Przewidywanie dostarczania ładunków in vivo przy użyciu bariery krew-mózg w naczyniu

Ukierunkowanie leków na nowotwory ośrodkowego układu nerwowego jest dużym wyzwaniem. W tym miejscu opisujemy protokół wytwarzania in vitro naśladującego barierę nowotworową krew-mózg przy użyciu komórek mysich i / lub ludzkich oraz omawiamy ich znaczenie dla przewidywalności celowania w nowotwór ośrodkowego układu nerwowego in vivo.

W celu opracowania nowych leków i związków, które są ukierunkowane na nowotwory ośrodkowego układu nerwowego, bardzo ważna jest dostępność i przejście przez barierę krew-mózg. Chociaż cytotoksyczność związków można łatwo zmierzyć, inkubując komórki z cząsteczkami terapeutycznymi, tak naprawdę nie mówi to nic o faktycznym dostarczeniu do miejsca guza w mózgu. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy następujący protokół, który opisuje, jak odtworzyć barierę nowotworową krew-mózg in vitro na szalce.

Użycie unieśmiertelnionych komórek pochodzenia mysiego lub ludzkiego sprawia, że test ten jest bardzo elastyczny. Można go również łatwo skalować w górę, aby przesiewać dziesiątki związków o wysokiej odtwarzalności. Ponadto metoda ta umożliwia zarówno kwantyfikację, jak i wizualizację pasażu i zdolności celowania związków przed przystąpieniem do modeli przedklinicznych.

Dlatego nasza metoda częściowo zastępuje modele zwierzęce przy użyciu wcześniej ustalonych linii komórkowych. Włączenie komórek guza mózgu pochodzących od pacjenta bada niejednorodność pacjenta, podczas gdy użycie unieśmiertelnionych komórek do ustanowienia bariery krew-mózg zapewnia powtarzalność wyników. Ogólnie rzecz biorąc, ten model bariery krew-mózg oferuje naprawdę interesujące narzędzie do badania dyfuzji leku lub dostarczania nośników leków.

Wizualna demonstracja metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ wysiewanie komórek po przeciwnej stronie wkładki wymaga manipulacji, która nie jest często opisywana w innych protokołach wykorzystujących podobną konfigurację. Na przykład uzyskanie adhezji astrocytów, gdy wkładka jest umieszczona do góry nogami, bardzo korzystne dla reprezentacji wizualnej. Pod sterylnym kapturem do hodowli komórkowych ostrożnie umyj hodowane astrocyty pięcioma mililitrami sterylnego PBS.

Użyj pompy próżniowej, aby delikatnie wyrzucić PBS i dodaj dwa mililitry odczynnika do dysocjacji komórek na pięć minut, aby odłączyć komórki. Następnie dodaj 10 mililitrów sterylnej kompletnej pożywki do hodowli komórek astrocytów do naczynia, aby zahamować aktywność odczynnika do dysocjacji komórek. Użyj sterylnej pipety serologicznej, aby przenieść oderwane komórki z naczynia do sterylnej probówki o pojemności 15 mililitrów.

Wirować 250 razy g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. W międzyczasie rozłóż wkładki. Użyj sterylnych kleszczy, aby umieścić wkładki stroną mózgową do góry na pokrywie sterylnej płytki sześciodołkowej.

Po zakończeniu wirowania ostrożnie wyrzuć supernatant z zawiesiny komórek i ponownie zawieś osad astrocytów w jednym mililitrze ABM-plus, delikatnie pipetując osad na ściance probówki do pięciu razy. Następnie policz komórki i dostosuj gęstość zawiesiny komórek do 150 000 komórek w 400 mikrolitrach ABM-plus na wkładkę. Umieść zawiesinę komórkową na środku błony wkładki po stronie mózgu i ostrożnie rozprowadź ją za pomocą siły kapilarnej za pomocą sterylnej końcówki pipety.

Trzymając wkładki po stronie mózgowej nadal skierowaną do góry, umieść sześciodołkową płytkę z powrotem na wkładkach. Umieść płytkę i wkładki, stroną z mózgiem do góry, w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aby umożliwić adhezję komórek. Następnie przywróć sześciodołkową płytkę z powrotem do normalnej pozycji, z wkładkami teraz krwią skierowaną do góry.

Dodaj pożywkę i kontynuuj inkubację zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Pod sterylnym kapturem do hodowli komórkowych ostrożnie umyj wyhodowane komórki śródbłonka pięcioma mililitrami sterylnego PBS. Użyj pompy próżniowej, aby delikatnie wyrzucić PBS i dodaj dwa mililitry odczynnika do dysocjacji komórek na pięć minut, aby odłączyć komórki.

Następnie dodaj 10 mililitrów sterylnej pożywki do pełnej pożywki do hodowli komórek śródbłonka do naczynia, aby zahamować aktywność odczynnika do dysocjacji komórek. Użyj sterylnej pipety serologicznej, aby przenieść oderwane komórki z naczynia do sterylnej probówki o pojemności 15 mililitrów. Wirować 250 razy g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej.

Następnie wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osad komórek śródbłonka w jednym mililitrze EBM-plus, powoli pipetując zawiesinę komórek na ściance probówki do pięciu razy. Policz komórki i dostosuj gęstość zawiesiny komórek do 200 000 komórek w 2,5 mililitrach hodowli komórek śródbłonka pozbawionej surowicy i czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego-A na wkładkę. Pobrać płytkę zawierającą wkładki.

Ostrożnie wyrzuć pożywkę od strony krwi i zastąp ją 2,5 mililitra zawiesiny komórek śródbłonka. Następnie włóż płytkę z powrotem do inkubatora i pozostaw ją na noc, aby komórki śródbłonka przylgnęły do błony. Następnego dnia przygotuj sześciodołkową płytkę, przenosząc trzy mililitry wstępnie podgrzanego ABM-minus do każdej studzienki.

Używając sterylnych kleszczy, należy obchodzić się z wkładkami, aby ostrożnie usunąć kompletne podłoże śródbłonka od strony krwi i umieścić wkładkę w nowej płytce zawierającej ABM-minus. Następnie dodaj 2,5 mililitra EBM-minus. Wkładki należy pozostawić w inkubatorze przy minimalnych zakłóceniach fizycznych lub zmianach temperatury przez pięć dni.

W dniu przeniesienia wymień nośnik. W przypadku obrazowania immunofluorescencyjnego należy umieścić do czterech okrągłych sterylnych szkiełek nakrywkowych borokrzemianu w każdym dołku sześciodołkowej płytki zawierającej dwa mililitry poli-D-lizyny. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

W międzyczasie użyj sterylnej pipety serologicznej, aby ostrożnie przenieść kulki nowotworowe z naczynia do hodowli komórkowej do sterylnej probówki o pojemności 15 mililitrów. Odwiruj kulki guza z prędkością 250 razy g przez trzy minuty. Odrzucić supernatant i delikatnie zawiesić kulki w jednym mililitrze GBM-minus.

Policz komórki i dostosuj gęstość komórek do około 10 000 kulek lub 100 000 komórek na mililitr GBM-minus. Następnie wyrzuć poli-D-lizynę ze studzienek i trzykrotnie przepłucz studzienki sterylnym PBS. Zasiej każdą studzienkę płytki trzema mililitrami zawiesiny sferoidalnej guza i przenieś wkładki z naśladowcą BBTB na zawiesinę komórek nowotworowych.

Inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla, aby umożliwić równowagę krwi i guza mózgu. Następnego dnia zastąp pożywkę po stronie krwi EBM-minus uzupełnioną interesującymi cząsteczkami, lekami lub nanocząsteczkami. Próbki należy pobierać w czasie w celu bezpośredniego oznaczania ilościowego, jak opisano powyżej.

Najpierw zbierz 100 mikrolitrów pożywki zarówno z krwi, jak i po stronie mózgu naśladowcy BBTB i przenieś każdy z nich na oddzielną, czarną, 96-dołkową płytkę z płaskim dnem w celu kolejnych pomiarów fluorescencji. Następnie przygotuj 50-mikromolowy roztwór fluoresceiny sodu w EBM-minus, upewniając się, że przygotowałeś 2,5 mililitra na studzienkę. Podgrzej ten roztwór do 37 stopni Celsjusza i zastąp pożywkę od strony krwi wkładek pożywką zawierającą ten roztwór fluoresceiny sodu.

Uruchom timer, gdy tylko nośnik zostanie wymieniony. Ostrożnie zbierz 100 mikrolitrów pożywki zarówno od strony krwi, jak i mózgu po pięciu minutach, 30 minutach, 60 minutach i 120 minutach. Przenieść każdą próbkę do oddzielnych studzienek na odpowiedniej czarnej, 96-dołkowej płytce.

Użyj czytnika płytek, aby określić ilościowo fluorescencję pobranych próbek. Najpierw rozcieńczyć lizosomowy barwnik fluorescencyjny do odpowiedniego stężenia roboczego we wstępnie podgrzanym podłożu. Dodaj to do komórek i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 45 minut.

Następnie trzykrotnie przepłucz komórki lodowatym PBS. Wyrzuć PBS i dodaj trzy mililitry lodowatego 4% paraformaldehydu do studzienek i 2,5 mililitra do wkładki. Inkubować na lodzie przez 10 minut.

Następnie wyrzuć paraformaldehyd i trzykrotnie przepłucz komórki PBS. Usunąć PBS i przeciwbarwić jądra komórkowe za pomocą roztworu DAPI o końcowym stężeniu jednego mikrograma na mililitr w wodzie destylowanej. Inkubować w temperaturze pokojowej przez siedem minut.

Następnie wyjmij DAPI i umyj membrany trzykrotnie wodą destylowaną. Ostrożnie przeciąć membranę, usunąć wodę destylowaną i umieścić ją na kropli podłoża montażowego na szklanym szkiełku mikroskopowym. Dodaj kolejną kroplę podłoża montażowego po drugiej stronie membrany i ostrożnie przykryj ją borokrzemianową szkłem nakrywkowym.

W tym badaniu komórki śródbłonka były hodowane wspólnie z astrocytami, aby utworzyć interfejs przypominający barierę krew-mózg guza w konfiguracji in vitro. Obrazowanie konfokalne mysiego naśladownictwa BBTB pokazuje ekspresję i lokalizację komórkową białek ścisłego połączenia zonula occludens-1 i klaudyny-5 w bEND3. Kontakty między komórkami śródbłonka a astrocytami wyraźnie indukują przemieszczenie tych dwóch białek do śródbłonka kontaktów komórka-komórka w porównaniu z monokulturami bEND3.

Wykorzystując barwienie immunofluorescencyjne do wizualizacji astrocytów eksprymujących GFAP po stronie błony mózgu, można obserwować i badać procesy astrocytarne i stopy końcowe stykające się z komórkami śródbłonka przez błonę. Aby porównać wartości przepuszczalności naśladowców BBTB in vitro z barierą krew-mózg in vitro, dyfuzja fluoresceiny sodu w czasie rzeczywistym jest obrazowana przez okno czaszkowe wszczepione nagim myszom. Za pomocą stereomikroskopu fluorescencyjnego rejestruje się dyfuzję fluoresceiny sodu z naczyń włosowatych naczyń krwionośnych pochodzących z głównych naczyń krwionośnych pialnych przed, w trakcie i po ogólnoustrojowym wstrzyknięciu sondy.

Transcytoza nanocząstek, które celują w kule glejaka pochodzące od pacjenta, jest następnie porównywana, aby zilustrować, w jaki sposób ten naśladowniczy BBTB może być wykorzystany do wizualizacji przejścia związków ze strony krwi do strony mózgu. Sygnał fluorescencyjny związany z NP110 kolokalizuje się z lizosomami w komórkach śródbłonka, astrocytach i komórkach nowotworowych. Ponadto NP110 są wykrywane pomiędzy komórkami śródbłonka a astrocytami, przechodząc przez pory błony wkładki.

Pasaż NP110 określa się ilościowo, mierząc fluorescencję z próbek pobranych zarówno od strony krwi, jak i mózgu, a wartości te porównuje się z określonymi nanocząstkami o wielkości 350 nanometrów. Jak widać, tylko NP110 są w stanie przekroczyć mimikę BBTB, podczas gdy NP350 pozostał po stronie krwi, co skutkuje niższymi wartościami przepuszczalności dla tych nanocząstek. Z wkładką należy obchodzić się ostrożnie i ostrożnie rozprowadzać zawiesinę komórek astrocytów po stronie mózgu wkładki bez bezpośredniego kontaktu z błoną.

Każde uszkodzenie membrany spowoduje wyciek. Metoda ta może być zaadaptowana, aby odpowiedzieć na pytanie o dostarczanie przez mózg obwodowo podawanych ładunków. Dzięki zastosowaniu różnych wkładek z większymi porami błonowymi możliwe jest również badanie wynaczynienia komórek.

Technikę tę można modyfikować poprzez stosowanie różnych typów komórek w celu naśladowania innych barier komórkowych. Toruje również drogę do bardziej odpowiedzialnych i etycznych badań, mających na celu zmniejszenie liczby zwierząt laboratoryjnych wykorzystywanych do walidacji leków przeciwnowotworowych. Należy pamiętać, że paraformaldehyd jest bardzo toksyczną substancją chemiczną i należy się z nią odpowiednio obchodzić.

Należy również zachować ostrożność podczas używania ostrego skalpela do wyciągania błon z wkładek.