Wizualizacja struktury węzłów chłonnych i lokalizacji komórkowej za pomocą mikroskopii konfokalnej ex-vivo

Ten powtarzalny i łatwy do wykonania protokół wykorzystuje strategię obrazowania węzłów chłonnych ex-vivo do śledzenia drenażu podawanych in vivo przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie do lokalnych wtórnych narządów limfatycznych. Zademonstrowanie tej techniki pozwala na specyficzną wizualizację procedury, co może ułatwić pomyślne wykonanie protokołu. Jest to bardzo prosta i nieskomplikowana technika, którą może wykonać każdy.

Jedynym wyzwaniem jest obsługa myszy, która wymaga pewnego treningu. Zaletą tej techniki jest poprawa szybkości zachowania wysiłku tkankowego i żywotności komórek w porównaniu z konwencjonalnymi metodami barwienia fluorescencyjnego. Szkolenie w zakresie procedury miała prowadzić Bruna Tatematsu, technik z laboratorium.

Rozcieńczyć interesujące nas przeciwciała, sprzężone z odpowiednimi fluoroforami, w 100 mikrolitrach PBS do obrazowania pachwinowych węzłów chłonnych lub 50 mikrolitrach PBS do obrazowania węzłów chłonnych podniebiennych. W przypadku obrazowania pachwinowych węzłów chłonnych załaduj 100 mikrolitrów koktajlu przeciwciał do jednomililitrowej strzykawki insulinowej, wyposażonej w igłę o wymiarach 30 na pół cala i podskórnie wstrzyknij przeciwciała do wewnętrznej strony uda eksperymentalnej myszy. W przypadku obrazowania węzłów chłonnych podkolanowych wstrzyknąć podskórnie 50 mikrolitrów koktajlu przeciwciał do jednej opuszki łapy zwierzęcia doświadczalnego.

Następnie umieść zwierzę z powrotem w jego pudełku domowym. W celu pobrania węzłów chłonnych drenujących pachwiny, po odczekaniu co najmniej trzech godzin od wstrzyknięcia, unieruchomij mysz na etapie akrylowym za pomocą taśmy klejącej i nałóż olej mineralny na skórę brzucha. Użyj standardowych nożyczek mikrochirurgicznych i zakrzywionych kleszczy mikrochirurgicznych, aby wykonać nacięcie skóry w linii środkowej brzucha od łona do wyrostka ksyloidalnego i oddzielić mięśnie brzucha od skóry.

Wykonaj poziome nacięcia skóry w górnej i dolnej części pionowej linii nacięcia, aby utworzyć płaty skóry po stronie wstrzyknięcia i cofnij skórę, aby uwidocznić węzeł chłonny. Przymocuj płat skóry do płytki akrylowej i użyj kleszczy, aby usunąć półprzezroczysty, zwykle dwuskładnikowy sferyczny pachwinowy drenujący węzeł chłonny. W celu pobrania węzłów chłonnych drenujących podkolanówkę, co najmniej 12 godzin po wstrzyknięciu, unieruchomij mysz w pozycji leżącej na akrylowym stoliku.

Nałóż olej mineralny na łydkę i kolano po stronie wstrzyknięcia zwierzęcia. Następnie wykonaj nacięcie w linii środkowej łydki od pięty do kolana i oddziel mięśnie łydki od skóry. Odsłoń dół podkolanowy.

Węzeł chłonny podkolanowy pojawi się jako półprzezroczysta kula w dole. Następnie usuń węzeł chłonny za pomocą zakrzywionych kleszczy mikrochirurgicznych. Aby przygotować węzeł chłonny do obrazowania, umieść całe narządy w naczyniu hodowlanym o wymiarach 35 na 10 milimetrów ze szklanym dnem i użyj kleszczy, aby usunąć tłuszcz otaczający tkankę.

Wyśrodkuj narząd na środku naczynia i przykryj tkankę kawałkiem delikatnej wycieraczki nasączonej solą fizjologiczną. W przypadku obrazowania ex vivo umieść czaszę w szczelinie odwróconego mikroskopu konfokalnego i użyj konwencjonalnego światła mikroskopu konfokalnego i obiektywu 4-10X, aby uzyskać prawidłową ostrość. Zmień funkcję światła na tryb laserowy i użyj próbki barwionej izotopem, niebarwionej lub niefluorescencyjnej, aby dostosować moc lasera, przesunięcie i wzmocnienie, aby usunąć autofluorescencję i wszelkie nieokreślone barwienia.

Rób zdjęcia w obiektywach 4, 10 i 20X, koncentrując się na strukturze węzłów chłonnych i dystrybucji komórkowej oraz używając rozdzielczości 1024 na 1024 piksele. Następnie użyj odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazowania, aby oddzielić kanały, dodać skalę i kolory, które Cię interesują, oraz zrekonstruować widok 3D. Silne połączenie znakowania immunologicznego komórek węzłów chłonnych z przeciwciałami anty-CD4 i anty-CD19 oraz analiza obrazowania konfokalnego umożliwia lokalizację limfocytów T i B w pachwinowych węzłach chłonnych.

W węzłach chłonnych podkolanowych, podobnie jak w tkance pachwinowej, pęcherzyki komórek B są otoczone populacjami limfocytów T, co jest cechą charakterystyczną struktury węzłów chłonnych. Jak zaobserwowano na tych obrazach, fagocyty nie internalizują wstrzykniętych przeciwciał, co wskazuje, że barwienie limfocytów B i T jest specyficzne. Co więcej, ponowna rekonstrukcja oznakowania wskazuje, że barwienie limfocytów T i B nie nakłada się na siebie, co dodatkowo potwierdza specyficzność barwienia.

Komórki jednokomórkowe obserwuje się w całym pachwinowym węźle chłonnym, w tym w zatoce podtorebkowej. Przy czym większość komórek jednojądrzastych wykazuje ekspresję CX3XR1, a następnie CCR2 i CXCR31CCR2 podwójnie dodatnie komórki. Ten sam wzorzec rozmieszczenia komórek i fenotypy komórek obserwuje się w węźle chłonnym podkolanowym.

Oba węzły chłonne wykazują również ciemne obszary bez ekspresji receptora komórki jednojądrzastej, które są zajęte przez limfocyty. Co więcej, komórki jednojądrzaste są rzadkie w wewnętrznym obszarze węzłów chłonnych, pozostając skoncentrowane w zewnętrznych obszarach tkanki, co wskazuje, że komórki te zajmują głównie zatokę podtorebkową węzła chłonnego. Mieszanina przeciwciał musi być precyzyjnie wstrzyknięta do tkanki podskórnej, aby układ limfatyczny mógł prawidłowo odprowadzić przeciwciała do węzła chłonnego.

Metoda ta może być stosowana do biodystrybucji leków znakowanych fluorescencyjnie oraz do badań celowania w komórki nanocząstek znakowanych fluorescencyjnie.