Badanie nabłonkowego wpływu zapalenia jelit in vitro na ustalone mysie kolonoidy

Opisujemy protokół szczegółowo opisujący izolację mysich krypt okrężnicy w celu opracowania 3-wymiarowych kolonoidów. Ustalone okokrody mogą być następnie ostatecznie różnicowane, aby odzwierciedlić skład komórkowy nabłonka gospodarza przed otrzymaniem prowokacji zapalnej lub skierowaniem do utworzenia monowarstwy nabłonka.

Poprzez nasze badania mamy na celu zbadanie, w jaki sposób mysie kolonoidy mogą być modyfikowane z konwencjonalnego systemu hodowli kolonoidów, aby zbadać pewne aspekty fizjologii jelit i ich zmianę w obecności stanu zapalnego. Badanie funkcji bariery i fizjologii jelit stanów chorobowych, takich jak nieswoiste zapalenie jelit, jest ograniczone w przypadku stosowania tradycyjnego systemu hodowli kolonoidów morskich, który odzwierciedla tylko fizjologię komórek macierzystych. Nasz protokół jest korzystny, ponieważ zapewnia czytelnikowi wiele technik do badania, w jaki sposób mediatory stanu zapalnego wpływają na nabłonek jelitowy poprzez ich końcowe różnicowanie lub tworzenie systemu jednowarstwowego 2D.

W przyszłości nasze laboratorium skoncentruje się na zrozumieniu, w jaki sposób można zmienić system hodowli kolonoidu u człowieka, aby zbadać różne aspekty fizjologii i chorób jelit, w szczególności nieswoistych zapaleń jelit. Rozpocznij od przygotowania wszystkich odczynników przed eksperymentem i rozmrozić matrycę błony podstawnej na lodzie. Następnie przygotuj monowarstwowe podłoże mysie.

Rozcieńczyć rozmrożoną błonę podstawną od 1 do 20 zimnym mysim podłożem monowarstwowym i trzymać na lodzie. Umieść przezroczystą wkładkę do hodowli komórkowej o średnicy 0,4 mikrometra za pomocą sterylnych kleszczy w pojedynczym dołku 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Chwyć narożny ząb wkładki i przenieś go do studni.

Powtarzaj tę czynność, aż dostępna będzie odpowiednia liczba wkładek do hodowli komórkowych. Aby pokryć wierzchołkową powierzchnię każdej wkładki do hodowli komórkowej rozcieńczoną matrycą błony podstawnej, umieść końcówkę pipety P200 na środku wkładki i usuń matrycę o pojemności 150 mikrolitrów. Następnie przenieś płytkę do sterylnego inkubatora o temperaturze 37 stopni z 5% dwutlenkiem węgla na co najmniej godzinę.

Pod koniec inkubacji obrócić 24-dołkową płytkę pod kątem 45 stopni. Umieść pojedynczy palec na rogu bolca, aby ustabilizować wkładkę. Delikatnie umieść końcówkę pipety P200 wzdłuż dolnej strony wkładu i wyjmij matrycę podstawową.

Usunąć nadmiar pozostałości, myjąc każdą wkładkę do hodowli komórkowej 150 mikrolitrami sterylnego DPBS bez jonów wapnia lub magnezu i pozostawić do wyschnięcia w komorze bezpieczeństwa biologicznego przez co najmniej 10 minut. Po wysuszeniu wkładek w 400 mikrolitrach mysiej pożywki monowarstwowej do dna i 75 mikrolitrów na górze wkładki do hodowli komórkowej, powtarzaj, aż wszystkie wkładki do hodowli komórkowych zostaną zanurzone. Pozostawić płytkę w komorze bezpieczeństwa biologicznego lub inkubatorze do czasu, gdy będzie potrzebna.

Następnie wyjąć z inkubatora 24-dołkową płytkę z dojrzałymi kolonoidami jelitowymi i umieścić ją pod komorą bezpieczeństwa biologicznego. Odessać pożywkę za pomocą sterylnych końcówek i umyć każdą studzienkę jednym mililitrem sterylnego DPBS w temperaturze pokojowej. Za pomocą sterylnych końcówek usuń DPBS bez jonów wapnia lub magnezu.

Trawić każdy czop macierzy błony podstawnej, dodając 500 mikrolitrów enzymatycznego odczynnika dysocjacyjnego do każdej studzienki, która ma być pasażowana. Aby rozbić korek, obróć 24-dołkową płytkę pod kątem 45 stopni. Umieść końcówkę pipety na krawędzi korka i delikatnie ją odsuń, pipetując każdą zatyczkę około sześć do 10 razy.

Umieść 24-dołkową płytkę z powrotem w sterylnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni z 5% dwutlenkiem węgla na trzy do czterech minut. Po inkubacji pipetować trypsynę w górę i w dół pięć do siedmiu razy dla każdej studzienki pod komorą bezpieczeństwa biologicznego. Przenieś zdysocjowane kolumnoidy z każdej studzienki do sterylnej stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów i doprowadź do objętości 10 mililitrów lodowatym środkiem do mycia myszy.

Następnie odwiruj częściowo strawione OID w stężeniu 300 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w wirówce z odchylanym wiadrem. Pod komorą bezpieczeństwa biologicznego usunąć supernatant z osadu za pomocą 10-mililitrowej pipety. Usuń również pozostałą pożywkę za pomocą pipety P200.

Następnie ponownie zawieś osad kolonoidy, dodając 75 mikrolitrów mysiego podłoża jednowarstwowego. Dozować 75 mikrolitrów zawiesiny kolonoidu do środka każdej wkładki do hodowli komórkowej. Delikatnie odpipetować zawiesinę raz lub dwa razy przed dodaniem jej do studzienki, aby zapewnić równomierne posiewanie.

Umieść 24-dołkową płytkę z wkładkami do hodowli komórkowych na obrotowej platformie na 10 minut, aby umożliwić równomierne rozproszenie we wstawce do hodowli komórkowej przed umieszczeniem płytki w sterylnym inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Pod koniec inkubacji usunąć nieprzyłączone fragmenty okrężnicy, umieszczając końcówkę wzdłuż wnętrza kultury komórkowej i pipetując pożywkę trzy do pięciu razy pipetą P200. Unikaj zakłócania przyczepionych komórek jelitowych.

Natychmiast usunąć mieszaninę pożywki i konoloidów. Powtarzaj, aż wszystkie wkładki do hodowli komórkowych zostaną oczyszczone. Teraz dodaj 150 mikrolitrów wstępnie podgrzanej mysiej pożywki jednowarstwowej do wierzchołkowej strony każdej wkładki do hodowli komórkowej.

Dodaj 400 mikrolitrów podgrzanej monowarstwowej pożywki mysiej do każdego dołka nowej 24-dołkowej płytki. Przenieś wkładkę do hodowli komórkowej na nową płytkę, chwytając jej ząb za pomocą sterylnych kleszczyków. Zmieniaj podłoże co drugi dzień, aż do osiągnięcia pożądanej zgryźliwości.

Enzymatycznie zakłócone kolonoidy powsiane na wkładkach do hodowli komórkowych początkowo pojawiały się w skupiskach komórkowych w zakresie od 15 do 150 komórek. Trzeciego dnia komórki spłaszczyły się i powoli pokryły wkładkę do hodowli komórkowej, ogólnie osiągając zlewność. W ciągu następnych kilku dni monowarstwy nadal rosły i tworzyły ciągłą barierę, którą można zmierzyć ilościowo.