Name: Przewidywanie dostarczania ładunków in vivo przy użyciu bariery krew-mózg w naczyniu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: Poznaj metodę tworzenia in vitro modelu bariery krew-mózg w naczyniu z użyciem mysich i ludzkich komórek. Technika umożliwia przewidywanie dostarczania leków do guzów układu nerwowego z wysoką powtarzalnością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez granty z Fińskich Organizacji Walki z Rakiem, Fundacji Jane i Aatos Erkko oraz Fundacji Sigrid Juselius (dla P.L. i V.L.J.), Swiss National Science Foundation (Advanced Postdoc.Mobility grant no: P300PB_164732, dla S.K.), Fundacji Badawczej Orion (dla S.K.), Fundacji Pamięci Maud Kuistila (dla S.K.) oraz Akademii Fińskiej (TERVA 2017, Nr grantu: 314 498). Zakład Obrazowania Biomedicum (Helsinki) jest uznawany za dostawcę podstawowego wyposażenia w obrazowanie mikroskopowe.

<ol><li>Daneman, R., Prat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412(2015).</li>
<li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Microenvironmental+Landscape+of+Brain+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">The Microenvironmental Landscape of Brain Tumors.</a> Cancer Cell. 31 (3), 326-341 (2017).</li>
<li>Wang, Z., Sun, H., Yakisich, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+the+blood-brain+barrier+for+chemotherapy%3A+limitations%2C+challenges+and+rising+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Agents+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Overcoming the blood-brain barrier for chemotherapy: limitations, challenges and rising problems.</a> Anticancer Agents in Medicinal Chemistry. 14 (8), 1085-1093 (2014).</li>
<li>Alkins, R. D., Brodersen, P. M., Sodhi, R. N., Hynynen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+drug+delivery+for+boron+neutron+capture+therapy+of+brain+tumors+with+focused+ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncology%22%5BJournal%5D)">Enhancing drug delivery for boron neutron capture therapy of brain tumors with focused ultrasound.</a> Neuro Oncology. 15 (9), 1225-1235 (2013).</li>
<li>Alli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brainstem+blood+brain+barrier+disruption+using+focused+ultrasound%3A+A+demonstration+of+feasibility+and+enhanced+doxorubicin+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Brainstem blood brain barrier disruption using focused ultrasound: A demonstration of feasibility and enhanced doxorubicin delivery.</a> Journal of Controlled Release. 281, 29-41 (2018).</li>
<li>Ashby, L. S., Smith, K. A., Stea, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gliadel+wafer+implantation+combined+with+standard+radiotherapy+and+concurrent+followed+by+adjuvant+temozolomide+for+treatment+of+newly+diagnosed+high-grade+glioma%3A+a+systematic+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Surgical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Gliadel wafer implantation combined with standard radiotherapy and concurrent followed by adjuvant temozolomide for treatment of newly diagnosed high-grade glioma: a systematic literature review.</a> World Journal of Surgical Oncology. 14 (1), 225(2016).</li>
<li>Guishard, A. F., Yakisich, J. S., Azad, N., Iyer, A. K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+gap+in+ongoing+clinical+trials+for+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Translational gap in ongoing clinical trials for glioma.</a> Journal of Clinical Neurosciences. 47, 28-42 (2018).</li>
<li>Rahman, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+endothelial+cell+lines+for+in+vitro+blood-brain+barrier+models%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Immortalized endothelial cell lines for in vitro blood-brain barrier models: A systematic review.</a> Brain Research. 1642, 532-545 (2016).</li>
<li>Helms, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier%3A+An+overview+of+commonly+used+brain+endothelial+cell+culture+models+and+guidelines+for+their+use%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).</li>
<li>Wang, J. D., Khafagy, el-S., Khanafer, K., Takayama, S., ElSayed, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+Endothelial+Cells%2C+Pericytes%2C+and+Astrocytes+into+a+3D+Microfluidic+in+Vitro+Model+of+the+Blood-Brain+Barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Organization of Endothelial Cells, Pericytes, and Astrocytes into a 3D Microfluidic in Vitro Model of the Blood-Brain Barrier.</a> Molecular Pharmaceutics. 13 (3), 895-906 (2016).</li>
<li>Phan, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier-on-a-chip%3A+Microphysiological+systems+that+capture+the+complexity+of+the+blood-central+nervous+system+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine+%28Maywood%29%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier-on-a-chip: Microphysiological systems that capture the complexity of the blood-central nervous system interface.</a> Experimental Biology and Medicine (Maywood). 242 (17), 1669-1678 (2017).</li>
<li>Bang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Low+Permeability+Microfluidic+Blood-Brain+Barrier+Platform+with+Direct+Contact+between+Perfusable+Vascular+Network+and+Astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A Low Permeability Microfluidic Blood-Brain Barrier Platform with Direct Contact between Perfusable Vascular Network and Astrocytes.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8083(2017).</li>
<li>Wilhelm, I., Krizbai, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier+for+the+study+of+drug+delivery+to+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">In vitro models of the blood-brain barrier for the study of drug delivery to the brain.</a> Molecular Pharmacology. 11 (7), 1949-1963 (2014).</li>
<li>Campisi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+self-organized+microvascular+model+of+the+human+blood-brain+barrier+with+endothelial+cells%2C+pericytes+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes.</a> Biomaterials. 180, 117-129 (2018).</li>
<li>Pirsko, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Effect+of+Culture+Media+on+Epithelial+Differentiation+Markers+in+Breast+Cancer+Cell+Lines+MCF7%2C+MDA-MB-436+and+SkBr3%5BTitle%5D)+AND+%22Medicina+%28Kaunas%29%22%5BJournal%5D)">An Effect of Culture Media on Epithelial Differentiation Markers in Breast Cancer Cell Lines MCF7, MDA-MB-436 and SkBr3.</a> Medicina (Kaunas). 54 (2), (2018).</li>
<li>Stebbins, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+characterization+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+brain+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells.</a> Methods. 101, 93-102 (2016).</li>
<li>Canfield, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+isogenic+blood-brain+barrier+model+comprising+brain+endothelial+cells%2C+astrocytes%2C+and+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (6), 874-888 (2017).</li>
<li>Cao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-inducible+factor-1alpha+is+involved+in+isoflurane-induced+blood-brain+barrier+disruption+in+aged+rats+model+of+POCD%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-inducible factor-1alpha is involved in isoflurane-induced blood-brain barrier disruption in aged rats model of POCD.</a> Behavioural Brain Research. 339, 39-46 (2018).</li>
<li>Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-endothelial+interactions+and+blood-brain+barrier+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-endothelial interactions and blood-brain barrier permeability.</a> Journal of Anatomy. 200 (6), 629-638 (2002).</li>
<li>Kinnari, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+homing+peptide-functionalized+porous+silicon+nanovectors+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Tumour homing peptide-functionalized porous silicon nanovectors for cancer therapy.</a> Biomaterials. 34 (36), 9134-9141 (2013).</li>
<li>Levin, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+medicine+in+neuro-oncology%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Oncology%22%5BJournal%5D)">Personalized medicine in neuro-oncology.</a> CNS Oncology. 5 (2), 55-58 (2016).</li>
<li>Weathers, S. S., Gilbert, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+Personalized+Targeted+Therapeutics%3A+An+Overview%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Toward Personalized Targeted Therapeutics: An Overview.</a> Neurotherapeutics. 14 (2), 256-264 (2017).</li>
<li>O'Duibhir, E., Carragher, N. O., Pollard, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerating+glioblastoma+drug+discovery%3A+Convergence+of+patient-derived+models%2C+genome+editing+and+phenotypic+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Accelerating glioblastoma drug discovery: Convergence of patient-derived models, genome editing and phenotypic screening.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 80, 198-207 (2017).</li>
<li>Kaya, M., Ahishali, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+permeability+in+barrier+type+of+endothelium+in+brain+using+tracers%3A+Evans+blue%2C+sodium+fluorescein%2C+and+horseradish+peroxidase%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Assessment of permeability in barrier type of endothelium in brain using tracers: Evans blue, sodium fluorescein, and horseradish peroxidase.</a> Methods in Molecular Biology. 763, 369-382 (2011).</li>
<li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+two+immortalized+cell+lines%2C+ECV304+and+bEnd3%2C+for+in+vitro+permeability+studies+of+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of two immortalized cell lines, ECV304 and bEnd3, for in vitro permeability studies of blood-brain barrier.</a> PLoS One. 12 (10), e0187017(2017).</li>
<li>Blouw, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hypoxic+response+of+tumors+is+dependent+on+their+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">The hypoxic response of tumors is dependent on their microenvironment.</a> Cancer Cell. 4 (2), 133-146 (2003).</li>
<li>Argaw, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-derived+VEGF-A+drives+blood-brain+barrier+disruption+in+CNS+inflammatory+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-derived VEGF-A drives blood-brain barrier disruption in CNS inflammatory disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2454-2468 (2012).</li>
<li>Miao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+increases+paracellular+permeability+in+brain+endothelial+cells+via+upregulation+of+EphA2%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">VEGF increases paracellular permeability in brain endothelial cells via upregulation of EphA2.</a> The Anatomical Record (Hoboken). 297 (5), 964-972 (2014).</li>
<li>Heinolainen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGFR3+Modulates+Vascular+Permeability+by+Controlling+VEGF%2FVEGFR2+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">VEGFR3 Modulates Vascular Permeability by Controlling VEGF/VEGFR2 Signaling.</a> Circulation Research. 120 (9), 1414-1425 (2017).</li>
<li>Claesson-Welsh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+permeability--the+essentials%5BTitle%5D)+AND+%22Upsala+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Vascular permeability--the essentials.</a> Upsala Journal of Medical Sciences. 120 (3), 135-143 (2015).</li>
<li>Adriani, G., Ma, D., Pavesi, A., Goh, E. L., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+Blood-Brain+Barrier+in+a+3D+triple+co-culture+microfluidic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Conference+Proceedings+-+IEEE+Engineering+in+Medicine+and+Biology+Society%22%5BJournal%5D)">Modeling the Blood-Brain Barrier in a 3D triple co-culture microfluidic system.</a> Conference Proceedings - IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2015, 338-341 (2015).</li>
<li>Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hCMEC%2FD3+cell+line+as+a+model+of+the+human+blood+brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+and+Barriers+of+the+CNS%22%5BJournal%5D)">The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16(2013).</li>
<li>Paatero, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyses+in+zebrafish+embryos+reveal+that+nanotoxicity+profiles+are+dependent+on+surface-functionalization+controlled+penetrance+of+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Analyses in zebrafish embryos reveal that nanotoxicity profiles are dependent on surface-functionalization controlled penetrance of biological membranes.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8423(2017).</li>
<li>Prabhakar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimuli-responsive+hybrid+nanocarriers+developed+by+controllable+integration+of+hyperbranched+PEI+with+mesoporous+silica+nanoparticles+for+sustained+intracellular+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Stimuli-responsive hybrid nanocarriers developed by controllable integration of hyperbranched PEI with mesoporous silica nanoparticles for sustained intracellular siRNA delivery.</a> International Journal of Nanomedicine. 11, 6591-6608 (2016).</li>
<li>Hyvonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+target+for+peptide-based+imaging+and+treatment+of+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Novel target for peptide-based imaging and treatment of brain tumors.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 13 (4), 996-1007 (2014).</li>
<li>Feng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary-Derived+Growth+Inhibitor+Targeting+Peptide-Modified+PEG-PLA+Nanoparticles+for+Enhanced+Targeted+Glioblastoma+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mammary-Derived Growth Inhibitor Targeting Peptide-Modified PEG-PLA Nanoparticles for Enhanced Targeted Glioblastoma Therapy.</a> Bioconjugate Chemistry. 26 (8), 1850-1861 (2015).</li>
<li>Nance, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dense+poly%28ethylene+glycol%29+coating+improves+penetration+of+large+polymeric+nanoparticles+within+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">A dense poly(ethylene glycol) coating improves penetration of large polymeric nanoparticles within brain tissue.</a> Science Translational Medicine. 4 (149), 149rA119(2012).</li>
<li>Berg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+nanoparticle+transport+through+in+vitro+blood-brain+barrier+models%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Barriers%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of nanoparticle transport through in vitro blood-brain barrier models.</a> Tissue Barriers. 4 (1), e1143545(2016).</li>
<li>Noumbissi, M. E., Galasso, B., Stins, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+vascular+heterogeneity%3A+implications+for+disease+pathogenesis+and+design+of+in+vitro+blood-brain+barrier+models%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+and+Barriers+of+the+CNS%22%5BJournal%5D)">Brain vascular heterogeneity: implications for disease pathogenesis and design of in vitro blood-brain barrier models.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 12(2018).</li>
<li>Heymans, M., Sevin, E., Gosselet, F., Lundquist, S., Culot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimicking+brain+tissue+binding+in+an+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier+illustrates+differences+between+in+vitro+and+in+vivo+methods+for+assessing+the+rate+of+brain+penetration%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Mimicking brain tissue binding in an in vitro model of the blood-brain barrier illustrates differences between in vitro and in vivo methods for assessing the rate of brain penetration.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 127, 453-461 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Rozwój koncepcji zmienności guza między pacjentami ożywił badania nad spersonalizowaną medycyną onkologiczną21. Ta zmienność jest również cechą charakterystyczną nowotworów ośrodkowego układu nerwowego. Ze względu na nieprzewidywalność guza, odpowiedź na chemioterapię zwiększa efekt ochronny bariery krew-mózg w dostarczaniu leków i w sumie stanowi poważne wyzwanie w opiece nad pacjentem22. Aby opracować skuteczniejsze terapie, często konieczne jest badanie przesiewowe dużych bibliotek nowych cząsteczek. Aby ocenić skuteczność przeciwnowotworową i zdolność nowych przewodów terapeutycznych do dotarcia do miejsca guza, najlepszą opcją jest badanie przedkliniczne na komórkach pochodzących od pacjenta wszczepionych in vivo do mysich awatarów pacjentów. Ze względów praktycznych (finansowych, czasowych, ludzkich i obiektowych) i etycznych (zasada 3R w przypadku wykorzystywania zwierząt laboratoryjnych) opracowanie tak dużej platformy badań przesiewowych in vivo często nie jest możliwe, w związku z czym testy oparte na komórkach pozostają modelem pierwszego wyboru23. Głównym powodem wyboru ustalonych linii komórkowych i unikania komórek pierwotnych jest ułatwienie odtwarzalności i ograniczenie wykorzystania zwierząt laboratoryjnych, które są głównym źródłem izolacji i zakładania pierwotnych kultur mysich. Przedstawione tu metody, w pełni zgodne z zasadą 3R, mogłyby skutecznie wyeliminować nanocząstki z dalszych badań przedklinicznych na kryterium ich niezdolności do przekroczenia modelu BBTB. Jako dowód słuszności zasady opisujemy tutaj wyniki uzyskane podczas opracowywania i walidacji BBTB. Udało nam się potwierdzić wyniki in vitro in vivo, na przykład podczas pomiaru biernej dyfuzji fluoresceiny sodowej 376 Da.
Protokół opisany w tym artykule opisuje przygotowanie komórek śródbłonka hodowanych wspólnie z astrocytami w celu utworzenia interfejsu przypominającego barierę krew-mózg guza w konfiguracji in vitro. Po nawiązaniu fizycznego kontaktu między tymi dwoma typami komórek, warstwa komórek śródbłonka wykazuje podobieństwa do BBB (np. ekspresja białek ścisłego połączenia na powierzchni komórki i stosunkowo niska przepuszczalność). Co ciekawe, mysi naśladowca BBTB wydawał się zapewniać szczególnie podobne wartości przepuszczalności Na-Fl do tych uzyskanych za pomocą pomiarów przepuszczalności BBB in vivo na myszach24. W związku z tym wydajność naśladowców BBTB będzie bezpośrednio związana z wyborem komórek użytych do utworzenia bariery. Komórki śródbłonka bEND3 pochodzą z mózgu i wiadomo, że skutecznie tworzą bariery, gdy są hodowane wspólnie z astrocytami25. Jednak do wygenerowania mimiki BBTB używaliśmy unieśmiertelnionych astrocytów HIFko26 . Ze względu na brak czynnika indukowanego hipoksją, astrocyty te nie wytwarzają VEGF-A, co jest kwintesencją opisanej tutaj stabilizacji naśladującej BBTB. Astrocyty zostały zidentyfikowane jako modulatory przepuszczalności bariery krew-mózg, na przykład poprzez uwalnianie VEGF-A w odpowiedzi na zapalenie nerwów27. Aktywacja receptorów czynnika wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (VEGFR) jest kluczowym regulatorem przepuszczalności śródbłonka/naczyń krwionośnych zarówno in vitro28 , jak i in vivo29. Dlatego suplementy VEGF-A w pożywce aktywują VEGFR2 na komórkach śródbłonka, co indukuje fosforylację białek połączeniowych adherenów, takich jak VE-kadheryna30. Utrata kontaktów komórka-komórka śródbłonka generuje wysoce przepuszczalne naczynia krwionośne. Podobnie, zarówno silne właściwości mitogenne, jak i nieznany skład płodowych surowic bydlęcych stosowanych w testach hodowli komórkowych powodują poważne problemy ze stabilizacją bariery i odtwarzalnością testu.
Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) są czasami wykorzystywane do tworzenia BBB in vitro31; jednak znacznie różnią się od komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu, takich jak linia komórkowa hCMEC/D332, pod względem ekspresji genów i właściwości tworzenia bariery. Jednak stosunkowo wyższe wartości przepuszczalności uzyskane za pomocą komórek HuAR2T hodowanych samodzielnie w porównaniu z bEND3 zostały znacznie zmniejszone przez kokulturację ich z ludzkimi astrocytami pierwotnymi. Chociaż komórki śródbłonka są niezbędne do utworzenia ściany komórkowej, jasne jest, że astrocyty mają do odegrania równie ważną rolę w tworzeniu i stabilizacji BBTB.
Kiedy do tego równania dodano kulki glejaka pochodzące od pacjentów, mysz naśladująca BBTB podsumowała niektóre cechy mysich ksenoprzeszczepów, takie jak dyfuzja leku przez naczynia krwionośne mózgu i celowanie w komórki nowotworowe. Omawiane tutaj mimiki BBTB odniosły na przykład sukces w odzwierciedleniu zachowania in vivo, gdy przebadaliśmy kilka nanocząstek o różnych średnicach. Aby zilustrować równoległość między modelami in vitro i in vivo, użyliśmy wcześniej opisanych mezoporowatych nanocząstek krzemianu33 o właściwościach penetrujących komórki34 sprzężonych z peptydem CooP ukierunkowanym na nowotwór na ich powierzchni20. Peptyd ukierunkowany na CooP jest domem dla inwazyjnych komórek nowotworowych poprzez specyficzne wiązanie z inhibitorem wzrostu pochodzącym z sutka (MDGI). Kilka nowotworów, w tym glejaki, wykazują nadekspresję MDGI w porównaniu z normalną tkanką35, co sprawia, że CooP jest bardzo skutecznym ugrupowaniem ukierunkowanym na nowotwór, zdolnym do zwiększenia dostarczania ładunku20. Wcześniej wykazano, że zastosowane tutaj nanocząstki dyfundują do miąższu mózgu (27547955), a po sfunkcjonalizowaniu za pomocą Taxolu te nano-ładunki odniosły sukces w zmniejszaniu wzrostu glejaka w modelach przedklinicznych36. Dodanie pozostałości glikolu polietylenowego (PEG) na powierzchni nanocząstek również utrzymało ich ładunek statyczny do wartości dodatnich (około + 4 mV), umożliwiając lepszą interakcję z jednostką nerwowo-naczyniową37 , a także zwiększając ich stabilność w krążeniu. W przedstawionych danych 3 kDa PEG sprzężono z NP110, natomiast NP350 pokryto 10 kDa PEG. Jednak PEG o zwiększonej masie cząsteczkowej spowodował również znaczny wzrost średnicy nanocząstek, stąd ich fizyczne możliwości przekraczania bariery krew-mózg. W związku z tym sprawdziliśmy, czy fizyczne wymiary cząstek uniemożliwiają im przejście przez BBTB i czy obserwacje te można odzwierciedlić in vivo.
Zgodnie z wcześniej opublikowanymi obserwacjami zaobserwowaliśmy, że NP110 wynaczyniane były zarówno przez BBTB in vitro, jak i BBB myszy z guzami wewnątrzczaszkowymi, podczas gdy NP350 zatrzymywane po stronie światła mimiki BBTB i w naczyniach krwionośnych myszy. Te podobne wyniki silnie sugerują, że model BBTB przewidział zdolność nanocząstek do przekraczania bariery krew-mózg in vivo i docierania do mózgu.
Często dyskutuje się o znaczeniu modeli komórkowych bariery krew-mózg, nawet w odniesieniu do centralnego dostarczania nanocząstek38. Pokazujemy tutaj, że pierwotne astrocyty i komórki śródbłonka, oba uważane za najistotniejsze narzędzia in vitro, mogą zostać zastąpione przez unieśmiertelnione i/lub dostępne na rynku komórki, zapewniając większą skalowalność i odtwarzalność. Następna generacja naśladowców BBB in vitro może zostać opracowana poprzez włączenie urządzeń mikroprzepływowych, co pozwoli na pięknie uformowane jednostki nerwowo-naczyniowe, które strukturalnie przypominają rzeczywisty BBB12,14. Jednak takie modele nie nadają się obecnie do wysokoprzepustowych badań przesiewowych cząsteczek dostarczanych do glejaków ze względu na ograniczenia techniczne w następstwie dostawy14. Rzeczywiście trudno jest uchwycić fizjologiczną złożoność bariery krew-mózg w naczyniu, a możliwy brak niektórych receptorów/białek, o których wiadomo, że są wyrażane przez barierę krew-mózg, może zagrozić interpretacji wyników. Kolejny argument dotyczy dużej zmienności ekspresji genów między warunkami in vivo i in vitro, a także między liniami komórkowymi, zwłaszcza biorąc pod uwagę komórki śródbłonka. Można jednak również argumentować, że jednostka nerwowo-naczyniowa nie jest jednolitą jednostką w mózgu39. Badania naukowe w dziedzinie biologii osiągnęły erę humanitarną, w której dobrostan zwierząt, odpowiedzialność etyczna i koszt wykorzystania życia zwierząt są zawsze brane pod uwagę przed zaprojektowaniem eksperymentu. Dlatego, aby wesprzeć zastępowanie zwierząt, coraz więcej ostatnich badań pokazuje, że świadomość ograniczeń modeli i staranny dobór modeli komórkowych w celu ustanowienia bariery – z naciskiem na astrocyty – uzasadnia zgodność wyników uzyskanych w naczyniu i w modelach zwierzęcych40. Dzięki opisanej tutaj metodologii zbliżamy się o krok do zmniejszenia liczby zwierząt doświadczalnych wykorzystywanych do celów przesiewowych transcytozy BBB pod kątem potencjalnych środków terapeutycznych.

Jednostka nerwowo-naczyniowa składa się z neuronów, astrocytów i BBB, utworzonych przez skomplikowane połączenia między perycytami, astrocytami, komórkami śródbłonka i powiązaną błoną podstawną tworzącą mikrokrążenie mózgu1. Ta szczelna ściana komórkowa utworzona przez ciągłe, niefenestrowane naczynia precyzyjnie reguluje ruch jonów i cząsteczek (w tym hormonów, składników odżywczych lub leków), ale także krążących komórek1. Szczególnie niska transcytoza przez barierę krew-mózg cząsteczek o dużej masie cząsteczkowej, takich jak przeciwciała terapeutyczne, koniugaty leków lub nanozwiązki, dramatycznie ogranicza postępy w odkrywaniu leków na choroby neurologiczne, w tym glejaki złośliwe2. Rzeczywiście, chemioterapia podawana doustnie lub dożylnie dociera do miąższu mózgu często w niewystarczająco niskich stężeniach, aby wywołać efekt przeciwnowotworowy lub po prostu nie jest w stanie przekroczyć BBTB, aby dotrzeć do komórek nowotworowych3. Kilka badań przedklinicznych i klinicznych nie zajmowało się kwestią przenikania BBTB, ale próbowano przejściowo zakłócić BBTB, na przykład za pomocą skoncentrowanych ultradźwięków4,5, lub obejść go poprzez bezpośrednie dostarczanie leków in situ6. Jednak żadna z tych technik nie była w stanie przeciwdziałać nieuniknionej ekspansji lub nawrotowi guza. W związku z tym, przy opracowywaniu nowych terapii przeciwglejakowych, dyfuzja przez BBTB powinna być traktowana jako jeden z krytycznych aspektów skutecznego dostarczania środków terapeutycznych7.
Ze względu na bardzo złożoną naturę interakcji komórkowych w BBTB, badania in vivo na zwierzętach laboratoryjnych wydają się być oczywistym wyborem podczas badania przejścia molekuł z krwi do mózgu. Metody in vivo na dużą skalę są jednak stosunkowo skomplikowane do ustalenia, a zatem nie pozwalają na wysokoprzepustowe badania przesiewowe cząsteczek w rozsądnym czasie przy rozsądnych kosztach. Co ważniejsze, testy na zwierzętach muszą być zgodne z wytycznymi etycznymi 3R zdefiniowanymi jako i) udoskonalić, ii) zredukować i, co ma znaczenie w obecnym kontekście, iii) zastąpić alternatywnymi protokołami (np. metodami in vitro/in silico). W związku z tym odtworzenie BBTB in vitro wydaje się interesującą i atrakcyjną możliwością, ale stanowi również złożone zadanie, które wiąże się z różnymi ograniczeniami. Opublikowano wiele prób odtworzenia tego złożonego przedziału z hodowanymi komórkami pierwotnymi lub liniami komórkowymi pochodzenia psiego, świńskiego, mysiego, a nawet ludzkiego (zgodnie z recenzją Rahman et al.8 i Helms et al.9). Modele te obejmują trójwymiarowe systemy mikroprzepływowe10, BBB-on-a-chip11,12 oraz wiele wariantów opartych na klasycznych kokulturach w systemach insertów. Niemniej jednak, obecne systemy mikroprzepływowe i chipowe albo nie nadają się do szybkich, wysokoprzepustowych badań walidacyjnych leków13,14 lub są obecnie niekompatybilne z badaniami nad dostarczaniem leków do guzów mózgu. Ponadto przegląd 155 opublikowanych modeli wykorzystujących komórki pierwotne, indukowalne pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) lub komercyjne linie komórkowe hodowane wspólnie na inteszach wykazał tendencję do rozbieżności między badaniami w ich pomiarach i/lub wnioskach8. Ten brak odtwarzalności międzylaboratoryjnej może być skorelowany z i) nieznormalizowanymi warunkami hodowli, na przykład z opcjonalnym pokryciem białkami macierzy błony podstawnej w naczyniu hodowli komórkowej, ii) zwiększoną liczbą subkultur i użyciem pożywek zawierających surowicę, które są głównymi czynnikami powodującymi genetyczne i fenotypowe modyfikacje linii komórkowych15lub iii) trudność w odtwarzalnym odtworzeniu właściwej równowagi między składnikami astrogleju i śródbłonka w naczyniu. Chociaż wykorzystanie unieśmiertelnionych komórek lub komercyjnych linii komórkowych do stworzenia modelu BBB in vitro nie ma niektórych właściwości w porównaniu z podobnymi modelami, które wykorzystują tylko komórki pierwotne, w opisanej metodzie pokazujemy, że właściwa kombinacja komórek wykazuje bardzo porównywalną wydajność do opublikowanych badań w innych modelach referencyjnych16, 17. Ostatecznie, brak solidnego i powtarzalnego modelu do badania przechodzenia związków terapeutycznych ukierunkowanych na nowotwory mózgu przez BBTB zmotywował nas do opracowania opisanych tutaj metod.
Ponieważ celem było wykorzystanie modelu do przewidywania dostarczania nanocząsteczek in vivo w przedklinicznych modelach zwierzęcych, najpierw zweryfikowaliśmy model BBTB, wykorzystując wstawki zawierające mysie komórki śródbłonka stykające się z mysimi astrocytami. Oprócz tego zoptymalizowaliśmy również model tak, aby wykorzystywał niektóre ludzkie linie komórkowe. Po ustabilizowaniu bariery komórkowe są przenoszone do hodowli z kulkami glejaka pochodzącymi od pacjenta lub komercyjnymi liniami komórkowymi glejaka. Następnie transcytozę nanocząstek i celowanie w komórki nowotworowe można uwidocznić za pomocą mikroskopii konfokalnej i określić ilościowo poprzez pobieranie próbek w czasie. Co ważne, wyniki uzyskane przy użyciu naśladowców BBTB mogą wiarygodnie przewidywać zachowanie nanocząstek in vivo, co przemawia za zastosowaniem naśladownictwa BBTB przed walidacją przedkliniczną.

<table><tbody><tr><td>Cells</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>bEND3</td><td>ATCC</td><td>CRL-2299</td><td>Hodowane w: DMEM (1g/L glukozy) uzupełnionym 10% FBS, 5 ml L-glutaminy i 5 ml penicyliny/streptomycyny</td></tr><tr><td>Unieśmiertelnione astrocyty myszy HIFko</td><td>wyizolowane w laboratorium dr Gabriele Bergers</td><td>https://doi.org/10.1016/S1535-6108(03)00194-6</td><td>Hodowane w: BME-1 uzupełnione 5% FBS, 5 ml 1 M HEPES, 5 ml 100 mM pirogronianu sodu, 3 g D-glukozy i 5 ml penicyliny/streptomycyny</td></tr><tr><td>HuAR2T</td><td>Wyizolowane w laboratorium dr Dagmar Wirth</td><td>https://doi.org/10.1089/ten.tea.2009.0184</td><td>Hodowane w: EBM-2 z SupplementMix</td></tr><tr><td>normalne ludzkie astrocyty pierwotne</td><td>Lonza</td><td>CC-2565</td><td>Hodowane w: ABM z SingleQuots</td></tr><tr><td>Materiał i odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Półmisek 100 mm x17 mm, Nunclon Delta</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>150350</td><td></td></tr><tr><td>10 ml pipeta serologiczna</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>170361</td><td></td></tr><tr><td>15 ml stożkowe sterylne probówki wirówkowe z polipropylenu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>ABM Basal Medium, 500 ml</td><td>Lonza</td><td>CC-3187</td><td>Dla pierwotnych astrocytów ludzkich. ABM+: zawiera wszystkie dodatki z mieszanki suplementów. ABM -: wszystkie dodatki z wyjątkiem rhEGF i FBS</td></tr><tr><td>Accutase Cell Detachment Solution</td><td>Corning</td><td>25-058-CI</td><td></td></tr><tr><td>AGM SingleQuots Suplementy i czynniki wzrostu</td><td>Lonza</td><td>CC-4123</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplement</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>zarówno dla GBM +, jak i - średni</td></tr><tr><td>Basal Medium</td><td>Eagle ThermoFisher Scientific</td><td>21010046</td><td>BME-1</td></tr><tr><td>Corning Costar Płytki 6-dołkowe z powłoką TC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3506</td><td></td></tr><tr><td>Corning Transwell Wkładki do hodowli komórek z membraną poliestrową</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3452&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-glukozę</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>rozpuścić w 50 ml BME-1 i sterylnym filtrze przed dodaniem do pożywki</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient F-12 Ham</td><td>Gibco</td><td>21331-020</td><td>Specyficzny dla hodowli kulek pochodzących od pacjenta wyizolowanych w naszym laboratorium, może się różnić dla innych linii komórkowych glejaka</td></tr><tr><td>Wzrost EBM-2 Medium SupplementMix</td><td>PromoCell</td><td>c-39216</td><td>EBM+: zawiera wszystkie dodatki z mieszanki suplementów. EBM-: wszystkie dodatki z wyjątkiem VEGF-A i FBS</td></tr><tr><td>Endothelial Basal Medium 2 (EBM-2)</td><td>PromoCell</td><td>c-22211</td><td>EBM+: zawiera wszystkie dodatki z mieszanki suplementów. EBM -: wszystkie dodatki z wyjątkiem VEGF-A i FBS</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS), kwalifikowana, inaktywowana termicznie, zatwierdzona przez UE, pochodzenie z Ameryki Południowej</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10500056</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa fluoresceiny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6377</td><td></td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR 96-dołkowe płytki</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Greiner 655090</td><td>czarne studzienki polistyrenowe płaskie dno (z mikroprzezroczystym dnem)</td></tr><tr><td>Menzel-Gl&auml; ser 0,9 cm okrągłe borokrzemianowe szkiełka nakrywkowe</td><td>Thermo Scientific</td><td>10313573</td><td></td></tr><tr><td>tabletki PBS</td><td>Medicago</td><td>09-9400-100</td><td>jedna tabletka na litr dH2O, następnie wysterylizować roztwór przez autoklawowanie</td></tr><tr><td>bromowodorku poli-D-lizyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki EGF</td><td>Peprotech</td><td>GMP100-15</td><td>do podłoża GBM+</td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki FGF-basic (154 a.a.)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>do GBM+ średnio</td></tr><tr><td><silna>immunofluorescencja</silna></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehydowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>24 mm x 60 mm szkiełko nasadkowe do mikroskopu</td><td>ORSAtec</td><td>0224601-D</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 i 594 przeciwciała drugorzędowe</td><td>ThermoFisher Naukowe</td><td></td><td>rozcieńczenie: 1/500</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Claudin-5</td><td>Abcam</td><td>ab15106</td><td>rozcieńczenie: 1/150</td></tr><tr><td>Klon przeciwciała anty-GFAP GF5</td><td>Abcam</td><td>ab10062</td><td>rozcieńczenie: 1/150</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD31&nbsp; przeciwciało Klon MEC 13,3</td><td>BD Biosciences</td><td>550274</td><td>rozcieńczenie 1/800</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-SV40 Anty-SV40</td> Anty-T <td>Abcam</td><td>Ab16879</td><td>Rozcieńczenie: 1/150</td></tr><tr><td>Anti-Zonula Occludens-1</td><td>Abcam</td><td>ab96587</td><td>Rozcieńczenie: 1/200</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>TOCRIS</td><td>5748</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount Wodne podłoże montażowe&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4680</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Red DND-99</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L7528</td><td></td></tr><tr><td>Animal procedures</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 cm zakrzywione nożyczki preparacyjne</td><td>World Precision Instruments</td><td>14394</td><td></td></tr><tr><td>BD Microlance 25 G</td><td>Eckton Dickinson</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>Cienkie kleszcze (12,5 cm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>503283</td><td>do dysocjacji tkanek</td></tr><tr><td>Intramedic Rurki polietylenowe PE20</td><td>Becton Dickinson</td><td>427406</td><td></td></tr><tr><td>Ketaminol vet 50 mg / ml</td><td>Intervet</td><td>VNR511485</td> Mikrowiertarka <td>zasilana z sieci ketaminy</td></tr><tr><td></td><td>World Precision Instruments</td><td>503599</td><td></td></tr><tr><td>Menzel-Gl&auml; ser 0,5 cm okrągłe borokrzemianowe szkiełka nakrywkowe</td><td>Thermo Scientific</td><td>11888372</td><td></td></tr><tr><td>Zacisk Micro Bulldog</td><td>World Precision Instruments</td><td>14119</td><td></td></tr><tr><td>Fizjologiczny roztwór soli</td><td>fizjologicznej Mustela</td><td>Sterylne fiolki jednodawkowe 20 x 5 ml / 40 x 5 ml - klasa</td><td></td>wyrobów medycznych</tr><tr><td>Kleszcze Rochester-Oschner</td><td>World Precision Instruments</td><td>501709</td><td></td></tr><tr><td>Rompun weterynarz 20 mg/ml</td><td>Intervet</td><td>VNR148999</td> Adapter stereotaktyczny <td>ksylazyny</td></tr><tr><td></td><td>World Precision Instruments</td><td>502063</td><td></td></tr><tr><td>Sugi Sponge Points</td><td>Kettenbach</td><td>31603</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Zoom.V16 fluorescencyjny stereofoniczny mikroskop zmiennoogniskowy&nbsp;</td>Czytnik mikropłytek <td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FLUOstar Omega</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Flash 4.0 cyfrowa kamera sCMOS</td> Wirówka stołowa <td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Universal 320&nbsp;</td><td>Kot Hettich</td><td>. Nr 1401</td><td></td></tr><tr><td>ZEISS LSM 880 z mikroskopem konfokalnym Airyscan</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

przewidywanie dostarczania ładunków in vivo przy użyciu bariery krew-mózg w naczyniu

Predicting In Vivo Payloads Delivery using a Blood-brain Tumor-barrier in a Dish

Wysoce selektywna z natury, bariera krew-mózg (BBB) jest niezbędna dla homeostazy mózgu w warunkach fizjologicznych. Jednak w kontekście nowotworów mózgu selektywność molekularna BBB chroni również komórki nowotworowe, blokując dostarczanie obwodowo podawanych chemoterapii. Opracowywanie nowych leków (w tym nanocząstek) ukierunkowanych na złośliwe nowotwory mózgu wymaga wykorzystania przedklinicznych modeli zwierzęcych do badania transcytozy i skuteczności przeciwnowotworowej leku. Aby zachować zgodność z zasadą 3R (udoskonalić, zmniejszyć i zastąpić) w celu zmniejszenia liczby zwierząt laboratoryjnych w konfiguracji eksperymentalnej i przeprowadzenia wysokoprzepustowych badań przesiewowych dużej biblioteki środków przeciwnowotworowych, opracowaliśmy odtwarzalną w warunkach in vitro ludzką i mysią naśladowniczkę bariery nowotworowej krew-mózg (BBTB) przy użyciu trójwarstwowych kultur komórek śródbłonka, astrocytów, i kule glejaka pochodzącego od pacjenta. Aby uzyskać większą skalowalność i odtwarzalność, komercyjne linie komórkowe lub unieśmiertelnione komórki zostały użyte w dostosowanych warunkach, aby umożliwić utworzenie bariery przypominającej rzeczywistą barierę BBB. Tutaj opisujemy protokół uzyskiwania mimiki BBTB poprzez hodowlę komórek śródbłonka w kontakcie z astrocytami przy określonej gęstości komórek na wstawkach. Ten naśladownictwo BBTB może być wykorzystany na przykład do kwantyfikacji i obrazowania konfokalnego przejścia nanocząstek przez bariery śródbłonka i astrocytów, a także do oceny celowania w komórki nowotworowe w ramach tego samego testu. Ponadto wykazujemy, że uzyskane dane mogą być wykorzystane do przewidywania zachowania nanocząstek w przedklinicznych modelach zwierzęcych. W szerszej perspektywie, ten model in vitro może zostać zaadaptowany do innych chorób neurodegeneracyjnych w celu określenia przejścia nowych cząsteczek terapeutycznych przez barierę krew-mózg i/lub zostać uzupełniony organoidami mózgowymi w celu bezpośredniej oceny skuteczności leków.

Obrazowanie konfokalne mysiego modelu BBTB wykazuje ekspresję i lokalizację komórkową białek połączeń ścisłych: zonula occludens-1 (ZO-1) oraz klaudyny-5 w komórkach bEND3. Kontakty między komórkami śródbłonka a astrocytami wyraźnie wywołały relokację ZO-1 i klaudyny-5 do miejsc kontaktu międzykomórkowego komórek śródbłonka w porównaniu z monokulturami bEND3 (Rycina 1D). Dzięki zastosowaniu barwienia immunofluorescencyjnego w celu wizualizacji wykazujących ekspresję GFAP astrocytów po stronie mózgowej membrany, możliwe jest obserwowanie i badanie wypustek astrocytarnych oraz stópek kontaktujących się z komórkami śródbłonka poprzez membranę (Rycina 1E). Znane jest, że kontakty między astrocytami a komórkami śródbłonka wspomagają i stabilizują uszczelnianie bariery komórkowej i wiążą się z niższymi wartościami przepuszczalności BBB19. Zgodnie z tym zaobserwowaliśmy znaczny spadek przepuszczalności mysiego modelu BBTB dla Na-Fl z 27,63 (± 3,45) x 10-6 cm/s w przypadku monokultur do 6,74 (± 3,01) x 10-6 cm/s podczas kokultury z astrocytami z nokautem czynnika indukowanego hipoksją (HIFko) (Tabela 1). Unieśmiertelniona linia HuAR2T tworzy wysoce przepuszczalne bariery komórkowe (104,92 ± 27,1 x 10-6 cm/s, Tabela 1). Podobnie jak w modelu mysim, zmierzyliśmy znacznie niższą przepuszczalność BBTB dla Na-Fl, mianowicie 47,4 (± 14,32) x 10-6 cm/s, gdy komórki HuAR2T były w kokulturze z ludzkimi pierwotnymi astrocytami (Tabela 1).
W obu modelach BBTB na myszach i ludziach obecność sfer glioblastoma pochodzących od pacjentów wywołała niewielki wzrost wartości przepuszczalności w porównaniu do samych kokultur komórek śródbłonka i astrocytów (Tabela 1). Zjawisko to obserwuje się w przypadku kilku, ale nie wszystkich modeli sfer glejaka od pacjentów. Może to być spowodowane VEGF-A wydzielanym przez niektóre z tych komórek pochodzących od pacjentów.
Aby porównać wartości przepuszczalności in vitro mimo biologicznej bariery krew-mózg (BBTB) z in vivo barierą krew-mózg (BBB), obrazowano dyfuzję Na-Fl w czasie rzeczywistym przez okno czaszkowe wszczepione u myszy nago. Za pomocą stereomikroskopu fluorescencyjnego rejestrowano dyfuzję Na-Fl z naczyń kapilarnych odchodzących od głównych naczyń pialnych przed, w trakcie oraz po systemowym wstrzyknięciu sondy (Rysunek 2C). Pomiary różnicowych wartości fluorescencji we krwi krążącej oraz w parenchymie kory mózgowej w czasie pozwoliły nam obliczyć przybliżone wartości przepuszczalności u myszy nude’BBB dla Na-Fl (5,57 &#177; 2,19 x 10-6 cm/s, Tabela 1).
Aby zilustrować, w jaki sposób ten model BBTB może być wykorzystany do wizualizacji przenikania związków ze strony krwi do strony mózgu, porównaliśmy transcytozę nanocząstek o średnicy ø 110 nm (NP110) oraz ø 350 nm (NP350) celujących w sferoidy glejaka wielopostaciowego pochodzenia od pacjenta. Wyniki uzyskane in vitro porównano następnie z transcytozą in vivo. W przedstawionym przykładzie powierzchnię nanocząstek pokryto peptydem CooP20 celującym w nowotwór i załadowano je barwnikiem fluorescencyjnym (FITC), aby ułatwić wizualizację. Komórki znakowano barwnikiem lizosomalnym i barwiono przeciwbarwnikiem DAPI 24 h po dodaniu nanocząstek FITC po stronie krwi modelu BBTB, a następnie wykonano mikrografie konfokalne na różnych poziomach (np. strona krwi, membrana, strona mózgu oraz sferoidy glejaka pacjenta) (Rysunek 3A). Sygnał fluorescencyjny związany z NP110 kolokalizował z lizosomami w komórkach śródbłonka, astrocytach i komórkach nowotworowych. Ponadto NP110 wykryto pomiędzy komórkami śródbłonka a astrocytami, przenikającymi przez pory membrany insertu (Rysunek 3A).
Przenikanie NP110 określono ilościowo poprzez pomiar fluorescencji z próbek pobranych zarówno ze strony krwi, jak i mózgu. Wartości przepuszczalności porównano z wartościami wyznaczonymi dla nanocząsteczek o średnicy &#160;ø 350 nm (NP350). Wyniki pokazują, że tylko NP110 było w stanie przekroczyć modele BBTB (Rycina 3B). NP350 pozostały po stronie krwi modelu BBTB, co skutkowało niższymi wartościami przepuszczalności dla tych nanocząsteczek.
Aby podkreślić istotność mimetyków BBTB w porównaniu z modelami in vivo, myszom nude wstrzyknięto dożylnie nanocząsteczki NP110 lub NP350 powlekane peptydem CooP celującym w guz i sprzężone z czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym (TRITC) w celu detekcji. Tkanki pobrane w kilku punktach czasowych wykazały, że po 8 h nanocząsteczki przenikające przez BBB przeniknęły do miąższu mózgu, podczas gdy nanocząsteczki nieprzenikające, które pozostały w krwiobiegu, zostały głównie usunięte z krążenia systemowego in vivo. W związku z tym pobraliśmy mózgi i określiliśmy liczbę nanocząsteczek na milimetr kwadratowy 8 h po wstrzyknięciu. Zgodnie z wynikami in vitro, NP110, a nie NP350, skutecznie przeniknęło do miąższu mózgu (Rycyna 3C). Obrazowanie nanocząsteczek w mózgu przy dużym powiększeniu wykazało, że NP110 było homogenicznie rozłożone w miąższu mózgu poza kapilarami krwionośnymi i skutecznie dotarło do zaimplantowanych komórek glejaka (Rycyna 3D). Pomimo posiadania tej samej grupy celującej w guz (CooP), NP350 nie było w stanie przeniknąć do miąższu mózgu i zostało wykryte jedynie po stronie światła naczyń krwionośnych mózgu (Rycyna 3E), co było zbieżne z wynikami uzyskanymi in vitro.
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59384/59384fig1.jpg" /> 
Rysunek 1: Opis modelu bariery krew-guz mózgu (BBTB). (A) Schematyczne przedstawienie rozmieszczenia różnych typów komórek. (B) Ilustracja umieszczenia wkładu na pokrywie płytki 6-dołkowej oraz techniki wysiewania astrocytów na stronę mózgową membrany wkładu’. (C) Ilustracja rozmieszczenia płytki 6-dołkowej umożliwiająca adhezję astrocytów. (D) Mikrografie immunofluorescencyjne białek połączeń ścisłych zonula occludens-1 (ZO-1, górny rząd, czerwony) i claudyny-5 (dolny rząd, zielony). Ekspresję białek porównano z mysimi mikro naczyniowymi komórkami śródbłonka mózgu (bEND3) hodowanymi na stronie krwi BBTB jako monokulturę (lewa kolumna) lub z mysimi unieśmiertelnionymi astrocytami HIFko (prawa kolumna). Jądra komórkowe zostały przeciwbarwione DAPI (niebieski). (E) Mikrograf immunofluorescencyjny pokazujący glia lny kwaśny białko (GFAP, czerwony) w astrocytach HIFko hodowanych po stronie mózgowej BBTB. Obraz przy dużym powiększeniu pokazuje wypustki astrocytów i stopki końcowe (strzałki) kontaktujące się z komórkami śródbłonka poprzez pory membrany (prawy panel). Tożsamość astrocytów HIFko została zweryfikowana poprzez barwienie immunofluorescencyjne dużego antygenu T wirusa małpiego 40 (SV40 large T, zielony) wykorzystanego do unieśmiertelnienia komórek. Komórki śródbłonka nie wykazują ekspresji GFAP ani SV40 large T i dlatego mogą być częściowo obserwowane przez przezroczystą, przeciwległą stronę membrany jako komórki barwione wyłącznie DAPI (linie przerywane). Jądra komórkowe zostały przeciwbarwione DAPI (niebieski). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59384/59384fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59384/59384fig2.jpg" /> 
Rycina 2: In vivo oznaczanie przepuszczalności BBB u myszy. (A) Przygotowanie implantowalnego cewnika do żyły ogonowej. (1) Narzędzia i sprzęt obejmują: (a) rurkę polietylenową PE20, (b) dwie igły 25 G, (c) kleszczyki Rochester-Ochsner oraz (d) mały zacisk typu bulldog. (2) Igłę 25 G usuwa się poprzez kilkukrotne przekręcenie za pomocą kleszczyków i (3) ostrożnie wsuwa do rurki. (4) Drugi koniec rurki zostaje połączony z drugą igłą 25 G. (B) Wytyczne dotyczące implantacji i pozycjonowania cewnika w celu infuzji roztworu fluoresceiny sodowej przez żyłę ogonową myszy. Zakreślony obszar wskazuje miejsce nałożenia kropli kleju cyjanoakrylowego w celu zabezpieczenia cewnika. Zacisk typu bulldog służy do manipulowania cewnikiem i jest usuwany po jego zabezpieczeniu. (C) Reprezentatywne obrazowanie i metoda kwantyfikacji służąca do wyznaczenia wartości przepuszczalności fluoresceiny sodowej. Przed infuzją fluoresceiny sodowej (lewa kolumna) mierzy się autofluorescencję/tło w obrębie obszaru zainteresowania (ROI) umieszczonego na mózgu (górny panel, biały prostokąt) oraz w obszarach naczyń krwionośnych (dolny panel, czerwony prostokąt). Podczas infuzji fluoresceiny sodowej (prawa kolumna) mierzy się intensywność fluorescencji w obu obszarach ROI, co pozwala na obliczenie przepuszczalności BBB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59384/59384fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59384/59384fig3.jpg" /> 
Rycina 3: Przewidywanie wewnątrzczaszkowej transcytozy nanocząstek przez BHE in vivo z wykorzystaniem modelu BBTB in vitro. (A) Graficzna reprezentacja testu BBTB z reprezentatywnymi obrazami konfokalnymi uzyskanymi na wskazanych różnych poziomach mysiego modelu BBTB. Nanocząstki o średnicy 110 nm (NP110) sprzężone z FITC (zielony) dodano po stronie krwi BBTB. Komórki znakowano sondą lizosomalną (LT-99, czerwony). &#160;(1) Komórki śródbłonka, (2) transcytoza śródbłonkowa nanocząstek przez pory membrany (biała przerywana linia), (3) astrocyty oraz (4) sfery glejaka pacjenta zostały zidentyfikowane na grafice i odpowiadających im mikrografiach konfokalnych (po prawej). Enkapsulacja lizosomalna nanocząstek (strzałki) sugeruje aktywną transcytozę przez warstwy śródbłonka i astrocytów BBTB. (B) Ilościowe oznaczenie wskazanej przepuszczalności nanocząstek przez BBTB in vitro (n = 6). (C) Ilościowe oznaczenie wskazanej gęstości nanocząstek w przekrojach tkanki mózgowej 8 h po infuzji do żyły ogonowej u myszy nude (n = 3). (D) Mikrografie konfokalne przedstawiające rozkład nanocząstek o średnicy ø 110 nm (NP110, czerwony) w przekrojach tkanki mózgowej myszy znakowanych przeciwciałem anty-mysim CD31 (zielony). Strzałka wskazuje transcytozę nanocząstek (panel lewy). Nanocząstki nagromadziły się wokół komórek guza mózgu (tumor, panel prawy) dzięki peptydowi celującemu CooP obecnemu na ich powierzchni. W tkance mózgowej (Brain) nie zaobserwowano istotnego hominguu. (E) Mikrografie konfokalne przedstawiające rozkład nanocząstek o średnicy ø 350 nm (NP350, czerwony) w przekrojach tkanki mózgowej myszy znakowanych przeciwciałem anty-mysim CD31 (zielony). Groty strzałek wskazują NP350, które zatrzymały się w świetle naczyń krwionośnych i nie były w stanie przekroczyć BHE, prawdopodobnie ze względu na większą średnicę w porównaniu do NP110. Jądra komórkowe zostały przeciwbarwione DAPI (niebieski). ** P &#60; 0.01. Wartości P obliczono za pomocą dwustronnego, nieparametrycznego testu U Manna-Whitneya. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59384/59384fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>mysi model naśladujący barierę krew-guzy mózgu (BBTB)</td>
			<td>bEND3</td>
			<td>bEND3+HIFko As</td>
			<td>bEND3+GB</td>
			<td>bEND3+HIFko As+GB</td>
			<td>In vivo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przepuszczalność (10-6 cm/s)</td>
			<td>27.63</td>
			<td>6.74</td>
			<td>26.8</td>
			<td>10.83</td>
			<td>5.57</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD (10-6 cm/s)</td>
			<td>3.45</td>
			<td>3.01</td>
			<td>7.99</td>
			<td>2.65</td>
			<td>2.19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mimik ludzkiego BBTB</td>
			<td>HuAR2T</td>
			<td>HuAR2T+hIAs</td>
			<td>HuAR2T+GB</td>
			<td>HuAR2T+hIAs+GB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przepuszczalność (10-6 cm/s)</td>
			<td>104.92</td>
			<td>47.4</td>
			<td>89.08</td>
			<td>48.24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD (10-6 cm/s)</td>
			<td>27.1</td>
			<td>14.32</td>
			<td>10.21</td>
			<td>13.07</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Wartości przepuszczalności sodu-fluoresceiny (Na-Fl) (w centymetrach na sekundę) określone in vitro w wskazanych systemach kokultury oraz in vivo u myszy nagi NMRI. Dane z reprezentatywnego eksperymentu (n = 3 myszy).

Ukierunkowanie leków na nowotwory ośrodkowego układu nerwowego jest dużym wyzwaniem. W tym miejscu opisujemy protokół wytwarzania in vitro naśladującego barierę nowotworową krew-mózg przy użyciu komórek mysich i / lub ludzkich oraz omawiamy ich znaczenie dla przewidywalności celowania w nowotwór ośrodkowego układu nerwowego in vivo.

Przewidywanie dostarczania ładunków in vivo przy użyciu bariery krew-mózg w naczyniu

Highly selective by nature, the blood-brain barrier (BBB) is essential for the brain homeostasis in physiological conditions. However, in the context of ...

W celu opracowania nowych leków i związków, które są ukierunkowane na nowotwory ośrodkowego układu nerwowego, bardzo ważna jest dostępność i przejście przez barierę krew-mózg. Chociaż cytotoksyczność związków można łatwo zmierzyć, inkubując komórki z cząsteczkami terapeutycznymi, tak naprawdę nie mówi to nic o faktycznym dostarczeniu do miejsca guza w mózgu. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy następujący protokół, który opisuje, jak odtworzyć barierę nowotworową krew-mózg in vitro na szalce.Użycie unieśmiertelnionych komórek pochodzenia mysiego lub ludzkiego sprawia, że test ten jest bardzo elastyczny. Można go również łatwo skalować w górę, aby przesiewać dziesiątki związków o wysokiej odtwarzalności. Ponadto metoda ta umożliwia zarówno kwantyfikację, jak i wizualizację pasażu i zdolności celowania związków przed przystąpieniem do modeli przedklinicznych.Dlatego nasza metoda częściowo zastępuje modele zwierzęce przy użyciu wcześniej ustalonych linii komórkowych. Włączenie komórek guza mózgu pochodzących od pacjenta bada niejednorodność pacjenta, podczas gdy użycie unieśmiertelnionych komórek do ustanowienia bariery krew-mózg zapewnia powtarzalność wyników. Ogólnie rzecz biorąc, ten model bariery krew-mózg oferuje naprawdę interesujące narzędzie do badania dyfuzji leku lub dostarczania nośników leków.Wizualna demonstracja metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ wysiewanie komórek po przeciwnej stronie wkładki wymaga manipulacji, która nie jest często opisywana w innych protokołach wykorzystujących podobną konfigurację. Na przykład uzyskanie adhezji astrocytów, gdy wkładka jest umieszczona do góry nogami, bardzo korzystne dla reprezentacji wizualnej. Pod sterylnym kapturem do hodowli komórkowych ostrożnie umyj hodowane astrocyty pięcioma mililitrami sterylnego PBS.Użyj pompy próżniowej, aby delikatnie wyrzucić PBS i dodaj dwa mililitry odczynnika do dysocjacji komórek na pięć minut, aby odłączyć komórki. Następnie dodaj 10 mililitrów sterylnej kompletnej pożywki do hodowli komórek astrocytów do naczynia, aby zahamować aktywność odczynnika do dysocjacji komórek. Użyj sterylnej pipety serologicznej, aby przenieść oderwane komórki z naczynia do sterylnej probówki o pojemności 15 mililitrów.Wirować 250 razy g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. W międzyczasie rozłóż wkładki. Użyj sterylnych kleszczy, aby umieścić wkładki stroną mózgową do góry na pokrywie sterylnej płytki sześciodołkowej.Po zakończeniu wirowania ostrożnie wyrzuć supernatant z zawiesiny komórek i ponownie zawieś osad astrocytów w jednym mililitrze ABM-plus, delikatnie pipetując osad na ściance probówki do pięciu razy. Następnie policz komórki i dostosuj gęstość zawiesiny komórek do 150 000 komórek w 400 mikrolitrach ABM-plus na wkładkę. Umieść zawiesinę komórkową na środku błony wkładki po stronie mózgu i ostrożnie rozprowadź ją za pomocą siły kapilarnej za pomocą sterylnej końcówki pipety.Trzymając wkładki po stronie mózgowej nadal skierowaną do góry, umieść sześciodołkową płytkę z powrotem na wkładkach. Umieść płytkę i wkładki, stroną z mózgiem do góry, w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aby umożliwić adhezję komórek. Następnie przywróć sześciodołkową płytkę z powrotem do normalnej pozycji, z wkładkami teraz krwią skierowaną do góry.Dodaj pożywkę i kontynuuj inkubację zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Pod sterylnym kapturem do hodowli komórkowych ostrożnie umyj wyhodowane komórki śródbłonka pięcioma mililitrami sterylnego PBS. Użyj pompy próżniowej, aby delikatnie wyrzucić PBS i dodaj dwa mililitry odczynnika do dysocjacji komórek na pięć minut, aby odłączyć komórki.Następnie dodaj 10 mililitrów sterylnej pożywki do pełnej pożywki do hodowli komórek śródbłonka do naczynia, aby zahamować aktywność odczynnika do dysocjacji komórek. Użyj sterylnej pipety serologicznej, aby przenieść oderwane komórki z naczynia do sterylnej probówki o pojemności 15 mililitrów. Wirować 250 razy g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej.Następnie wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osad komórek śródbłonka w jednym mililitrze EBM-plus, powoli pipetując zawiesinę komórek na ściance probówki do pięciu razy. Policz komórki i dostosuj gęstość zawiesiny komórek do 200 000 komórek w 2,5 mililitrach hodowli komórek śródbłonka pozbawionej surowicy i czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego-A na wkładkę. Pobrać płytkę zawierającą wkładki.Ostrożnie wyrzuć pożywkę od strony krwi i zastąp ją 2,5 mililitra zawiesiny komórek śródbłonka. Następnie włóż płytkę z powrotem do inkubatora i pozostaw ją na noc, aby komórki śródbłonka przylgnęły do błony. Następnego dnia przygotuj sześciodołkową płytkę, przenosząc trzy mililitry wstępnie podgrzanego ABM-minus do każdej studzienki.Używając sterylnych kleszczy, należy obchodzić się z wkładkami, aby ostrożnie usunąć kompletne podłoże śródbłonka od strony krwi i umieścić wkładkę w nowej płytce zawierającej ABM-minus. Następnie dodaj 2,5 mililitra EBM-minus. Wkładki należy pozostawić w inkubatorze przy minimalnych zakłóceniach fizycznych lub zmianach temperatury przez pięć dni.W dniu przeniesienia wymień nośnik. W przypadku obrazowania immunofluorescencyjnego należy umieścić do czterech okrągłych sterylnych szkiełek nakrywkowych borokrzemianu w każdym dołku sześciodołkowej płytki zawierającej dwa mililitry poli-D-lizyny. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.W międzyczasie użyj sterylnej pipety serologicznej, aby ostrożnie przenieść kulki nowotworowe z naczynia do hodowli komórkowej do sterylnej probówki o pojemności 15 mililitrów. Odwiruj kulki guza z prędkością 250 razy g przez trzy minuty. Odrzucić supernatant i delikatnie zawiesić kulki w jednym mililitrze GBM-minus.Policz komórki i dostosuj gęstość komórek do około 10 000 kulek lub 100 000 komórek na mililitr GBM-minus. Następnie wyrzuć poli-D-lizynę ze studzienek i trzykrotnie przepłucz studzienki sterylnym PBS. Zasiej każdą studzienkę płytki trzema mililitrami zawiesiny sferoidalnej guza i przenieś wkładki z naśladowcą BBTB na zawiesinę komórek nowotworowych.Inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla, aby umożliwić równowagę krwi i guza mózgu. Następnego dnia zastąp pożywkę po stronie krwi EBM-minus uzupełnioną interesującymi cząsteczkami, lekami lub nanocząsteczkami. Próbki należy pobierać w czasie w celu bezpośredniego oznaczania ilościowego, jak opisano powyżej.Najpierw zbierz 100 mikrolitrów pożywki zarówno z krwi, jak i po stronie mózgu naśladowcy BBTB i przenieś każdy z nich na oddzielną, czarną, 96-dołkową płytkę z płaskim dnem w celu kolejnych pomiarów fluorescencji. Następnie przygotuj 50-mikromolowy roztwór fluoresceiny sodu w EBM-minus, upewniając się, że przygotowałeś 2,5 mililitra na studzienkę. Podgrzej ten roztwór do 37 stopni Celsjusza i zastąp pożywkę od strony krwi wkładek pożywką zawierającą ten roztwór fluoresceiny sodu.Uruchom timer, gdy tylko nośnik zostanie wymieniony. Ostrożnie zbierz 100 mikrolitrów pożywki zarówno od strony krwi, jak i mózgu po pięciu minutach, 30 minutach, 60 minutach i 120 minutach. Przenieść każdą próbkę do oddzielnych studzienek na odpowiedniej czarnej, 96-dołkowej płytce.Użyj czytnika płytek, aby określić ilościowo fluorescencję pobranych próbek. Najpierw rozcieńczyć lizosomowy barwnik fluorescencyjny do odpowiedniego stężenia roboczego we wstępnie podgrzanym podłożu. Dodaj to do komórek i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 45 minut.Następnie trzykrotnie przepłucz komórki lodowatym PBS. Wyrzuć PBS i dodaj trzy mililitry lodowatego 4% paraformaldehydu do studzienek i 2,5 mililitra do wkładki. Inkubować na lodzie przez 10 minut.Następnie wyrzuć paraformaldehyd i trzykrotnie przepłucz komórki PBS. Usunąć PBS i przeciwbarwić jądra komórkowe za pomocą roztworu DAPI o końcowym stężeniu jednego mikrograma na mililitr w wodzie destylowanej. Inkubować w temperaturze pokojowej przez siedem minut.Następnie wyjmij DAPI i umyj membrany trzykrotnie wodą destylowaną. Ostrożnie przeciąć membranę, usunąć wodę destylowaną i umieścić ją na kropli podłoża montażowego na szklanym szkiełku mikroskopowym. Dodaj kolejną kroplę podłoża montażowego po drugiej stronie membrany i ostrożnie przykryj ją borokrzemianową szkłem nakrywkowym.W tym badaniu komórki śródbłonka były hodowane wspólnie z astrocytami, aby utworzyć interfejs przypominający barierę krew-mózg guza w konfiguracji in vitro. Obrazowanie konfokalne mysiego naśladownictwa BBTB pokazuje ekspresję i lokalizację komórkową białek ścisłego połączenia zonula occludens-1 i klaudyny-5 w bEND3. Kontakty między komórkami śródbłonka a astrocytami wyraźnie indukują przemieszczenie tych dwóch białek do śródbłonka kontaktów komórka-komórka w porównaniu z monokulturami bEND3.Wykorzystując barwienie immunofluorescencyjne do wizualizacji astrocytów eksprymujących GFAP po stronie błony mózgu, można obserwować i badać procesy astrocytarne i stopy końcowe stykające się z komórkami śródbłonka przez błonę. Aby porównać wartości przepuszczalności naśladowców BBTB in vitro z barierą krew-mózg in vitro, dyfuzja fluoresceiny sodu w czasie rzeczywistym jest obrazowana przez okno czaszkowe wszczepione nagim myszom. Za pomocą stereomikroskopu fluorescencyjnego rejestruje się dyfuzję fluoresceiny sodu z naczyń włosowatych naczyń krwionośnych pochodzących z głównych naczyń krwionośnych pialnych przed, w trakcie i po ogólnoustrojowym wstrzyknięciu sondy.Transcytoza nanocząstek, które celują w kule glejaka pochodzące od pacjenta, jest następnie porównywana, aby zilustrować, w jaki sposób ten naśladowniczy BBTB może być wykorzystany do wizualizacji przejścia związków ze strony krwi do strony mózgu. Sygnał fluorescencyjny związany z NP110 kolokalizuje się z lizosomami w komórkach śródbłonka, astrocytach i komórkach nowotworowych. Ponadto NP110 są wykrywane pomiędzy komórkami śródbłonka a astrocytami, przechodząc przez pory błony wkładki.Pasaż NP110 określa się ilościowo, mierząc fluorescencję z próbek pobranych zarówno od strony krwi, jak i mózgu, a wartości te porównuje się z określonymi nanocząstkami o wielkości 350 nanometrów. Jak widać, tylko NP110 są w stanie przekroczyć mimikę BBTB, podczas gdy NP350 pozostał po stronie krwi, co skutkuje niższymi wartościami przepuszczalności dla tych nanocząstek. Z wkładką należy obchodzić się ostrożnie i ostrożnie rozprowadzać zawiesinę komórek astrocytów po stronie mózgu wkładki bez bezpośredniego kontaktu z błoną.Każde uszkodzenie membrany spowoduje wyciek. Metoda ta może być zaadaptowana, aby odpowiedzieć na pytanie o dostarczanie przez mózg obwodowo podawanych ładunków. Dzięki zastosowaniu różnych wkładek z większymi porami błonowymi możliwe jest również badanie wynaczynienia komórek.Technikę tę można modyfikować poprzez stosowanie różnych typów komórek w celu naśladowania innych barier komórkowych. Toruje również drogę do bardziej odpowiedzialnych i etycznych badań, mających na celu zmniejszenie liczby zwierząt laboratoryjnych wykorzystywanych do walidacji leków przeciwnowotworowych. Należy pamiętać, że paraformaldehyd jest bardzo toksyczną substancją chemiczną i należy się z nią odpowiednio obchodzić.Należy również zachować ostrożność podczas używania ostrego skalpela do wyciągania błon z wkładek.

predicting-vivo-payloads-delivery-using-blood-brain-tumor-barrier

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Zacznij od mysiego modelu glejaka, inwazyjnego guza mózgu.Na obrzeżach guza bariera krew-mózg (BBB) pozostaje nienaruszona, a komórki śródbłonka tworzą ścisłe połączenia, które regulują wejście molekularne.Mysz jest wyposażona w światłowód montowany na głowie, który dostarcza światło laserowe.Podaj laser na podczerwień o niskiej intensywności, który przenika przez skórę i czaszkę, aby dotrzeć do mózgu.Laser wzbudza tlen cząsteczkowy w komórkach mózgowych, wytwarzając reaktywne formy tlenu (ROS).

Indukowane laserowo przerwanie bariery krew-mózg w celu dostarczania liposomów do mysiego modelu glejaka

W tym filmie opisujemy kompleksowy protokół do stworzenia modelu in vitro naśladującego barierę krew-mózg. Model ten jest obiecujący, jeśli chodzi o zrozumienie sposobu dostarczania środków terapeutycznych w leczeniu guzów mózgu.

Bariera nowotworowa krew-mózg lub model BBTB: adaptacja bariery krew-mózg lub model BBB w celu oceny dostarczania leków do guza

Ten film opisuje test przepuszczalności do oceny przepuszczalności bariery krew-mózg in vitro przy użyciu cząsteczek fluoresceiny sodu.

Test przepuszczalności naśladującej barierę krew-mózg: Test in vitro do oceny przepuszczalności naśladownictwa BBB dla cząsteczek znacznikowych

Opisujemy nowatorską technikę obrazowania in vivo, która łączy fluorescencyjne chimeryczne myszy z oknami wewnątrzczaszkowymi i mikroskopią 2-fotonową o wysokiej rozdzielczości. Ta platforma obrazowania wspomaga badania dynamicznych zmian w tkance mózgowej i mikrokrążeniu na poziomie pojedynczej komórki, po patologicznych urazach i jest przystosowana do oceny wewnątrzczaszkowego dostarczania i dystrybucji leków.

Nowatorska technika obrazowania in vivo o wysokiej rozdzielczości do badania dynamicznej odpowiedzi struktur wewnątrzczaszkowych na wzrost guza i terapie

Mózg to unikalne miejsce o cechach, które nie są dobrze reprezentowane przez analizy in vitro lub ektopowe. Ortotopowe modele myszy z powtarzalną lokalizacją i charakterystyką wzrostu można niezawodnie tworzyć za pomocą wstrzyknięć wewnątrzczaszkowych przy użyciu stereotaktycznego przyrządu do fiksacji i niskociśnieniowej pompy strzykawkowej.

Tworzenie anatomicznie dokładnych i odtwarzalnych ksenoprzeszczepów wewnątrzczaszkowych ludzkich guzów mózgu

Wprowadzamy protokół do pomiaru w czasie rzeczywistym reakcji komórek przerzutowych raka piersi do mózgu na leki i promieniowanie w organotypowym modelu wycinka mózgu. Metody te zapewniają test ilościowy w celu zbadania efektów terapeutycznych różnych metod leczenia przerzutów raka piersi do mózgu w sposób ex vivo w obrębie interfejsu mikrośrodowiska mózgu.

Model wycinka mózgu ex vivo do badania i celowania we wzrost guza z przerzutami do mózgu raka piersi

Ten protokół opisuje metodę tworzenia ludzkiej bariery krew-mózg (BBB) w modelu in vitro. Komórki śródbłonka i perycyty są wysiewane po obu stronach wkładki filtracyjnej (przedział krwi), a astrocyty są wysiewane w dolnej studzience (przedział mózgowy). Scharakteryzowany model wykorzystano w eksperymentach z transportem nanocząstek.

System potrójnej hodowli komórkowej modelujący ludzką barierę krew-mózg

Wykorzystanie immunokompetentnego, autochtonicznego modelu nowotworu napędzanego przez typowe mutacje pacjentów do testów przedklinicznych jest kluczowe dla testów immunoterapeutycznych. Protokół ten opisuje metodę generowania mysich modeli guza mózgu przy użyciu opartego na elektroporacji dostarczania plazmidowego DNA, które reprezentują typowe mutacje pacjentów, zapewniając w ten sposób dokładny, powtarzalny i spójny model myszy.

Modelowanie guzów mózgu in vivo przy użyciu opartego na elektroporacji dostarczania plazmidowego DNA reprezentującego sygnatury mutacji pacjenta

Bariera krew-mózg jest znaczącą przeszkodą w dostarczaniu terapii glejaka, choroby, na którą nie ma lekarstwa. W tym miejscu przedstawiamy sterowaną obrazem in vivo terapeutyczną platformę nano tlenku żelaza, która może ominąć tę fizjologiczną barierę ze względu na rozmiar i gromadzić się w guzie.

Dostarczanie nanocząstek ładunku oligonukleotydowego w modelu zwierzęcym glejaka wielopostaciowego

Opracowanie ortotopowych modeli guzów mózgu u dzieci wymaga skrupulatnej precyzji, przy użyciu urządzenia stereotaktycznego do precyzyjnego wszczepiania komórek nowotworowych. Przedstawiona tutaj metodologia przedstawia etapy związane z przygotowaniem komórek guza mózgu, wykonywaniem iniekcji wewnątrzczaszkowych i wdrażaniem systemu monitorowania pooperacyjnego w celu oceny wszczepienia guza mózgu.

Opracowanie ortotopowych modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów dla guzów mózgu przy użyciu urządzenia stereotaktycznego

Poznaj metodę tworzenia in vitro modelu bariery krew-mózg w naczyniu z użyciem mysich i ludzkich komórek. Technika umożliwia przewidywanie dostarczania leków do guzów układu nerwowego z wysoką powtarzalnością.

Przewidywanie dostarczania ładunków in vivo przy użyciu bariery krew-mózg w naczyniu

Przeglądaj więcej filmów