Name: Wizualizacja struktury węzłów chłonnych i lokalizacji komórkowej za pomocą mikroskopii konfokalnej ex-vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Poznaj technikę obrazowania ex-vivo węzłów chłonnych myszy przy użyciu fluorescencyjnych przeciwciał i mikroskopii konfokalnej. Metoda umożliwia wizualizację komórek T i B z zachowaniem struktury tkanek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez NIH (R01 AI43458 do H.L.W.).

Protokół został zatwierdzony przez Stały Komitet ds. Zwierząt w Harvard Medical School oraz Brigham and Women's Hospital, protokół 2016N000230.
1. Myszy użyte do eksperymentu
<ol>
	<li>Do podawania mieszanki przeciwciał należy użyć 8-tygodniowych samców i samic myszy na tle witaminy B6.</li>
	<li>Użyj myszy CX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WT, aby określić, czy obrazowanie ex vivo całego LN można również zastosować u myszy reporterowych bez podawania mieszanki przeciwciał, a także do zbadania obecności komórek jednojądrzastych, w tym komórek prezentujących antygen i fagocytów, oraz ich dystrybucji w LN. 
	UWAGA: Myszy reporterowe CX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WT mają wstawione białko zielonej fluorescencji (GFP) i białko czerwonej fluorescencji (RFP) pod kontrolą odpowiednio promotorów CX3CR1 i CCR2. Myszy reporterowe mogą być używane z wstrzyknięciem mieszanki przeciwciał lub bez niej. Zobacz reference4 dla wstrzykiwania mieszanki przeciwciał w myszy reporterowej. Przejdź do operacji, jeśli nie zostanie wstrzyknięte przeciwciało.</li>
</ol>
2. Przygotowanie i wstrzyknięcie mieszanki przeciwciał
UWAGA: Wykonaj te kroki na myszach opisanych w kroku 1.1.
<ol>
	<li>Rozcieńczyć w stosunku 1:10 fioletu brylantowego (BV) 421 anty-CD4 (GK1,5; 0,2 mg/ml), 1:10 błękitu brylantowego (BB) 515 anty-CD19 (1D3; 0,2 mg/ml) i 1:20 fikoerytryny (PE) anty-F4/80 (T45-2342; 0,2 mg/ml) w PBS o odpowiedniej objętości końcowej do wstrzyknięcia do wewnętrznej strony uda (w celu zobrazowania pachwinowego) lub do opuszki łapy (w celu uzyskania obrazu podkolanowego) limfy. 
	UWAGA: Stosować jako izotypy: BV421 IgG2b myszy, k Kontrola izotypu (R35-38; 0,2 mg/mL); PE IgG2a Szczur, kontrola izotypu κ (R35-95; 0,2 mg/ml); BB515 Szczur IgG2a, kontrola izotypu κ (R35-95; 0,2 mg / ml). W przypadku zmiany przeciwciała barwiącego należy użyć prawidłowego izotypu.</li>
	<li>Aby zobrazować pachwinowy LN, wstrzyknij 100 μl mieszanki przeciwciał podskórnie w wewnętrzną stronę uda (<silna klasa = "xfig">Ryc. 1A). Alternatywnie, wstrzyknąć podskórnie 50 μl mieszanki przeciwciał do opuszki łapy, aby zobrazować podkolanowy LN (<silna klasa = "xfig">Figura 2A). Używaj delikatnych strzykawek insulinowych o pojemności 1 ml (insulina U-100) z igłą o rozmiarach 0,30 mm × 13 mm (30 G × 1/2 cala). 
	UWAGA: Upewnij się, że wstrzyknięcie do pachwinowego barwienia LN jest podskórne, a nie domięśniowe (i.m.), ponieważ mieszanina przeciwciał nie zostanie prawidłowo opróżniona, jeśli zostanie wykonane podanie domięśniowe.</li>
	<li>Nie należy znieczulać zwierząt przed wstrzyknięciem mieszanki przeciwciał.</li>
	<li>Odczekać co najmniej 3 godziny (dLN pachwinowe) i 12 godzin (dLN podkolanowe) po wstrzyknięciu, aby usunąć narządy.</li>
	<li>Jeśli znakowanie komórek LN nie jest w pełni obserwowane przy użyciu dużych polimerowych barwników fluorescencyjnych, takich jak fiolet brylantowy lub błękit brylantowy, należy użyć mniejszych fluoroforów, w tym izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC), PE i allofikocyjaniny (APC) jako alternatywy.</li>
</ol>
3. Zabieg chirurgiczny usunięcia węzła chłonnego drenującego pachwinę
<ol>
	<li>Eutanazja myszy za pomocą uduszenia CO2 , a następnie zwichnięcia szyjki macicy.</li>
	<li>Unieruchomić myszy na scenie akrylowej za pomocą taśmy klejącej i nałóż olej mineralny za pomocą bawełnianego wacika na skórę brzucha, aby zapobiec osadzaniu się sierści wokół nacięcia (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B). Usuwanie sierści nie jest konieczne.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie linii środkowej za pomocą zakrzywionych nożyczek mikrochirurgicznych (11,5 cm) i zakrzywionych kleszczy mikrochirurgicznych (12,5 cm) w jamie brzusznej od łona do wyrostka mieczykowatego (<silna klasa = "xfig">Ryc. 1C).</li>
	<li>Oddziel mięśnie brzucha od skóry (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D).</li>
	<li>Wykonaj poziome nacięcia skóry u góry i u dołu pionowej linii nacięcia, aby utworzyć płaty skóry po stronie zainteresowania (zgodnie ze stroną wstrzyknięcia mieszanki przeciwciał) i odchyl skórę, aby uwidocznić węzeł chłonny (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1E).</li>
	<li>Przyklej płat skóry do akrylowej płytki (<silna klasa="xfig">Rysunek 1F).</li>
	<li>Usuń pachwinowy węzeł chłonny drenujący za pomocą zakrzywionych kleszczy mikrochirurgicznych (<silna klasa="xfig">Ryc. 1F). Węzeł chłonny pojawi się jako półprzezroczysta, zwykle dwuskrzydłowa kula pod skórą.</li>
</ol>
4. Zabieg chirurgiczny usunięcia węzła chłonnego drenującego podkolanowy
<ol>
	<li>Eutanazja myszy za pomocą uduszenia CO2 , a następnie zwichnięcia szyjki macicy.</li>
	<li>Unieruchom myszy w pozycji leżącej na akrylowej scenie za pomocą taśmy klejącej i nałóż olej mineralny za pomocą bawełnianego wacika w łydkę i kolano (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A-D).</li>
	<li>Wykonaj nacięcie w linii środkowej łydki od pięty do kolana (<silna klasa="xfig">Rysunek 2E,F).</li>
	<li>Oddziel muskulaturę łydki od skóry (<silna klasa="xfig">Rysunek 2F,G).</li>
	<li>Odsłoń dół podkolanowy (<silna klasa="xfig">Rysunek 2G). Węzeł chłonny podkolanowy pojawi się jako półprzezroczysta kula w dole podkolanowym.</li>
	<li>Usuń węzeł chłonny podkolanowy za pomocą zakrzywionych kleszczyków mikrochirurgicznych (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2G).</li>
	<li>Alternatywnie, obróć mysz w pozycji leżącej na plecach i zbliż się do dołu podkolanowego między mięśniem dwugłowym uda a półścięgnistym w celu usunięcia LN podkolanowego, wykonując nacięcie w linii środkowej łydki od pięty do kolana, a następnie dysocjację mięśni łydki od skóry. 
	UWAGA: Dół podkolanowy to płytkie zagłębienie zlokalizowane w tylnej części stawu kolanowego. Otwórz ostrożnie, aby zobaczyć węzeł chłonny podkolanowy.</li>
</ol>
5. Przygotowanie węzłów chłonnych
<ol>
	<li>Umieść cały narząd w naczyniu hodowlanym ze szklanym dnem (35 mm x 10 mm) i usuń tłuszcz otaczający narząd za pomocą zakrzywionych kleszczyków mikrochirurgicznych (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1G-I i <silna klasa = "xfig">Rysunek 2H).</li>
	<li>Wyśrodkuj narząd na środku naczynia (<silna klasa="xfig">Ryc. 1J i <silna klasa="xfig">Ryc. 2H).</li>
	<li>Przykryj narząd fragmentem delikatnych wycieraczek i nasącz go solą fizjologiczną o temperaturze pokojowej 0,9% lub roztworem buforu fosforanowego (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1KM i <silna klasa = "xfig" > Rysunek 2H). 
	UWAGA: Nie jest konieczne mycie węzłów chłonnych po usunięciu ani wykonywanie ekstrakcji węzłów chłonnych w kapturze.</li>
</ol>
6. Mikroskopia konfokalna ex-vivo (obrazowanie)
<ol>
	<li>Umieść szalkę Petriego w szczelinie odwróconego mikroskopu konfokalnego (<silna klasa="xfig">Rysunek 1N i <silna klasa="xfig">Rysunek 2H).</li>
	<li>Obraz LN pod mikroskopem konfokalnym (<silna klasa="xfig">Rysunek 1O i <silna klasa="xfig">Rysunek 2H).</li>
	<li>Po pierwsze, uzyskaj prawidłową ostrość, używając konwencjonalnego światła mikroskopu konfokalnego z obiektywem 4x lub 10x. Następnie zmień funkcję światła na tryb laserowy. 
	UWAGA: Jeśli mikroskop konfokalny nie jest wyposażony w obiektyw 4x, ostrość można uzyskać za pomocą obiektywu 10x.</li>
	<li>Dostosuj moc lasera, przesunięcie i wzmocnienie za pomocą próbki barwionej izotypem, niebarwionej lub niefluorescencyjnej (Tabela 1), aby usunąć autofluorescencję i niespecyficzne barwienie z przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie, takich jak te użyte na obrazach pokazanych w tym manuskrypcie (BV-421 anty-CD4, BB515 anty-CD19 i PE anty-F4/80).</li>
	<li>Dostosuj pozycje Z i XY, używając odpowiednio mikrometrii i rydwanu, w obszarze zainteresowania w węźle chłonnym.</li>
	<li>Rób zdjęcia pod obiektywami 4x, 10x i 20x, koncentrując się na strukturze LN i dystrybucji komórkowej. Użyj rozdzielczości 1024 x 1024 pikseli. 
	UWAGA: Zdobądź co najmniej pięć obrazów w różnych polach na cel dla każdego zwierzęcia.</li>
	<li>Analizuj obrazy za pomocą oprogramowania do obsługi obrazów, aby oddzielić kanały, dodać skalę i kolory będące przedmiotem zainteresowania oraz zrekonstruować widok 3D.</li>
</ol>

<ol><li>Willard-Mack, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+structure%2C+function%2C+and+histology+of+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Normal structure, function, and histology of lymph nodes.</a> Toxicologic Pathology. 34, 409-424 (2006).</li>
<li>Tas, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+antibody+affinity+maturation+in+germinal+centers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing antibody affinity maturation in germinal centers.</a> Science. 351, 1048-1054 (2016).</li>
<li>David, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+Mass+Cytometry+and+Imaging+Analysis+Reveals+Origin%2C+Location%2C+and+Functional+Repopulation+of+Liver+Myeloid+Cells+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Combination of Mass Cytometry and Imaging Analysis Reveals Origin, Location, and Functional Repopulation of Liver Myeloid Cells in Mice.</a> Gastroenterology. 151, 1176-1191 (2016).</li>
<li>Rezende, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gammadelta+T+cells+control+humoral+immune+response+by+inducing+T+follicular+helper+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">gammadelta T cells control humoral immune response by inducing T follicular helper cell differentiation.</a> Nature Communications. 9, 3151(2018).</li>
<li>Nakagaki, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+triple-fluorescent+mouse+strain+allows+a+dynamic+and+spatial+visualization+of+different+liver+phagocytes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Anais+da+Academia+Brasileira+de+Ciencias%22%5BJournal%5D)">Generation of a triple-fluorescent mouse strain allows a dynamic and spatial visualization of different liver phagocytes in vivo.</a> Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 91 (suppl 1), e20170317(2019).</li>
<li>Ajami, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+reveals+distinct+populations+of+brain+myeloid+cells+in+mouse+neuroinflammation+and+neurodegeneration+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry reveals distinct populations of brain myeloid cells in mouse neuroinflammation and neurodegeneration models.</a> Nature Neuroscience. 21, 541-551 (2018).</li>
<li>Becher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-dimensional+analysis+of+the+murine+myeloid+cell+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system.</a> Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).</li>
<li>McElroy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+LYVE-1+antibody+to+image+dynamically+lymphatic+trafficking+of+cancer+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Fluorescent LYVE-1 antibody to image dynamically lymphatic trafficking of cancer cells in vivo.</a> Journal of Surgical Research. 151, 68-73 (2009).</li>
<li>Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+and+antigen+dispersal+landscapes+regulate+T+cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity.</a> The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).</li>
<li>Hauser, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+germinal-center+B+cell+migration+in+vivo+reveals+predominant+intrazonal+circulation+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Definition of germinal-center B cell migration in vivo reveals predominant intrazonal circulation patterns.</a> Immunity. 26, 655-667 (2007).</li>
<li>Allen, C. D., Okada, T., Tang, H. L., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+germinal+center+selection+events+during+affinity+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging of germinal center selection events during affinity maturation.</a> Science. 315, 528-531 (2007).</li>
<li>Arnon, T. I., Horton, R. M., Grigorova, I. L., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+splenic+marginal+zone+B-cell+shuttling+and+follicular+B-cell+egress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualization of splenic marginal zone B-cell shuttling and follicular B-cell egress.</a> Nature. 493, 684-688 (2013).</li>
<li>Sipkins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+specialized+bone+marrow+endothelial+microdomains+for+tumour+engraftment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment.</a> Nature. 435, 969-973 (2005).</li>
<li>Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W. Jr, Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+shuttling+of+marginal+zone+B+cells+facilitates+antigen+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport.</a> Nature Immunology. 9, 54-62 (2008).</li>
<li>Pereira, J. P., An, J., Xu, Y., Huang, Y., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabinoid+receptor+2+mediates+the+retention+of+immature+B+cells+in+bone+marrow+sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cannabinoid receptor 2 mediates the retention of immature B cells in bone marrow sinusoids.</a> Nature Immunology. 10, 403-411 (2009).</li>
<li>Nakagaki, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+and+metabolic+shifts+during+neonatal+development+reprogram+liver+identity+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Immune and metabolic shifts during neonatal development reprogram liver identity and function.</a> Journal of Hepatology. (6), 1294-1307 (2018).</li>
<li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+in+Genome+Editing+and+Beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).</li>
<li>Roozendaal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conduits+mediate+transport+of+low-molecular-weight+antigen+to+lymph+node+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Conduits mediate transport of low-molecular-weight antigen to lymph node follicles.</a> Immunity. 30, 264-276 (2009).</li>
<li>Sarder, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-near-infrared+multiphoton+microscopy+interrogates+intact+tissues+at+deeper+imaging+depths+than+conventional+single-+and+two-photon+near-infrared+excitation+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">All-near-infrared multiphoton microscopy interrogates intact tissues at deeper imaging depths than conventional single- and two-photon near-infrared excitation microscopes.</a> Journal of Biomedical Optics. 18, 106012(2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Połączenie obrazowania z innymi technikami, w tym biologią molekularną i wysokowymiarowym immunofenotypowaniem, zwiększyło naszą zdolność do badania komórek odpornościowych w ich naturalnym kontekście. W rzeczywistości, podczas gdy inne podejścia mogą wymagać trawienia tkanek i izolacji komórek – co może prowadzić do utraty integralności tkanek – zastosowanie obrazowania in vivo lub ex vivo daje ogromną przewagę w badaniu różnych podtypów komórek w sposób geograficzny 3,16<sup class="xr...

Węzły chłonne (LN) to jajowate narządy, szeroko obecne w całym ciele, z kluczową funkcją łączenia wrodzonej i adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej. LN filtrują limfę w celu zidentyfikowania obcych cząstek i komórek rakowych w celu wywołania odpowiedzi immunologicznej przeciwko nim1. Komórki prezentujące antygen (APC), limfocyty T i limfocyty B współpracują ze sobą w celu wytworzenia przeciwciał specyficznych dla antygenu (odporność humoralna) i limfocytów cytotoksycznych (odporność komórkowa) w celu wyeliminowania obcych cząstek i komórek rakowych2. W związku z tym zrozumienie dynamiki komórek odpornościowych obecnych w układzie limfatycznym będzie miało ważne implikacje dla opracowania szczepionki i immunoterapii nowotworów.
Pojawienie się potężnych mikroskopów - w tym nowych mikroskopów konfokalnych i superrozdzielczych - pozwoliło na niezwykły postęp w zrozumieniu, jak różne populacje komórek odpornościowych zachowują się w swoim naturalnym środowisku3. Obecnie możliwe jest obrazowanie kilku jednoczesnych podtypów komórek za pomocą kombinacji sond z genetycznie zmodyfikowanymi myszami, które wyrażają białka fluorescencyjne pod kontrolą określonych celów4,5. W rzeczywistości techniki wielowymiarowe, w tym cytometria masowa i wieloparametryczna analiza przepływu, miały kluczowe znaczenie dla poszerzenia naszej wiedzy na temat różnych przedziałów i funkcjonalności komórek odpornościowych w zdrowiu i chorobie<klasa sup="xref">6,7. Jednak, aby przygotować próbki do tych technik, tkanki muszą zostać strawione, a komórki są oddzielane od swojego naturalnego środowiska w celu analizy w zawiesinach komórkowych. Aby przezwyciężyć te ograniczenia i umożliwić lepszą translację w biologii, celem proponowanego tutaj protokołu jest zastosowanie prostej metodologii do obrazowania ex vivo całych węzłów chłonnych przy użyciu standardowych mikroskopów konfokalnych z korzyścią dla lepszej szybkości, zachowania struktury tkankowej i żywotności komórek w porównaniu z konwencjonalnym barwieniem immunofluorescencyjnym. Stosując to podejście, byliśmy w stanie wykazać, że myszy z niedoborem limfocytów T γδ, podtypu limfocytów T zaangażowanych we wczesną obronę gospodarza przed patogenami4, mają naruszone pęcherzyki i strefy limfocytów T w porównaniu z myszami typu dzikiego. Te odkrycia pozwoliły nam kontynuować badanie, w którym wykazaliśmy, że limfocyty T γδ odgrywają kluczową rolę w homeostazie narządów limfatycznych i humoralnej odpowiedzi immunologicznej4. Co więcej, protokół ten zapewnia fizjologiczną ścieżkę dla sond i przeciwciał, aby dotrzeć do węzła chłonnego, ponieważ są one podawane podskórnie i rozpraszają się w tkankowym krążeniu limfatycznym, opierając się na poprzednich raportach, w których stosowano znakowanie in situ przeciwciałami w celu wizualizacji struktur związanych z limfą8,9, dynamika centrum zarodkowego10,11,12, a cele łatwo dostępne dla przepływu krwi13,14,15.

<table><tbody><tr><td>BV421 anty-CD4</td><td>BD Horizon</td><td>562891</td><td>GK1.5; 0,2 mg mL-1</td></tr><tr><td>BB515 anty-CD19</td><td>BD Horizon</td><td>564509</td><td>1D3; 0,2 mg mL-1</td></tr><tr><td>BB515 Szczur IgG2a, &kappa; Kontrola izotypu</td><td>BD Horizon</td><td>564418</td><td>R35-95; 0,2 mg mL-1</td></tr><tr><td>BV421 Mysz IgG2b, K Kontrola izotypu</td><td>BD Horizon</td><td>562603</td><td>R35-38 0,2 mg mL-1</td></tr><tr><td>Cellview naczynie hodowlane</td><td>Greiner-Bio</td><td>627861</td><td>35x10 mm ze szklanym dnem</td></tr><tr><td>Strzykawki insulinowe</td><td>BD Plastipak-Insulina</td><td></td> <td>U-100</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Marka Naukowa Kimtech</td><td>7557</td><td>rozmiar 21 x 20 cm / 100 arkuszy w pudełku</td></tr><tr><td>Zakrzywione kleszcze mikrochirurgiczne</td><td>Instrumenty chirurgiczne WEP</td><td>wykonane na zamówienie</td><td>12,5 cm</td></tr><tr><td>Zakrzywione nożyczki do mikrochirurgii</td><td>Instrumenty chirurgiczne WEP</td><td>wykonane na zamówienie</td><td>11,5 cm</td></tr><tr><td>Igła</td><td>BD PrecisionGlide-30</td><td></td> <td>miernik i czasy; &frac12; cal</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Te + A1R głowica konfokalna</td><td>Nikon</td><td>-</td><td>załadowane 4 głównymi liniami laserowymi (405, 488, 543 i 647 nm)</td></tr><tr><td>PE anty-F4/80</td><td>BD Pharmigen</td><td>565410</td><td>T45-2342; 0,2 mg mL-1</td></tr><tr><td>PE Rat IgG2a, &kappa; Isotype Control</td><td>BD Pharmigen</td><td>553930</td><td>R35-95; 0,2 mg mL-1</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny Zeiss LSM 710 Zeiss</td><td></td><td></td> z <td>4 głównymi liniami laserowymi (405, 488, 543 i 647 nm)</td></tr></tbody></table>

wizualizacja struktury węzłów chłonnych i lokalizacji komórkowej za pomocą mikroskopii konfokalnej ex-vivo

Visualizing Lymph Node Structure and Cellular Localization using Ex-Vivo Confocal Microscopy

Węzły chłonne (LN) to narządy rozsiane w organizmie, gdzie wrodzone reakcje immunologiczne mogą łączyć się z odpornością adaptacyjną. W rzeczywistości LN są strategicznie umieszczane na ścieżce naczyń limfatycznych, umożliwiając intymny kontakt antygenów tkankowych ze wszystkimi rezydującymi komórkami odpornościowymi w LN. W ten sposób zrozumienie składu, dystrybucji, lokalizacji i interakcji komórkowych za pomocą obrazowania ex vivo całego LN wzbogaci wiedzę na temat tego, w jaki sposób organizm koordynuje miejscowe i ogólnoustrojowe odpowiedzi immunologiczne. Protokół ten przedstawia strategię obrazowania ex vivo po podaniu in vivo przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie, która umożliwia bardzo powtarzalną i łatwą do wykonania metodologię przy użyciu konwencjonalnych mikroskopów konfokalnych i odczynników podstawowych. Poprzez podskórne wstrzyknięcie przeciwciał możliwe jest znakowanie różnych populacji komórek w drenażowych LN bez wpływu na struktury tkankowe, które mogą zostać potencjalnie uszkodzone przez konwencjonalną technikę mikroskopii immunofluorescencyjnej.

Niniejszy artykuł przedstawia techniki usuwania węzłów chłonnych pachwinowych i podkolanowych bez uszkadzania ich struktury po wstrzyknięciu przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie w celu barwienia specyficznych populacji komórek w tych organach (Rysunek 1 i Rysunek 2).
Zastosowanie potężnej kombinacji immunoznakowania komórek węzłów chłonnych (LN) przeciwciałami BV421 anty-CD4 i BB515 anty-CD19 wraz z analizą obrazowania konfokalneg...

Ten protokół opisuje technikę obrazowania różnych populacji komórek w drenujących węzłach chłonnych bez zmian w strukturze narządu.

Wizualizacja struktury węzłów chłonnych i lokalizacji komórkowej za pomocą mikroskopii konfokalnej ex-vivo

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are ...

Ten powtarzalny i łatwy do wykonania protokół wykorzystuje strategię obrazowania węzłów chłonnych ex-vivo do śledzenia drenażu podawanych in vivo przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie do lokalnych wtórnych narządów limfatycznych. Zademonstrowanie tej techniki pozwala na specyficzną wizualizację procedury, co może ułatwić pomyślne wykonanie protokołu. Jest to bardzo prosta i nieskomplikowana technika, którą może wykonać każdy.Jedynym wyzwaniem jest obsługa myszy, która wymaga pewnego treningu. Zaletą tej techniki jest poprawa szybkości zachowania wysiłku tkankowego i żywotności komórek w porównaniu z konwencjonalnymi metodami barwienia fluorescencyjnego. Szkolenie w zakresie procedury miała prowadzić Bruna Tatematsu, technik z laboratorium.Rozcieńczyć interesujące nas przeciwciała, sprzężone z odpowiednimi fluoroforami, w 100 mikrolitrach PBS do obrazowania pachwinowych węzłów chłonnych lub 50 mikrolitrach PBS do obrazowania węzłów chłonnych podniebiennych. W przypadku obrazowania pachwinowych węzłów chłonnych załaduj 100 mikrolitrów koktajlu przeciwciał do jednomililitrowej strzykawki insulinowej, wyposażonej w igłę o wymiarach 30 na pół cala i podskórnie wstrzyknij przeciwciała do wewnętrznej strony uda eksperymentalnej myszy. W przypadku obrazowania węzłów chłonnych podkolanowych wstrzyknąć podskórnie 50 mikrolitrów koktajlu przeciwciał do jednej opuszki łapy zwierzęcia doświadczalnego.Następnie umieść zwierzę z powrotem w jego pudełku domowym. W celu pobrania węzłów chłonnych drenujących pachwiny, po odczekaniu co najmniej trzech godzin od wstrzyknięcia, unieruchomij mysz na etapie akrylowym za pomocą taśmy klejącej i nałóż olej mineralny na skórę brzucha. Użyj standardowych nożyczek mikrochirurgicznych i zakrzywionych kleszczy mikrochirurgicznych, aby wykonać nacięcie skóry w linii środkowej brzucha od łona do wyrostka ksyloidalnego i oddzielić mięśnie brzucha od skóry.Wykonaj poziome nacięcia skóry w górnej i dolnej części pionowej linii nacięcia, aby utworzyć płaty skóry po stronie wstrzyknięcia i cofnij skórę, aby uwidocznić węzeł chłonny. Przymocuj płat skóry do płytki akrylowej i użyj kleszczy, aby usunąć półprzezroczysty, zwykle dwuskładnikowy sferyczny pachwinowy drenujący węzeł chłonny. W celu pobrania węzłów chłonnych drenujących podkolanówkę, co najmniej 12 godzin po wstrzyknięciu, unieruchomij mysz w pozycji leżącej na akrylowym stoliku.Nałóż olej mineralny na łydkę i kolano po stronie wstrzyknięcia zwierzęcia. Następnie wykonaj nacięcie w linii środkowej łydki od pięty do kolana i oddziel mięśnie łydki od skóry. Odsłoń dół podkolanowy.Węzeł chłonny podkolanowy pojawi się jako półprzezroczysta kula w dole. Następnie usuń węzeł chłonny za pomocą zakrzywionych kleszczy mikrochirurgicznych. Aby przygotować węzeł chłonny do obrazowania, umieść całe narządy w naczyniu hodowlanym o wymiarach 35 na 10 milimetrów ze szklanym dnem i użyj kleszczy, aby usunąć tłuszcz otaczający tkankę.Wyśrodkuj narząd na środku naczynia i przykryj tkankę kawałkiem delikatnej wycieraczki nasączonej solą fizjologiczną. W przypadku obrazowania ex vivo umieść czaszę w szczelinie odwróconego mikroskopu konfokalnego i użyj konwencjonalnego światła mikroskopu konfokalnego i obiektywu 4-10X, aby uzyskać prawidłową ostrość. Zmień funkcję światła na tryb laserowy i użyj próbki barwionej izotopem, niebarwionej lub niefluorescencyjnej, aby dostosować moc lasera, przesunięcie i wzmocnienie, aby usunąć autofluorescencję i wszelkie nieokreślone barwienia.Rób zdjęcia w obiektywach 4, 10 i 20X, koncentrując się na strukturze węzłów chłonnych i dystrybucji komórkowej oraz używając rozdzielczości 1024 na 1024 piksele. Następnie użyj odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazowania, aby oddzielić kanały, dodać skalę i kolory, które Cię interesują, oraz zrekonstruować widok 3D. Silne połączenie znakowania immunologicznego komórek węzłów chłonnych z przeciwciałami anty-CD4 i anty-CD19 oraz analiza obrazowania konfokalnego umożliwia lokalizację limfocytów T i B w pachwinowych węzłach chłonnych.W węzłach chłonnych podkolanowych, podobnie jak w tkance pachwinowej, pęcherzyki komórek B są otoczone populacjami limfocytów T, co jest cechą charakterystyczną struktury węzłów chłonnych. Jak zaobserwowano na tych obrazach, fagocyty nie internalizują wstrzykniętych przeciwciał, co wskazuje, że barwienie limfocytów B i T jest specyficzne. Co więcej, ponowna rekonstrukcja oznakowania wskazuje, że barwienie limfocytów T i B nie nakłada się na siebie, co dodatkowo potwierdza specyficzność barwienia.Komórki jednokomórkowe obserwuje się w całym pachwinowym węźle chłonnym, w tym w zatoce podtorebkowej. Przy czym większość komórek jednojądrzastych wykazuje ekspresję CX3XR1, a następnie CCR2 i CXCR31CCR2 podwójnie dodatnie komórki. Ten sam wzorzec rozmieszczenia komórek i fenotypy komórek obserwuje się w węźle chłonnym podkolanowym.Oba węzły chłonne wykazują również ciemne obszary bez ekspresji receptora komórki jednojądrzastej, które są zajęte przez limfocyty. Co więcej, komórki jednojądrzaste są rzadkie w wewnętrznym obszarze węzłów chłonnych, pozostając skoncentrowane w zewnętrznych obszarach tkanki, co wskazuje, że komórki te zajmują głównie zatokę podtorebkową węzła chłonnego. Mieszanina przeciwciał musi być precyzyjnie wstrzyknięta do tkanki podskórnej, aby układ limfatyczny mógł prawidłowo odprowadzić przeciwciała do węzła chłonnego.Metoda ta może być stosowana do biodystrybucji leków znakowanych fluorescencyjnie oraz do badań celowania w komórki nanocząstek znakowanych fluorescencyjnie.

visualizing-lymph-node-structure-cellular-localization-using-ex-vivo

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Obrazowanie dwufotonowe pozwoliło na odkrycie ruchomości limfocytów oraz oddziaływań komórkowych w obrębie węzła chłonnego w warunkach podstawowych oraz podczas odpowiedzi immunologicznej 1. W niniejszej pracy demonstrujemy adoptywny transfer limfocytów T, izolację węzłów chłonnych oraz obrazowanie ruchomości limfocytów T CD4+ w wypreparowanym węźle chłonnym.

Disekcja i obrazowanie dwufotonowe obwodowych węzłów chłonnych u myszy

Niniejszy protokół opisuje metodę obrazowania fluorescencyjnych limfocytów T wprowadzonych do przekrojów węzła chłonnego. Technika ta umożliwia analizę migracji limfocytów T w czasie rzeczywistym przy użyciu tradycyjnych mikroskopów fluorescencyjnych w szerokim polu lub mikroskopów konfokalnych.

Obrazowanie ex vivo limfocytów T w przekrojach węzłów chłonnych myszy z wykorzystaniem mikroskopii szerokopolowej i konfokalnej

Ostatnie postępy w mikroskopii dwufotonowej umożliwiły obrazowanie in situ żywych tkanek w modelach zwierzęcych w czasie rzeczywistym, co zwiększyło nasze możliwości badania zachowania komórek zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych. W niniejszym materiale przedstawiamy przygotowania niezbędne do przeprowadzenia obrazowania przyżyciowego węzła chłonnego podkolanowego myszy.

Obrazowanie intravitalne węzła chłonnego podkolanowego myszy

Niedawno opracowane techniki obrazowania z wykorzystaniem fluorescencji w bliskiej podczerwieni (NIRF) mogą pomóc w wyjaśnieniu roli, jaką układ limfatyczny odgrywa w przerzutowaniu nowotworów, odpowiedzi immunologicznej, gojeniu ran oraz innych chorobach związanych z układem limfatycznym.

Nieinwazyjne obrazowanie optyczne naczyń limfatycznych myszy

Ten film demonstruje technikę preparacji w celu pobrania węzłów chłonnych drenujących podkolanowe z tylnych nóg myszy. Węzły chłonne odgrywają kluczową rolę w łączeniu odporności wrodzonej i nabytej, a pobieranie nienaruszonych węzłów chłonnych – z zachowaną strukturą tkankową i żywotnością komórek – może pomóc w badaniu miejscowych i ogólnoustrojowych odpowiedzi immunologicznych.

Metoda preparacji w celu pobrania mysich węzłów chłonnych drenujących podkolanowe do obrazowania ex vivo

Obrazowanie przyżyciowe o wysokiej rozdzielczości ze zwiększonym kontrastem do głębokości 120 μm w węzłach chłonnych dorosłych myszy osiąga się poprzez przestrzenną modulację wzorca wzbudzenia wieloogniskowego mikroskopu dwufotonowego. Na głębokości 100 μm zmierzyliśmy rozdzielczości 487 nm (boczna) i 551 nm (osiowa), omijając w ten sposób granice rozpraszania i dyfrakcji.

Wysokorozdzielcza przyżyciowa mikroskopia pasiasta ośrodków rozrodczych

Macierz zewnątrzkomórkowa ulega znacznej przebudowie podczas gojenia się ran, stanów zapalnych i nowotworzenia. Przedstawiamy nowatorskie podejście do mikroskopii immunofluorescencyjnej przyżyciowej do wizualizacji dynamiki fibrylarnych, a także siatkowych składników matrycy z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową przy użyciu mikroskopii epifluorescencyjnej lub dwufotonowej.

Długoterminowe przyżyciowe obrazowanie immunofluorescencyjne składników macierzy tkankowej z mikroskopią epifluorescencyjną i dwufotonową

Ten protokół opisuje metodę obrazowania rezydentnych komórek T CD8 infiltrujących nowotwór, oznaczonych fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami w wycinkach ludzkiego guza płuc. Technika ta umożliwia analizę migracji limfocytów T CD8 w czasie rzeczywistym przy użyciu mikroskopii konfokalnej.

Ex vivo Obrazowanie rezydentnych limfocytów T CD8 w wycinkach ludzkiego guza płuc za pomocą mikroskopii konfokalnej

Przedstawiono protokół łączący oczyszczanie tkanek z mikroskopią fluorescencyjną (LSFM) w celu uzyskania trójwymiarowych i komórkowych obrazów naczyń limfatycznych i węzłów chłonnych (LN) zbierających płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) i płyn zewnątrzoponowy rdzeniowy.

Trójwymiarowe obrazowanie układu naczyniowego i drenażu limfatycznego kręgów przy użyciu iDISCO+ i mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych

Przedstawiono tutaj protokół do oceny naczyń limfatycznych oponowych myszy (MLV), które odgrywają ważną rolę w wielu chorobach neurologicznych. Celem tego protokołu jest zapewnienie zintegrowanej metody, która umożliwia zarówno funkcjonalną ocenę drenażu znacznika, jak i szczegółową charakteryzację morfologiczną sieci grzbietowych MLV.

Zintegrowany Protokół Oceny Naczyń Chłonnych Opon Mózgowo-rdzeniowych: Wstrzyknięcie do Cisterny Magny, Wizualizowanie Węzłów Chłonnych, Sekcja Opon Mózgowo-rdzeniowych i Barwienie Całego Montażu

Poznaj technikę obrazowania ex-vivo węzłów chłonnych myszy przy użyciu fluorescencyjnych przeciwciał i mikroskopii konfokalnej. Metoda umożliwia wizualizację komórek T i B z zachowaniem struktury tkanek.

Wizualizacja struktury węzłów chłonnych i lokalizacji komórkowej za pomocą mikroskopii konfokalnej ex-vivo

Przeglądaj więcej filmów