Name: Izolacja cząstek lipoprotein z żółtka jaja kurzego w celu zbadania włączenia kwasów tłuszczowych patogenów bakteryjnych do fosfolipidów błonowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 59 s
Description: Poznaj metodę izolacji cząstek lipoprotein z żółtka jaja kurzego do badania włączania kwasów tłuszczowych do błon bakteryjnych Staphylococcus aureus. Protokół wykorzystuje spektrometrię masową do analizy lipidomowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom laboratorium Hammera za ich krytyczną ocenę manuskryptu i wsparcie tej pracy. Dr Alex Horswill z University of Colorado School of Medicine uprzejmie dostarczył AH1263. Dr Chris Waters z laboratorium Michigan State University dostarczyło odczynniki. Prace te były wspierane przez grant American Heart Association 16SDG30170026 oraz fundusze na rozpoczęcie działalności zapewnione przez Michigan State University.

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.

S. aureus włącza egzogenne kwasy tłuszczowe do swoich fosfolipidów błonowych 27,32,43. Synteza fosfolipidów przy użyciu egzogennych kwasów tłuszczowych omija hamowanie FASII, ale także zmienia właściwości biofizyczne błony 27,32,44. Chociaż włączenie egzogennych kwasów tłuszczowych do fosfolipidów patogenów Gram-dodatnich jest ...

Oporny na metycylinę S. aureus (MRSA) jest główną przyczyną zakażeń związanych z opieką zdrowotną, a związana z tym oporność na antybiotyki stanowi poważne wyzwanie kliniczne1,2,3. W związku z tym opracowanie nowych strategii terapeutycznych ma wysoki priorytet. Obiecującą strategią leczenia patogenów Gram-dodatnich jest hamowanie syntezy kwasów tłuszczowych, co jest wymogiem do produkcji fosfolipidów błonowych, które w S. aureus obejmują fosfatydyloglicerol (PG), lizylo-PG i kardiolipinę4. U bakterii produkcja kwasów tłuszczowych odbywa się za pośrednictwem szlaku syntezy kwasów tłuszczowych II (FASII)5, który znacznie różni się od eukariotycznego odpowiednika, co czyni FASII atrakcyjnym celem dla rozwoju antybiotyków5,6. Inhibitory FASII są przede wszystkim ukierunkowane na FabI, enzym niezbędny do wydłużenia łańcucha węglowego kwasów tłuszczowych7. Inhibitor FabI, triklosan, jest szeroko stosowany w towarach konsumpcyjnych i medycznych8,9. Dodatkowe inhibitory FabI są opracowywane przez kilka firm farmaceutycznych do leczenia <zakażenia S. aureus class="xref">10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Jednak wiele patogenów Gram-dodatnich, w tym S. aureus, jest zdolnych do wymiatania egzogennych kwasów tłuszczowych w celu syntezy fosfolipidów, omijając hamowanie FASII27,28,29. Tak więc potencjał kliniczny inhibitorów FASII jest dyskutowany ze względu na znaczne luki w naszej wiedzy na temat źródeł kwasów tłuszczowych gospodarza i mechanizmów, za pomocą których patogeny ekstrahują kwasy tłuszczowe z host27,28. Aby wypełnić te luki, opracowaliśmy bezstronną metodę analizy lipidomicznej w celu monitorowania włączania egzogennych kwasów tłuszczowych z cząstek lipoprotein do fosfolipidów błonowych S. aureus.
Podczas sepsy cząsteczki lipoprotein gospodarza stanowią potencjalne źródło kwasów tłuszczowych pochodzących od gospodarza w obrębie układu krwionośnego, ponieważ większość kwasów tłuszczowych gospodarza jest związana z cząsteczkami30. Lipoproteiny składają się z hydrofilowej powłoki złożonej z fosfolipidów i białek, które otaczają hydrofobowy rdzeń z trójglicerydów i estrów cholesterolu31. Cztery główne klasy lipoprotein - chylomikron, lipoproteiny o bardzo niskiej gęstości, lipoproteiny o dużej gęstości i lipoproteiny o niskiej gęstości (LDL) - są wytwarzane przez gospodarza i działają jako nośniki transportu lipidów, dostarczając kwasy tłuszczowe i cholesterol do iz komórek gospodarza przez układ naczyniowy. LDL są bogate w estryfikowane kwasy tłuszczowe, w tym trójglicerydy i estry cholesterolu31. Wcześniej wykazaliśmy, że wysoce oczyszczone ludzkie LDL są realnym źródłem egzogennych kwasów tłuszczowych do syntezy PG, zapewniając w ten sposób mechanizm obejścia inhibitora FASII32. Oczyszczanie ludzkich LDL może być technicznie trudne i czasochłonne, podczas gdy komercyjne źródła oczyszczonych ludzkich LDL są zbyt drogie w rutynowym stosowaniu lub przeprowadzaniu badań przesiewowych na dużą skalę. Aby rozwiązać te problemy, zmodyfikowaliśmy procedurę wzbogacania LDL z żółtka jaja kurzego, bogatego źródła cząsteczek lipoprotein33. Z powodzeniem zastosowaliśmy nieukierunkowaną, wysokorozdzielczą/dokładną spektrometrię mas i tandemową spektrometrię mas do monitorowania wprowadzania ludzkich kwasów tłuszczowych pochodzących z LDL do błony S. aureus32. W przeciwieństwie do wcześniej opisanych metod, podejście to może określić ilościowo poszczególne izomery kwasów tłuszczowych dla każdego z trzech głównych typów fosfolipidów gronkowcowych. Kwas oleinowy (18:1) jest nienasyconym kwasem tłuszczowym obecnym we wszystkich cząsteczkach lipoprotein gospodarza, który jest łatwo włączany do fosfolipidów S. aureus29,30,32. S. aureus nie jest zdolny do syntezy kwasu oleinowego29; W związku z tym ilość kwasu oleinowego inkorporowanego fosfolipidami określa obecność kwasów tłuszczowych pochodzących z lipoprotein gospodarza w błonie gronkowcowej<klasa SUP="xref">29. Te gatunki fosfolipidów można zidentyfikować za pomocą opisanej tutaj najnowocześniejszej metody spektrometrii mas, oferującej niespotykaną rozdzielczość składu błonowego S. aureus hodowanego w obecności źródła kwasów tłuszczowych, z którym prawdopodobnie spotyka się podczas infekcji.

<table><tbody><tr><td>Siarczan amonu</td><td>Fisher</td><td>BP212R-1</td><td>&ge; </td></tr><tr><td>Inkubator do hodowli komórkowych</td><td>o</td> czystości 99,5% Thermo <td>MaxQ 6000</td><td></td></tr><tr><td>Centrafuge</td><td>Thermo</td><td>75-217-420</td><td>Sorvall Legen XTR, rotor F14-6x250 LE</td></tr><tr><td>Płytka testowa Costar</td><td>Corning</td><td>3788</td><td>96 well</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna</td><td>Schleicher & Schuell</td><td>597</td><td></td></tr><tr><td>Duże jajo kurze</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Powszechnie kupione jajko</td></tr><tr><td>Spektrofotometr mikropłytkowy</td><td>BioTek</td><td>Epoch 2</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Szczep S. aureus AH1263</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Dostarczone przez Alexa Horswilla z University of Colorado</td></tr><tr><td>Rurki do dializy</td><td>Pierce</td><td>68700</td><td>7,000 MWCO</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Becton, Dickison and Company</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>kulki z tlenku cyrkonu 0,5 mm</td><td>Next Advance</td><td>ZROB05</td><td></td></tr><tr><td>Bullet Blender</td><td>Next Advance</td><td>BBX24B</td><td></td></tr><tr><td>Metanol (klasa LC-MS)</td><td>Fisher</td><td>A4561</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform (klasa odczynnika)</td><td>Fisher</td><td>MCX10559</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol (klasa LC-MS)</td><td>Fisher</td><td>A4611</td><td></td></tr><tr><td>Dimyristoyl fosfatydylocholina</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850345C-25mg</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan amonu</td><td>Sigma</td><td>9830</td><td>&ge; Oprogramowanie</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>70221-25G-F</td><td></td></tr> Xcalibur o czystości 99,5% <tr><td>Thermo</td><td>Scientific</td><td>OPTON-30801</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr masowy LTQ-Orbitrap Velos</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>wysoka rozdzielczość/dokładna masa MS</td></tr><tr><td>Agilent 1260 kapilarna HPLC</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac Koncentratory próżni</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja cząstek lipoprotein z żółtka jaja kurzego w celu zbadania włączenia kwasów tłuszczowych patogenów bakteryjnych do fosfolipidów błonowych

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Staphylococcus aureus i inne patogeny Gram-dodatnie wprowadzają kwasy tłuszczowe z otoczenia do fosfolipidów błonowych. Podczas infekcji większość egzogennych kwasów tłuszczowych jest obecna w cząsteczkach lipoprotein gospodarza. Pozostaje niepewność co do rezerwuarów kwasów tłuszczowych gospodarza i mechanizmów, za pomocą których bakterie ekstrahują kwasy tłuszczowe z cząstek lipoprotein. W niniejszej pracy opisujemy protokoły wzbogacania cząstek lipoprotein o niskiej gęstości (LDL) z żółtka jaja kurzego i określania, czy LDL służą jako rezerwuary kwasów tłuszczowych dla S. aureus. Metoda ta wykorzystuje bezstronną analizę lipidomiczną i LDL kurczaka, skuteczny i ekonomiczny model do badania interakcji między LDL a bakteriami. Analiza integracji S. aureus egzogennych kwasów tłuszczowych z LDL jest przeprowadzana przy użyciu spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości/dokładności i tandemowej spektrometrii mas, co umożliwia scharakteryzowanie składu kwasów tłuszczowych błony bakteryjnej i bezstronną identyfikację nowych kombinacji kwasów tłuszczowych, które powstają w lipidach błon bakteryjnych po ekspozycji na LDL. Te zaawansowane techniki spektrometrii mas oferują niezrównaną perspektywę włączania kwasów tłuszczowych poprzez ujawnienie specyficznych egzogennych kwasów tłuszczowych wchodzących w skład fosfolipidów. Przedstawione tutaj metody można dostosować do badania innych patogenów bakteryjnych i alternatywnych źródeł złożonych kwasów tłuszczowych.

Protokół wzbogacania LDL z żółtka jaja kurczaka przedstawiono na Rysunku 1. Proces ten rozpoczyna się od rozcieńczenia całkowitego żółtka jaja roztworem soli fizjologicznej oraz oddzielenia stałych składników żółtka, zwanych granulkami, od frakcji rozpuszczalnej lub osocza zawierającego LDL (Rysunek 1)33. Zawartość LDL we frakcji osocza jest dalej wzbogacana poprzez wytrącanie białek β-livetyn o masie ~ 30...

Ta metoda dostarcza ram do badania inkorporacji egzogennych kwasów tłuszczowych z kompleksowych źródeł gospodarza do błon bakteryjnych, szczególnie Staphylococcus aureus. Aby to osiągnąć, opisano protokoły wzbogacania cząstek lipoprotein z żółtka jaja kurzego i późniejszego profilowania fosfolipidów bakteryjnych za pomocą spektrometrii mas.

Izolacja cząstek lipoprotein z żółtka jaja kurzego w celu zbadania włączenia kwasów tłuszczowych patogenów bakteryjnych do fosfolipidów błonowych

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Protokół ten zapewnia ramy do badania włączenia egzogennych kwasów tłuszczowych ze złożonych źródeł gospodarza do błon bakteryjnych, w szczególności gronkowca złocistego. Protokół wykorzystuje bezstronną analizę lipidomiczną i cząsteczki lipoprotein wyizolowane z żółtek jaj kurzych jako ekonomiczne źródło złożonych kwasów tłuszczowych w celu ilościowego określenia włączenia kwasów tłuszczowych do lipidów bakteryjnych. Opisane tutaj techniki spektrometrii mas oferują niezrównaną perspektywę profilu kwasów tłuszczowych lipidów Staphylococcus aureus, ale można je dostosować do badania innych błon bakteryjnych.Podczas wykonywania tego protokołu należy zwrócić uwagę, aby każdy etap frakcjonowania miał na celu zidentyfikowanie i zachowanie frakcji zawierającej LDL. Usunięcie siarczanu amoniaku z frakcji osocza ma kluczowe znaczenie dla dalszych zastosowań LDL. Należy zapewnić wystarczająco dużo miejsca w przewodach i w razie potrzeby wymieniać wodę, aby umożliwić skuteczną dializę.Na początek umyj dwa żółtka jaj dwukrotnie 30 mililitrami sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, aby usunąć resztki albuminy. Przebić błonę witelinową sterylną końcówką pipety i spuścić zawartość membrany do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 mililitrów. Dodać około 24 do 30 mililitrów lub 17 molowego roztworu chlorku sodu o pH siedem do żółtka jaja i energicznie wymieszać.Następnie umieść probówkę na kołyszącym się shakerze, aby mieszać w czterech stopniach Celsjusza przez 60 minut. Odwirować rozcieńczenie żółtka jaja w temperaturze 10 stopni Celsjusza w temperaturze 10 000 razy g przez 45 minut. Przenieść supernatantową frakcję osocza do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów, pozostawiając granulowaną frakcję granulowaną.I znowu odwirować. Najpierw wymieszaj frakcję osocza z siarczanem amonu o zawartości 40 procent objętości na kołyszącym się wytrząsarce lub podobnym urządzeniu w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 60 minut. Po dostosowaniu pH odwirować frakcję osocza w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 10 000 g przez 45 minut.Usunąć górną półstałą żółtą frakcję do rurki dializacyjnej o wielkości porów siedmiu kilodaltonów. Zapewnij co najmniej 25% dodatkowego miejsca w rurce, aby umożliwić jej pęcznienie. Umieść rurkę dializacyjną w trzech litrach ultraczystej wody, aby dializować przez noc w temperaturze trzech stopni Celsjusza w celu usunięcia siarczanu amonu.Po dializie odwirować roztwór w temperaturze czterech stopni Celsjusza, jak opisano wcześniej. Ostrożnie wyjmij górną, półstałą żółtą frakcję do sterylnej probówki i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po całonocnej inkubacji kultury przenieść 500 mikrolitrów do dwóch sterylnych 250-mililitrowych kolb z przegrodami zawierających 49,5 mililitrów 1% bulionu tryptonowego.Inkubować przez około cztery godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem, aż do osiągnięcia średniej fazy. Przenieś 100 mililitrów kultury w odstępach co 25 mililitrów do czterech sterylnych 50-mililitrowych probówek wirówkowych i odwiruj cztery probówki po 10 000 razy g, aby osadzać komórki. Usuń supernatant i ponownie zawieś każdą osadkę komórkową w 750 mikrolitrach 1% bulionu tryptonowego.Połącz cztery zawiesiny ogniw o pojemności 750 mikrolitrów w jedną rurkę o pojemności 15 mililitrów. I podajcie 350 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do sześciu sterylnych 1,5 mililitrowych probówek wirówkowych. Za pomocą pipety dodaj 30 mikrolitrów LDL do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej, aby osiągnąć pożądane stężenie końcowe 5% I inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając przez cztery godziny.Odwirować kultury w temperaturze czterech stopni Celsjusza w temperaturze 16 000 razy g przez dwie minuty. I ponownie zawiesić granulki komórek w 330 mikrolitrach sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem w celu umycia. Powtórz to pranie jeszcze raz.Zapisać wagę sześciu granulek o mokrych komórkach, odejmując masę pustej tuby. Zamroź granulki komórek na suchym lodzie. Najpierw dodaj jedną miarkę 5 milimetrowych kulek tlenku cyrkonu na wierzch każdej granulki komórek.Dodaj 740 mikrolitrów 75% metanolu klasy HPLC schłodzonego do minus 80 stopni Celsjusza bezpośrednio do każdej probówki. Następnie dodaj dwa mikrolitry 50 mikromolowych dimyrystoylfosfatydylocholiny jako wzorzec wewnętrzny. Umieść próbkę zawierającą 1,5 mililitra probówek wirówkowych w dostępnym porcie homogenizatora tkankowego mieszalnika kulowego.Homogenizować próbki na niskich obrotach. Ustawienie od dwóch do trzech przez trzy minuty. Przeprowadzić wzrokową kontrolę próbek pod kątem jednorodności.Jeśli widoczne są grudki komórek, kontynuuj homogenizację w mieszalniku kulowym w dwuminutowych odstępach. Następnie dodaj 270 mikrolitrów chloroformu do każdej próbki w dygestoriach chemicznych. Energicznie wirować próbki przez 30 minut.Próbki należy odwirować w wirówce stołowej przez maksymalnie 30 minut z prędkością co najmniej 2 000 g. W dygestorium chemicznym zebrać monofazowy supernatant i przenieść go do nowej probówki, ostrożnie unikając osadu białkowego na dnie probówki ekstrakcyjnej. Przenieść rozcieńczone ekstrakty lipidowe wcześniej przygotowane do odpowiedniej fiolki z automatycznym podajnikiem próbek.W celu analizy opartej na wtrysku przepływu, należy umieścić fiolki automatycznego podajnika próbek w automatycznym podajniku próbek z kontrolowaną temperaturą systemu HPLC, który jest zdolny do zastosowań z przepływem kapilarnym. Skonfiguruj system HPLC zgodnie z manuskryptem. Eluent jest wprowadzany z linii transferowej HPLC do spektrometru mas przez źródło jonizacji elektronrozpylania wyposażone w metalową igłę o niskim przepływie o rozmiarze 34.W oprogramowaniu sterującym przyrządem Thermo Tune Plus ustaw napięcie jonizacji na 4 000 woltów, a gaz osłonowy na pięć. Podobnie ustaw temperaturę kapilary na 150 stopni Celsjusza, a soczewkę S na 50%Kliknij przycisk definiowania skanowania, a następnie w menu analizatora wybierz FTMS. Ustaw pole zakresu masy na normalne, a następnie w polu rozdzielczości wybierz 100 000.Upewnij się, że opcja Typ skanowania jest ustawiona na pełne. W menu zakresów skanowania wprowadź liczbę 200 w pierwszym polu masy i wprowadź 2 000 w ostatnim polu masy. Po dalszym określeniu obserwowanej dokładności masy, należy uśrednić sygnał przez szeroki pik w chromatogramie jonów całkowitych.Kliknij prawym przyciskiem myszy ikonę pinezki w oknie podglądu widma masowego i wybierz view lista widma. Z tego samego menu wybierz opcje wyświetlania, a następnie przełącz pole przełączania wszystkie szczyty w menu wyświetlania. Kliknij przycisk OK, aby zamknąć okno podglądu.Kliknij prawym przyciskiem myszy ikonę pinezki w oknie podglądu widma masy i wybierz dokładną masę eksportu schowka. Wklej wyeksportowaną komórkę danych A1 pierwszego arkusza roboczego do nowego arkusza kalkulacyjnego Excel i postępuj zgodnie z rękopisem. Aby przeprowadzić dokładną identyfikację lipidów na podstawie masy, otwórz oprogramowanie LIMSA.Z menu głównego wybierz listę szczytów w menu typu widma. Wybierz tryb dodatni lub ujemny, aby odpowiadał polaryzacji, w której uzyskano dane spektrometrii mas. W oknie piku o pełnej szerokości w połowie maksimum i powyżej okna z wprowadź żądane okno wyszukiwania masowego, aby znaleźć pik.W tym protokole zawartość LDL we frakcji osocza została dodatkowo wzbogacona przez wytrącenie 30 do 40 kilodaltonów beta lewityny. Obecność prążków białkowych w 140, 80, 65, 60 i 15 kilodaltonach koreluje z apoproteinami LDL. Leczenie triklosanem hamuje wzrost gronkowca złocistego w podłożu wolnym od kwasów tłuszczowych.Uzupełnianie kultur z osoczem żółtka jaja jako źródłem egzogennych kwasów tłuszczowych przezwycięża hamowanie wzrostu wywołane triklosanem. Podobnie, suplementacja kultur traktowanych triklosanem wzbogaconym żółtkiem jaja LDL przywraca wzrost. Co więcej, dodatek LDL z żółtka jaja wspomaga wzrost wcześniej scharakteryzowanego kwasu tłuszczowego S.aureus, auksotrofu.Zawartość kwasów tłuszczowych przed kwasem tłuszczowym mierzono w 1% bulionie tryptonowym lub żółtku jaja kurzego LDL za pomocą dokładnej spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości z wtryskiem przepływowym. Stwierdzono minimalne ilości wolnych kwasów tłuszczowych. Ortogonalna analiza dyskryminacyjna cząstkowa metodą najmniejszych kwadratów obfitych fosfolipidów błonowych gronkowca złocistego wykazała wyraźną separację klas, ze składem kwasów tłuszczowych w warunkach niepoddanych działaniu LDL i żółtka jaja kurzego.Wzbogacanie LDL z żółtka jaja kurzego stanowi niedrogie źródło złożonych kwasów tłuszczowych do badania interakcji między patogenami bakteryjnymi a lipoproteinami gospodarza. Chloroform i metanol stosowane do sporządzania ekstraktów lipidowych są niebezpieczne. Upewnij się, że używasz tych odczynników w dygestoriach chemicznych i zawieraj wszystkie strumienie odpadów.

isolation-lipoprotein-particles-from-chicken-egg-yolk-for-study

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Źródło: Armbruster, KM, Meredith, TC Wzbogacanie lipoprotein bakteryjnych i otrzymywanie N-końcowych lipopeptydów do oznaczania strukturalnego za pomocą spektrometrii mas. J. Vis. Exp. (2018)Ten film pokazuje wzbogacanie lipoprotein bakteryjnych za pomocą niejonowego detergentu, który po podgrzaniu ulega separacji faz. Poprzez sekwencyjne zmiany temperatury i etapy wirowania, lipoproteiny są selektywnie rozdzielane na fazę detergentu, podczas gdy zanieczyszczenia nielipoproteinowe są usuwane.

Wzbogacanie lipoprotein bakteryjnych za pomocą niejonowej separacji faz detergentowych

Izolacja i charakterystyka domeny lipidów A lipopolisacharydu (LPS) od bakterii Gram-ujemnych dostarcza wglądu w oparte na powierzchni komórek mechanizmy oporności na antybiotyki, przeżywalność i sprawność bakterii, oraz jak chemicznie zróżnicowane gatunki molekularne lipidów A różnie modulują wrodzoną odpowiedź immunologiczną gospodarza.

Izolacja i charakterystyka chemiczna lipidu A z bakterii Gram-ujemnych

Przedstawiono dwie techniki izolowania kropelek lipidów komórkowych z 1) komórek drożdży i 2) ludzkich łożysk. Centralnym elementem obu procedur jest wirowanie w gradionym gradimencie gęstości, w którym powstałą pływającą warstwę zawierającą kropelki można łatwo zwizualizować za pomocą oka, wyekstrahować i określić ilościowo za pomocą analizy Western Blot w celu uzyskania czystości.

Izolacja kropelek lipidów komórkowych: dwie techniki oczyszczania, zaczynając od komórek drożdży i ludzkich łożysk

Komórki Caco-2 mogą służyć jako model in vitro do badania transportu lipidów przez enterocyty oraz rozpuszczalnych w tłuszczach leków/witamin. Przepuszczalny system błonowy oddziela przedział wierzchołkowy od podstawno-bocznego, podczas gdy system ekspresji lentiwirusa oferuje skuteczną metodę nadekspresji genów. Izolacja lipoprotein jest potwierdzona przez TEM.

Wykorzystanie komórek Caco-2 do badania transportu lipidów przez jelito

MikroRNA odgrywają ważną rolę regulacyjną i stają się nowymi celami terapeutycznymi dla różnych chorób ludzkich. Wykazano, że miRNA są przenoszone w lipoproteinach o dużej gęstości. Opracowaliśmy uproszczoną metodę szybkiego izolowania oczyszczonego HDL nadającego się do analizy miRNA z ludzkiego osocza.

Szybka i uproszczona metoda wysokoprzepustowej izolacji miRNA z wysoko oczyszczonej lipoproteiny o wysokiej gęstości

Wzbogacanie lipoprotein bakteryjnych za pomocą metody podziału fazy niejonowego środka powierzchniowo czynnego jest opisane do bezpośredniego użycia w testach TLR lub innych zastosowaniach. Dalsze kroki są szczegółowo opisane w celu przygotowania N-końcowych lipopeptydów tryptycznych do charakterystyki strukturalnej za pomocą spektrometrii mas.

Wzbogacanie lipoprotein bakteryjnych i otrzymywanie N-końcowych lipopeptydów do oznaczania strukturalnego metodą spektrometrii mas

Ten protokół ustanawia nowatorską metodę izolacji i oczyszczania kropelek lipidów z wątroby myszy, przy użyciu dobrze znanego zestawu do izolacji retikulum endoplazmatycznego.

Protokół szybkiej izolacji kropelek lipidów przy użyciu dobrze znanego zestawu do izolacji organelli

Do analizy lipoprotein osocza użyto kilku metod; jednak ultrawirowanie jest nadal jedną z najbardziej popularnych i niezawodnych metod. W tym miejscu opisujemy metodę izolowania lipoprotein z osocza za pomocą sekwencyjnego ultrawirowania o gęstości oraz jak analizować apolipoproteiny zarówno do celów diagnostycznych, jak i badawczych.

Izolacja i analiza lipoprotein osocza metodą ultrawirowania

Obecny protokół opisuje prostą metodę izolowania preadipocytów z tkanki tłuszczowej w zarodkach brojlerów. Metoda ta umożliwia izolację z wysoką wydajnością, hodowlą pierwotną i różnicowaniem adipogennym preadipocytów. Barwienie czerwienią olejową O i barwienie lipidami/DNA mierzyło zdolność adipogenną izolowanych komórek indukowanych pożywką różnicującą.

Izolacja preadipocytów z zarodków piskląt brojlerów

Obecny protokół opisuje szczegółowy protokół chirurgiczny izolowania przepływającej limfy jelitowej w odpowiedzi na infuzje składników odżywczych dodwunastnicy u myszy. Pozwala to na fizjologiczne określenie całkowitego wchłaniania lipidów w jelitach oraz syntezy i wydzielania chylomikronu w odpowiedzi na różne eksperymentalne składniki odżywcze.

Izolacja przepływającej limfy krezkowej u myszy w celu ilościowego określenia in vivo kinetyki wchłaniania lipidów w diecie i wydzielania chylomikronu

Tutaj opisujemy protokoły pomiaru ilości fluorescencyjnego fosfolipidu specjalnie usuwanego z cząstek dawcy lipidów za pomocą lipoproteiny o wysokiej gęstości (HDL) obecnej w całym ludzkim osoczu lub surowicy. Wykazaliśmy, że ten wskaźnik funkcjonalności HDL przewiduje występ chorób sercowo-naczyniowych.

Testy wypływu lipoproteiny o wysokiej gęstości

Poznaj metodę izolacji cząstek lipoprotein z żółtka jaja kurzego do badania włączania kwasów tłuszczowych do błon bakteryjnych Staphylococcus aureus. Protokół wykorzystuje spektrometrię masową do analizy lipidomowej.

Izolacja cząstek lipoprotein z żółtka jaja kurzego w celu zbadania włączenia kwasów tłuszczowych patogenów bakteryjnych do fosfolipidów błonowych (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja cząstek lipoprotein z żółtka jaja kurzego w celu zbadania włączenia kwasów tłuszczowych patogenów bakteryjnych do fosfolipidów błonowych

Przeglądaj więcej filmów