Izolacja i ocena ilościowa komórek szczoteczki z tchawicy myszy

Opracowaliśmy procedurę izolacji komórek szczoteczki tchawicy, rzadkich wyspecjalizowanych komórek nabłonka chemosensorycznego od fluorescencyjnych myszy reporterowych acetylotransferazy choliny. Metoda ta opiera się na wstępnym oddzieleniu nabłonka tchawicy od błony podśluzowej, co pozwala na późniejszą krótszą inkubację arkusza nabłonka z papainą. Pozwala to na solidną regenerację komórek szczoteczki tchawicy i jest z powodzeniem stosowane do izolacji i analizy transkrypcyjnej komórek szczoteczki za pomocą sekwencjonowania RNA.

Długa inkubacja z enzymami trawiennymi może zmniejszyć żywotność komórek i zmienić profil transkrypcyjny komórek wyizolowanych z tkanek. Tutaj oddzielamy nabłonek tchawicy za pomocą dypazy, a następnie inkubujemy go z papainą przez krótki czas, uzyskując wysokie plony żywotnych komórek szczoteczki. Nasza metoda może przyczynić się do badań nabłonka górnych dróg oddechowych.

Ten sam protokół można zastosować do izolowania komórek szczoteczki z innych miejsc błony śluzowej, takich jak tkanka nosa. Demonstracja naszej wysoce powtarzalnej techniki pozwoli naukowcom na wyizolowanie i dalsze badanie komórek szczoteczki tchawicy. Aby rozpocząć tę procedurę, należy dodać dyspazę i DNazę I do PBS w końcowych stężeniach pokazanych tutaj, aby przygotować roztwór do wytrawiania w dyspazie.

Upewnij się, że proszek dispazy jest całkowicie rozpuszczony przed podgrzaniem roztworu w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie dodaj 5% inaktywowanego termicznie FBS do DMEM, aby przygotować roztwór zatrzymujący. Aby przygotować bufor Tyrode I, dodaj papainę i L-cysteinę do buforu HEPES Tyrode bez wapnia.

Aby przygotować bufor Tyrode II, należy dodać leupeptynę do buforu HEPES Tyrode'a bez wapnia w stężeniu dwóch mikrolitrów na mililitr. Aby przygotować bufor FACS, użyj Zbilansowanego Roztworu Soli Hanka bez wapnia, magnezu i czerwieni fenolowej uzupełnionego dwoma milimolowymi EDTA i 2% FBS. Po eutanazji myszy użyj igieł o rozmiarze 21, aby przymocować ją do deski chirurgicznej w pozycji leżącej z wyprostowanymi kończynami górnymi i dolnymi.

Spryskaj futro 70% etanolem, aby zdezynfekować obszar. Za pomocą prostych kleszczy podnieś skórę i sierść brzucha i użyj nożyczek preparacyjnych, aby wykonać nacięcie pośrodku. Za pomocą nożyczek oddziel skórę od tkanki podskórnej od brzucha do żuchwy.

Trzymając tkankę podskórną za pomocą kleszczy, wykonaj małe nacięcie nożyczkami na środku ściany brzucha. Następnie otwórz otrzewną z nacięciem w kształcie litery V. Za pomocą kleszczy delikatnie przesuń jelito cienkie na bok.

Zlokalizuj aortę brzuszną i żyłę główną i wykonaj nacięcie nożyczkami preparacyjnymi, aby umożliwić szybkie wykrwawienie. Zlokalizuj membranę. Za pomocą igły o rozmiarze 18 wykonaj otwór w przeponie tuż pod mostkiem, aby opróżnić płuca.

Za pomocą ostrych, spiczastych, prostych nożyczek preparacyjnych przetnij wzdłuż podstawy żeber, aby ostrożnie oddzielić przeponę od klatki piersiowej. Użyj kleszczy, aby podnieść odsłonięty koniec mostka i przeciąć mostek wzdłużnie od podstawy klatki piersiowej do szyi. Użyj krótkich, prostych nożyczek, aby wykonać centralne nacięcie szyjki macicy i oddzielić dwa płaty gruczołu podżuchwowego.

Następnie użyj pary precyzyjnych kleszczyków o wysokiej precyzji, aby ostrożnie usunąć otaczającą tkankę łączną i grasicę pokrywającą carinę. Wypreparuj tchawicę swobodnie, najpierw oddzielając bliższy koniec na poziomie nagłośni, a następnie preparując dystalny koniec na poziomie rozwidlenia tchawicy. Zlokalizuj nagłośnię i przetnij tchawicę wzdłuż od nagłośni do cariny.

Na początek umieść tchawicę w 1,5-mililitrowej probówce zawierającej 750 mikrolitrów roztworu do wytrawiania w dyspazie, podgrzanego do 37 stopni Celsjusza. Przykryj probówkę folią aluminiową, aby zmniejszyć ekspozycję na bezpośrednie światło i inkubować na wytrząsarce z prędkością 200 obr./min i w temperaturze pokojowej przez 40 minut. Następnie dodaj 750 mikrolitrów DMEM z 5% FBS, aby zatrzymać reakcję i umieść probówkę na lodzie.

Przenieś tchawicę na szalkę Petriego. Zorientuj tchawicę stroną nabłonkową skierowaną do góry. Podłużnie rozcięta tchawica ma półcylindryczny kształt utrzymywany przez pierścienie chrzęstne.

Nabłonek znajduje się na wklęsłej powierzchni. Za pomocą prostych kleszczy przymocuj obszar nagłośni tchawicy do szalki Petriego i użyj skalpela do usuwania w rozmiarze 22, aby zeskrobać nabłonek z tchawicy. Warstwa nabłonkowa oddzieli się jako półprzezroczysty arkusz.

Użyj skalpela, aby zmielić nabłonek i przenieść warstwę nabłonka do dwumililitrowej tubki. Przepłukać szalkę Petriego 750 mikrolitrami buforu Tyrode I i przenieść ją do probówki zawierającej warstwę nabłonkową. Przykryj probówkę folią aluminiową, aby zmniejszyć ekspozycję na bezpośrednie światło i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza na wytrząsarce z prędkością 200 obr./min przez 30 minut.

Następnie dodaj 750 mikrolitrów zimnego buforu Tyrode II. Energicznie wiruj strawioną tkankę przez 20 do 30 sekund. Za pomocą strzykawki dołączonej do igły o rozmiarze 18 rozcierać homogenat 10 razy.

Następnie przełącz się na igłę o rozmiarze 21 i rozcieraj jeszcze 10 do 20 razy. Przefiltruj komórki przez sitko o średnicy 100 mikrometrów do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Dodaj zimny bufor FACS w stosunku objętościowym 30 do jednego.

Wirować w temperaturze 350 razy g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w zimnym buforze FACS. Przenieś tę zawiesinę na rurkę z polistyrenu o wymiarach 12 na 75 milimetrów.

Ponownie odwirować w temperaturze 350 g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach buforu FACS. Następnie dodaj jeden mikrolitr przeciwciała blokującego anty-myszy CD1632, aby zablokować niespecyficzne wiązanie i inkubować na lodzie przez 15 minut.

Następnie dodaj przeciwciała w odpowiednich kontrolkach izotypu, jak opisano w protokole tekstowym. Inkubować na lodzie przez 45 minut, chroniąc przed bezpośrednim światłem. Następnie dodaj 4,5 mililitra zimnego buforu FACS i wymieszaj.

Odwirować w temperaturze 350 razy g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 300 mikrolitrach zimnego buforu FACS. Dodać jodek propydyny bezpośrednio przed sortowaniem metodą cytometrii przepływowej.

W tym badaniu komórki szczoteczki tchawicy z fluorescencyjnych myszy reporterowych acetylocholiny ChAT eGFP zostały z powodzeniem wyizolowane do sekwencjonowania RNA. Komórki są identyfikowane na podstawie szczątków na podstawie kąta rozproszenia do przodu i z boku. Dublety są wykluczane przy użyciu wysokości i szerokości rozproszenia do przodu oraz wysokości i szerokości rozproszenia bocznego.

Dublety to komórki, które mają wysokie wartości szerokości. W pojedynczych komórkach żywe komórki są identyfikowane jako populacja, która jest ujemna pod względem jodku propidyny. W żywych pojedynczych komórkach komórki CD45 o niskim lub ujemnym poziomie są identyfikowane na podstawie kontroli izotypu.

W komórkach CD45 o niskim poziomie ujemnym, komórki EpCAM dodatnie, które są również eGFP dodatnie w kanale FITC, stanowią populację komórek szczoteczkowych. Liczba komórek szczoteczki ulega zmianie pod wpływem narażenia na metabolity drobnoustrojów i pierwotniaki, a zatem odzwierciedla zmienność mikrobioty instytucjonalnej. Dlatego sugerowalibyśmy oszacowanie liczby komórek szczoteczek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, aby ocenić oczekiwaną liczbę izolowanych komórek szczoteczki za pomocą sortowania metodą cytometrii przepływowej.

Upewnij się, że prawidłowo oddzieliłeś warstwę nabłonkową tchawicy, ponieważ decyduje ona o wydajności izolowanych komórek szczoteczki. Wyizolowane komórki szczoteczki tchawicy mogą być wykorzystywane w szerokim zakresie testów, takich jak sekwencjonowanie RNA, hodowla komórkowa i analiza funkcjonalna.