Wykorzystanie Caenorhabditis elegans do badania trans- i wielopokoleniowych skutków substancji toksycznych

Przedstawiony protokół ułatwi prowadzenie badań nad trans i wielopokoleniowymi skutkami białek, które mogą długo istnieć w środowisku. Użyliśmy wolno żyjących nicieni z 99,5 jako hermafrodytów, aby zaoszczędzić czas i wysiłek w badaniu efektów trans i wielopokoleniowych. Technika ta może być wykorzystana do zademonstrowania długoterminowych skutków leków końcowych, ponieważ nicienie w obecnym protokole dzielą wiele konserwatywnych mechanizmów lub szlaków z ludźmi.

Metoda ta może zapewnić wgląd w dziedziny syntezy farmaceutycznej i zarządzania środowiskiem, ponieważ wymagają one informacji zwrotnych na temat potencjalnych zagrożeń związanych z chemikaliami. Metodę tę można zastosować do Daphnia magna z większym naciskiem na toksyczność dla organizmów wodnych. Również Drosphila melanogaster do dalszego badania wpływu na płeć.

On lub ona utknęliby w przekonaniu, że badanie efektów na przestrzeni pokoleń jest czasochłonne i energochłonne. Nie bój się pierwszego wrażenia. Przestrzeganie protokołu przyniesie Ci owocne rezultaty.

Aby wyhodować E. coli, odpipetuj 200 mikrolitrów z zawiesin bakteryjnych do 50 mililitrów pożywki LB w kolbie. Lub użyj pętli zaszczepiającej, aby wybrać małą kolonię z agarów NGM i umieścić ją w pożywce LB. Aby wyhodować C.elegans, pod mikroskopem policz nicienie na przygotowanych wcześniej agarach NGM.

Gdy liczba zbliży się do 2 000, za pomocą sterylnej końcówki odetnij 1/6 agaru NGM i przenieś go na nowo przygotowane agary NGM z trawnikiem bakteryjnym. Trzymaj agary NGM do góry nogami w inkubatorze o temperaturze 22 stopni Celsjusza w celu późniejszej hodowli. Po około 36 godzinach nicienie stają się ciężkie.

Użyj dwóch mililitrów sterylnej wody, aby spłukać grawitacyjne nicienie i nowo wyprodukowane jaja z każdego agaru NGM do sterylnych probówek wirówkowych. Umieścić probówki na stojaku na 30 minut, aby osiadły nicienie, a następnie wyrzucić 85% supernatantów przez pipetowanie. Bardzo ważne jest, aby ocenić, czy nicienie są wystarczająco ciężkie, aby można je było zsynchronizować.

W przeciwnym razie operacja synchronizacji wieku byłaby daremna. Wymieszaj osady z siedmioma objętościami roztworu podchlorynu sodu i potrząsaj probówkami wirówkowymi co dwie minuty przez pięć do ośmiu razy, aby zlizować larwy i dorosłe nicienie. Odwirować probówki w temperaturze 700 razy G przez trzy minuty w temperaturze 20 stopni Celsjusza, a następnie wyrzucić supernatanty przez pipetowanie.

Ponownie zawiesić granulki w pięciu objętościach sterylnej wody, aby umyć jaja zsynchronizowane z wiekiem. Wirować w temperaturze 700 razy G przez trzy minuty w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Powtórz pranie sterylną wodą dwa razy.

Następnie dodaj jedną objętość sterylnej wody do probówek, aby ponownie zawiesić jaja zsynchronizowane z wiekiem. Rozprowadzić zawiesiny jaj, pipetując pięćdziesiąt mikrolitrów na każdy nowy agar NGM z trawnikiem bakteryjnym. Trzymaj agary NGM górną stroną do góry w inkubatorze o temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 30 minut, pozwalając wodzie odparować lub zostać wchłoniętą przez trawnik bakteryjny.

Następnie odwróć agary NGM do góry nogami, aby uzyskać kolejną hodowlę, i oznacz czas jako czas jaja. 36 godzin po czasie jaja nicienie osiągają stadium larw L3. Użyj dwóch mililitrów sterylnej wody, aby spłukać nicienie z każdego agaru NGM do probówek wirówkowych.

Po 30 minutach zastąp 85% supernatantów pożywką K, aby trawić pokarm w jelitach przez dwie godziny. Następnie wyrzuć supernatanty. Użyj K Medium, aby dostosować zawiesiny nicieni do około 200 nicieni na 100 mikrolitrów do kolejnych eksperymentów.

Aby uniknąć efektów krawędziowych, w środkowej części 96-dołkowej sterylnej mikropłytki dodaj 100 mikrolitrów przygotowanych roztworów kontrolnych lub chemicznych do 10 dołków, jako powtórzenia w sześciu grupach. Dodaj 100 mikrolitrów przygotowanego medium K Nicieni do każdego z 60 dołków. Oznacz czas jako T0. Wykonuj ekspozycję przez 24 do 96 godzin.

Po ekspozycji użyj pipety, aby zebrać nicienie z pięciu studzienek w każdej grupie do sześciu 1,5-mililitrowych probówek wirówkowych. Osadzać nicienie przez 30 minut, a następnie pipetą, aby usunąć supernatanty. Umyj nicienie na dnie jednym mililitrem wysterylizowanej wody.

Usytuj nicienie na 30 minut. Odrzucić supernatanty i użyć nicieni znajdujących się na dole do pomiarów wskaźnikowych narażonego pokolenia rodzicielskiego, oznaczonych jako F0. Zbierz nicienie z pozostałych pięciu studzienek w każdej grupie. Usiądź i umyj nicienie jak poprzednio.

Następnie dodaj 100 mikrolitrów sterylnej wody, aby ponownie zawiesić nicienie w każdej probówce i przenieś zawiesiny nicieni równomiernie na trzy nowo przygotowane agary NGM z trawnikiem bakteryjnym. Wysiaduj nicienie przez 36 godzin, aby stały się ciężkie, i przeprowadź synchronizację wieku, jak poprzednio. Po inkubacji zsynchronizowanych jaj na agarach NGM z trawnikiem bakteryjnym przez 36 godzin, przepłucz nicienie do sześciu probówek wirówkowych.

Po osiadaniu i umyciu jednym mililitrem wysterylizowanej wody, użyj nicieni na dnie do pomiarów wskaźnikowych pokolenia potomstwa oznaczonego jako T1. Wymieszaj 99 mililitrów ciepłych agarów NGM z jednym mililitrem roztworów kontrolnych lub chemicznych. Po przygotowaniu agarów z zawiesinami bakteryjnymi zgodnie z rękopisem, w szafie bezpieczeństwa biologicznego odłóż górne pokrywy szalek Petriego i wystaw trawnik bakteryjny na działanie światła UV przez 15 minut. Odpipetuj jaja zsynchronizowane z wiekiem na agary poddane działaniu promieniowania UV.

Oznacz początek ekspozycji na pokolenie rodzicielskie, F0, jako dzień zerowy. Inkubuj agary przez trzy dni w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Następnie użyj dojrzałych nicieni do zmierzenia efektów w F0. Również trzeciego dnia użyj szklanego pręta wyposażonego w sztuczny drut z włókna wygiętego w pierścień, aby wybrać dojrzałe nicienie F0 i wsunąć je na powierzchnię nowych agarów NGM poddanych działaniu promieniowania UV.

Czwartego dnia wybierz i wyrzuć dojrzałe nicienie F0 z agarów NGM. Szóstego dnia użyj dojrzałych nicieni F1, które były narażone na kontakt przez trzy dni, do pomiaru wskaźników. W tym protokole międzypokoleniowy wpływ kadmu, miedzi, ołowiu i na częstotliwość zginania ciała wykazał, że zahamowania u rodzica nicienia, F0, po ekspozycji prenatalnej były mniejsze niż u ich potomstwa, T1. Wielopokoleniowy wpływ resztkowy sulfametoksazolu na długość życia i reprodukcję nicieni wykazał, że narażenie na linię zarodkową miało znaczący wpływ na reprodukcję, a toksyczność utrzymywała się w nienarażonych pokoleniach od pokoleń T3 do T6.

Wielopokoleniowa ekspozycja i wielopokoleniowy resztkowy wpływ lindanu na wskaźniki biochemiczne i genetyczne nicieni wykazały skutki otyłości z zaburzeniami regulacji sygnału insulinowego. Co więcej, zmiany między sygnalizacją sgk-1 i akt-1 wskazały, że nicienie z różnych generacji ekspozycji wykazywały różne strategie reagowania w zakresie tolerancji i unikania. Przed każdą operacją należy sprawdzić stan żywy nicieni i odpowiednio zmodyfikować następujące kroki.

Inne skutki, na przykład otyłość chemiczna, mogą być uwzględnione, aby jeszcze bardziej odpowiedzieć na rosnące rozpowszechnienie otyłości z pokolenia na pokolenie. Na podstawie tej metody można badać dalsze mechanizmy. Na przykład dziedziczne sygnały epigenetyczne między pokoleniami.

Roztwory chloru mają silne potencjały oksytacyjne i unikają bezpośredniego kontaktu z nim skóry.