Protokół szybkiej izolacji kropelek lipidów przy użyciu dobrze znanego zestawu do izolacji organelli

Badania nad biologią kropelek lipidów były utrudnione ze względu na trudności w oczyszczaniu. Ponadto badanie komórkowego strumienia lipidów wymaga jednoczesnego oczyszczania wielu organelli, a obecnie nie są dostępne żadne proste protokoły. Główną zaletą tej techniki jest ułatwienie oczyszczania kropelek lipidów.

Zmodyfikowaliśmy dostępny na rynku zestaw, aby jednocześnie izolować kropelki lipidów, retikulum endoplazmatyczne i lizosomy z jednej próbki. Nagromadzenie lipidów w wątrobie w kropelkach predysponuje pacjentów otyłych i alkoholików do postępującej choroby wątroby. To przesunęło pogląd kropelek lipidów z obojętnych przedziałów magazynowych na dynamiczne biologicznie ważne organelle.

Na początek użyj sterylnych kleszczy i nożyczek preparacyjnych, aby przeciąć warstwę skóry i mięśni brzucha uśpionej myszy na osi tylno-przedniej, odsłaniając wątrobę. Przetnij więzadła łączące wątrobę z jelitem. Za pomocą kleszczy odciągnij jelito od wątroby w kierunku tylnej.

Przeciąć więzadło łączące wątrobę z przeponą. Następnie przeciąć między wątrobą a grzbietową klatką piersiową, przesuwając się od przodu do tyłu, aż wątroba zostanie uwolniona. Przenieś wątrobę na zimną pięciocentymetrową szalkę Petriego z 10 mililitrami zimnego 1x PBS i umyj wątrobę dwukrotnie na platformie bujanej w 10 mililitrach zimnej 1x PBS przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza.

Po ostatnim umyciu odlej 1x PBS i użyj sterylnego ostrza chirurgicznego w rozmiarze 10, aby pokroić wątrobę w kostkę na kawałki o wielkości od trzech do pięciu milimetrów w naczyniu. Następnie umyj pokrojoną w kostkę wątrobę dwa razy 10 mililitrami zimnego 1x PBS przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zdekantuj 1x PBS i przenieś pokrojone w kostkę kawałki wątroby do zimnego 45-mililitrowego homogenizatora Dounce, upewniając się, że wszystkie kawałki znajdują się na dnie.

Dodaj siedem mililitrów zimnego buforu 1x IE. Homogenizuj na lodzie, przesuwając tłuczek w górę iw dół 20 razy, upewniając się, że tłuczek opada na dno homogenizatora podczas każdego pociągnięcia. Przenieść homogenat do zimnej 15-mililitrowej probówki wirówkowej.

Przepłukać homogenizator jednym mililitrem zimnego buforu 1x IE i dodać go do reszty homogenatu. Aby usunąć jądra, odwirować homogenat w wirówce o dużej pojemności w temperaturze 1 000 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Upewnij się, że wszelkie lipidy zebrane w górnej części 15-mililitrowej probówki są ponownie zawieszone, aby zapobiec utracie LD.

Upewniając się, że osad jądrowy na dnie probówki nie jest zakłócony, przenieś pojądrowy supernatant zawierający lipidy do świeżej zimnej 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Przenieść 100-mikrolitrową porcję postjądrowego supernatantu do zimnej 1,7-mililitrowej probówki wirówkowej na lodzie w celu późniejszej analizy czystości. Aby usunąć mitochondria, odwirować postjądrową próbkę supernatantu w chłodzonej wirówce szybkoobrotowej o stężeniu 12 000 g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Upewnij się, że lipid zebrany w górnej części probówki jest ponownie zawieszony, aby zapobiec utracie LD, a następnie przenieś supernatant pomitochondrialny do 13-mililitrowej probówki ultrawirówkowej. Przenieś 100-mikrolitrową podwielokrotność post-mitochondrialnego supernatantu do zimnej 1,7-mililitrowej probówki mikrowirówkowej na lodzie w celu późniejszej analizy czystości. Napełnij probówkę ultrawirówki supernatantem postmitochondrialnym po brzegi zimnym buforem 1x IE, aby zapobiec jego zapadnięciu się podczas ultrawirowania.

Zrównoważyć próbki, a następnie odwirować w ultrawirówce pod ciśnieniem 100 000 g przez 60 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby usunąć warstwę LD, przechyl probówkę pod kątem 45 stopni i zassaj szklaną pipetą. Po przeniesieniu osadu do zimnej 1,7-mililitrowej probówki mikrowirówkowej, należy zebrać 100 mikrolitrów supernatantu post-ER pod warstwą lipidową w celu analizy czystości.

Aby osadzać jakiekolwiek resztki komórek, odwiruj w mikrowirówce z maksymalną prędkością przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie delikatnie ogrzej probówkę rękami, aby pomóc w ponownym zawieszeniu warstwy LD i przenieś supernatant, w tym warstwę lipidową, do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,7 mililitra. Powtórz te kroki mycia, podgrzewając rurkę dwa do trzech razy, aż granulka przestanie być widoczna.

Następnie, aby przepłukać supernatant LD bez granulek, dodaj 1x PBS do końcowej objętości 1,5 mililitra i odwiruj w mikrowirówce z maksymalną prędkością przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza. Użyj szklanej pipety, aby usunąć jeden mililitr 1x PBS, który znajduje się pod warstwą lipidową, bez naruszania warstwy lipidowej. Powtórz mycie LD cztery do pięciu razy, aż 1x PBS stanie się wizualnie przezroczysty bez zmętnienia.

Następnie użyj szklanej pipety, aby usunąć cały 1x PBS poniżej warstwy lipidowej i użyj uzyskanej czystej frakcji LD do dalszej analizy. Kiedy reprezentatywne 20-krotne obrazy fluorescencyjne i LD w jasnym polu zostały wykonane zarówno z metody izolacji LD zestawu ER, jak i sacharozy LD, ujawniły one podobne poziomy cząstek stałych, co sugeruje podobną czystość przy użyciu dwóch różnych protokołów. Po oczyszczeniu poziomy trójglicerydów LD i białek mierzono za pomocą testów kolorymetrycznych, a dane znormalizowano do masy wątroby, pokazując, że gdy materiał wyjściowy został znormalizowany, wydajność trójglicerydów LD i białka była podobna przy użyciu zestawu ER i metody sacharozy.

Średnice LD określono ilościowo za pomocą oprogramowania do analizy obrazu, wykazując, że izolacja LD zestawu ER i izolacja LD sacharozy dały LD o podobnych rozmiarach. Aby ocenić czystość LD, próbki oznaczono metodą immunoblottingu, wykazując, że LD pochodzące z izolacji LD zestawu ER i protokołu gradientu sacharozy miały jednakową czystość. PLIN2, marker LD, wykryto we wszystkich próbkach z wyjątkiem izolacji LD zestawu ER PER i PNS sacharozy.

Analiza czystości frakcji ER przy użyciu immunoblot pokazuje, że były one wolne od markera LD PLIN2, ale miały znaczne poziomy białka ER SEC61A. Oceniono również czystość frakcji lizosomalnej po dalszym oczyszczaniu lizosomów za pomocą zestawu do wzbogacania lizosomów. Discovery jest obecnie najbardziej użyteczną aplikacją naszego protokołu.

Przeprowadziliśmy lipidomikę w oczyszczonych organellach i wykazaliśmy, że lipotoksyny są zwiększone szczególnie w kropelkach lipidów w alkoholowej chorobie wątroby.