Izolacja cząstek lipoprotein z żółtka jaja kurzego w celu zbadania włączenia kwasów tłuszczowych patogenów bakteryjnych do fosfolipidów błonowych

Protokół ten zapewnia ramy do badania włączenia egzogennych kwasów tłuszczowych ze złożonych źródeł gospodarza do błon bakteryjnych, w szczególności gronkowca złocistego. Protokół wykorzystuje bezstronną analizę lipidomiczną i cząsteczki lipoprotein wyizolowane z żółtek jaj kurzych jako ekonomiczne źródło złożonych kwasów tłuszczowych w celu ilościowego określenia włączenia kwasów tłuszczowych do lipidów bakteryjnych. Opisane tutaj techniki spektrometrii mas oferują niezrównaną perspektywę profilu kwasów tłuszczowych lipidów Staphylococcus aureus, ale można je dostosować do badania innych błon bakteryjnych.

Podczas wykonywania tego protokołu należy zwrócić uwagę, aby każdy etap frakcjonowania miał na celu zidentyfikowanie i zachowanie frakcji zawierającej LDL. Usunięcie siarczanu amoniaku z frakcji osocza ma kluczowe znaczenie dla dalszych zastosowań LDL. Należy zapewnić wystarczająco dużo miejsca w przewodach i w razie potrzeby wymieniać wodę, aby umożliwić skuteczną dializę.

Na początek umyj dwa żółtka jaj dwukrotnie 30 mililitrami sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, aby usunąć resztki albuminy. Przebić błonę witelinową sterylną końcówką pipety i spuścić zawartość membrany do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 mililitrów. Dodać około 24 do 30 mililitrów lub 17 molowego roztworu chlorku sodu o pH siedem do żółtka jaja i energicznie wymieszać.

Następnie umieść probówkę na kołyszącym się shakerze, aby mieszać w czterech stopniach Celsjusza przez 60 minut. Odwirować rozcieńczenie żółtka jaja w temperaturze 10 stopni Celsjusza w temperaturze 10 000 razy g przez 45 minut. Przenieść supernatantową frakcję osocza do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów, pozostawiając granulowaną frakcję granulowaną.

I znowu odwirować. Najpierw wymieszaj frakcję osocza z siarczanem amonu o zawartości 40 procent objętości na kołyszącym się wytrząsarce lub podobnym urządzeniu w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 60 minut. Po dostosowaniu pH odwirować frakcję osocza w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 10 000 g przez 45 minut.

Usunąć górną półstałą żółtą frakcję do rurki dializacyjnej o wielkości porów siedmiu kilodaltonów. Zapewnij co najmniej 25% dodatkowego miejsca w rurce, aby umożliwić jej pęcznienie. Umieść rurkę dializacyjną w trzech litrach ultraczystej wody, aby dializować przez noc w temperaturze trzech stopni Celsjusza w celu usunięcia siarczanu amonu.

Po dializie odwirować roztwór w temperaturze czterech stopni Celsjusza, jak opisano wcześniej. Ostrożnie wyjmij górną, półstałą żółtą frakcję do sterylnej probówki i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po całonocnej inkubacji kultury przenieść 500 mikrolitrów do dwóch sterylnych 250-mililitrowych kolb z przegrodami zawierających 49,5 mililitrów 1% bulionu tryptonowego.

Inkubować przez około cztery godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem, aż do osiągnięcia średniej fazy. Przenieś 100 mililitrów kultury w odstępach co 25 mililitrów do czterech sterylnych 50-mililitrowych probówek wirówkowych i odwiruj cztery probówki po 10 000 razy g, aby osadzać komórki. Usuń supernatant i ponownie zawieś każdą osadkę komórkową w 750 mikrolitrach 1% bulionu tryptonowego.

Połącz cztery zawiesiny ogniw o pojemności 750 mikrolitrów w jedną rurkę o pojemności 15 mililitrów. I podajcie 350 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do sześciu sterylnych 1,5 mililitrowych probówek wirówkowych. Za pomocą pipety dodaj 30 mikrolitrów LDL do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej, aby osiągnąć pożądane stężenie końcowe 5% I inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając przez cztery godziny.

Odwirować kultury w temperaturze czterech stopni Celsjusza w temperaturze 16 000 razy g przez dwie minuty. I ponownie zawiesić granulki komórek w 330 mikrolitrach sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem w celu umycia. Powtórz to pranie jeszcze raz.

Zapisać wagę sześciu granulek o mokrych komórkach, odejmując masę pustej tuby. Zamroź granulki komórek na suchym lodzie. Najpierw dodaj jedną miarkę 5 milimetrowych kulek tlenku cyrkonu na wierzch każdej granulki komórek.

Dodaj 740 mikrolitrów 75% metanolu klasy HPLC schłodzonego do minus 80 stopni Celsjusza bezpośrednio do każdej probówki. Następnie dodaj dwa mikrolitry 50 mikromolowych dimyrystoylfosfatydylocholiny jako wzorzec wewnętrzny. Umieść próbkę zawierającą 1,5 mililitra probówek wirówkowych w dostępnym porcie homogenizatora tkankowego mieszalnika kulowego.

Homogenizować próbki na niskich obrotach. Ustawienie od dwóch do trzech przez trzy minuty. Przeprowadzić wzrokową kontrolę próbek pod kątem jednorodności.

Jeśli widoczne są grudki komórek, kontynuuj homogenizację w mieszalniku kulowym w dwuminutowych odstępach. Następnie dodaj 270 mikrolitrów chloroformu do każdej próbki w dygestoriach chemicznych. Energicznie wirować próbki przez 30 minut.

Próbki należy odwirować w wirówce stołowej przez maksymalnie 30 minut z prędkością co najmniej 2 000 g. W dygestorium chemicznym zebrać monofazowy supernatant i przenieść go do nowej probówki, ostrożnie unikając osadu białkowego na dnie probówki ekstrakcyjnej. Przenieść rozcieńczone ekstrakty lipidowe wcześniej przygotowane do odpowiedniej fiolki z automatycznym podajnikiem próbek.

W celu analizy opartej na wtrysku przepływu, należy umieścić fiolki automatycznego podajnika próbek w automatycznym podajniku próbek z kontrolowaną temperaturą systemu HPLC, który jest zdolny do zastosowań z przepływem kapilarnym. Skonfiguruj system HPLC zgodnie z manuskryptem. Eluent jest wprowadzany z linii transferowej HPLC do spektrometru mas przez źródło jonizacji elektronrozpylania wyposażone w metalową igłę o niskim przepływie o rozmiarze 34.

W oprogramowaniu sterującym przyrządem Thermo Tune Plus ustaw napięcie jonizacji na 4 000 woltów, a gaz osłonowy na pięć. Podobnie ustaw temperaturę kapilary na 150 stopni Celsjusza, a soczewkę S na 50%Kliknij przycisk definiowania skanowania, a następnie w menu analizatora wybierz FTMS. Ustaw pole zakresu masy na normalne, a następnie w polu rozdzielczości wybierz 100 000.

Upewnij się, że opcja Typ skanowania jest ustawiona na pełne. W menu zakresów skanowania wprowadź liczbę 200 w pierwszym polu masy i wprowadź 2 000 w ostatnim polu masy. Po dalszym określeniu obserwowanej dokładności masy, należy uśrednić sygnał przez szeroki pik w chromatogramie jonów całkowitych.

Kliknij prawym przyciskiem myszy ikonę pinezki w oknie podglądu widma masowego i wybierz view lista widma. Z tego samego menu wybierz opcje wyświetlania, a następnie przełącz pole przełączania wszystkie szczyty w menu wyświetlania. Kliknij przycisk OK, aby zamknąć okno podglądu.

Kliknij prawym przyciskiem myszy ikonę pinezki w oknie podglądu widma masy i wybierz dokładną masę eksportu schowka. Wklej wyeksportowaną komórkę danych A1 pierwszego arkusza roboczego do nowego arkusza kalkulacyjnego Excel i postępuj zgodnie z rękopisem. Aby przeprowadzić dokładną identyfikację lipidów na podstawie masy, otwórz oprogramowanie LIMSA.

Z menu głównego wybierz listę szczytów w menu typu widma. Wybierz tryb dodatni lub ujemny, aby odpowiadał polaryzacji, w której uzyskano dane spektrometrii mas. W oknie piku o pełnej szerokości w połowie maksimum i powyżej okna z wprowadź żądane okno wyszukiwania masowego, aby znaleźć pik.

W tym protokole zawartość LDL we frakcji osocza została dodatkowo wzbogacona przez wytrącenie 30 do 40 kilodaltonów beta lewityny. Obecność prążków białkowych w 140, 80, 65, 60 i 15 kilodaltonach koreluje z apoproteinami LDL. Leczenie triklosanem hamuje wzrost gronkowca złocistego w podłożu wolnym od kwasów tłuszczowych.

Uzupełnianie kultur z osoczem żółtka jaja jako źródłem egzogennych kwasów tłuszczowych przezwycięża hamowanie wzrostu wywołane triklosanem. Podobnie, suplementacja kultur traktowanych triklosanem wzbogaconym żółtkiem jaja LDL przywraca wzrost. Co więcej, dodatek LDL z żółtka jaja wspomaga wzrost wcześniej scharakteryzowanego kwasu tłuszczowego S.aureus, auksotrofu.

Zawartość kwasów tłuszczowych przed kwasem tłuszczowym mierzono w 1% bulionie tryptonowym lub żółtku jaja kurzego LDL za pomocą dokładnej spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości z wtryskiem przepływowym. Stwierdzono minimalne ilości wolnych kwasów tłuszczowych. Ortogonalna analiza dyskryminacyjna cząstkowa metodą najmniejszych kwadratów obfitych fosfolipidów błonowych gronkowca złocistego wykazała wyraźną separację klas, ze składem kwasów tłuszczowych w warunkach niepoddanych działaniu LDL i żółtka jaja kurzego.

Wzbogacanie LDL z żółtka jaja kurzego stanowi niedrogie źródło złożonych kwasów tłuszczowych do badania interakcji między patogenami bakteryjnymi a lipoproteinami gospodarza. Chloroform i metanol stosowane do sporządzania ekstraktów lipidowych są niebezpieczne. Upewnij się, że używasz tych odczynników w dygestoriach chemicznych i zawieraj wszystkie strumienie odpadów.