Name: Badanie nabłonkowego wpływu zapalenia jelit in vitro na ustalone mysie kolonoidy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T14:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Poznaj izolację krypt jelita grubego myszy i hodowlę kolonoidów 3D do badania fizjologii jelit oraz funkcji bariery nabłonkowej w stanach zapalnych, zwłaszcza w chorobie Leśniowskiego-Crohna i wrzodziejącym zapaleniu jelita grubego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health Grants R01DK120986 (do K.P.M.).

Epithelial Effects of Intestinal Inflammation on Established Murine Colonoids

<ol><li>Martini, E., Krug, S. M., Siegmund, B., Neurath, M. F., Becker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mend+your+fences%3A+The+epithelial+barrier+and+its+relationship+with+mucosal+immunity+in+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Mend your fences: The epithelial barrier and its relationship with mucosal immunity in inflammatory bowel disease.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (1), 33-46 (2017).</li>
<li>McGuckin, M. A., Rajaraman, E., Simms, L. A., Florin, T. H. J., Radford-Smith, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+barrier+dysfunction+in+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Diseases%22%5BJournal%5D)">Intestinal barrier dysfunction in inflammatory bowel diseases.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 15 (1), 100-113 (2009).</li>
<li>Joshi, A., Soni, A., Acharya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+and+ex+vivo+systems+used+in+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Models%22%5BJournal%5D)">In vitro models and ex vivo systems used in inflammatory bowel disease.</a> In Vitro Models. 1 (3), 213-227 (2022).</li>
<li>Goyal, N., Rana, A., Ahlawat, A., Bijjem, K. R., Kumar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+inflammatory+bowel+disease%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammopharmacology%22%5BJournal%5D)">Animal models of inflammatory bowel disease: A review.</a> Inflammopharmacology. 22 (4), 219-233 (2014).</li>
<li>Ostanin, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+transfer+model+of+chronic+colitis%3A+Concepts%2C+considerations%2C+and+tricks+of+the+trade%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">T cell transfer model of chronic colitis: Concepts, considerations, and tricks of the trade.</a> American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 296 (2), 135-146 (2009).</li>
<li>Bhinder, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Citrobacter+rodentium+mouse+model%3A+Studying+pathogen+and+host+contributions+to+infectious+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The Citrobacter rodentium mouse model: Studying pathogen and host contributions to infectious colitis.</a> Journal of Visualized Experiments. (72), e50222(2013).</li>
<li>Bhan, A. K., Mizoguchi, E., Smith, R. N., Mizoguchi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colitis+in+transgenic+and+knockout+animals+as+models+of+human+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Colitis in transgenic and knockout animals as models of human inflammatory bowel disease.</a> Immunological Reviews. 169, 195-207 (1999).</li>
<li>Okayasu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+in+the+induction+of+reliable+experimental+acute+and+chronic+ulcerative+colitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice.</a> Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).</li>
<li>Dotti, I., Salas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+use+of+human+stem+cell-derived+intestinal+organoids+to+study+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Diseases%22%5BJournal%5D)">Potential use of human stem cell-derived intestinal organoids to study inflammatory bowel diseases.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 24 (12), 2501-2509 (2018).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Santos, A. J. M., Lo, Y. H., Mah, A. T., Kuo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+stem+cell+niche%3A+Homeostasis+and+adaptations%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The intestinal stem cell niche: Homeostasis and adaptations.</a> Trends in Cell Biology. 28 (12), 1062-1078 (2018).</li>
<li>Yin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche-independent+high-purity+cultures+of+Lgr5%2B+intestinal+stem+cells+and+their+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Niche-independent high-purity cultures of Lgr5+ intestinal stem cells and their progeny.</a> Nature Methods. 11 (1), 106-112 (2014).</li>
<li>Wilson, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+culture+conditions+for+improved+growth+and+functional+differentiation+of+mouse+and+human+colon+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Optimized culture conditions for improved growth and functional differentiation of mouse and human colon organoids.</a> Frontiers in Immunology. 11, 547102(2021).</li>
<li>Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+intestinal+inflammation+in+DSS-induced+model+of+IBD%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Investigating intestinal inflammation in DSS-induced model of IBD.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), e3678(2012).</li>
<li>Cunningham, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+proliferator-activated+receptor-%CE%B3+coactivator+1-%CE%B1+%28PGC1%CE%B1%29+protects+against+experimental+murine+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator 1-α (PGC1α) protects against experimental murine colitis.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10184-10200 (2016).</li>
<li>Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+and+genetic+modification+of+gastrointestinal+stem+cells+in+spheroid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture.</a> Nature Protocols. 8 (12), 2471-2481 (2013).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Julian, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelium+is+more+susceptible+to+cytopathic+injury+and+altered+permeability+than+the+lung+epithelium+in+the+context+of+acute+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Experimental+Pathology%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelium is more susceptible to cytopathic injury and altered permeability than the lung epithelium in the context of acute sepsis.</a> International Journal of Experimental Pathology. 92 (5), 366-376 (2011).</li>
<li>Haberman, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ulcerative+colitis+mucosal+transcriptomes+reveal+mitochondriopathy+and+personalized+mechanisms+underlying+disease+severity+and+treatment+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Ulcerative colitis mucosal transcriptomes reveal mitochondriopathy and personalized mechanisms underlying disease severity and treatment response.</a> Nature Communications. 10, 38(2019).</li>
<li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+transcription+factor+A+plays+opposite+roles+in+the+initiation+and+progression+of+colitis-associated+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Communications%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial transcription factor A plays opposite roles in the initiation and progression of colitis-associated cancer.</a> Cancer Communications. 41 (8), 695-714 (2021).</li>
<li>Maidji, E., Somsouk, M., Rivera, J. M., Hunt, P. W., Stoddart, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+CMV+in+the+gut+of+HIV-infected+individuals+and+epithelial+barrier+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogen%22%5BJournal%5D)">Replication of CMV in the gut of HIV-infected individuals and epithelial barrier dysfunction.</a> PLoS Pathogen. 13, 1006202(2017).</li>
<li>Noel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primary+human+macrophage-enteroid+co-culture+model+to+investigate+mucosal+gut+physiology+and+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions.</a> Scientific Reports. 7, 452-470 (2017).</li>
<li>Grondin, J., Kwon, Y., Far, P., Haq, S., Khan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucins+in+Intestinal+mucosal+defense+and+inflammation%3A+Learning+from+clinical+and+experimental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mucins in Intestinal mucosal defense and inflammation: Learning from clinical and experimental studies.</a> Frontiers in Immunology. 11, 2054(2020).</li>
<li>Metcalfe, C., Kljavin, N. M., Ybarra, R., de Sauvage, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5%2B+stem+cells+are+indispensable+for+radiation-induced+intestinal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Lgr5+ stem cells are indispensable for radiation-induced intestinal regeneration.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 149-159 (2014).</li>
<li>Yui, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YAP%2FTAZ-Dependent+reprogramming+of+colonic+epithelium+links+ECM+remodeling+to+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">YAP/TAZ-Dependent reprogramming of colonic epithelium links ECM remodeling to tissue regeneration.</a> Cell Stem Cell. 22 (1), 35-49 (2018).</li>
<li>Komiya, Y., Habas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signal+transduction+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">Wnt signal transduction pathways.</a> Organogenesis. 4 (2), 68-75 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Rozwój organoidów zrewolucjonizował sposób, w jaki społeczność naukowa bada układy narządów in vitro , dzięki zdolności do częściowego odtworzenia struktury i funkcji komórkowej zwierzęcia lub człowieka w naczyniu. Co więcej, systemy organoidowe pochodzące od ludzi z chorobami stanowią obiecujące narzędzie dla medycyny spersonalizowanej, które może pomóc w podejmowaniu decyzji terapeutycznych. W tym miejscu opisujemy protokół izolacji krypty, który działa dobrze i wprowadzamy kluczowe kroki, które pozwalają na u...

Nieswoiste zapalenie jelit (IBD) jest przewlekłą, remisyjną i nawracającą chorobą charakteryzującą się epizodami zapalenia i klinicznego spoczynku. Etiologia IBD jest wieloczynnikowa, ale kluczowymi cechami charakterystycznymi choroby są wadliwa funkcja bariery i zwiększona przepuszczalność nabłonka jelitowego, a także prozapalne kaskady sygnalizacyjne aktywowane w obrębie przedziału nabłonkowego1,2. Do podsumowania odpowiedzi nabłonkowej podczas IBD wykorzystano kilka modeli in vitro i in vivo, w tym hodowle komórkowe i mysie modele zapalenia3. Jednak wszystkie te systemy mają poważne wady, które ograniczają ich zdolność do rekapitulacji zmian nabłonkowych podczas IBD4. Większość linii komórkowych wykorzystywanych do badania IBD jest transformowana, ma zdolność do tworzenia monowarstwy i może różnicować się3, ale wewnętrznie rozprzestrzenia się inaczej niż nieprzekształcone komórki nabłonka jelitowego w gospodarzu. Do badania IBD wykorzystuje się kilka różnych mysich modeli zapalenia, z których niektóre obejmują modele nokautujące, modele zakaźne, chemiczne modele zapalne i modele transferu komórek T5,6,7,8. Chociaż każdy z nich może badać pewne aspekty etiologiczne IBD, takie jak predyspozycje genetyczne, dysfunkcja bariery pokarmowej, deregulacja immunologiczna i mikrobiom, mają ograniczoną zdolność do badania wieloczynnikowego charakteru choroby.
Organoidy jelitowe, w tym enteroidy i kolonoidy, zostały ustanowione w ciągu ostatniej dekady jako użyteczny model in vitro do badania nie tylko dynamiki jelitowych komórek macierzystych, ale także ich roli, integralności bariery i funkcji nabłonka jelitowego w homeostazie jelit i chorobie. Podmioty te znacząco przyczyniły się do naszego zrozumienia patogenezy IBD9 i otworzyły nowe możliwości dla medycyny spersonalizowanej. Kolononice, czyli samoorganizujące się kultury tkankowe z okrężnicy pochodzące z komórek macierzystych, zostały opracowane zarówno z tkanki mysjej, jak i ludzkiej w procesie, który umożliwia namnażanie się komórek macierzystych znajdujących się w kryptach jelitowych i utrzymywanie ich w nieskończoność10. Nisza komórek macierzystych in vivo opiera się na czynnikach zewnątrzkomórkowych wspierających jej wzrost, w szczególności na kanonicznych szlakach sygnałowych Wnt i morfogennych białek kostnych11. Dodanie tych czynników sprzyja zdrowiu i długowieczności kolonoidów, ale także prowadzi hodowlę w kierunku stanu podobnego do komórek macierzystych, który nie odzwierciedla architektury komórkowej nabłonka in vivo, która składa się zarówno z samoodnawiających się, jak i terminalnie zróżnicowanych komórek12,13. Podczas gdy funkcjonalność nabłonka jelitowego zależy od ciągłego przesłuchu między przedziałem komórek macierzystych a zróżnicowanymi komórkami, zdolność do posiadania obu tych elementów w systemie hodowli okrężnicy jest dość ograniczona. Pomimo tych ograniczeń, system hodowli organoidów pozostaje złotym standardem w badaniu wewnętrznych właściwości nabłonka ex vivo. Niemniej jednak może być konieczne rozważenie alternatywnych strategii kulturowych, aby odpowiedzieć na zadane pytanie naukowe.
Wykazano, że u myszy na ciągłym 7-dniowym schemacie siarczanu sodu dekstranu (DSS) rozwijają zarówno zapalenie nabłonka, jak i dysfunkcję bariery 14. Co więcej, niepowodzenie biogenezy mitochondriów i przeprogramowanie metaboliczne w nabłonku jelitowym, które, jak wykazano, są widoczne w ludzkim IBD, zostały również uchwycone w tym modelu DSS zapalenia jelita grubego15. Jednak nasze wstępne dane pokazują, że cechy niewydolności biogenezy mitochondriów nie są zachowane w kolonoidach pochodzących z krypt zwierząt leczonych DSS (rysunek uzupełniający 1). Dlatego przy badaniu, w jaki sposób stan zapalny napędza zmiany nabłonkowe podczas zapalenia jelit mysich, należy zastosować alternatywne metody hodowli. W tym miejscu przedstawiamy opracowany przez nas protokół, który opisuje: 1) jak wyizolować krypty z całej tkanki okrężnicy w celu ustanowienia mysich kolonoidów, 2) jak ostatecznie różnicować tę populację komórek, aby odzwierciedlić populację komórek tak, jak wygląda in vivo, oraz 3) jak wywołać stan zapalny w tym modelu in vitro. Aby zbadać interakcje leków w obrębie nabłonka objętego stanem zapalnym, opracowaliśmy protokół ustanawiania monowarstw 2-wymiarowych (2D) z mysich kolonoidów, które można zasadniczo leczyć mediatorami stanu zapalnego i leczyć wierzchołkowo terapiami lekowymi.

<table><tbody><tr><td>0,4-&mu; M przezroczyste transwell, 24-dołkowe</td><td>rurki stożkowe Greiner Bio-one</td><td>662-641</td><td></td></tr><tr><td>15 ml</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>12-565-269</td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 50 ml</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>12-565-271</td><td></td></tr><tr><td>70-&mu; Filtr siatkowy M</td><td>VWR</td><td>76327-100</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>12634-010</td><td>Koncentracja zapasów (1x); Stężenie końcowe (1x)</td></tr><tr><td>B-27 suplement&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>12587-010</td><td>Koncentracja zapasów (50x); Stężenie końcowe (1x)</td></tr><tr><td>Pałeczki Zestaw elektrod do EVO</td><td>World Precision Instruments</td><td>STX2</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel GFR Membrane Mix</td><td>Corning</td><td>354-230</td><td>Stężenie zapasu (100%); Stężenie końcowe (100%)</td></tr><tr><td>Ditiothreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632-5G</td><td>Stężenie zapasów (1 m); stężenie końcowe (1,5 mM); Rozpuszczalnik (woda ultraczysta)</td></tr><tr><td>DMEM o wysokiej zawartości glukozy</td><td>Thermo Fisher</td><td>11960-069</td><td>Stężenie zapasów (1x); Stężenie końcowe (1x)</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco bez wapnia i magnezu</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>14190-144</td><td>Koncentracja zapasów (1x); Stężenie końcowe (1x)</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (ETDA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7889</td><td>Stężenie podstawowe (0,5 m); Stężenie końcowe (30 mM)</td></tr><tr><td>Stężenie surowicy płodowej bydlęcej</td><td>Bio-Techne</td><td>S11150H</td><td>(100%); Stężenie końcowe (1%)</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe Fisherbrand Superfrost Plus, białe, 25 x 75 mm</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>InvivoGen</td><td>ant-ga-1</td><td>Stężenie końcowe (400 &mikro; g/&mikro; L)</td></tr> <tr><td>Odczynnik gentamycyny</td><td>Gibco/Fisher</td><td>15750-060</td><td>Stężenie podstawowe (50 mg / ml); Stężenie końcowe (250 &mu; g/mL)</td></tr><tr><td>GlutaMAX-1</td><td>Fisher Scientific</td><td>35050-061</td><td>Stężenie zapasów (100x); Stężenie końcowe (1x)</td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>Stężenie zapasu (1 m); Stężenie końcowe (10 mM)</td></tr><tr><td>hIFN&gamma;</td><td>R& D Systems</td><td>285-IF</td><td>Stężenie zapasów (1000 ng/&mikro; L); Stężenie końcowe (10 ng/ml); Rozpuszczalnik (woda ultraczysta)</td></tr> <tr><td>hIL-1 i beta;</td><td>R& D Systems</td><td>201-LB</td><td>Koncentracja zapasów (10 ng/&mikro; L); Stężenie końcowe (20 ng/ml); Rozpuszczalnik (woda ultraczysta)</td></tr><tr><td>hTNF&alfa;</td><td>R& D Systems</td><td>210-TA</td><td>Stężenie zapasów (10 ng/&mikro; L); Stężenie końcowe (40 ng/ml); Rozpuszczalnik (woda ultraczysta)</td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru&nbsp;</td>stężenie akcji <td>Sigma</td><td>H1009</td><td>(30%); stężenie końcowe (0,003%); Rozpuszczalnik (media do mycia myszy)</td></tr><tr><td>Hygromycyna B Gold</td><td>InvivoGen</td><td>ant-hg-1</td><td>Stężenie końcowe (400 &mikro; g/&mikro; L</td></tr><tr><td>) L-WRN Linia komórkowa</td><td>ATCC</td><td>CRL-3276</td><td></td></tr><tr><td>mEGF</td><td>Novus</td><td>NBP2-35176</td><td>Stężenie zapasów (0,5 i mikro; g/&mikro; L); Stężenie końcowe (50 ng/ml); Rozpuszczalnik (D-PBS + 1% BSA)</td></tr><tr><td>Suplement N-2</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td>Stężenie podstawowe (100x); Stężenie końcowe (1x)</td></tr><tr><td>N-acetylo-L-cysteina</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A9165-5G</td><td>Koncentracja zapasów (500 mM); stężenie końcowe (1 mM); Rozpuszczalnik (woda ultraczysta)</td></tr><tr><td>Noggin</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td>Stężenie podstawowe (0,1 ng / & mikro; L); Stężenie końcowe (100 ng/ml); Rozpuszczalnik (woda ultraczysta + 0,1% BSA)</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140-122</td><td>Stężenie podstawowe (100x); Stężenie końcowe (1x)</td></tr><tr><td>Szalki Petriego (sterylizowane; 100 mm x 15 mm) Polystrene jednorazowe</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>Mikropłytki polistyrenowe, 24-dołkowe hodowle tkankowe, sterylne</td><td>Greiner Bio-one</td><td>5666-2160</td><td></td></tr><tr><td>R-Spondin</td><td>R& D Systems</td><td>3474-RS-050</td><td>Koncentracja zapasów (0,25 &mikro; g/&mikro; L); Stężenie końcowe (500 ng/ml); Rozpuszczalnik (D-PBS + 1% BSA)</td></tr><tr><td>Tryp LE Express</td><td>Thermo Fisher</td><td>12604-013</td><td>Stężenie podstawowe (10x); Końcowa koncentracja (1x); Rozpuszczalnik (1 mM EDTA)</td></tr><tr><td>Ultraczysta woda&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>10977-023</td><td>Koncentracja zapasów (1x); Stężenie końcowe (1x)</td></tr><tr><td>Y-27632 dihyddrochlorek&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab120129</td><td>Koncentracja zapasów (10 mM); Stężenie końcowe (10 &mikro; M); Rozpuszczalnik (woda ultraczysta)</td></tr></tbody></table>

badanie nabłonkowego wpływu zapalenia jelit in vitro na ustalone mysie kolonoidy

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids

Nabłonek jelitowy odgrywa istotną rolę w zdrowiu człowieka, stanowiąc barierę między gospodarzem a środowiskiem zewnętrznym. Ta wysoce dynamiczna warstwa komórkowa stanowi pierwszą linię obrony między populacjami drobnoustrojów i odporności oraz pomaga modulować jelitową odpowiedź immunologiczną. Przerwanie bariery nabłonkowej jest cechą charakterystyczną nieswoistego zapalenia jelit (IBD) i jest interesujące dla celów terapeutycznych. Trójwymiarowy system hodowli okrężnicy jest niezwykle przydatnym modelem in vitro do badania dynamiki jelitowych komórek macierzystych i fizjologii komórek nabłonkowych w patogenezie IBD. Idealnie byłoby, gdyby ustalenie kolonoidów z tkanki nabłonkowej zwierząt objętych stanem zapalnym było najbardziej korzystne w ocenie genetycznych i molekularnych wpływów na chorobę. Wykazaliśmy jednak, że zmiany nabłonkowe in vivo niekoniecznie są zatrzymywane w kolonoidach utworzonych od myszy z ostrym stanem zapalnym. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy protokół leczenia kolonoidów za pomocą koktajlu mediatorów stanu zapalnego, które zwykle są podwyższone podczas IBD. Chociaż system ten może być stosowany powszechnie w różnych warunkach hodowli, protokół ten kładzie nacisk na leczenie zarówno zróżnicowanych kolonoidów, jak i dwuwymiarowych monowarstw pochodzących z ustalonych kolonoidów. W tradycyjnym środowisku hodowlanym kolonoidy są wzbogacane jelitowymi komórkami macierzystymi, co stanowi idealne środowisko do badania niszy komórek macierzystych. System ten nie pozwala jednak na analizę cech fizjologii jelit, takich jak funkcja bariery. Co więcej, tradycyjne kolonoidy nie dają możliwości badania odpowiedzi komórkowej terminalnie zróżnicowanych komórek nabłonka na bodźce prozapalne. Przedstawione tutaj metody stanowią alternatywne ramy eksperymentalne w celu rozwiązania tych ograniczeń. 2-wymiarowy system hodowli jednowarstwowej daje również możliwość terapeutycznych badań przesiewowych leków ex vivo. Ta spolaryzowana warstwa komórek może być leczona mediatorami stanu zapalnego po podstawowej stronie komórki i jednocześnie przypuszczalnymi terapiami wierzchołkowo w celu określenia ich przydatności w leczeniu IBD.

System hodowli trójwymiarowych (3D) kolonoid jelitowych jest nieocenionym narzędziem do badania wewnętrznego wkładu nabłonka w homeostazę błony śluzowej jelit. Opisany protokół dostarcza szczegółowych instrukcji dotyczących izolacji krypt od myszy C57BL/6J (WT) w wieku 8 tygodni oraz ustanowienia długoterminowego systemu hodowli kolonoid, który może być modyfikowany w celu zastosowania w wielu dalszych badaniach. Po izolacji i wysianiu krypt w macierzy błony podstawnej, krypty w obrazowaniu za pomocą mikroskopii w świetl...

Opisujemy protokół szczegółowo opisujący izolację mysich krypt okrężnicy w celu opracowania 3-wymiarowych kolonoidów. Ustalone okokrody mogą być następnie ostatecznie różnicowane, aby odzwierciedlić skład komórkowy nabłonka gospodarza przed otrzymaniem prowokacji zapalnej lub skierowaniem do utworzenia monowarstwy nabłonka.

Badanie nabłonkowego wpływu zapalenia jelit in vitro na ustalone mysie kolonoidy

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic ...

Poprzez nasze badania mamy na celu zbadanie, w jaki sposób mysie kolonoidy mogą być modyfikowane z konwencjonalnego systemu hodowli kolonoidów, aby zbadać pewne aspekty fizjologii jelit i ich zmianę w obecności stanu zapalnego. Badanie funkcji bariery i fizjologii jelit stanów chorobowych, takich jak nieswoiste zapalenie jelit, jest ograniczone w przypadku stosowania tradycyjnego systemu hodowli kolonoidów morskich, który odzwierciedla tylko fizjologię komórek macierzystych. Nasz protokół jest korzystny, ponieważ zapewnia czytelnikowi wiele technik do badania, w jaki sposób mediatory stanu zapalnego wpływają na nabłonek jelitowy poprzez ich końcowe różnicowanie lub tworzenie systemu jednowarstwowego 2D.W przyszłości nasze laboratorium skoncentruje się na zrozumieniu, w jaki sposób można zmienić system hodowli kolonoidu u człowieka, aby zbadać różne aspekty fizjologii i chorób jelit, w szczególności nieswoistych zapaleń jelit. Rozpocznij od przygotowania wszystkich odczynników przed eksperymentem i rozmrozić matrycę błony podstawnej na lodzie. Następnie przygotuj monowarstwowe podłoże mysie.Rozcieńczyć rozmrożoną błonę podstawną od 1 do 20 zimnym mysim podłożem monowarstwowym i trzymać na lodzie. Umieść przezroczystą wkładkę do hodowli komórkowej o średnicy 0,4 mikrometra za pomocą sterylnych kleszczy w pojedynczym dołku 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Chwyć narożny ząb wkładki i przenieś go do studni.Powtarzaj tę czynność, aż dostępna będzie odpowiednia liczba wkładek do hodowli komórkowych. Aby pokryć wierzchołkową powierzchnię każdej wkładki do hodowli komórkowej rozcieńczoną matrycą błony podstawnej, umieść końcówkę pipety P200 na środku wkładki i usuń matrycę o pojemności 150 mikrolitrów. Następnie przenieś płytkę do sterylnego inkubatora o temperaturze 37 stopni z 5% dwutlenkiem węgla na co najmniej godzinę.Pod koniec inkubacji obrócić 24-dołkową płytkę pod kątem 45 stopni. Umieść pojedynczy palec na rogu bolca, aby ustabilizować wkładkę. Delikatnie umieść końcówkę pipety P200 wzdłuż dolnej strony wkładu i wyjmij matrycę podstawową.Usunąć nadmiar pozostałości, myjąc każdą wkładkę do hodowli komórkowej 150 mikrolitrami sterylnego DPBS bez jonów wapnia lub magnezu i pozostawić do wyschnięcia w komorze bezpieczeństwa biologicznego przez co najmniej 10 minut. Po wysuszeniu wkładek w 400 mikrolitrach mysiej pożywki monowarstwowej do dna i 75 mikrolitrów na górze wkładki do hodowli komórkowej, powtarzaj, aż wszystkie wkładki do hodowli komórkowych zostaną zanurzone. Pozostawić płytkę w komorze bezpieczeństwa biologicznego lub inkubatorze do czasu, gdy będzie potrzebna.Następnie wyjąć z inkubatora 24-dołkową płytkę z dojrzałymi kolonoidami jelitowymi i umieścić ją pod komorą bezpieczeństwa biologicznego. Odessać pożywkę za pomocą sterylnych końcówek i umyć każdą studzienkę jednym mililitrem sterylnego DPBS w temperaturze pokojowej. Za pomocą sterylnych końcówek usuń DPBS bez jonów wapnia lub magnezu.Trawić każdy czop macierzy błony podstawnej, dodając 500 mikrolitrów enzymatycznego odczynnika dysocjacyjnego do każdej studzienki, która ma być pasażowana. Aby rozbić korek, obróć 24-dołkową płytkę pod kątem 45 stopni. Umieść końcówkę pipety na krawędzi korka i delikatnie ją odsuń, pipetując każdą zatyczkę około sześć do 10 razy.Umieść 24-dołkową płytkę z powrotem w sterylnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni z 5% dwutlenkiem węgla na trzy do czterech minut. Po inkubacji pipetować trypsynę w górę i w dół pięć do siedmiu razy dla każdej studzienki pod komorą bezpieczeństwa biologicznego. Przenieś zdysocjowane kolumnoidy z każdej studzienki do sterylnej stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów i doprowadź do objętości 10 mililitrów lodowatym środkiem do mycia myszy.Następnie odwiruj częściowo strawione OID w stężeniu 300 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w wirówce z odchylanym wiadrem. Pod komorą bezpieczeństwa biologicznego usunąć supernatant z osadu za pomocą 10-mililitrowej pipety. Usuń również pozostałą pożywkę za pomocą pipety P200.Następnie ponownie zawieś osad kolonoidy, dodając 75 mikrolitrów mysiego podłoża jednowarstwowego. Dozować 75 mikrolitrów zawiesiny kolonoidu do środka każdej wkładki do hodowli komórkowej. Delikatnie odpipetować zawiesinę raz lub dwa razy przed dodaniem jej do studzienki, aby zapewnić równomierne posiewanie.Umieść 24-dołkową płytkę z wkładkami do hodowli komórkowych na obrotowej platformie na 10 minut, aby umożliwić równomierne rozproszenie we wstawce do hodowli komórkowej przed umieszczeniem płytki w sterylnym inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Pod koniec inkubacji usunąć nieprzyłączone fragmenty okrężnicy, umieszczając końcówkę wzdłuż wnętrza kultury komórkowej i pipetując pożywkę trzy do pięciu razy pipetą P200. Unikaj zakłócania przyczepionych komórek jelitowych.Natychmiast usunąć mieszaninę pożywki i konoloidów. Powtarzaj, aż wszystkie wkładki do hodowli komórkowych zostaną oczyszczone. Teraz dodaj 150 mikrolitrów wstępnie podgrzanej mysiej pożywki jednowarstwowej do wierzchołkowej strony każdej wkładki do hodowli komórkowej.Dodaj 400 mikrolitrów podgrzanej monowarstwowej pożywki mysiej do każdego dołka nowej 24-dołkowej płytki. Przenieś wkładkę do hodowli komórkowej na nową płytkę, chwytając jej ząb za pomocą sterylnych kleszczyków. Zmieniaj podłoże co drugi dzień, aż do osiągnięcia pożądanej zgryźliwości.Enzymatycznie zakłócone kolonoidy powsiane na wkładkach do hodowli komórkowych początkowo pojawiały się w skupiskach komórkowych w zakresie od 15 do 150 komórek. Trzeciego dnia komórki spłaszczyły się i powoli pokryły wkładkę do hodowli komórkowej, ogólnie osiągając zlewność. W ciągu następnych kilku dni monowarstwy nadal rosły i tworzyły ciągłą barierę, którą można zmierzyć ilościowo.

studying-epithelial-effects-intestinal-inflammation-vitro-on

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Techniki obrazowania małych zwierząt pozwalają na seryjne badania diagnostyczne i interwencje terapeutyczne in vivo. W ostatnim czasie zakres zastosowań znacznie się poszerzył i obecnie obejmuje ocenę rozwoju guza jelita grubego, gojenie się ran oraz monitorowanie stanu zapalnego. Protokół ten ilustruje te różnorodne potencjalne zastosowania endoskopii mysiej skóry.

Endoskopia mysia do multimodalnego obrazowania in vivo kancerogenezy i oceny gojenia się ran jelitowych i stanów zapalnych

Opisujemy metodę tworzenia ludzkich enteroidów z krypt jelita cienkiego i kolonoidów z krypt jelita grubego pobranych zarówno z tkanek chirurgicznych, jak i z biopsji. W tym artykule metodologicznym przedstawiamy metody hodowli, które są niezbędne do pomyślnego wzrostu i utrzymania ludzkich enteroidów i okronoidów.

Ustalenie ludzkich enteroidów nabłonkowych i kolonoidów z całej tkanki i biopsja

Obecne metody leczenia chorób zapalnych jelit (IBD) mają na celu złagodzenie objawów choroby, ale mogą powodować poważne skutki uboczne. W związku z tym badane są alternatywne strategie w modelach zapalenia jelita grubego u zwierząt. W tym miejscu wyjaśniamy, w jaki sposób analizowany jest korzystny wpływ suplementów diety na kliniczne objawy IBD w takim modelu zapalenia jelita grubego.

Analiza korzystnego wpływu suplementów diety na funkcje bariery nabłonkowej jelit podczas eksperymentalnego zapalenia jelita grubego

Dwie metody są tutaj przedstawione do określenia funkcji bariery jelitowej. Miernik nabłonka (wolt/om) służy do pomiarów transnabłonkowej rezystancji elektrycznej nabłonka hodowanego bezpośrednio w studzienkach do hodowli tkankowych. U myszy metodę zgłębnika FITC-dekstranu stosuje się do określenia przepuszczalności jelit in vivo.

Metody in vitro i in vivo w celu określenia przepuszczalności komórek nabłonka jelitowego

Tutaj prezentujemy protokół hodowli ludzkich monowarstw enteroidowych lub kolonoidowych, które mają nienaruszoną funkcję bariery, do badania interakcji nabłonkowo-mikrobiota gospodarza na poziomie komórkowym i biochemicznym.

Ludzkie monowarstwy okrężnicy do badania interakcji między patogenami, komensalami i nabłonkiem jelitowym gospodarza

Tutaj opisujemy technikę ilościowego określania integralności bariery organoidów jelita cienkiego. Fakt, że metoda opiera się na żywych organoidach, umożliwia sekwencyjne badanie różnych substancji modulujących integralność bariery lub ich kombinacji w sposób rozdzielczy w czasie.

Badanie rozpadu bariery jelitowej w żywych organoidach

Korzystając z mikroskopii przyżyciowej, przedstawiona tutaj metoda umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym wydalania komórek nabłonka jelitowego u żywych zwierząt. W związku z tym miejscowo wybarwiona błona śluzowa jelit (akryflawina i rodamina B-dekstran) znieczulonych myszy jest obrazowana do rozdzielczości pojedynczej komórki za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Podejście oparte na mikroskopii przyżyciowej do oceny przepuszczalności jelit i wydajności wydalania komórek nabłonkowych

Systematyczne ocenianie stanu zapalnego jelit za pomocą darmowego systemu wspomaganego komputerowo jest potężnym narzędziem do ilościowego porównywania zmian histopatologicznych w modelach zapalenia jelita grubego charakteryzujących się obecnością wrzodów i zmian zapalnych. Ocena wyniku histologicznego zapalenia jelita grubego wzmacnia obserwacje kliniczne i ułatwia interpretację danych.

Systematyczna analiza punktacji zapalenia jelit w modelu zapalenia jelita grubego wywołanego mysim dekstranem sodu

W tym protokole opisujemy, jak generować monowarstwy mysiego pierwotnego nabłonka jelita grubego bezpośrednio z krypt jelitowych. Zapewniamy eksperymentalne podejścia do generowania zlewających się monowarstw na filtrach przepuszczalnych, monowarstw konfluentnych do gojenia ran drapanych i badań biochemicznych oraz rzadkich i zlewających się monowarstw do analizy immunofluorescencyjnej.

Generowanie monowarstw nabłonka pierwotnego jelita grubego myszy z krypt jelitowych

Ten protokół oferuje szczegółowe instrukcje dotyczące tworzenia mysich organoidów jelita cienkiego, izolowania wrodzonych komórek limfoidalnych typu 1 od mysiej blaszki jelita cienkiego oraz ustanawiania trójwymiarowych (3D) kokultur między oboma typami komórek w celu zbadania dwukierunkowych interakcji między komórkami nabłonka jelitowego a wrodzonymi komórkami limfoidalnymi typu 1.

Współhodowla organoidów nabłonkowych mysiego jelita cienkiego z wrodzonymi komórkami limfoidalnymi

Tutaj opisujemy konstrukcję podstawowego, trójwymiarowego (3D) modelu linii komórkowej jelitowej oraz protokołu osadzania parafiny do mikroskopowej oceny stałych jelitowych odpowiedników. Barwienie wybranych białek umożliwia analizę wielu parametrów wzrokowych z jednego eksperymentu do potencjalnego wykorzystania w przedklinicznych badaniach przesiewowych leków.

Podstawowy trójwymiarowy (3D) model jelitowy z komponentem odpornościowym

Poznaj izolację krypt jelita grubego myszy i hodowlę kolonoidów 3D do badania fizjologii jelit oraz funkcji bariery nabłonkowej w stanach zapalnych, zwłaszcza w chorobie Leśniowskiego-Crohna i wrzodziejącym zapaleniu jelita grubego.

Badanie nabłonkowego wpływu zapalenia jelit in vitro na ustalone mysie kolonoidy

Przeglądaj więcej filmów