Name: Izolacja i ocena ilościowa komórek szczoteczki z tchawicy myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Poznaj metodę izolacji komórek szczoteczki z tchawicy myszy przy użyciu papainy i dispazy. Technika ta zapewnia wysoką wydajność i żywotność komórek, umożliwiając analizę transkrypcyjną RNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Adamowi Chicoine z Brigham and Women's Human Immunology Center Flow Core za pomoc w sortowaniu metodą cytometrii przepływowej. Praca ta była wspierana przez National Institutes of Health Grants R01 HL120952 (N.A.B.), R01 AI134989 (N.A.B.), U19 AI095219 (N.A.B., L.G.B) i K08 AI132723 (LGB) oraz przez American Academy of Allergy, Asthma and Immunology (AAAAI)/ American Lung Allergic Respiratory Disease Award (N.A.B.), przez AAAAI Foundation Faculty Development Award (LGB), przez Steven and Judy Kaye Young Innovators Award (N.A.B.), przez Joycelyn C. Austen Fund for Career Development of Women Physician Scientists (L.G.B.) oraz przez hojną darowiznę rodziny Vinik (L.G.B.).

Przed przeprowadzeniem następujących eksperymentów, upewnij się, że wszystkie procedury opieki nad zwierzętami zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) i przeprowadzone zgodnie z "Przewodnikiem po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych" National Research Council (8th Edition, 2011) oraz wytycznymi ARRIVE. Wszystkie procedury opisane poniżej zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucję Opieki nad Zwierzętami i Komitet ds. Użytkowania w Szpitalu Brigham and Women's Hospital.
1. Przygotowanie odczynników
<ol>
	<li>Przygotować roztwór do wytrawiania w postaci dypazy, który jest roztworem PBS zawierającym 16 j./ml dypazy i 20 μg/ml DNazy I. Upewnij się, że proszek dypazy jest całkowicie rozpuszczony przed podgrzaniem roztworu w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C. Upewnij się, że proszek dypazy jest całkowicie rozpuszczony przed podgrzaniem roztworu w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C. Upewnij się, że proszek dypazy jest całkowicie rozpuszczony.</li>
	<li>Dodaj 5% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), aby uzyskać roztwór zatrzymujący.</li>
	<li>Przygotuj bufor Tyrode I: dodaj 26 j./ml papainy (20 μl/ml 48 μl/mg roztworu papainy) i 10 μl/ml L-cysteiny do buforu HEPES-Tyrode bez wapnia.</li>
	<li>Przygotować bufor Tyrode II: dodać 2 μl/ml leupeptyny (5 mg/ml) do buforu HEPES-Tyrode z wapniem.</li>
	<li>Przygotuj bufor FACS: użyj Zbilansowanego Roztworu Soli Hanksa (HBSS) bez wapnia, magnezu i czerwieni fenolowej, uzupełnionego 2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i dodaj 2% FBS.</li>
</ol>
2. Sekcja tchawicy myszy
UWAGA: Myszy używane w tym protokole to ChAT(BAC)-eGFP (B6.Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J), w wieku 3-6 miesięcy obu płci. Zminimalizuj ekspozycję tkanki na bezpośrednie światło, aby zmniejszyć fotowybielanie eGFP.
<ol>
	<li>Poddaj mysz eutanazji roztworem pentobarbitalu w dawce 100 mg/kg wstrzykiwanym dootrzewnowo lub przy użyciu standardowych protokołów zatwierdzonych przez IACUC.</li>
	<li>Zamocuj mysz na tablicy operacyjnej w pozycji leżącej na plecach za pomocą igieł 21 G z przedłużonymi kończynami górnymi i dolnymi. Spryskaj futro 70% EtOH, aby zdezynfekować obszar.</li>
	<li>Za pomocą prostych kleszczy podnieś skórę i sierść brzucha i wykonaj nacięcie pośrodku nożyczkami preparacyjnymi (nożyczki proste, 3 cm). Za pomocą nożyczek oddziel skórę od tkanki podskórnej od brzucha do żuchwy. Trzymając tkankę podskórną za pomocą kleszczy, wykonaj małe nacięcie nożyczkami na środku ściany brzucha.</li>
	<li>Otwórz otrzewną z nacięciem w kształcie litery V. Za pomocą kleszczy delikatnie przesuń jelito cienkie na bok, zlokalizuj aortę brzuszną i żyłę główną i wykonaj nacięcie nożyczkami preparacyjnymi, aby umożliwić szybkie wykrwawienie.</li>
	<li>Zlokalizuj membranę. Za pomocą igły 18 G wykonaj otwór w przeponie tuż pod mostkiem, aby opróżnić płuca. Ostrożnie oddziel przeponę od klatki piersiowej za pomocą ostrych prostych nożyczek preparacyjnych, aby przeciąć wzdłuż podstawy żeber.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy podnieś odsłonięty koniec mostka i przetnij mostek wzdłużnie od podstawy klatki piersiowej do szyi. Wykonaj centralne nacięcie szyjki macicy krótkimi prostymi nożyczkami (2 cm) i oddziel dwa płaty gruczołu podżuchwowego.</li>
	<li>Ostrożnie usuń otaczającą tkankę łączną i grasicę pokrywającą carinę za pomocą pary precyzyjnych kleszczy o wysokiej precyzji.</li>
	<li>Wypreparuj tchawicę wolnie, najpierw oddzielając bliższy koniec na poziomie nagłośni, a następnie rozcinając dystalny koniec na poziomie rozwidlenia tchawicy.</li>
	<li>Zlokalizuj nagłośnię i przetnij tchawicę wzdłuż od nagłośni do cariny.</li>
</ol>
3. Trawienie nabłonkowe tchawicy
<ol>
	<li>Umieścić tchawicę w probówce o pojemności 1,5 ml zawierającej 750 μl wstępnie podgrzanego (do 37 °C) roztworu do wytrawiania w dypazie. Inkubować na wytrząsarce z prędkością 200 obr./min przez 40 minut w temperaturze pokojowej. Przykryj rurkę folią aluminiową, aby zmniejszyć ekspozycję na bezpośrednie światło.</li>
	<li>Dodaj 750 μL zimnego DMEM z 5% FBS, aby zatrzymać reakcję. Ułóż na lodzie.</li>
	<li>Przenieść tchawicę na szalkę Petriego (100 mm x 15 mm) i umieścić pod mikroskopem preparacyjnym. Zorientuj tchawicę stroną nabłonkową skierowaną do góry. Podłużnie rozcięta tchawica ma półcylindryczny kształt utrzymywany przez pierścienie chrzęstne. Nabłonek znajduje się na wklęsłej powierzchni.</li>
	<li>Przywiąż obszar nagłośni tchawicy prostymi kleszczami do szalki Petriego i za pomocą jednorazowego skalpela w rozmiarze 22 zeskrob nabłonek z tchawicy. Warstwa nabłonkowa oddziela się jako półprzezroczysty arkusz.</li>
	<li>Zmiel nabłonek skalpelem. Przenieś warstwę nabłonka do probówki o pojemności 2 ml.</li>
	<li>Przepłukać szalkę Petriego 750 μl buforu Tyrode I i przenieść do probówki o pojemności 2 ml zawierającej warstwę nabłonkową.</li>
	<li>Inkubować warstwę nabłonka tchawicy w buforze Tyrode I przez 30 minut w temperaturze 37 °C na wytrząsarce z prędkością 200 obr./min. Przykryj rurkę folią aluminiową, aby zmniejszyć ekspozycję na bezpośrednie światło.</li>
	<li>Dodać 750 μl zimnego buforu Tyrode II. Energicznie wiruj strawioną tkankę przez 20-30 s. Rozcierać homogenat za pomocą strzykawki dołączonej do igły 18 G. Zmienić na igłę o rozmiarze 21 G i rozcierać jeszcze 10-20 razy.</li>
	<li>Przefiltruj komórki przez sitko o wielkości 100 μm do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Dodać 30:1 obj./obj. zimnego bufora FACS.</li>
	<li>Wirować w temperaturze 350 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Zawiesić osad w zimnym buforze FACS i przenieść zawiesinę do probówki z polistyrenu o wymiarach 12 mm x 75 mm (5 ml). Wirować ponownie w temperaturze 350 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad w 100 μl bufora FACS.</li>
	<li>Dodać 1 μl przeciwciała blokującego CD16/32 przeciwko myszy, aby zablokować niespecyficzne wiązanie i inkubować przez 15 minut na lodzie. Nie prać.</li>
	<li>Dodać następujące przeciwciała i odpowiednie kontrole izotypu: przeciwciała monoklonalne przeciwko mysim CD45 lub szczurzym IgG2a, k (0,25 μg/106 komórek w objętości 100 μl) i allofikocyjaninę (APC) przeciwko mysim EpCAM lub szczurzej IgG2b, k (0,5 μg/106 komórek w objętości 100 μl). Inkubować przez 45 minut na lodzie chronionym przed bezpośrednim światłem. Dodać 4,5 ml zimnego buforu FACS, mieszać i wirować w temperaturze 350 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić bufor FACS i ponownie zawiesić osad w 300 μl zimnego buforu FACS.</li>
	<li>Dodać jodek propidyny (PI) (5 μg/ml) bezpośrednio przed sortowaniem metodą cytometrii przepływowej. 
	nuta: Komórki szczotek mają nieregularny kształt z kilkoma procesami, które mogą potencjalnie zwiększyć ich przyleganie do filtrów (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C). Porównaliśmy filtry 30 μm z 70 μm i 100 μm i stwierdziliśmy, że większe filtry porowe zapewniają lepszą wydajność. Ponadto dokładne roztarcie zawiesiny komórkowej po trawieniu papainą znacznie poprawia wydajność komórek szczoteczki. Zalecamy użycie igły 18G do wstępnego roztarcia, a następnie mniejszego otworu (igła 21 lub 23 G) w celu dokładniejszej dysocjacji komórek.</li>
</ol>
4. Strategia bramkowania cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Zidentyfikuj komórki od gruzu według kąta rozproszenia do przodu i bocznego. Wyklucz dublety, używając wysokości i szerokości rozproszenia do przodu oraz wysokości i szerokości rozproszenia bocznego. Dublety to komórki, które mają wysokie wartości szerokości.</li>
	<li>W pojedynczych komórkach zidentyfikuj żywe komórki jako populację, która jest PI ujemna.</li>
	<li>W żywych pojedynczych komórkach zidentyfikuj komórki CD45 o niskim lub ujemnym poziomie na podstawie kontroli izotypu.</li>
	<li>W komórkach CD45 o niskim/ujemnym poziomie zidentyfikuj komórki EpCAM dodatnie, które są również eGFP dodatnie (w kanale FITC). Jest to populacja komórek szczoteczki (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
</ol>

<ol><li>Tizzano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nasal+chemosensory+cells+use+bitter+taste+signaling+to+detect+irritants+and+bacterial+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nasal chemosensory cells use bitter taste signaling to detect irritants and bacterial signals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (7), 3210-3215 (2010).</li>
<li>Genovese, F., Tizzano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvillous+cells+in+the+olfactory+epithelium+express+elements+of+the+solitary+chemosensory+cell+transduction+signaling+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Microvillous cells in the olfactory epithelium express elements of the solitary chemosensory cell transduction signaling cascade.</a> PLoS One. 13 (9), 0202754(2018).</li>
<li>Bankova, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cysteinyl+leukotriene+3+receptor+regulates+expansion+of+IL-25-producing+airway+brush+cells+leading+to+type+2+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Immunology%22%5BJournal%5D)">The cysteinyl leukotriene 3 receptor regulates expansion of IL-25-producing airway brush cells leading to type 2 inflammation.</a> Science Immunology. 3 (28), (2018).</li>
<li>Krasteva, G., Canning, B. J., Papadakis, T., Kummer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+brush+cells+in+the+trachea+mediate+respiratory+responses+to+quorum+sensing+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cholinergic brush cells in the trachea mediate respiratory responses to quorum sensing molecules.</a> Life Sciences. 91 (21-22), 992-996 (2012).</li>
<li>Nadjsombati, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Succinate+by+Intestinal+Tuft+Cells+Triggers+a+Type+2+Innate+Immune+Circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Detection of Succinate by Intestinal Tuft Cells Triggers a Type 2 Innate Immune Circuit.</a> Immunity. 49 (1), 33-41 (2018).</li>
<li>von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuft-cell-derived+IL-25+regulates+an+intestinal+ILC2-epithelial+response+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit.</a> Nature. 529 (7585), 221-225 (2016).</li>
<li>Deckmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bitter+triggers+acetylcholine+release+from+polymodal+urethral+chemosensory+cells+and+bladder+reflexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Bitter triggers acetylcholine release from polymodal urethral chemosensory cells and bladder reflexes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8287-8292 (2014).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Members+of+Bitter+Taste+Receptor+Cluster+Tas2r143%2FTas2r135%2FTas2r126+Are+Expressed+in+the+Epithelium+of+Murine+Airways+and+Other+Non-gustatory+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Members of Bitter Taste Receptor Cluster Tas2r143/Tas2r135/Tas2r126 Are Expressed in the Epithelium of Murine Airways and Other Non-gustatory Tissues.</a> Frontiers in Physiology. 8, 849(2017).</li>
<li>Krasteva, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+chemosensory+cells+in+the+auditory+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cholinergic chemosensory cells in the auditory tube.</a> Histochemistry and Cell Biology. 137 (4), 483-497 (2012).</li>
<li>Krasteva, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+chemosensory+cells+in+the+trachea+regulate+breathing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cholinergic chemosensory cells in the trachea regulate breathing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9478-9483 (2011).</li>
<li>Montoro, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revised+airway+epithelial+hierarchy+includes+CFTR-expressing+ionocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes.</a> Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).</li>
<li>Plasschaert, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+atlas+of+the+airway+epithelium+reveals+the+CFTR-rich+pulmonary+ionocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte.</a> Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).</li>
<li>Dwyer, D. F., Barrett, N. A., Austen, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+Genome+Project%2C+C.+Expression+profiling+of+constitutive+mast+cells+reveals+a+unique+identity+within+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunological Genome Project, C. Expression profiling of constitutive mast cells reveals a unique identity within the immune system.</a> Nature Immunology. 17 (7), 878-887 (2016).</li>
<li>Howitt, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuft+cells%2C+taste-chemosensory+cells%2C+orchestrate+parasite+type+2+immunity+in+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut.</a> Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).</li>
<li>Bankova, L. G., Dwyer, D. F., Liu, A. Y., Austen, K. F., Gurish, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+mast+cell+progenitors+to+mucosal+mast+cells+during+allergic+pulmonary+inflammation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Maturation of mast cell progenitors to mucosal mast cells during allergic pulmonary inflammation in mice.</a> Mucosal Immunology. 8 (3), 596-606 (2015).</li>
<li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).</li>
<li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+stromal+populations+contribute+to+pulmonary+fibrosis+without+evidence+for+epithelial+to+mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Multiple stromal populations contribute to pulmonary fibrosis without evidence for epithelial to mesenchymal transition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 1475-1483 (2011).</li>
<li>Gerbe, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+tuft+cells+initiate+type+2+mucosal+immunity+to+helminth+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites.</a> Nature. 529 (7585), 226-230 (2016).</li>
<li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+protein+16A+%28TMEM16A%29+is+a+Ca2%2B-regulated+Cl-+secretory+channel+in+mouse+airways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Transmembrane protein 16A (TMEM16A) is a Ca2+-regulated Cl- secretory channel in mouse airways.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (22), 14875-14880 (2009).</li>
<li>Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin+cleaves+exclusively+C-terminal+to+arginine+and+lysine+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).</li>
<li>Verma, S., Dixit, R., Pandey, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cysteine+Proteases%3A+Modes+of+Activation+and+Future+Prospects+as+Pharmacological+Targets%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Cysteine Proteases: Modes of Activation and Future Prospects as Pharmacological Targets.</a> Frontiers in Pharmacology. 7, 107(2016).</li>
<li>Huettner, J. E., Baughman, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+identified+neurons+from+the+visual+cortex+of+postnatal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats.</a> Journal of Neuroscience. 6 (10), 3044-3060 (1986).</li>
<li>Kaiser, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociated+neurons+and+glial+cells+derived+from+rat+inferior+colliculi+after+digestion+with+papain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dissociated neurons and glial cells derived from rat inferior colliculi after digestion with papain.</a> PLoS One. 8 (12), 80490(2013).</li>
<li>Aoyagi, T., Takeuchi, T., Matsuzaki, A., Kawamura, K., Kondo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leupeptins%2C+new+protease+inhibitors+from+Actinomycetes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Antibiotics+%28Tokyo%29%22%5BJournal%5D)">Leupeptins, new protease inhibitors from Actinomycetes.</a> Journal of Antibiotics (Tokyo). 22 (6), 283-286 (1969).</li>
<li>Kohanski, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solitary+chemosensory+cells+are+a+primary+epithelial+source+of+IL-25+in+patients+with+chronic+rhinosinusitis+with+nasal+polyps%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Solitary chemosensory cells are a primary epithelial source of IL-25 in patients with chronic rhinosinusitis with nasal polyps.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (2), 460-469 (2018).</li>
<li>Patel, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solitary+chemosensory+cells+producing+interleukin-25+and+group-2+innate+lymphoid+cells+are+enriched+in+chronic+rhinosinusitis+with+nasal+polyps%5BTitle%5D)+AND+%22International+Forum+of+Allergy+%26+Rhinology%22%5BJournal%5D)">Solitary chemosensory cells producing interleukin-25 and group-2 innate lymphoid cells are enriched in chronic rhinosinusitis with nasal polyps.</a> International Forum of Allergy & Rhinology. , (2018).</li>
<li>Kouzaki, H., O'Grady, S. M., Lawrence, C. B., Kita, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteases+induce+production+of+thymic+stromal+lymphopoietin+by+airway+epithelial+cells+through+protease-activated+receptor-2%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Proteases induce production of thymic stromal lymphopoietin by airway epithelial cells through protease-activated receptor-2.</a> The Journal of Immunology. 183 (2), 1427-1434 (2009).</li>
<li>Cambier, J. C., Vitetta, E. S., Kettman, J. R., Wetzel, G. M., Uhr, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-cell+tolerance.+III.+Effect+of+papain-mediated+cleavage+of+cell+surface+IgD+on+tolerance+susceptibility+of+murine+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">B-cell tolerance. III. Effect of papain-mediated cleavage of cell surface IgD on tolerance susceptibility of murine B cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 146 (1), 107-117 (1977).</li>
<li>Nishikado, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cysteine+protease+antigens+cleave+CD123%2C+the+alpha+subunit+of+murine+IL-3+receptor%2C+on+basophils+and+suppress+IL-3-mediated+basophil+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Cysteine protease antigens cleave CD123, the alpha subunit of murine IL-3 receptor, on basophils and suppress IL-3-mediated basophil expansion.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (2), 261-266 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Odkryliśmy, że połączenie leczenia dużą dawką dypazy przez 40 minut, a następnie krótkiego leczenia papainą (30 minut) zapewnia optymalny protokół trawienia tchawicy i izolacji komórek szczoteczki. Ta kombinacja zarówno pozwala uniknąć intensywnego trawienia, jak i zapewnia najwyższą wydajność komórek szczoteczki w porównaniu z alternatywnymi protokołami.
Podczas gdy trawienie płuc w celu ekstrakcji komórek krwiotwórczych klasycznie opiera się na łagodnych enzymach trawiennych, takich jak kola...

Komórki szczotek należą do klasy komórek nabłonka chemosensorycznego, charakteryzujących się ekspresją receptorów gorzkiego smaku i maszynerią transdukcji receptorów smaku znajdującą się w komórkach kubków smakowych. W przeciwieństwie do komórek kubków smakowych, komórki nabłonka chemosensorycznego są rozproszone na powierzchniach nabłonka i są określane jako pojedyncze komórki chemosensoryczne (SCC) i komórki mikrokosmków w nabłonku nosa1,2, komórki szczoteczki w tchawicy3,4, a komórki kępkowe w jelicie5,6. Komórki nabłonkowe wyrażające receptory gorzkiego smaku i maszynerię transdukcji gorzkiego smaku znajdują się również w cewce moczowej7,8 i trąbce słuchowej9. Komórki szczoteczki dróg oddechowych pełnią unikalne funkcje w neurogennych i immunologicznych odpowiedziach dróg oddechowych. Są to komórki chemosensoryczne wytwarzające acetylocholinę, które wywołują ochronne odruchy oddechowe po aktywacji związkami gorzkimi i metabolitami bakteryjnymi, takimi jak substancje wyczuwające kworum10. Komórki szczoteczki do dróg oddechowych są również dominującym źródłem IL-25 w nabłonku dróg oddechowych, która reguluje wywołane przez alergeny wziewne zapalenie typu 2 w drogach oddechowych3.
Charakterystyka pełnego transkryptomu komórek szczoteczki dolnych dróg oddechowych i ich reakcji na bodźce środowiskowe została ograniczona przez ich niską liczbę w nabłonku tchawicy i bardzo ograniczoną liczbę poza dużymi oskrzelami10. Techniki stosowane do izolacji komórek chemosensorycznych z nabłonka jelitowego nie przyniosły proporcjonalnie wysokich liczb z tchawicy, prawdopodobnie z powodu intymnych kontaktów komórek szczoteczki tchawicy z zakończeniami nerwowymi10 lub innymi specyficznymi dla tkanek czynnikami błony śluzowej dróg oddechowych, takimi jak skład adherenów i białek połączeń ścisłych. Ostatnie doniesienia o udanej izolacji komórek szczoteczki tchawicy w większej liczbie do analizy sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki wykorzystywały albo 2-godzinną inkubację z papainą, albo 18-godzinną inkubację z pronase11,12. Ponieważ dłuższa inkubacja z enzymami trawiennymi może zmniejszyć żywotność komórek i zmienić profil transkrypcyjny komórek z trawionych tkanek 13, może to zniekształcić analizę porównawczą z innymi populacjami nabłonka chemosensorycznego.
Tutaj przedstawiamy metodę izolacji komórek szczoteczki tchawicy do sekwencjonowania RNA3. Leczenie tchawicy dużą dawką dypazy oddziela nabłonek od błony podśluzowej. Późniejsze trawienie arkusza nabłonka za pomocą papainy pozwala na doskonałą regenerację tej komórki strukturalnej.

<table><tbody><tr><td>Przeciwciała</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP (poliklonalny kozioł Ig)</td><td>Abcam</td><td>cat# ab5450</td><td></td></tr><tr><td>APC anty-mysie CD326 (EpCAM)&nbsp; (G8.8)</td><td>Kot Biolegend</td><td>#118214</td><td></td></tr><tr><td>APC Szczur IgG2a, kontrola izotypu k</td> Kot <td>Biolegend</td><td>#400511</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Biolegend</td><td>kot#422801</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-kozie IgG (H+L) Przeciwciało wtórne o wysokiej adsorpcji krzyżowej, Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies/Sondy molekularne</td><td>cat#A-11055</td><td></td></tr><tr><td>Normalna koza IgG</td><td>R& D Systems</td><td>cat#AB-108-C</td><td></td></tr><tr><td>Pacific Blue anty-myszy CD45 (30F-11)</td><td>Biolegend</td><td>cat#103126</td><td></td></tr><tr><td>Pacific Blue Rat IgG2b, k kontrola izotypu</td><td>Biolegend</td><td>cat#400627</td><td></td></tr><tr><td>TruStain FcX (anty-mysz CD16/32) Przeciwciało</td><td>Biolegend</td><td>cat#101320</td><td></td></tr><tr><td>Chemikalia, peptydy i białka</td><td></td><td></td><td></td>rekombinowane</tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco</td><td>cat# 17105041&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>cat# 10104159001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES-Tyrode' s Bufor bez wapnia (10 mM HEPES, 135 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 1 mM MgCl2, 12 mM NaHCO3, 0,4 mM NaH2PO4, 0,25% BSA, 5,5 mM glukozy. Przygotowany w wodzie o stężeniu 18,2 megaoma i przefiltrowany przez 0,22 &mikro; m filtr</td><td>Boston BioProducts</td><td>cat# PY-912</td><td></td></tr><tr><td>Tyrode' s Roztwór (buforowany przez HEPES) 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 i 10 mM glukozy. Przygotowany w wodzie o stężeniu 18,2 megaoma i przefiltrowany przez 0,22 &mikro; m filtr. )</td> <td>Boston BioProducts</td><td>cat# BSS-355</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Sigma</td><td>cat # C7352</td><td></td></tr><tr><td>Sól trifluorooctanu leupeptyny</td><td>Sigma</td><td>cat# L2023</td><td></td></tr><tr><td>Papaina z lateksu papai</td><td>Sigma</td><td>cat # P3125</td><td></td></tr><tr><td>Jodek propidyny&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>cat# P4170</td><td></td></tr><tr><td>Modele eksperymentalne: Organizmy/Szczepy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ChATBAC-eGFP (B6. Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J)</td><td>Laboratorium Jacksona</td><td>7902</td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM 800 z systemem konfokalnym Airyscan&nbsp; na&nbsp; Mikroskop odwrócony Zeiss Axio Observer Z1</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSRFortessa</td><td>BD</td><td>647465</td><td></td></tr><tr><td><mocny>sprzęt jednorazowy</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml sterylne probówki</td><td>Thomas Scientific</td><td>1157C86</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Poysterene Probówka okrągłodenna, 12 mm x 75 mm styl</td><td>Falcon</td><td>14-959-1A</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Polipropylenowa probówka stożkowa, 30 mm x 115 mm styl</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Feather Jednorazowy skalpel nr 12</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9999403</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego, 100 mm x 15 mm Style</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne sitko do komórek, 100 &mu; m</td><td>Fisherbrand</td><td>cat#22363549</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i ocena ilościowa komórek szczoteczki z tchawicy myszy

Isolation and Quantitative Evaluation of Brush Cells from Mouse Tracheas

Komórki szczoteczki tchawicy to cholinergiczne komórki nabłonka chemosensorycznego, zdolne do przekazywania sygnałów ze światła dróg oddechowych do układu odpornościowego i nerwowego. Należą do rodziny chemosensorycznych komórek nabłonkowych, która obejmuje komórki kępek w błonie śluzowej jelit, komórki szczoteczki w tchawicy oraz pojedyncze komórki chemosensoryczne i mikrokosmkowe w błonie śluzowej nosa. Komórki chemosensoryczne w różnych przedziałach nabłonkowych mają wspólne kluczowe markery wewnątrzkomórkowe i podstawową sygnaturę transkrypcyjną, ale wykazują również znaczną niejednorodność transkrypcji, prawdopodobnie odzwierciedlającą lokalne środowisko tkankowe. Izolacja komórek szczoteczki tchawicy z zawiesin pojedynczych komórek jest wymagana do szczegółowego określenia funkcji tych rzadkich komórek nabłonkowych, ale ich izolacja jest trudna, potencjalnie ze względu na ścisłą interakcję między komórkami szczoteczki tchawicy a zakończeniami nerwowymi lub ze względu na specyficzny dla dróg oddechowych skład połączeń ścisłych i przylegających. W tym miejscu opisujemy procedurę izolacji komórek szczoteczki z nabłonka tchawicy myszy. Metoda opiera się na wstępnym oddzieleniu nabłonka tchawicy od błony podśluzowej, co pozwala na późniejszą krótszą inkubację arkusza nabłonka z papainą. Procedura ta oferuje szybkie i wygodne rozwiązanie do sortowania cytometrycznego przepływowego i analizy funkcjonalnej żywotnych komórek szczoteczki tchawicy.

Niniejsza procedura została z powodzeniem zastosowana do izolacji komórek szczoteczkowych tchawicy w celu sekwencjonowania RNA3. Po izolacji tchawicy i trawieniu tkanki zgodnie z dwuetapowym protokołem (Rysunek 1), komórki zostały zebrane i zabarwione przeciwciałami fluorescencyjnymi przeciwko CD45 i EpCAM, po uprzednim wykluczeniu martwych komórek za pomocą PI. Po wyeliminowaniu dubletów na podstawie charakterystyki rozproszonego światła przedniego i bocznego (forwar...

Komórki szczoteczki to rzadkie cholinergiczne komórki nabłonka chemosensorycznego znalezione w naiwnej tchawicy myszy. Ze względu na ich ograniczoną liczbę, ocena ex vivo ich funkcjonalnej roli w odporności i przebudowie dróg oddechowych jest trudna. Opisano metodę izolacji komórek szczoteczki tchawicy za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja i ocena ilościowa komórek szczoteczki z tchawicy myszy

Tracheal brush cells are cholinergic chemosensory epithelial cells poised to transmit signals from the airway lumen to the immune and nervous systems. ...

Opracowaliśmy procedurę izolacji komórek szczoteczki tchawicy, rzadkich wyspecjalizowanych komórek nabłonka chemosensorycznego od fluorescencyjnych myszy reporterowych acetylotransferazy choliny. Metoda ta opiera się na wstępnym oddzieleniu nabłonka tchawicy od błony podśluzowej, co pozwala na późniejszą krótszą inkubację arkusza nabłonka z papainą. Pozwala to na solidną regenerację komórek szczoteczki tchawicy i jest z powodzeniem stosowane do izolacji i analizy transkrypcyjnej komórek szczoteczki za pomocą sekwencjonowania RNA.Długa inkubacja z enzymami trawiennymi może zmniejszyć żywotność komórek i zmienić profil transkrypcyjny komórek wyizolowanych z tkanek. Tutaj oddzielamy nabłonek tchawicy za pomocą dypazy, a następnie inkubujemy go z papainą przez krótki czas, uzyskując wysokie plony żywotnych komórek szczoteczki. Nasza metoda może przyczynić się do badań nabłonka górnych dróg oddechowych.Ten sam protokół można zastosować do izolowania komórek szczoteczki z innych miejsc błony śluzowej, takich jak tkanka nosa. Demonstracja naszej wysoce powtarzalnej techniki pozwoli naukowcom na wyizolowanie i dalsze badanie komórek szczoteczki tchawicy. Aby rozpocząć tę procedurę, należy dodać dyspazę i DNazę I do PBS w końcowych stężeniach pokazanych tutaj, aby przygotować roztwór do wytrawiania w dyspazie.Upewnij się, że proszek dispazy jest całkowicie rozpuszczony przed podgrzaniem roztworu w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie dodaj 5% inaktywowanego termicznie FBS do DMEM, aby przygotować roztwór zatrzymujący. Aby przygotować bufor Tyrode I, dodaj papainę i L-cysteinę do buforu HEPES Tyrode bez wapnia.Aby przygotować bufor Tyrode II, należy dodać leupeptynę do buforu HEPES Tyrode'a bez wapnia w stężeniu dwóch mikrolitrów na mililitr. Aby przygotować bufor FACS, użyj Zbilansowanego Roztworu Soli Hanka bez wapnia, magnezu i czerwieni fenolowej uzupełnionego dwoma milimolowymi EDTA i 2% FBS. Po eutanazji myszy użyj igieł o rozmiarze 21, aby przymocować ją do deski chirurgicznej w pozycji leżącej z wyprostowanymi kończynami górnymi i dolnymi.Spryskaj futro 70% etanolem, aby zdezynfekować obszar. Za pomocą prostych kleszczy podnieś skórę i sierść brzucha i użyj nożyczek preparacyjnych, aby wykonać nacięcie pośrodku. Za pomocą nożyczek oddziel skórę od tkanki podskórnej od brzucha do żuchwy.Trzymając tkankę podskórną za pomocą kleszczy, wykonaj małe nacięcie nożyczkami na środku ściany brzucha. Następnie otwórz otrzewną z nacięciem w kształcie litery V. Za pomocą kleszczy delikatnie przesuń jelito cienkie na bok.Zlokalizuj aortę brzuszną i żyłę główną i wykonaj nacięcie nożyczkami preparacyjnymi, aby umożliwić szybkie wykrwawienie. Zlokalizuj membranę. Za pomocą igły o rozmiarze 18 wykonaj otwór w przeponie tuż pod mostkiem, aby opróżnić płuca.Za pomocą ostrych, spiczastych, prostych nożyczek preparacyjnych przetnij wzdłuż podstawy żeber, aby ostrożnie oddzielić przeponę od klatki piersiowej. Użyj kleszczy, aby podnieść odsłonięty koniec mostka i przeciąć mostek wzdłużnie od podstawy klatki piersiowej do szyi. Użyj krótkich, prostych nożyczek, aby wykonać centralne nacięcie szyjki macicy i oddzielić dwa płaty gruczołu podżuchwowego.Następnie użyj pary precyzyjnych kleszczyków o wysokiej precyzji, aby ostrożnie usunąć otaczającą tkankę łączną i grasicę pokrywającą carinę. Wypreparuj tchawicę swobodnie, najpierw oddzielając bliższy koniec na poziomie nagłośni, a następnie preparując dystalny koniec na poziomie rozwidlenia tchawicy. Zlokalizuj nagłośnię i przetnij tchawicę wzdłuż od nagłośni do cariny.Na początek umieść tchawicę w 1,5-mililitrowej probówce zawierającej 750 mikrolitrów roztworu do wytrawiania w dyspazie, podgrzanego do 37 stopni Celsjusza. Przykryj probówkę folią aluminiową, aby zmniejszyć ekspozycję na bezpośrednie światło i inkubować na wytrząsarce z prędkością 200 obr./min i w temperaturze pokojowej przez 40 minut. Następnie dodaj 750 mikrolitrów DMEM z 5% FBS, aby zatrzymać reakcję i umieść probówkę na lodzie.Przenieś tchawicę na szalkę Petriego. Zorientuj tchawicę stroną nabłonkową skierowaną do góry. Podłużnie rozcięta tchawica ma półcylindryczny kształt utrzymywany przez pierścienie chrzęstne.Nabłonek znajduje się na wklęsłej powierzchni. Za pomocą prostych kleszczy przymocuj obszar nagłośni tchawicy do szalki Petriego i użyj skalpela do usuwania w rozmiarze 22, aby zeskrobać nabłonek z tchawicy. Warstwa nabłonkowa oddzieli się jako półprzezroczysty arkusz.Użyj skalpela, aby zmielić nabłonek i przenieść warstwę nabłonka do dwumililitrowej tubki. Przepłukać szalkę Petriego 750 mikrolitrami buforu Tyrode I i przenieść ją do probówki zawierającej warstwę nabłonkową. Przykryj probówkę folią aluminiową, aby zmniejszyć ekspozycję na bezpośrednie światło i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza na wytrząsarce z prędkością 200 obr./min przez 30 minut.Następnie dodaj 750 mikrolitrów zimnego buforu Tyrode II. Energicznie wiruj strawioną tkankę przez 20 do 30 sekund. Za pomocą strzykawki dołączonej do igły o rozmiarze 18 rozcierać homogenat 10 razy.Następnie przełącz się na igłę o rozmiarze 21 i rozcieraj jeszcze 10 do 20 razy. Przefiltruj komórki przez sitko o średnicy 100 mikrometrów do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Dodaj zimny bufor FACS w stosunku objętościowym 30 do jednego.Wirować w temperaturze 350 razy g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w zimnym buforze FACS. Przenieś tę zawiesinę na rurkę z polistyrenu o wymiarach 12 na 75 milimetrów.Ponownie odwirować w temperaturze 350 g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach buforu FACS. Następnie dodaj jeden mikrolitr przeciwciała blokującego anty-myszy CD1632, aby zablokować niespecyficzne wiązanie i inkubować na lodzie przez 15 minut.Następnie dodaj przeciwciała w odpowiednich kontrolkach izotypu, jak opisano w protokole tekstowym. Inkubować na lodzie przez 45 minut, chroniąc przed bezpośrednim światłem. Następnie dodaj 4,5 mililitra zimnego buforu FACS i wymieszaj.Odwirować w temperaturze 350 razy g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 300 mikrolitrach zimnego buforu FACS. Dodać jodek propydyny bezpośrednio przed sortowaniem metodą cytometrii przepływowej.W tym badaniu komórki szczoteczki tchawicy z fluorescencyjnych myszy reporterowych acetylocholiny ChAT eGFP zostały z powodzeniem wyizolowane do sekwencjonowania RNA. Komórki są identyfikowane na podstawie szczątków na podstawie kąta rozproszenia do przodu i z boku. Dublety są wykluczane przy użyciu wysokości i szerokości rozproszenia do przodu oraz wysokości i szerokości rozproszenia bocznego.Dublety to komórki, które mają wysokie wartości szerokości. W pojedynczych komórkach żywe komórki są identyfikowane jako populacja, która jest ujemna pod względem jodku propidyny. W żywych pojedynczych komórkach komórki CD45 o niskim lub ujemnym poziomie są identyfikowane na podstawie kontroli izotypu.W komórkach CD45 o niskim poziomie ujemnym, komórki EpCAM dodatnie, które są również eGFP dodatnie w kanale FITC, stanowią populację komórek szczoteczkowych. Liczba komórek szczoteczki ulega zmianie pod wpływem narażenia na metabolity drobnoustrojów i pierwotniaki, a zatem odzwierciedla zmienność mikrobioty instytucjonalnej. Dlatego sugerowalibyśmy oszacowanie liczby komórek szczoteczek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, aby ocenić oczekiwaną liczbę izolowanych komórek szczoteczki za pomocą sortowania metodą cytometrii przepływowej.Upewnij się, że prawidłowo oddzieliłeś warstwę nabłonkową tchawicy, ponieważ decyduje ona o wydajności izolowanych komórek szczoteczki. Wyizolowane komórki szczoteczki tchawicy mogą być wykorzystywane w szerokim zakresie testów, takich jak sekwencjonowanie RNA, hodowla komórkowa i analiza funkcjonalna.

isolation-quantitative-evaluation-brush-cells-from-mouse

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Komórki nabłonka płuc można wyizolować z dróg oddechowych myszy i hodować na granicy fazy powietrze-ciecz jako model zróżnicowanego nabłonka oddechowego. Opisano protokół izolacji, hodowli i narażania tych komórek na dym papierosowy z głównego strumienia w celu zbadania odpowiedzi molekularnych na tę toksynę środowiskową.

Izolacja komórek nabłonka dróg oddechowych myszy i ekspozycja na eksperymentalny dym tytoniowy w układzie interfejsu powietrze-ciecz

Opisano metodę otrzymywania wysoce oczyszczonej preparacji komórek dendrytycznych z płuc myszy. Szczególny nacisk położono na izolację podgrupy konwencjonalnych komórek dendrytycznych.

Izolacja komórek dendrytycznych z płuc myszy

Myszy transgeniczne okazały się niezwykle użyteczne w przypisywaniu funkcji fizjologicznych konkretnym genom. W związku z tym badania ogólne, a w szczególności studia funkcjonalne dróg oddechowych, przeszły znaczący zwrot w stronę modeli mysich. W niniejszym materiale przedstawiamy protokoły badań skurczu tchawicy in vitro w celu oceny funkcji mięśni gładkich w drogach oddechowych myszy.

In vitro pomiary skurczu tchawki u myszy

W niniejszym materiale prezentujemy protokół izolacji komórek podstawnych oraz komórek przewodów gruczołów podśluzowych z tchawki myszy. Przedstawiamy również metodę wstrzykiwania komórek macierzystych do grzbietowej poduszki tłuszczowej myszy w celu stworzenia modelu in vivo regeneracji gruczołów podśluzowych.

Izolacja komórek podstawnych i komórek przewodów gruczołów podśluzowych z tchawki myszy

Opisujemy metodę szybkiej izolacji pierwotnych pęcherzykowych komórek nabłonkowych typu II (AECII) myszy za pomocą negatywnej selekcji cytometrycznej. Uzyskane komórki AECII wykazują wysoką żywotność oraz czystość i nadają się do szerokiego zakresu badań funkcjonalnych i molekularnych dotyczących ich roli w schorzeniach układu oddechowego, takich jak choroby autoimmunologiczne lub zakaźne.

Izolacja pierwotnych komórek nabłonkowych pęcherzyków płucnych typu II myszy metodą cytometrii przepływowej do badań funkcjonalnych i molekularnych

Opisana jest łatwa i niezawodna technika wizualizacji i ilościowego określania ruchliwości rzęsek w drogach oddechowych oraz przepływu generowanego przez rzęski za pomocą tchawicy myszy.  Technikę tę można zmodyfikować w celu określenia, w jaki sposób szeroki zakres czynników wpływa na ruchliwość rzęsek, w tym czynniki farmakologiczne, czynniki genetyczne, narażenie środowiskowe i/lub czynniki mechaniczne, takie jak obciążenie śluzem.

Ex vivo Metoda obrazowania w wysokiej rozdzielczości ruchliwości rzęsek w nabłonku dróg oddechowych gryzoni

Odpowiedź immunologiczna gospodarza na infekcję patogenem jest ściśle regulowanym procesem. Wykorzystując model ekspozycji płuc na lipopolisacharydy u myszy, możliwe jest przeprowadzenie oceny w wysokiej rozdzielczości złożonych mechanizmów związanych z patogenezą choroby.

Wykorzystanie dotchawczego podawania PAMP w jamie ustnej i gardłowej oraz płukania oskrzeli i pęcherzyków płucnych w celu oceny odpowiedzi immunologicznej gospodarza u myszy

Zwężenie krtani i tchawicy wynika z patologicznego osadzania się blizn, które krytycznie zwężają drogi oddechowe tchawicy i nie mają skutecznych terapii medycznych. Stosując stent PLLA-PCL (70% poli-L-laktydu i 30% polikaprolaktonu) jako miejscowy system dostarczania leków, można badać potencjalne terapie mające na celu zmniejszenie proliferacji blizn w tchawicy.

Projekt biokompatybilnego stentu tchawicy uwalniającego leki u myszy ze zwężeniem krtani i tchawicy

Tutaj opisujemy model in vitro do izolowania i różnicowania mysich komórek nabłonka dróg oddechowych, skupiając się na ich aklimatyzacji do przewlekłego ekstraktu z dymu papierosowego (CSE). Model może zostać wykorzystany do kompleksowego scharakteryzowania multiomicznego wpływu CSE, co może dostarczyć informacji na temat reakcji komórkowych na przewlekłe narażenie na dym tytoniowy.

Model in vitro do badania różnicowania i zmian multiomiki na mysich komórkach nabłonka dróg oddechowych stymulowanych ekstraktem z dymu papierosowego

Tutaj opisujemy pomiar kaszlu za pomocą nieinwazyjnego systemu pletyzmografii całego ciała (WBP) w czasie rzeczywistym oraz procedury normatywne pobierania próbek tkanek myszy i wprowadzamy pewne metody oceny stanu zapalnego dróg oddechowych.

Metody wykrywania kaszlu i zapalenia dróg oddechowych u myszy

Ten protokół opisuje metodę ilościowego określania produkcji tlenku azotu (NO) w kulturach nabłonka dróg oddechowych zróżnicowanych na granicy powietrze-ciecz (ALI) poprzez pomiar azotynów w sekretach wierzchołkowych za pomocą testu chemiluminescencyjnego opartego na trijodku.

Ocena produkcji tlenku azotu w kulturach ludzkich komórek nabłonkowych przewodów oddechowych zróżnicowanych na granicy powietrze-płyn

Poznaj metodę izolacji komórek szczoteczki z tchawicy myszy przy użyciu papainy i dispazy. Technika ta zapewnia wysoką wydajność i żywotność komórek, umożliwiając analizę transkrypcyjną RNA.

Izolacja i ocena ilościowa komórek szczoteczki z tchawicy myszy

Przeglądaj więcej filmów