywkowego. Po narysowaniu bariery zastąp PBS 100 mikrolitrami proteazy III i umieść szkiełko w inkubatorze o temperaturze 40 stopni Celsjusza na 15 minut. Pod koniec inkubacji umyć szkiełka dwa razy w świeżym PBS przez dwie minuty na mycie z kołysaniem.

Po drugim płukaniu rozcieńczyć sondę w 200 mikrolitrach buforu hybrydyzacyjnego w temperaturze 67 stopni Celsjusza przez 10 minut. Pod koniec inkubacji dodać 50 mikrolitrów roztworu sondy do każdego szkiełka nakrywkowego i umieścić szkiełka w nawilżonym piekarniku o temperaturze 40 stopni Celsjusza na dwie godziny. Pod koniec inkubacji umyj szkiełka dwa razy świeżym buforem do płukania i kołysząc przez dwie minuty na mycie.

Po drugim płukaniu postukaj w szkiełka, aby usunąć nadmiar buforu i sekwencyjnie potraktuj szkiełka nakrywkowe jedną kroplą amplifiers dla kanałów fluorescencyjnych 1, 2 i 3 przez 30 minut inkubacji w temperaturze 40 stopni Celsjusza na amplifier z dwoma dwuminutowymi płukaniami w buforze świeżego płukania z kołysaniem na pranie między zabiegami. Po ostatnim przepłukaniu dodać kroplę wzmacniacza kanału fluorescencyjnego 4 do szkiełka nakrywkowego na 15-minutową inkubację w piecu o temperaturze 40 stopni Celsjusza i umyć szkiełko dwa razy buforem do przemywania i raz PBS, jak pokazano. W celu barwienia immunologicznego badanych białek, po ostatnim praniu, należy potraktować każde szkiełko nakrywkowe 200 mikrolitrami buforu blokującego przez jedną godzinę inkubacji w temperaturze pokojowej.

Pod koniec inkubacji zdekantować bufor blokujący i dodać 200 mikrolitrów badanego przeciwciała pierwszorzędowego, rozcieńczonego w PBS plus Tween 20, uzupełnionego 1% albuminą surowicy bydlęcej. Po godzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej umyć szkiełka dwoma 10-minutowymi płukaniami w świeżym PBS plus Tween 20 z wstrząsaniem na mycie, a następnie oznaczyć próbki odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji umyć szkiełka dwa razy świeżym PBS plus Tween 20 przez 10 minut z potrząsaniem przy każdym myciu.

Po drugim płukaniu przeciwbarwić jądra odpowiednim barwnikiem jądrowym przez jedną minutę w temperaturze pokojowej, a następnie dwa płukania w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem. Aby zamontować próbki do obrazowania, należy umieścić jedną kroplę roztworu zapobiegającego blaknięciu na jednym nowym sterylnym szkiełku podstawowym na próbkę i rozprowadzić roztwór, aby pokryć obszar o rozmiarze zbliżonym do szkiełek nakrywkowych. Odłącz kartki okładki od ich szkiełek i zanurz je w PBS.

Użyj kleszczyków, aby usunąć resztki lakieru do paznokci i osusz tylną część szkiełka nakrywkowego chusteczką laboratoryjną. Następnie delikatnie umieść każdą próbkę szkiełka nakrywkowego stroną do dołu na roztworze zapobiegającym blaknięciu i pozostaw próbki do wyschnięcia na noc. Jako dowód słuszności tej procedury, DNA, RNA i białko HIV-1 zostały jednocześnie znakowane i wizualizowane mikroskopowo na poziomie pojedynczej komórki.

W tym przykładzie dwa genomy DNA HIV-1 można zwizualizować w jednej komórce, ponieważ aktywnie transkrybują wirusowe RNA. Wirusowe RNA zostało wyeksportowane przez kompleks porów jądrowych, a białko wirusowe zostało zsyntetyzowane w cytoplazmie. Jak zaobserwowano, obserwuje się bardzo małą lub żadną reaktywność krzyżową między zestawami sond w odniesieniu do dwóch wirusów, pomimo znakowania dwoma retrowirusami z potencjałem do reaktywności krzyżowej sondy.

Ponadto barwienie wirusowego RNA można wyeliminować, jeśli komórki zostaną potraktowane RNazą podczas przygotowywania próbki. Średnia zintegrowana intensywność fluorescencji sygnału przeciwciała na komórkę na każdym obrazie może być następnie określona ilościowo. Jak zaobserwowano, ilość pregenomowego RNA HBV i całkowitego RNA HBV wzrasta w trakcie zakażenia HBV.

Obrazowanie zakażenia HCV można również wykonać za pomocą mikroskopii konfokalnej przy użyciu 60-krotnego obiektywu zanurzeniowego w oleju w celu wykrycia interesujących fluoroforów. To wysoce specyficzne podejście pozwala również na śledzenie procesów wirusowych lub komórkowych z wysoką rozdzielczością przestrzenną czasową. Ponadto technika ta może być wykorzystywana do badania wielu wirusów i innych patogenów.