Name: Wykorzystanie Caenorhabditis elegans do badania trans- i wielopokoleniowych skutków substancji toksycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Poznaj metodę badania wielopokoleniowych skutków substancji toksycznych przy użyciu Caenorhabditis elegans. Protokół ten pozwala ocenić długoterminowe wpływy chemikaliów na zdrowie i ekosystemy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Culture E. coli OP50
<ol>
	<li>Prepare 1 M sodium hydroxide solution by dissolving 4 g of sodium hydroxide in 100 mL water.</li>
	<li>Prepare lysogeny broth (LB) medium by dissolving 10 g of tryptone, 5 g of yeast extract and 10 g of sodium chloride with 1 L of ultrapure water in a 1 L conical flask. Adjust the pH to 7.0 with 1 M sodium hydroxide solution.</li>
	<li>Aliquot the LB liquid medium from step1.2 into 20 conical flasks (maximum allowable volume: 100 mL) with 50 mL medium in each. Cover the conical flasks with kraft paper.</li>
	<li>Sterilize the LB liquid medium at 121 °C and 0.105 MPa for 20 min. Cool the LB medium down to room temperature.</li>
	<li>Pipette 200 µL from the bacterial suspensions (see step 1.8) or pick a small colony from agars (in step 2.14) using an inoculating loop, place it in LB medium.</li>
	<li>Incubate the LB medium with shaking at 150 rpm at 37 °C for 24-48 h. The LB medium will change from a brown transparent liquid to turbid khaki-colored suspension.</li>
	<li>Use the bacterial suspensions from 80% of total flasks to provide E. coli OP50 as nematode food to be used in step 2.11.</li>
	<li>Store the rest of the flasks containing the bacterial suspensions in a refrigerator at 4 °C. Pipette 200 µL of the LB suspensions on to the upper side of fresh LB medium (step 1.4) and repeat step1.6 for subsequent incubation.</li>
</ol>
2. Culture C. elegans
NOTE: Culture C. elegans using as per steps 2.1 to 2.11 based upon standard methods18.
<ol>
	<li>Dissolve 22.8 g of K2HPO4•3H2O in 100 mL of sterile distilled water.</li>
	<li>Dissolve 6.8 g of KH2PO4 in 50 mL of sterile distilled water.</li>
	<li>Mix solutions from steps 2.1 and 2.2, to prepare 1 M K2HPO4-KH2PO4 buffer (pH 6.0, 150 mL in total).</li>
	<li>Prepare 1.0 M MgSO4 by dissolving 1.232 g of MgSO4•7H2O in 5 mL of sterile distilled water, and sterilize it by filtering the solution through a 0.22 µm sterile disposable membrane filter into a sterile container.</li>
	<li>Prepare 1 M CaCl2 by dissolving 0.554 g of CaCl2 in 5 mL of sterile distilled water, and sterilize it by filtering the solutions through a 0.22 µm sterile disposable membrane filter into a sterile container.</li>
	<li>Prepare 1 M cholesterol solution by dissolving 0.025 g of cholesterol in 5 mL of absolute ethanol, and sterilize it by filtering the solution through a 0.22 µm sterile disposable membrane filter into a sterile container.</li>
	<li>Prepare the nematode growth medium (NGM) agar by adding 17 g of agar powder, 2.5 g of peptone and 3 g of sodium chloride to a 1 L conical flask containing 1 L of ultrapure water. Add 25 mL of K2HPO4-KH2PO4 solution from step 2.3.</li>
	<li>Sterilize the NGM agar from step 2.7 at 121 °C with 0.105 MPa for 20 min.</li>
	<li>Cool the NGM agar to about 50 °C, add 1 mL of 1 M MgSO4, 1 M CaCl2, and 5 mg/mL cholesterol-ethanol solution from steps 2.4 to 2.6 into the medium and mix them thoroughly.</li>
	<li>Pour ~10 mL NGM agar medium per dish into 100 sterile Petri dishes (6.0 cm diameter). Cool the medium in the Petri dishes to room temperature to form solid agar.</li>
	<li>Pipette 170 µL of the bacterial suspensions from step 1.7 onto the aforementioned NGM agar using a sterile tip. Shake the NGM agar slightly to distribute the LB medium evenly over the NGM agar surface.</li>
	<li>Inoculate the NGM agar with the top-side up at 37 °C for 8-12 h to form a bacterial lawn.</li>
	<li>Use most of the agar with bacterial lawns from step 2.12 to culture nematodes in step 2.15 or 2.19.</li>
	<li>Store 1 or 2 agars up-side down to avoid water evaporation and contamination in refrigerators at 4 °C so as to sustain the bacteria in of contamination.</li>
	<li>When there are less than 2,000 nematodes on the stocking NGM agars (from earlier experiments or gifted from other labs), cut one sixth of the NGM agar that contains C. elegans with a sterile tip and transfer it onto newly prepared NGM agars with bacterial lawn (from step 2.13). Keep the NGM agars up-side down in a 22 °C incubator for the subsequent culture.</li>
	<li>When there are more than 2,000 nematodes on the stocking NGM agar, flush the nematodes of the NGM agar with 2 mL of sterile water into centrifuge tubes. The input of 2 mL of water will result in an approximately 1.5 mL output.</li>
	<li>Allow the nematodes to settle in the centrifuge tubes from for 30 min. Discard 1 mL of the supernatants by pipetting and add 1 mL of sterile water into each tube to wash the pellets (i.e., the nematodes).</li>
	<li>Settle down the nematodes in the centrifuge tubes for 30 min. Discard 1 mL of the supernatants by pipetting. Add 1 mL of sterile water into each tube to resuspend the nematodes.</li>
	<li>Distribute the nematode suspensions (approximately 1.5 mL in total) by pipetting 150 µL onto each new NGM agar with bacterial lawn (from step 2.13), making 8-10 new NGM agars in total.</li>
	<li>Keep the NGM agars from step 2.19 up-side up in a 20 °C incubator overnight and then up-side down for the subsequent culture.</li>
	<li>Repeat step 2.15 or step 2.16-2.20 every three days.</li>
</ol>
3. Prepare synchronized eggs and L3 larvae of C. elegans
<ol>
	<li>Flush off the gravid nematodes and newly produced eggs from the NGM agars into sterile centrifuge tubes, with 2 mL of sterile water on each NGM agar resulting in approximately 1.5 mL of output.</li>
	<li>Settle down the nematodes in the centrifuge tubes for 30 min, and then discard 85% of the supernatants by pipetting.</li>
	<li>Prepare sodium hypochlorite solutions by dissolving 0.6 g of NaOH and

<ol><li>Yu, Z., Zhang, J., Hou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+time-dependent+stimulation+of+sodium+halide+salts+on+redox+reactants%2C+energy+supply+and+luminescence+in+Vibrio+fischeri%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hazardous+Materials%22%5BJournal%5D)">The time-dependent stimulation of sodium halide salts on redox reactants, energy supply and luminescence in Vibrio fischeri.</a> Journal of Hazardous Materials. 342, 429-435 (2018).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+nicotine+exposure+induces+dysfunction+of+mouse+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Therapeutic%22%5BJournal%5D)">Long-term nicotine exposure induces dysfunction of mouse endothelial progenitor cells.</a> Experimental and Therapeutic. 13, 85-90 (2017).</li>
<li>Yu, Z. Y., Chen, X. X., Zhang, J., Wang, R., Yin, D. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenerational+effects+of+heavy+metals+on+L3+larva+of+Caenorhabditis+elegans+with+greater+behavior+and+growth+inhibitions+in+the+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+Environmental+Safety%22%5BJournal%5D)">Transgenerational effects of heavy metals on L3 larva of Caenorhabditis elegans with greater behavior and growth inhibitions in the progeny.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 88C, 178-184 (2013).</li>
<li>Chen, R., Yu, Z., Yin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-generational+effects+of+lindane+on+nematode+lipid+metabolism+with+disturbances+on+insulin-like+signal+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Multi-generational effects of lindane on nematode lipid metabolism with disturbances on insulin-like signal pathway.</a> Chemosphere. 210, 607-614 (2018).</li>
<li>Van Norman, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+matter+of+mice+and+men%3A+ethical+issues+in+animal+experimentation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Anesthesiology+Clinics%22%5BJournal%5D)">A matter of mice and men: ethical issues in animal experimentation.</a> International Anesthesiology Clinics. 53 (3), 63-78 (2015).</li>
<li>Pereira, C. M. S., Everaert, G., Blust, R., De Schamphelaere, K. A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multigenerational+effects+of+nickel+on+Daphnia+magna+depend+on+temperature+and+the+magnitude+of+the+effect+in+the+first+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Multigenerational effects of nickel on Daphnia magna depend on temperature and the magnitude of the effect in the first generation.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (7), 1877-1888 (2018).</li>
<li>Morimoto, J., Simpson, S. J., Ponton, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+trans-generational+effects+of+male+and+female+gut+microbiota+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Letters%22%5BJournal%5D)">Direct and trans-generational effects of male and female gut microbiota in Drosophila melanogaster.</a> Biology Letters. 13, 20160966(2017).</li>
<li>Coimbra, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+effects+of+clofibric+acid+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29%3A+A+multigenerational+study%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Chronic effects of clofibric acid in zebrafish (Danio rerio): A multigenerational study.</a> Aquatic Toxicology. 160, 76-86 (2015).</li>
<li>Sugi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+C.+elegans+and+other+nematode+species%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Genome editing in C. elegans and other nematode species.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17, 295(2016).</li>
<li>Leung, M. C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans%3A+an+emerging+model+in+biomedical+and+environmental+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Science%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology.</a> Toxicological Science. 106 (1), 5-28 (2008).</li>
<li>Yu, Z. Y., Jiang, L., Yin, D. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavior+toxicity+to+Caenorhabditis+elegans+transferred+to+the+progeny+after+exposure+to+sulfamethoxazole+at+environmentally+relevant+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Environmental+Sciences-China%22%5BJournal%5D)">Behavior toxicity to Caenorhabditis elegans transferred to the progeny after exposure to sulfamethoxazole at environmentally relevant concentration.</a> Journal of Environmental Sciences-China. 23 (2), 294-300 (2011).</li>
<li>Kim, S. W., Kwak, J. I., An, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multigenerational+study+of+gold+nanoparticles+in+Caenorhabditis+elegans%3A+transgenerational+effect+of+maternal+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Multigenerational study of gold nanoparticles in Caenorhabditis elegans: transgenerational effect of maternal exposure.</a> Environmental Science & Technology. 47, 5393-5399 (2013).</li>
<li>Klosin, A., Casas, E., Hidalgo-Carcedo, C., Vavouri, T., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenerational+transmission+of+environmental+information+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transgenerational transmission of environmental information in C. elegans.</a> Science. 356, 320(2017).</li>
<li>Yu, Z. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-generational+influences+of+sulfamethoxazole+on+lifespan%2C+reproduction+and+population+growth+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+Environmental+Safety%22%5BJournal%5D)">Trans-generational influences of sulfamethoxazole on lifespan, reproduction and population growth of Caenorhabditis elegans.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 135, 312-318 (2017).</li>
<li>Buisset-Goussen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+chronic+gamma+irradiation%3A+a+multigenerational+study+using+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Radioactivity%22%5BJournal%5D)">Effects of chronic gamma irradiation: a multigenerational study using Caenorhabditis elegans.</a> Radioactivity. 137, 190-197 (2014).</li>
<li>Zhao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multigenerational+exposure+to+dietary+zearalenone+%28ZEA%29%2C+anestrogenic+mycotoxin%2C+affects+puberty+and+reproductionin+female+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Multigenerational exposure to dietary zearalenone (ZEA), anestrogenic mycotoxin, affects puberty and reproductionin female mice.</a> Reproductive Toxicology. 47, 81-88 (2014).</li>
<li>Yang, Z., Wang, J., Tang, L., Sun, X., Xue, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenerational+comparison+of+developmental+and+reproductive+toxicities+in+zearalenone+exposed+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+Journal+of+Ecotoxicology%22%5BJournal%5D)">Transgenerational comparison of developmental and reproductive toxicities in zearalenone exposed Caenorhabditis elegans.</a> Asian Journal of Ecotoxicology. 11 (4), 61-68 (2016).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+dlegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis dlegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
<li>Emmons, S., Klass, M., Hirsch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+the+constancy+of+DNA+sequences+during+development+and+evolution+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">An analysis of the constancy of DNA sequences during development and evolution of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 1333-1337 (1979).</li>
<li>Van Gilst, M. R., Hadjivassiliou, H., Yamamoto, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Caenorhabditis+elegans+nutrient+response+system+partially+dependent+on+nuclear+receptor+NHR-49%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A Caenorhabditis elegans nutrient response system partially dependent on nuclear receptor NHR-49.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (38), 13496-13501 (2005).</li>
<li>Cobb, E., Hall, J., Palazzolo, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+metallothionein+expression+after+exposure+to+conventional+cigarette+smoke+but+not+electronic+cigarette+%28ECIG%29-generated+aerosol+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Induction of metallothionein expression after exposure to conventional cigarette smoke but not electronic cigarette (ECIG)-generated aerosol in Caenorhabditis elegans.</a> Frontiers in Physiology. 9, 426(2018).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2-%CE%94%CE%94CT+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Hill, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+flexibility+in+the+convergent+evolution+of+hermaphroditism+in+Caenorhabditis+Nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic flexibility in the convergent evolution of hermaphroditism in Caenorhabditis Nematodes.</a> Developmental Cell. 10, 531-538 (2006).</li>
<li>Cabreiro, F., Gems, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Worms+need+microbes+too%3A+microbiota%2C+health+and+aging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans.</a> EMBO Molecular Medicine. 2013, 1300-1310 (2013).</li>
<li>Breider, F., von Gunten, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+total+N-nitrosamine+concentrations+in+aqueous+samples+via+UV-photolysis+and+chemiluminescence+detection+of+nitric+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantification of total N-nitrosamine concentrations in aqueous samples via UV-photolysis and chemiluminescence detection of nitric oxide.</a> Analytical Chemistry. 89 (3), 1574-1582 (2017).</li>
</ol>

Autorzy są wdzięczni za wsparcie finansowe ze strony Narodowego Projektu Nauki i Technologii na rzecz Kontroli i Uzdatniania Zanieczyszczenia Wody (2017ZX07201004) oraz Międzynarodowego Programu Współpracy Naukowo-Technologicznej Chin (nr 2016YFE0123700).

Aby skutecznie przeprowadzić opisany protokół, należy wziąć pod uwagę następujące sugestie. Wykonaj ogólne operacje eksperymentalne w sterylnym środowisku. Niewłaściwa eksploatacja może spowodować zanieczyszczenie szczepów E. coli , np. grzyby i roztocza mogą utrudniać prawidłowy wzrost C. elegans, a tym samym wpływać na wyniki eksperymentów. W części opisującej hodowlę C. elegans obserwuj skalę wzrostu C. elegans na agarach NGM gołym okiem lub pod mikroskopem. Gdy skala C. elegans...

Stosowanie i zarządzanie odpadami chemikaliów jest w dużym stopniu zależne od informacji o ich skutkach przy określonych stężeniach. Warto zauważyć, że czas jest kolejnym istotnym elementem między efektami a stężeniami. Oznacza to, że substancje chemiczne, zwłaszcza te w niskich stężeniach w rzeczywistym środowisku, potrzebują czasu, aby wywołać mierzalne efekty1. Dlatego naukowcy ustalają różne długości czasu ekspozycji w eksperymentach na zwierzętach, a nawet obejmują cały cykl życia. Na przykład myszy były narażone na nikotynę przez 30, 90 lub 180 dni, aby zbadać jej toksyczne działanie 2. Jednak takie czasy narażenia nadal nie są wystarczające, aby wyjaśnić długoterminowe skutki zanieczyszczeń (np. trwałych zanieczyszczeń organicznych [TZO]), które mogą utrzymywać się przez pokolenia organizmów w środowisku. Dlatego badania nad skutkami na przestrzeni pokoleń zyskują coraz większe zainteresowanie.
Istnieją dwa główne aspekty badań nad efektem pokoleniowym. Pierwszym z nich jest badanie efektu międzypokoleniowego (TG), które może solidnie sprawdzić, czy narażenie rodziców na chemikalia może mieć jakiekolwiek konsekwencje dla potomstwa3. Drugie badanie to wielopokoleniowe badanie efektów, które jest bardziej systematyczne i uwzględnia zarówno narażenie, jak i skutki rezydualne. Z jednej strony, efekty ekspozycji wielopokoleniowej (MGE) są wykorzystywane do zilustrowania reakcji adaptacyjnych zwierząt na długotrwałe trudne środowisko. Z drugiej strony, wielopokoleniowe efekty resztkowe (MGR) są wykorzystywane do wykazania długoterminowych konsekwencji resztkowych po narażeniu, ponieważ narażeniu matki towarzyszy narażenie zarodka na pierwsze potomstwo i narażenie linii zarodkowej na drugie potomstwo, co sprawia, że trzecie potomstwo jako pierwsze pokolenie całkowicie nie jest narażone4.
Chociaż ssaki (np. myszy) są organizmami modelowymi w badaniach toksyczności, szczególnie w odniesieniu do ludzi, ich zastosowanie w badaniu efektów pokoleniowych jest dość czasochłonne, kosztowne i etycznie problematyczne 5. W związku z tym organizmy, w tym skorupiak Daphnia magna6, owad Drosophila melanogaster7 i danio pręgowany Danio rerio8, zapewniają alternatywne opcje. Jednak organizmy te albo nie są podobne do ludzi, albo wymagają specjalnego sprzętu w badaniach. 
Caenorhabditis elegans to mały, wolno żyjący nicień (około 1 mm długości) o krótkim cyklu życia (około 84 h w temperaturze 20 °C)9. Nicienie te mają wiele wspólnych szlaków biologicznych konserwatywnych dla ludzi, dlatego są szeroko stosowane do ilustrowania skutków różnych stresów lub substancji toksycznych10. Warto zauważyć, że 99,5% nicieni to hermafrodyty, co czyni te organizmy niezwykle przydatnymi w badaniu efektów pokoleniowych, np. Efekty TG metali ciężkich i sulfonamidów3,11, MGE effects of gold nanoparticles and heavy metals12 and temperature13, MGR effects of sulfonamide14, oraz zarówno MGE, jak i MGR wpływu promieniowania gamma15 oraz lindane4. Ponadto uzyskano porównywalne wyniki między wpływem substancji chemicznych (np. zearalenonu) na rozwój i rozmnażanie myszy a C. elegans16,17, co dałoby przewagę w ekstrapolacji efektów z tego małego zwierzęcia na ludzi.
Zarówno badania efektu TG, jak i MG są czasochłonne i wymagają starannego projektowania i wydajności. Warto zauważyć, że w wyżej wymienionych badaniach istniały różnice w wyborach dotyczących etapów życia, warunków narażenia i metod separacji pokoleń. Różnice te utrudniały bezpośrednie porównanie wyników i utrudniały ich dalszą interpretację. W związku z tym konieczne jest ustanowienie jednolitych protokołów, które będą kierować badaniami skutków TG i MG, a także zapewnić szerszy obraz, aby ujawnić podobne wzorce różnych substancji toksycznych lub zanieczyszczeń w długoterminowych konsekwencjach. Nadrzędny cel obecnych protokołów zademonstruje jasne procesy operacyjne w badaniu między- i wielopokoleniowych efektów z C. elegans. Protokoły przyniosą korzyści naukowcom, którzy są zainteresowani badaniem długoterminowych skutków substancji toksycznych lub zanieczyszczeń.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; agar w proszku</td><td>OXOID, Thermo Fisher Scientific, Wielka Brytania</td><td>9002-18-0</td><td></td></tr><tr><td>79nnHT Szybki system PCR w czasie rzeczywistym</td><td>&nbsp; Biosystemy stosowane&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa sterylna mikropłytka</td><td>Costar? Corning? Ameryka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylizator autoklawu</td><td>Tomy, Tomy Digital Biology, Japonia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego</td><td>LongYue, Shanghai longyue instrument equipment co. Ltd, Chiny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>chlorek wapnia</td><td>Sinopharm odczynnik chemiczny firma Ltd, Chiny</td><td>10043-52-4</td><td></td></tr><tr><td>wirówka&nbsp; 5417R</td><td>Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe</td><td>Axygen, Aixjin biotechnology (Hangzhou) co. Ltd, Ameryka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cholesterol</td><td>Sinopharm chemical reagent company Ltd, Chiny</td><td>57-88-5</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>VETEC, Sigmar aldrich (Shanghai) trading co. Ltd, Ameryka</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>wodorofosforan disodowy</td><td>Odczynnik chemiczny Sinopharm Ltd, Chiny</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>etanol</td><td>Sinopharm chemical reagent company Ltd, Chiny</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Filter</td><td>Thermo, Thermo Fisher Scientific, amerykański</td><td></td><td></td></tr><tr><td>inkubator</td><td>YiHeng17, Shanghai yiheng scientific instrument co. Ltd, chińska</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pętla</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>inokulacyjnaK2HPO4&bull; 3H2O</td><td>Sinopharm chemical reagent company Ltd, Chiny</td><td>16788-57-1</td><td></td></tr><tr><td>papier</td><td></td><td></td><td></td>pakowy</tr><tr><td>Mcroplate Reader</td><td>Boitek, Boten apparatus co. Ltd, America</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&bull; 7H2O</td><td>Sinopharm chemical reagent company Ltd, Chiny</td><td>10034-99-8</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopy XTL-BM-9TD</td><td>BM, Shanghai BM optical instruments manufacturing co. Ltd, Chiny&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szalki</td><td></td><td></td><td></td>Petriego</tr><tr><td>Pipeta</td><td>Eppendorf, Ai Bende (Szanghaj) International Trade Co., Ltd, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sinopharm odczynnik chemiczny firma Ltd, Chiny</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>diwodorofosforan potasu</td><td>Sinopharm chemical reagent company Ltd, Chiny</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>Zestawy Qiagen RNeasy</td><td>Qiagen Inc., Walencja, Kalifornia, Stany Zjednoczone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestawy QuantiTect SYBR Green RT-PCR</td><td>Qiagen Inc., Walencja, Kalifornia, Stany Zjednoczone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do syntezy pierwszej nici cDNA</td><td>RevertAid Thermo Scientific, Wilmington, DE, Stany</td><td></td><td></td>Zjednoczone</tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sinopharm chemical reagent company Ltd, Chiny</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>wodorotlenek sodu</td><td>Sinopharm chemical reagent company Ltd, Chiny</td><td>1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>roztwór podchlorynu sodu</td><td>Aladdin, Shanghai Aladdin biochemical technology co., Ltd, Chiny</td><td>7681-52-9</td><td></td></tr><tr><td>trypton</td><td>OXOID, Thermo Fisher Scientific, Wielka Brytania</td><td>73049-73-7</td><td></td></tr><tr><td>ekstrakt drożdżowy</td><td>OXOID, Thermo Fisher Scientific, Wielka Brytania</td><td>119-44-8</td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie caenorhabditis elegans do badania trans- i wielopokoleniowych skutków substancji toksycznych

Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants

Informacje o toksyczności chemikaliów są niezbędne w ich stosowaniu i gospodarce odpadami. W przypadku chemikaliów o niskich stężeniach długoterminowe skutki są bardzo ważne dla oceny ich konsekwencji dla środowiska i zdrowia ludzkiego. Demonstrując długoterminowe wpływy, wpływ chemikaliów na przestrzeni pokoleń w ostatnich badaniach dostarcza nowego wglądu. W tym miejscu opisujemy protokoły badania wpływu substancji chemicznych na wiele pokoleń przy użyciu wolno żyjących nicieni Caenorhabditis elegans. Przedstawiono dwa aspekty: (1) badania skutków międzypokoleniowych (TG) i (2) badań efektów wielopokoleniowych, z których te ostatnie są podzielone na badania narażenia wielopokoleniowego (MGE) i wielopokoleniowego efektu resztkowego (MGR). Badanie efektu TG jest solidne i ma prosty cel, jakim jest ustalenie, czy narażenie rodziców na chemikalia może skutkować jakimikolwiek szczątkowymi konsekwencjami dla potomstwa. Po zmierzeniu wpływu na rodziców, roztwory podchlorynu sodu są używane do zabicia rodziców i zatrzymania potomstwa, aby ułatwić pomiar wpływu na potomstwo. Badanie efektu TG służy do określenia, czy potomstwo jest dotknięte, gdy jego rodzic jest narażony na zanieczyszczenia. Badanie efektu MGE i MGR jest systematycznie stosowane w celu określenia, czy ciągła ekspozycja pokoleniowa może skutkować reakcjami adaptacyjnymi u potomstwa na przestrzeni pokoleń. Staranne pobieranie i przenoszenie służy do rozróżniania generacji, aby ułatwić pomiar wpływu na każde pokolenie. Połączyliśmy również protokoły, aby zmierzyć zachowanie lokomocji, reprodukcję, długość życia, zmiany biochemiczne i ekspresję genów. Przedstawiono również kilka przykładowych eksperymentów ilustrujących badania efektów trans- i wielopokoleniowych.

W niniejszym artykule opisano protokoły badania wpływu substancji chemicznych na kolejne pokolenia za pomocą C. elegans w badaniach efektów transgeneracyjnych (TG), wielopokoleniowego narażenia (MGE) oraz wielopokoleniowego wpływu resztkowego (MGR). Własne wyniki badań przedstawiono jako przykłady. Jedno z badań prezentuje efekty TG metali ciężkich na zachowanie ruchowe3. Pozostałe dwa badania przedstawiają efekty MGE i MGR sulfametoksazolu oraz lindanu na...

Trans- i wielopokoleniowe skutki trwałych chemikaliów są niezbędne do oceny ich długoterminowych konsekwencji dla środowiska i zdrowia ludzkiego. Udostępniamy nowatorskie szczegółowe metody badania efektów trans- i wielopokoleniowych z wykorzystaniem wolno żyjących nicieni Caenorhabditis elegans.

Wykorzystanie Caenorhabditis elegans do badania trans- i wielopokoleniowych skutków substancji toksycznych

Information about toxicities of chemicals are essential in their application and waste management. For chemicals at low concentrations, the long-term ...

Przedstawiony protokół ułatwi prowadzenie badań nad trans i wielopokoleniowymi skutkami białek, które mogą długo istnieć w środowisku. Użyliśmy wolno żyjących nicieni z 99,5 jako hermafrodytów, aby zaoszczędzić czas i wysiłek w badaniu efektów trans i wielopokoleniowych. Technika ta może być wykorzystana do zademonstrowania długoterminowych skutków leków końcowych, ponieważ nicienie w obecnym protokole dzielą wiele konserwatywnych mechanizmów lub szlaków z ludźmi.Metoda ta może zapewnić wgląd w dziedziny syntezy farmaceutycznej i zarządzania środowiskiem, ponieważ wymagają one informacji zwrotnych na temat potencjalnych zagrożeń związanych z chemikaliami. Metodę tę można zastosować do Daphnia magna z większym naciskiem na toksyczność dla organizmów wodnych. Również Drosphila melanogaster do dalszego badania wpływu na płeć.On lub ona utknęliby w przekonaniu, że badanie efektów na przestrzeni pokoleń jest czasochłonne i energochłonne. Nie bój się pierwszego wrażenia. Przestrzeganie protokołu przyniesie Ci owocne rezultaty.Aby wyhodować E. coli, odpipetuj 200 mikrolitrów z zawiesin bakteryjnych do 50 mililitrów pożywki LB w kolbie. Lub użyj pętli zaszczepiającej, aby wybrać małą kolonię z agarów NGM i umieścić ją w pożywce LB. Aby wyhodować C.elegans, pod mikroskopem policz nicienie na przygotowanych wcześniej agarach NGM.Gdy liczba zbliży się do 2 000, za pomocą sterylnej końcówki odetnij 1/6 agaru NGM i przenieś go na nowo przygotowane agary NGM z trawnikiem bakteryjnym. Trzymaj agary NGM do góry nogami w inkubatorze o temperaturze 22 stopni Celsjusza w celu późniejszej hodowli. Po około 36 godzinach nicienie stają się ciężkie.Użyj dwóch mililitrów sterylnej wody, aby spłukać grawitacyjne nicienie i nowo wyprodukowane jaja z każdego agaru NGM do sterylnych probówek wirówkowych. Umieścić probówki na stojaku na 30 minut, aby osiadły nicienie, a następnie wyrzucić 85% supernatantów przez pipetowanie. Bardzo ważne jest, aby ocenić, czy nicienie są wystarczająco ciężkie, aby można je było zsynchronizować.W przeciwnym razie operacja synchronizacji wieku byłaby daremna. Wymieszaj osady z siedmioma objętościami roztworu podchlorynu sodu i potrząsaj probówkami wirówkowymi co dwie minuty przez pięć do ośmiu razy, aby zlizować larwy i dorosłe nicienie. Odwirować probówki w temperaturze 700 razy G przez trzy minuty w temperaturze 20 stopni Celsjusza, a następnie wyrzucić supernatanty przez pipetowanie.Ponownie zawiesić granulki w pięciu objętościach sterylnej wody, aby umyć jaja zsynchronizowane z wiekiem. Wirować w temperaturze 700 razy G przez trzy minuty w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Powtórz pranie sterylną wodą dwa razy.Następnie dodaj jedną objętość sterylnej wody do probówek, aby ponownie zawiesić jaja zsynchronizowane z wiekiem. Rozprowadzić zawiesiny jaj, pipetując pięćdziesiąt mikrolitrów na każdy nowy agar NGM z trawnikiem bakteryjnym. Trzymaj agary NGM górną stroną do góry w inkubatorze o temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 30 minut, pozwalając wodzie odparować lub zostać wchłoniętą przez trawnik bakteryjny.Następnie odwróć agary NGM do góry nogami, aby uzyskać kolejną hodowlę, i oznacz czas jako czas jaja. 36 godzin po czasie jaja nicienie osiągają stadium larw L3. Użyj dwóch mililitrów sterylnej wody, aby spłukać nicienie z każdego agaru NGM do probówek wirówkowych.Po 30 minutach zastąp 85% supernatantów pożywką K, aby trawić pokarm w jelitach przez dwie godziny. Następnie wyrzuć supernatanty. Użyj K Medium, aby dostosować zawiesiny nicieni do około 200 nicieni na 100 mikrolitrów do kolejnych eksperymentów.Aby uniknąć efektów krawędziowych, w środkowej części 96-dołkowej sterylnej mikropłytki dodaj 100 mikrolitrów przygotowanych roztworów kontrolnych lub chemicznych do 10 dołków, jako powtórzenia w sześciu grupach. Dodaj 100 mikrolitrów przygotowanego medium K Nicieni do każdego z 60 dołków. Oznacz czas jako T0. Wykonuj ekspozycję przez 24 do 96 godzin.Po ekspozycji użyj pipety, aby zebrać nicienie z pięciu studzienek w każdej grupie do sześciu 1,5-mililitrowych probówek wirówkowych. Osadzać nicienie przez 30 minut, a następnie pipetą, aby usunąć supernatanty. Umyj nicienie na dnie jednym mililitrem wysterylizowanej wody.Usytuj nicienie na 30 minut. Odrzucić supernatanty i użyć nicieni znajdujących się na dole do pomiarów wskaźnikowych narażonego pokolenia rodzicielskiego, oznaczonych jako F0. Zbierz nicienie z pozostałych pięciu studzienek w każdej grupie. Usiądź i umyj nicienie jak poprzednio.Następnie dodaj 100 mikrolitrów sterylnej wody, aby ponownie zawiesić nicienie w każdej probówce i przenieś zawiesiny nicieni równomiernie na trzy nowo przygotowane agary NGM z trawnikiem bakteryjnym. Wysiaduj nicienie przez 36 godzin, aby stały się ciężkie, i przeprowadź synchronizację wieku, jak poprzednio. Po inkubacji zsynchronizowanych jaj na agarach NGM z trawnikiem bakteryjnym przez 36 godzin, przepłucz nicienie do sześciu probówek wirówkowych.Po osiadaniu i umyciu jednym mililitrem wysterylizowanej wody, użyj nicieni na dnie do pomiarów wskaźnikowych pokolenia potomstwa oznaczonego jako T1. Wymieszaj 99 mililitrów ciepłych agarów NGM z jednym mililitrem roztworów kontrolnych lub chemicznych. Po przygotowaniu agarów z zawiesinami bakteryjnymi zgodnie z rękopisem, w szafie bezpieczeństwa biologicznego odłóż górne pokrywy szalek Petriego i wystaw trawnik bakteryjny na działanie światła UV przez 15 minut. Odpipetuj jaja zsynchronizowane z wiekiem na agary poddane działaniu promieniowania UV.Oznacz początek ekspozycji na pokolenie rodzicielskie, F0, jako dzień zerowy. Inkubuj agary przez trzy dni w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Następnie użyj dojrzałych nicieni do zmierzenia efektów w F0. Również trzeciego dnia użyj szklanego pręta wyposażonego w sztuczny drut z włókna wygiętego w pierścień, aby wybrać dojrzałe nicienie F0 i wsunąć je na powierzchnię nowych agarów NGM poddanych działaniu promieniowania UV.Czwartego dnia wybierz i wyrzuć dojrzałe nicienie F0 z agarów NGM. Szóstego dnia użyj dojrzałych nicieni F1, które były narażone na kontakt przez trzy dni, do pomiaru wskaźników. W tym protokole międzypokoleniowy wpływ kadmu, miedzi, ołowiu i na częstotliwość zginania ciała wykazał, że zahamowania u rodzica nicienia, F0, po ekspozycji prenatalnej były mniejsze niż u ich potomstwa, T1. Wielopokoleniowy wpływ resztkowy sulfametoksazolu na długość życia i reprodukcję nicieni wykazał, że narażenie na linię zarodkową miało znaczący wpływ na reprodukcję, a toksyczność utrzymywała się w nienarażonych pokoleniach od pokoleń T3 do T6.Wielopokoleniowa ekspozycja i wielopokoleniowy resztkowy wpływ lindanu na wskaźniki biochemiczne i genetyczne nicieni wykazały skutki otyłości z zaburzeniami regulacji sygnału insulinowego. Co więcej, zmiany między sygnalizacją sgk-1 i akt-1 wskazały, że nicienie z różnych generacji ekspozycji wykazywały różne strategie reagowania w zakresie tolerancji i unikania. Przed każdą operacją należy sprawdzić stan żywy nicieni i odpowiednio zmodyfikować następujące kroki.Inne skutki, na przykład otyłość chemiczna, mogą być uwzględnione, aby jeszcze bardziej odpowiedzieć na rosnące rozpowszechnienie otyłości z pokolenia na pokolenie. Na podstawie tej metody można badać dalsze mechanizmy. Na przykład dziedziczne sygnały epigenetyczne między pokoleniami.Roztwory chloru mają silne potencjały oksytacyjne i unikają bezpośredniego kontaktu z nim skóry.

using-caenorhabditis-elegans-for-studying-trans-multi-generational

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Ten film przedstawia test krótkoterminowego przeżycia, który testuje leczenie ostrej toksyczności lub testuje szczep genetyczny pod kątem odporności na stan toksyczny. Przykładowy protokół pokazuje przykładowy test przeżycia, w którym robaki są testowane pod kątem ich odporności na stres oksydacyjny wywołany przez parakmet (PQ).

C. elegans (C. elegans) Test przeżycia: test toksyczności krótkoterminowej

C. elegans jest zwykle uprawiany na solidnych płytkach agarowych lub w płynnych kulturach z wysiewem E. coli. Aby zapobiec zakłóceniom w badaniach toksykologicznych i żywieniowych bakteryjnych produktów ubocznych, wykorzystaliśmy płynne podłoże akseniczne, CeHR, do hodowli i synchronizacji dużej liczby robaków do szeregu dalszych zastosowań.

Hodowla Caenorhabditis elegans w płynnych pożywkach aksenicznych i tworzenie transgenicznych robaków przez bombardowanie mikrocząsteczkami

Opisujemy szczegółowe etapy wysokoprzepustowego testu chemicznego u nicieni Caenorhabditis elegans używanych do oceny toksyczności linii zarodkowej. W tym teście zaburzenie funkcji linii zarodkowej po narażeniu na działanie substancji chemicznych jest monitorowane za pomocą fluorescencyjnego reportera specyficznego dla zarodków aneuploidalnych.

Kompleksowa ocena toksyczności chemicznej linii rozrodczej z wykorzystaniem nicienia Caenorhabditis elegans

Opisany jest podstawowy protokół oceny toksyczności substancji chemicznych u zwierzęcia modelowego, Caenorhabditis elegans. Metoda ta jest wygodna i przydatna przy opracowywaniu farmaceutyków, a także przy ocenie ryzyka związanego z różnymi zanieczyszczeniami środowiska.

Pomiar wpływu substancji chemicznych na wzrost i rozmnażanie Caenorhabditis elegans

Tutaj prezentujemy nicienia Caenorhabditis elegans jako wszechstronny model gospodarza do badania interakcji mikrobiologicznych.

Nicienie Caenorhabditis elegans - wszechstronny model in vivo do badania interakcji gospodarz-mikroorganizm

Narażenie na toksyczne czynniki środowiskowe może poważnie wpłynąć na rozwój z długoterminowymi skutkami. Przedstawiono szczegółowe protokoły ilustrujące strategię wykorzystującą skuteczny model laboratoryjny do badania wpływu wczesnej ekspozycji embrionalnej na bisfenol A. Zapewniamy testy płodności i behawioralne w celu monitorowania skuteczności naszych testów biologicznych narażenia na toksyny.

Długoterminowe behawioralne i reprodukcyjne konsekwencje narażenia zarodków na toksyczne substancje w niskich dawkach

Metoda ilościowa została opracowana do identyfikacji i przewidywania ostrej toksyczności chemikaliów poprzez automatyczną analizę profilowania fenotypowego Caenorhabditis elegans. Protokół ten opisuje, jak leczyć robaki chemikaliami w 384-dołkowej płytce, przechwytywać filmy i określać ilościowo fenotypy związane z toksykologią.

Wysokoprzepustowy test do przewidywania toksyczności chemicznej za pomocą zautomatyzowanego profilowania fenotypowego Caenorhabditis elegans

Tutaj prezentujemy protokół oceny neuroprotekcyjnych aktywności testowych związków u Caenorhabditis elegans, w tym agregacji poliglutaminy, śmierci neuronów i zachowania chemounikania, a także przykładowej integracji wielu fenotypów.

Caenorhabditis elegans jako modelowy system do odkrywania związków bioaktywnych przeciwko neurotoksyczności za pośrednictwem poliglutaminy

Młode dorosłe nicienie Caenorhabditis elegans są narażone na różne stężenia komercyjnych pestycydów lub innych substancji toksycznych przez 2-24 godziny. Następnie można wizualizować różne neurony za pomocą szczepów wykazujących ekspresję fluorescencyjną. W artykule pokazano, w jaki sposób można wystawić nicienie na działanie pestycydów i ocenić uszkodzenia neuronów.

Badanie wpływu pestycydów na neurony Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans służy jako doskonały system modelowy z solidnymi i tanimi metodami badania zdrowia, długości życia i odporności na stres.

Badanie tanich metod pomiaru długości życia i długości zdrowia u Caenorhabditis elegans

Poznaj metodę badania wielopokoleniowych skutków substancji toksycznych przy użyciu Caenorhabditis elegans. Protokół ten pozwala ocenić długoterminowe wpływy chemikaliów na zdrowie i ekosystemy.

Wykorzystanie Caenorhabditis elegans do badania trans- i wielopokoleniowych skutków substancji toksycznych

Przeglądaj więcej filmów