Name: Protokół szybkiej izolacji kropelek lipidów przy użyciu dobrze znanego zestawu do izolacji organelli (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Poznaj szybką izolację kropelek lipidów z wątroby myszy przy użyciu zmodyfikowanego zestawu do izolacji retikulum endoplazmatycznego. Ta metoda umożliwia jednoczesne oczyszczanie wielu organelli i ułatwia badania biologii lipidów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Instytutowi Badań nad Rakiem Rodziny Abramsonów. Prace te są wspierane przez następujące granty: NIH/NIAAA R01 AA026302-01, NIH/NIAAA K08-AA021424, Robert Wood Johnson Foundation, Harold Amos Medical Faculty Development Award, 7158, IDOM DRC Pilot Award P30 DK019525 (R.M.C.); NIH/NIAAA F32-AA024347 (J.C.). Prace te były częściowo wspierane przez NIH P30-DK050306 i jego główne urządzenia (Molecular Pathology and Imaging Core, Molecular Biology/Gene Expression Core i Cell Culture Core) oraz pilotażowy program grantów. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone na stanowisku laboratoryjnym z osobistym sprzętem ochronnym odpowiednim dla poziomu bezpieczeństwa biologicznego 1, w tym fartuchem laboratoryjnym, rękawicami i okularami ochronnymi. Eksperymenty przeprowadzono zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania (IACUC) Uniwersytetu Pensylwanii. Dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować dyskomfort zwierząt, a zwierzęta były traktowane z humanitarną opieką.
1. Izolacja LD za pomocą zestawu izolacyjnego ER
<ol>
	<li>Przygotowanie 
	UWAGA: Podane ilości są odpowiednie dla pojedynczej 1 g wątroby myszy.
	<ol>
		<li>Przygotować 10 ml 1x izotonicznego buforu ekstrakcyjnego (bufor IE, z zestawu do izolacji ER), rozcieńczając 2 ml 5x buforu IE 8 ml ultraczystej wody. Ostudzić bufor, umieszczając go na lodzie.</li>
		<li>Przygotuj 100 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), rozcieńczając 10 ml 10x PBS w 90 ml ultraczystej wody. Ostudzić go, umieszczając go na lodzie.</li>
		<li>Przygotować 10 ml 5% eteru p-(1,1,3,3-tetrametylobutylo)-fenylowego glikolu polietylenowego (PGPE), rozcieńczając 500 μl PGPE w 9,5 ml ultraczystej wody. Użyj strzykawki o pojemności 1 ml, aby odmierzyć PGPE, ponieważ jest lepki. Ostudzić go, umieszczając go na lodzie.</li>
		<li>Schłodzić wszystkie probówki, umieszczając je na lodzie: probówki do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml, probówki wirówkowe o pojemności 15 ml, probówki wirówkowe o dużej prędkości 50 ml i probówki ultrawirówkowe o pojemności 13 ml.</li>
		<li>Schłodzić wszystkie wymagane wirówki do temperatury 4 °C: mikrowirówkę, wirówkę o dużej pojemności do probówek 15 ml, wirówkę szybkoobrotową do probówek 50 ml i ultrawirówkę.</li>
		<li>Sterylizuj kleszcze i nożyczki preparacyjne przez autoklawowanie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie tkanek 
	<ol>
		<li>Poddaj mysz eutanazji, umieszczając ją w komorze wypełnionej 100% CO2 na 10 minut. Potwierdź eutanazję, wykonując zwichnięcie szyjki macicy.</li>
		<li>Za pomocą sterylnych kleszczy i nożyczek preparacyjnych przeciąć warstwę skóry i mięśni brzucha na osi tylnej/przedniej, aby odsłonić wątrobę.</li>
		<li>Przetnij więzadła łączące wątrobę z przeponą i jelitem. Użyj kleszczy, aby odciągnąć jelito od wątroby w kierunku tylnej, aby odsłonić więzadła.</li>
		<li>Przeciąć między wątrobą a grzbietową klatką piersiową, przesuwając się od przodu do tyłu, aż wątroba zostanie uwolniona.</li>
		<li>Przenieś wątrobę na zimną 5 cm szalkę Petriego z 10 ml zimnego 1x PBS.</li>
		<li>Myć wątrobę 2x na bujanej platformie w 10 ml zimnego 1x PBS przez 5 minut w temperaturze 4 °C na 5 cm szalce Petriego. Odlej 1x PBS po ostatnim praniu.</li>
		<li>Użyj sterylnego ostrza chirurgicznego w rozmiarze 10 (patrz Tabela Materiałów), aby pokroić wątrobę na 3-5 mm kawałki na 5-centymetrowej szalce Petriego (<silna klasa="xfig">Ryc. 1A).</li>
		<li>Pokrojoną w kostkę wątróbkę myć 2x 10 ml zimnej 1x PBS przez 5 minut w temperaturze 4 °C na 5 cm szalce Petriego. 
		UWAGA: W celu izolacji lizosomów przenieś 0,5 g wątroby do czystego homogenizatora o pojemności 45 ml i postępuj zgodnie ze wskazówkami dostarczonymi przez zestaw do ekstrakcji lizosomów (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Zdekantować 1x PBS i przenieść pokrojone w kostkę kawałki wątroby do zimnego homogenizatora Dounce o pojemności 45 ml. Upewnij się, że wszystkie kawałki trafiają na dno homogenizatora.</li>
		<li>Dodać 7 ml zimnego buforu 1x IE (z zestawu izolacyjnego ER) i homogenizować na lodzie, przesuwając tłuczek w górę iw dół 20x. Upewnij się, że tłuczek opada na dno homogenizatora podczas każdego pociągnięcia.</li>
		<li>Przenieś homogenat (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1B) do zimnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Przepłukać homogenizator 1 ml zimnego buforu 1x IE (z zestawu izolacyjnego ER) i dodać go do reszty homogenatu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja LD 
	<ol>
		<li>Usunąć jądra przez odwirowanie homogenatu w wirówce o dużej pojemności przy 1 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1C).</li>
		<li>Przenieść supernatant pojądrowy (PNS) do nowej, zimnej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Aby zapobiec utracie LD, należy upewnić się, że wszelkie lipidy zebrane w górnej części probówki o pojemności 15 ml są ponownie zawieszone przed przeniesieniem PNS.</li>
		<li>Pobrać 100 μl podwielokrotności PNS do analizy czystości i umieścić ją w zimnej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml. Odłóż na lód.</li>
		<li>W celu usunięcia mitochondriów należy odwirować próbkę PNS, a nie podwielokrotność, w wirówce szybkoobrotowej z chłodzeniem o sile 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
		<ol>
			<li>Opcjonalnie: W przypadku surowych izolatów LD (CLD) (z zanieczyszczeniem cytozolem i błoną komórkową) należy pobrać górną warstwę lipidową za pomocą szklanej pipety i przenieść ją do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml. Przejdź do sekcji 1.4.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przenieś supernatant postmitochondrialny (PMS) do probówki ultrawirówkowej. Aby zapobiec utracie LD, upewnij się, że lipid zebrany na górze jest ponownie zawieszony przed przeniesieniem PMS.</li>
		<li>Pobrać 100 μl porcji PMS do analizy czystości i umieścić ją w zimnej probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml. Odłóż na lód.</li>
		<li>Napełnij probówkę ultrawirówki po brzegi zimnym buforem 1x IE, aby zapobiec zapadaniu się probówki podczas ultrawirowania.</li>
		<li>Zrównoważyć próbki i odwirować je w ultrawirówce o sile 100 000 x g przez 60 minut w temperaturze 4 °C (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1D).</li>
		<li>Aby usunąć warstwę LD, przechyl probówkę pod kątem 45° i użyj szklanej pipety do natarcia. Przenieś osad do zimnej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,7 ml. 
		UWAGA: Osad zawiera izolowany ER. Użyj tej frakcji za ER do izolacji ER.</li>
		<li>Zebrać 100 μl supernatantu post-ER (PER) pod warstwą lipidową w celu analizy czystości.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mycie LD
	<ol>
		<li>Dodać 1x PBS do frakcji LD zebranej w probówce mikrowirówki 1,7, do całkowitej objętości 1,3 ml.</li>
		<li>Odwirować próbkę.</li>
		<li>Wirować w mikrowirówce z maksymalną prędkością przez 5 minut w temperaturze 4 °C, aby osadzać wszelkie resztki komórek. Delikatnie ogrzej probówkę rękami, aby pomóc w ponownym zawieszeniu warstwy LD. Przenieść supernatant wraz z warstwą lipidową do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,7 ml.</li>
		<li>Powtarzaj kroki 1.4.1–1.4.3 2x–3x, aż granulka przestanie być widoczna.</li>
		<li>Dodać 1x PBS do bezgranulkowego supernatantu LD do końcowej objętości 1,5 ml. Przemyć frakcję lipidową przez odwirowanie w mikrowirówce z maksymalną prędkością przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Usuń 1 ml 1x PBS (spod warstwy lipidowej) szklaną pipetą, nie naruszając warstwy lipidowej.</li>
		<li>Powtórz kroki 1.4.5 i 1.4.6 4x–5x, aż 1x PBS stanie się wizualnie przezroczysty bez zmętnienia.</li>
		<li>Usuń wszystkie 1x PBS poniżej warstwy lipidowej za pomocą szklanej pipety (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1E).</li>
		<li>Wynik, czyli czystą frakcję LD, należy wykorzystać do dalszej analizy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznaczanie ilościowe białka LD za pomocą testu kwasu bicinchoninowego 
	UWAGA: Nie należy stosować testu kwasu bicinchoninowego (BCA), jeśli ma być oceniana morfologia LD.
	<ol>
		<li>Zawiesić LD w 500 μl 5% PGPE.</li>
		<li>Gotować próbki przez 5 minut w temperaturze 95 °C, wirować je i inkubować próbki w temperaturze pokojowej przez 5 minut do ostygnięcia.</li>
		<li>Powtórz krok 1.5.2 dodatkowo 2 razy.</li>
		<li>Sonikować próbki przez 5 minut w 30-sekundowym cyklu włączania/wyłączania, przy średniej intensywności.</li>
		<li>Znormalizować próbki, mierząc stężenie białka we wszystkich próbkach do analizy czystości oraz we frakcji LD za pomocą testu BCA.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Izolacja LD za pomocą gradientu gęstości sacharozy
<ol>
	<li>preparat
	<ol>
		<li>Przygotować 200 ml buforu TE (10 mM Tris-HCl [pH 7,4], 1 mM EDTA [pH 8,0]). Ostudzić go, umieszczając go na lodzie.</li>
		<li>Przygotować 100 ml 60% (m/v) roztworu sacharozy w buforze TE, rozpuszczając 60 g sacharozy w buforze TE, doprowadzając końcową objętość do 100 ml. Ostudzić go, umieszczając go na lodzie.</li>
		<li>Przygotować 6 ml 40% (w/v) roztworu sacharozy, dodając 4 ml 60% sacharozy do 2 ml buforu TE. Ostudzić go, umieszczając go na lodzie.</li>
		<li>Przygotować 6 ml 25% (w/v) roztworu sacharozy, dodając 2,5 ml 60% sacharozy do 3,5 ml buforu TE. Ostudzić go, umieszczając go na lodzie.</li>
		<li>Przygotować 4 ml 10% (w/v) roztworu sacharozy, dodając 0,7 ml 60% sacharozy do 3,3 ml buforu TE. Ostudzić go, umieszczając go na lodzie.</li>
		<li>Przygotować 10 ml roztworu inhibitora proteazy i fosfatazy, dodając jedną tabletkę zarówno proteazy, jak i inhibitorów fosfatazy do 10 ml buforu TE.</li>
		<li>Przygotować bufor homogenatu tkankowego, dodając 4 ml roztworu inhibitora proteazy i fosfatazy do 50 ml 60% roztworu podstawowego sacharozy. Ostudzić go, umieszczając go na lodzie.</li>
		<li>Przygotować bufor nakładkowy, dodając 2 ml roztworu inhibitora proteazy i fosfatazy do 50 ml buforu TE. Ostudzić go, umieszczając go na lodzie.</li>
		<li>Przygotuj 100 ml 1x PBS, rozcieńczając 10 ml 10x PBS w 90 ml ultraczystej wody. Ostudzić go, umieszczając go na lodzie.</li>
		<li>Przygotuj 10 ml 5% PGPE, rozcieńczając 500 μl PGPE w 9,5 ml ultraczystej wody. Użyj strzykawki o pojemności 1 ml, aby odmierzyć PGPE, ponieważ jest lepki. Ostudzić go, umieszczając go na lodzie.</li>
		<li>Schłodzić następujące probówki wirówkowe, umieszczając je na lodzie: probówki do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml, probówki wirówkowe o pojemności 15 ml, probówki wirówkowe szybkoobrotowe o pojemności 50 ml i probówki ultrawirówkowe o pojemności 13 ml.</li>
		<li>Schłodzić wymagane wirówki do temperatury 4 °C: mikrowirówkę, wirówkę o dużej pojemności (do probówek 15 ml), wirówkę szybkoobrotową (do probówek 50 ml) i ultrawirówkę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie tkanek
	<ol>
		<li>Wykonaj kroki 1.2.1–1.2.9, aby przygotować tkankę do homogenizacji.</li>
		<li>Dodaj 7 ml zimnego buforu do homogenatu tkankowego i homogenizuj go na lodzie, przesuwając tłuczek w górę iw dół 20 razy. Podczas pierwszych pięciu pociągnięć upewnij się, że tłuczek opada na dno homogenizatora.</li>
		<li>Przenieść homogenat do zimnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Przepłukać homogenizator 1 ml zimnego buforu do homogenatu tkankowego i przenieść go do poprzednio używanej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Doprowadzić objętość homogenatu do 10 ml za pomocą buforu do homogenatu tkankowego.</li>
		<li>Odwirować próbkę w wirówce o dużej pojemności przy 1 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przenieść 8 ml supernatantu do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Przenieść 100 μl pozostałego supernatantu jako próbkę PNS do analizy czystości.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gradient sacharozy
	<ol>
		<li>Przechylić probówkę wirówkową o pojemności 50 ml zawierającą 8 ml PNS pod kątem 45°. Ostrożnie dodaj 6 ml 40% roztworu sacharozy, upewniając się, że obie fazy pozostają oddzielone.</li>
		<li>W podobny sposób powoli dodawać 6 ml 25% roztworu sacharozy, następnie dodać 4 ml 10% roztworu sacharozy, a na koniec dodać 8 ml buforu nakładkowego.</li>
		<li>Odwirować próbkę w wirówce szybkoobrotowej przy 30 000 x g w temperaturze 4 °C przez 30 minut.</li>
		<li>Przenieść górną warstwę zawierającą LD do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml.</li>
		<li>W przypadku mycia LD należy postępować zgodnie z instrukcjami podanymi w punkcie 1.4.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Lipid+Droplets+from+Cells+by+Density+Gradient+Centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of Lipid Droplets from Cells by Density Gradient Centrifugation.</a> Current Protocols in Cell Biology. 72, (2016).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+lipid+droplets+from+multiple+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolating lipid droplets from multiple species.</a> Nature Protocols. 8 (1), 43-51 (2013).</li>
<li>Gao, Q., Goodman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lipid+droplet-a+well-connected+organelle%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The lipid droplet-a well-connected organelle.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 49(2015).</li>
<li>Correnti, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+and+C2+ceramide+activate+fatty+acid+oxidation+in+human+hepatoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Ethanol and C2 ceramide activate fatty acid oxidation in human hepatoma cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12923(2018).</li>
<li>Williams, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+ceramide+synthase+6+in+mouse+and+human+alcoholic+steatosis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">A novel role for ceramide synthase 6 in mouse and human alcoholic steatosis.</a> FASEB Journal. 32 (1), 130-142 (2018).</li>
<li>Carr, R. M., Ahima, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+lipid+droplet+proteins+in+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases.</a> Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).</li>
<li>Carr, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perilipin+Staining+Distinguishes+Between+Steatosis+and+Nonalcoholic%5BTitle%5D)+AND+%22Steatohepatitis+in+Adults+and+Children.+Clinical+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Perilipin Staining Distinguishes Between Steatosis and Nonalcoholic.</a> Steatohepatitis in Adults and Children. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 15 (1), 145-147 (2017).</li>
<li>Carr, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+TIP47+improves+hepatic+steatosis+and+glucose+homeostasis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Regulatory%2C+Integrative+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Reduction of TIP47 improves hepatic steatosis and glucose homeostasis in mice.</a> American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (8), R996-R1003 (2012).</li>
<li>Carr, R. M., Peralta, G., Yin, X., Ahima, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+perilipin+2+prevents+hepatic+steatosis%2C+glucose+intolerance+and+ceramide+accumulation+in+alcohol-fed+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Absence of perilipin 2 prevents hepatic steatosis, glucose intolerance and ceramide accumulation in alcohol-fed mice.</a> PLoS One. 9 (5), e97118(2014).</li>
<li>Tsai, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+constitutive+lipid+droplet+protein+PLIN2+regulates+autophagy+in+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">The constitutive lipid droplet protein PLIN2 regulates autophagy in liver.</a> Autophagy. 13 (7), 1130-1144 (2017).</li>
<li>Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122 (Pt 6), 749-752 (2009).</li>
<li>Liu, K., Czaja, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+lipid+stores+and+metabolism+by+lipophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Regulation of lipid stores and metabolism by lipophagy.</a> Cell Death and Differentiation. 20 (1), 3-11 (2013).</li>
<li>Mannik, J., Meyers, A., Dalhaimer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+cellular+lipid+droplets%3A+two+purification+techniques+starting+from+yeast+cells+and+human+placentas%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of cellular lipid droplets: two purification techniques starting from yeast cells and human placentas.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e509814(2014).</li>
<li>Sato, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+profiling+of+lipid+droplet+proteins+in+hepatoma+cell+lines+expressing+hepatitis+C+virus+core+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein.</a> Journal of Biochemistry. 139 (5), 921-930 (2006).</li>
<li>Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R. 3rd, McManaman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+reveal+a+link+between+the+endoplasmic+reticulum+and+lipid+secretory+mechanisms+in+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells.</a> Electrophoresis. 21 (16), 3470-3482 (2000).</li>
<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologically+and+Functionally+Distinct+Lipid+Droplet+Subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Morphologically and Functionally Distinct Lipid Droplet Subpopulations.</a> Scientific Reports. 6, 29539(2016).</li>
</ol>

Dr Carr otrzymuje wsparcie badawcze od Intercept Pharmaceuticals.

Biologia LD wątroby jest coraz częściej uznawana za krytyczny regulator fizjologii komórek wątrobowych zarówno w zdrowiu, jak i chorobie. Jako organelle działające w dobrej wierze, LD są dynamiczne, wchodzą w interakcje z innymi strukturami komórkowymi i zawierają w nich bioaktywne składniki biorące udział zarówno w homeostazie lipidów, jak i glukozy. Gradient sacharozy jest rutynowo stosowany do izolacji LD i umożliwia badaczom badanie struktury LD, ale wymaga od nich wykonania wielu. Wykazaliśmy, że zastosowanie dostęp...

LD to bioaktywne organelle występujące w cytozolu większości komórek eukariotycznych i niektórych komórkach prokariotycznych1,2,3. Rdzeń LD składa się z neutralnych lipidów, takich jak trójglicerydy (TG) i estry cholesterolu. Zawierają również ceramidy, bioaktywne lipidy biorące udział w komórkowych szlakach sygnałowych4,5. LD są otoczone monowarstwą fosfolipidową i pokryte białkami, w tym białkami perylipiny 2 (PLIN2) i 3 (PLIN3)1,5,6. Obecne są również enzymy lipogenne, lipazy i białka transportujące błonę, które zostały powiązane z kilkoma chorobami stłuszczeniowymi wątroby, w tym niealkoholową stłuszczeniową chorobą wątroby, alkoholową chorobą wątroby i wirusowym zapaleniem wątroby C3,5,6,7,8,9,10.
LDs są uważane za formowane z zewnętrznej błony ER i zawierają nowo zsyntetyzowane TG pochodzące z wolnych kwasów tłuszczowych pochodzących z ER11. Nie wiadomo jednak, czy zgromadzone lipidy pączkują, pozostają połączone, czy też są wycinane z klasy ER<sup="xref">6,11, co sprawia, że izolacja LD wolnych od ER jest technicznie trudna. Wolne kwasy tłuszczowe mogą być uwalniane z LD przez działanie lipaz powierzchniowych w celu zapewnienia produkcji energii lub syntezy błonowej. Dodatkowo, LD mogą być degradowane przez lipofagię jako mechanizm regulacyjny i do produkcji wolnych kwasów tłuszczowych12.
Oprócz ER i lizosomów, istnieją inne organelle - takie jak mitochondria, endosomy, peroksysomy i błona plazmatyczna - które znajdują się w ścisłym związku z LDs11. Ta ścisła poligamia utrudnia przeprowadzenie czystej ekstrakcji LD. Jednak wrodzoną niską gęstość neutralnych lipidów można wykorzystać poprzez wirowanie5.
Tradycyjnie, LD były izolowane za pomocą gradientu gęstości sacharozy1,5,13. Jednak metody te nie zostały zaprojektowane do izolowania innych organelli. Dodatkowo wymagają czasochłonnego przygotowania odczynników. Protokół ten dostosowuje dostępny na rynku zestaw izolacyjny ER (patrz Tabela materiałów), aby umożliwić izolację LD. Używamy bufora ekstrakcyjnego dostarczonego przez zestaw, dodając krok izolacji LD. Co więcej, protokół może być również stosowany do izolacji ER i lizosomów przy użyciu tych samych próbek, co pozwala na uzyskanie bardziej kompleksowego obrazu cyklu życia LD. Aby zwalidować tę nową metodę, oznaczamy wydajność, morfologię, wielkość i czystość LD. Przedstawione tutaj wyniki porównujemy z wynikami uzyskanymi za pomocą powszechnie stosowanego protokołu wykorzystującego gradient sacharozy do izolacji LD.
Użyliśmy 10- do 12-tygodniowej, 20-gramowej samicy myszy C57BL/6 na czczo przez 16 godzin (usuwanie pokarmu o 17:00 do 9:00 czasu izolacji LD) z wolnym dostępem do wody. Typowa wydajność dla TG wynosi 0,6 mg/g wątroby, a dla białka LD 0,25 mg/g wątroby. Zapewnia to wystarczającą ilość materiału na ~10 immunoblot przez SDS PAGE. Poniższy protokół wyszczególnia użyte odczynniki oraz protokół odpowiedni dla pojedynczej 1 g wątroby. Protokół izolacji gradientu sacharozy jest zaadaptowany z Sato14 i Wu15.

<table><tbody><tr><td>Mieszalnik wirowy BioExpress</td><td>GeneMate</td><td>S-3200-1</td><td>Wirówka mieszająca Vortex</td></tr><tr><td>54242 R</td><td>Eppendorf</td><td>54242 R</td><td>Mikrowirówka z chłodzeniem przeciwprądowym Wirnik: FA-45-24-11</td></tr><tr><td>Wirówka Sorvall RC6 +</td> <td>Thermo Scientific</td><td>RC6+</td><td>Wirówka szybkoobrotowa z chłodzeniem Wirnik: Wirówka F21S-8x50Y</td></tr><tr><td>Sorvall Legend RT+</td><td>Thermo Scientific</td><td>Legend RT+</td> <td>Chłodzona wirówka o dużej pojemności Wirnik: 75006445 Wiadro: 75006441</td></tr><tr><td>cOmplete Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>04 693 116 001</td><td>Tabletki inhibitora proteazy</td></tr><tr><td>Diagenode Bioruptur UCD-200</td><td>System</td><td>Sonication</td><td>UCD-200</td></tr><tr><td>Młynek do tkanek (45 ml)</td><td>Wheaton</td><td>357546</td><td>Użyj luźnego tłuczka</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco (1x)</td> <td>Corning</td><td>21-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji retikulum endoplazmatycznego</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ER0100</td><td>do zestawu ER Ekstrakcja: Zawiera: Bufor do ekstrakcji izotonicznej 5X 100 mL Bufor do ekstrakcji hipotonicznej 10 ml Chlorek wapnia, roztwór 2,5 M 5 ml OptiPrep Gradient Medium 100 mL Igła z noskiem 1 szt.</td></tr><tr><td>Zewnętrzne źródło światła do wzbudzenia fluorescencyjnego</td><td>Leica</td><td>Leica EL6000</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1758</td><td>Kwas solny</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Oprogramowanie do analizy obrazu</td></tr><tr><td>Odwrócony modulowany mikroskop kontrastowy</td><td>Leica</td><td>DM IRB</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do wzbogacania lizosomów do tkanek i hodowanych komórek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89839</td><td>Do kamery mikroskopu do izolacji lizosomów</td></tr><tr><td></td><td>Qimaging</td><td>QICAM fast 1394</td><td></td></tr><tr><td>Optima XL-100K Ultrawirówka</td><td>Beckman-Coulter</td><td>XL-100K</td><td>Ultrawirówka Wirnik: SW41Ti</td></tr><tr><td>Pipety Pasteura</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-042817</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego 5 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>04 906 845 001</td><td>Tabletki hamujące fosfatazę</td></tr><tr><td>Sterylne ostrze chirurgiczne #10</td><td>Pioneer</td><td>S2646</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-500</td><td>Krystaliczny/certyfikowany</td></tr><tr><td>zestaw do triglicerydów ACS Liquicolor</td><td>Stanbio&nbsp;</td><td>2200-225</td><td>Zestaw triglicerydów kolorymetrycznych</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>Do buforu TE</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP151-100</td><td>5%, Eter p-(1,1,3,3-tetrametylobutylo)-fenylowy glikolu polietylenowego, Odczynnik do lizy białek</td></tr><tr><td>UltraPure EDTA (0,5 M, pH 8,0)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575-038</td><td>Do buforu TE</td></tr></tbody></table>

protokół szybkiej izolacji kropelek lipidów przy użyciu dobrze znanego zestawu do izolacji organelli

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

Kropelki lipidów (LD) to bioaktywne organelle znajdujące się w cytozolu najbardziej eukariotycznych i niektórych komórek prokariotycznych. LD składają się z obojętnych lipidów otoczonych monowarstwą fosfolipidów i białek. Lipidy LD w wątrobie, takie jak ceramidy i białka, są zaangażowane w kilka chorób, które powodują stłuszczenie wątroby. Chociaż poprzednie metody izolacji LD zostały ustalone, wymagają one czasochłonnego przygotowania odczynników i nie są przeznaczone do izolacji wielu kompartmentów subkomórkowych. Staraliśmy się ustalić nowy protokół, który umożliwiłby izolację LD, retikulum endoplazmatycznego (ER) i lizosomów z pojedynczej wątroby myszy.
Ponadto, wszystkie odczynniki używane w przedstawionym tutaj protokole są dostępne na rynku i wymagają minimalnego przygotowania odczynnika bez poświęcania czystości LD. Poniżej przedstawiamy dane porównujące ten nowy protokół ze standardowym protokołem gradientu sacharozy, wykazując porównywalną czystość, morfologię i wydajność. Dodatkowo możemy wyizolować ER i lizosomy przy użyciu tej samej próbki, zapewniając szczegółowy wgląd w tworzenie i przepływ wewnątrzkomórkowy lipidów i powiązanych z nimi białek.

Przeprowadziliśmy izolację LD przy użyciu zestawu ER u około 30 myszy i porównaliśmy wyniki z wynikami uzyskanymi po zastosowaniu protokołu izolacji sacharozą u około 40 myszy. Przedstawione odkrycia są typowe dla obu protokołów. Myszy pozostawiono na czczo przez noc, zapewniając swobodny dostęp do wody, aby zwiększyć wydajność LD. Izolację LD z wykorzystaniem gradientu sacharozy przeprowadzono równolegle z protokołem izolacji LD za pomocą zestawu ER. W trakcie protokołu izolacji LD za po...

Ten protokół ustanawia nowatorską metodę izolacji i oczyszczania kropelek lipidów z wątroby myszy, przy użyciu dobrze znanego zestawu do izolacji retikulum endoplazmatycznego.

Protokół szybkiej izolacji kropelek lipidów przy użyciu dobrze znanego zestawu do izolacji organelli

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...

Badania nad biologią kropelek lipidów były utrudnione ze względu na trudności w oczyszczaniu. Ponadto badanie komórkowego strumienia lipidów wymaga jednoczesnego oczyszczania wielu organelli, a obecnie nie są dostępne żadne proste protokoły. Główną zaletą tej techniki jest ułatwienie oczyszczania kropelek lipidów.Zmodyfikowaliśmy dostępny na rynku zestaw, aby jednocześnie izolować kropelki lipidów, retikulum endoplazmatyczne i lizosomy z jednej próbki. Nagromadzenie lipidów w wątrobie w kropelkach predysponuje pacjentów otyłych i alkoholików do postępującej choroby wątroby. To przesunęło pogląd kropelek lipidów z obojętnych przedziałów magazynowych na dynamiczne biologicznie ważne organelle.Na początek użyj sterylnych kleszczy i nożyczek preparacyjnych, aby przeciąć warstwę skóry i mięśni brzucha uśpionej myszy na osi tylno-przedniej, odsłaniając wątrobę. Przetnij więzadła łączące wątrobę z jelitem. Za pomocą kleszczy odciągnij jelito od wątroby w kierunku tylnej.Przeciąć więzadło łączące wątrobę z przeponą. Następnie przeciąć między wątrobą a grzbietową klatką piersiową, przesuwając się od przodu do tyłu, aż wątroba zostanie uwolniona. Przenieś wątrobę na zimną pięciocentymetrową szalkę Petriego z 10 mililitrami zimnego 1x PBS i umyj wątrobę dwukrotnie na platformie bujanej w 10 mililitrach zimnej 1x PBS przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza.Po ostatnim umyciu odlej 1x PBS i użyj sterylnego ostrza chirurgicznego w rozmiarze 10, aby pokroić wątrobę w kostkę na kawałki o wielkości od trzech do pięciu milimetrów w naczyniu. Następnie umyj pokrojoną w kostkę wątrobę dwa razy 10 mililitrami zimnego 1x PBS przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zdekantuj 1x PBS i przenieś pokrojone w kostkę kawałki wątroby do zimnego 45-mililitrowego homogenizatora Dounce, upewniając się, że wszystkie kawałki znajdują się na dnie.Dodaj siedem mililitrów zimnego buforu 1x IE. Homogenizuj na lodzie, przesuwając tłuczek w górę iw dół 20 razy, upewniając się, że tłuczek opada na dno homogenizatora podczas każdego pociągnięcia. Przenieść homogenat do zimnej 15-mililitrowej probówki wirówkowej.Przepłukać homogenizator jednym mililitrem zimnego buforu 1x IE i dodać go do reszty homogenatu. Aby usunąć jądra, odwirować homogenat w wirówce o dużej pojemności w temperaturze 1 000 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Upewnij się, że wszelkie lipidy zebrane w górnej części 15-mililitrowej probówki są ponownie zawieszone, aby zapobiec utracie LD.Upewniając się, że osad jądrowy na dnie probówki nie jest zakłócony, przenieś pojądrowy supernatant zawierający lipidy do świeżej zimnej 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Przenieść 100-mikrolitrową porcję postjądrowego supernatantu do zimnej 1,7-mililitrowej probówki wirówkowej na lodzie w celu późniejszej analizy czystości. Aby usunąć mitochondria, odwirować postjądrową próbkę supernatantu w chłodzonej wirówce szybkoobrotowej o stężeniu 12 000 g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Upewnij się, że lipid zebrany w górnej części probówki jest ponownie zawieszony, aby zapobiec utracie LD, a następnie przenieś supernatant pomitochondrialny do 13-mililitrowej probówki ultrawirówkowej. Przenieś 100-mikrolitrową podwielokrotność post-mitochondrialnego supernatantu do zimnej 1,7-mililitrowej probówki mikrowirówkowej na lodzie w celu późniejszej analizy czystości. Napełnij probówkę ultrawirówki supernatantem postmitochondrialnym po brzegi zimnym buforem 1x IE, aby zapobiec jego zapadnięciu się podczas ultrawirowania.Zrównoważyć próbki, a następnie odwirować w ultrawirówce pod ciśnieniem 100 000 g przez 60 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby usunąć warstwę LD, przechyl probówkę pod kątem 45 stopni i zassaj szklaną pipetą. Po przeniesieniu osadu do zimnej 1,7-mililitrowej probówki mikrowirówkowej, należy zebrać 100 mikrolitrów supernatantu post-ER pod warstwą lipidową w celu analizy czystości.Aby osadzać jakiekolwiek resztki komórek, odwiruj w mikrowirówce z maksymalną prędkością przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie delikatnie ogrzej probówkę rękami, aby pomóc w ponownym zawieszeniu warstwy LD i przenieś supernatant, w tym warstwę lipidową, do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,7 mililitra. Powtórz te kroki mycia, podgrzewając rurkę dwa do trzech razy, aż granulka przestanie być widoczna.Następnie, aby przepłukać supernatant LD bez granulek, dodaj 1x PBS do końcowej objętości 1,5 mililitra i odwiruj w mikrowirówce z maksymalną prędkością przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza. Użyj szklanej pipety, aby usunąć jeden mililitr 1x PBS, który znajduje się pod warstwą lipidową, bez naruszania warstwy lipidowej. Powtórz mycie LD cztery do pięciu razy, aż 1x PBS stanie się wizualnie przezroczysty bez zmętnienia.Następnie użyj szklanej pipety, aby usunąć cały 1x PBS poniżej warstwy lipidowej i użyj uzyskanej czystej frakcji LD do dalszej analizy. Kiedy reprezentatywne 20-krotne obrazy fluorescencyjne i LD w jasnym polu zostały wykonane zarówno z metody izolacji LD zestawu ER, jak i sacharozy LD, ujawniły one podobne poziomy cząstek stałych, co sugeruje podobną czystość przy użyciu dwóch różnych protokołów. Po oczyszczeniu poziomy trójglicerydów LD i białek mierzono za pomocą testów kolorymetrycznych, a dane znormalizowano do masy wątroby, pokazując, że gdy materiał wyjściowy został znormalizowany, wydajność trójglicerydów LD i białka była podobna przy użyciu zestawu ER i metody sacharozy.Średnice LD określono ilościowo za pomocą oprogramowania do analizy obrazu, wykazując, że izolacja LD zestawu ER i izolacja LD sacharozy dały LD o podobnych rozmiarach. Aby ocenić czystość LD, próbki oznaczono metodą immunoblottingu, wykazując, że LD pochodzące z izolacji LD zestawu ER i protokołu gradientu sacharozy miały jednakową czystość. PLIN2, marker LD, wykryto we wszystkich próbkach z wyjątkiem izolacji LD zestawu ER PER i PNS sacharozy.Analiza czystości frakcji ER przy użyciu immunoblot pokazuje, że były one wolne od markera LD PLIN2, ale miały znaczne poziomy białka ER SEC61A. Oceniono również czystość frakcji lizosomalnej po dalszym oczyszczaniu lizosomów za pomocą zestawu do wzbogacania lizosomów. Discovery jest obecnie najbardziej użyteczną aplikacją naszego protokołu.Przeprowadziliśmy lipidomikę w oczyszczonych organellach i wykazaliśmy, że lipotoksyny są zwiększone szczególnie w kropelkach lipidów w alkoholowej chorobie wątroby.

rapid-lipid-droplet-isolation-protocol-using-well-established

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film demonstruje technikę wizualizacji powstawania synapsy immunologicznej w komórkach NK na podpartej dwuwarstwie lipidowej (SLB). SLB jest najpierw znakowany ligandem receptora aktywującego komórki NK znakowanym fluoroforem, a następnie inkubacją z komórkami NK. Następnie komórki są barwione pod kątem spolimeryzowanych granulek litycznych aktyny i perforyno-dodatniej. Takie podejście umożliwia wizualizację powstawania synaps za pomocą mikroskopii wymuszonego zubożenia emisji (STED).

Obrazowanie w superrozdzielczości tworzenia synaps immunologicznych komórek NK na podpartej dwuwarstwie lipidowej

Przekształcanie funkcjonalnych białek błonowych w gigantyczne liposomy o określonym składzie jest potężnym podejściem w połączeniu z elektrofizjologią patch-clamp. Jednak konwencjonalna produkcja gigantycznych liposomów może być niezgodna ze stabilnością białka.  Opisujemy protokoły wytwarzania gigantycznych liposomów z czystych lipidów lub małych liposomów zawierających kanały jonowe.

Preparat liposomów olbrzymich do obrazowania i elektrofizjologii patch-clamp

Przedstawiono dwie techniki izolowania kropelek lipidów komórkowych z 1) komórek drożdży i 2) ludzkich łożysk. Centralnym elementem obu procedur jest wirowanie w gradionym gradimencie gęstości, w którym powstałą pływającą warstwę zawierającą kropelki można łatwo zwizualizować za pomocą oka, wyekstrahować i określić ilościowo za pomocą analizy Western Blot w celu uzyskania czystości.

Izolacja kropelek lipidów komórkowych: dwie techniki oczyszczania, zaczynając od komórek drożdży i ludzkich łożysk

MikroRNA odgrywają ważną rolę regulacyjną i stają się nowymi celami terapeutycznymi dla różnych chorób ludzkich. Wykazano, że miRNA są przenoszone w lipoproteinach o dużej gęstości. Opracowaliśmy uproszczoną metodę szybkiego izolowania oczyszczonego HDL nadającego się do analizy miRNA z ludzkiego osocza.

Szybka i uproszczona metoda wysokoprzepustowej izolacji miRNA z wysoko oczyszczonej lipoproteiny o wysokiej gęstości

Tutaj prezentujemy protokół do wykrywania pojedynczych, zapośredniczonych przez SNARE zdarzeń fuzji między liposomami a wspieranymi dwuwarstwami w kanałach mikroprzepływowych za pomocą spolaryzowanego TIRFM, z czułością pojedynczej cząsteczki i rozdzielczością czasową ~15 ms. Uwalnianie lipidów i rozpuszczalnego ładunku może być wykrywane jednocześnie. Mierzy się wielkość liposomów, dyfuzyjność lipidów i właściwości porów fuzyjnych.

Fuzja pojedynczych proteoliposomów za pośrednictwem SNARE z dwuwarstwami na uwięzi w mikroprzepływowej komórce przepływowej monitorowanej za pomocą spolaryzowanej mikroskopii TIRF

Ten protokół opisuje izolację i kwantyfikację małych RNA lipoprotein o dużej gęstości.

Izolacja lipoprotein o dużej gęstości do niekodującej kwantyfikacji małego RNA

Kropelki lipidów są ważnymi organellami do replikacji kilku patogenów, w tym wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV). Opisujemy metodę izolowania kropelek lipidów do ilościowej spektrometrii mas powiązanych białek; Może być stosowany w różnych warunkach, takich jak infekcja wirusowa, stres środowiskowy lub leczenie farmakologiczne.

Izolacja kropelek lipidów do ilościowej analizy spektrometrii mas

Przedstawiono szybki i skuteczny protokół izolacji kropelek lipidów plastoglobul związanych z różnymi organizmami fotosyntetycznymi. Pomyślne przygotowanie wyizolowanych plastoglobul jest kluczowym pierwszym krokiem, który poprzedza szczegółowe badania molekularne, takie jak analizy proteomiczne i lipidomiczne.

Izolacja kropelek lipidów plastoglobuli z tkanki liści roślin i cyjanobakterii

Przedstawiamy protokół do odtwarzania białek błonowych i enkapsulacji enzymów oraz innych rozpuszczalnych w wodzie składników w pęcherzykach lipidowych o rozmiarach sub-mikrometrowych i mikrometrowych.

Budowa nierównowagowych sieci metabolicznych w pęcherzykach o rozmiarach nano- i mikrometrowych

Lipofagia to selektywna forma autofagii, która polega na degradacji kropelek lipidów. Dysfunkcje w tym procesie są związane z rozwojem nowotworów. Jednak dokładne mechanizmy nie są jeszcze w pełni poznane. Protokół ten opisuje ilościowe podejścia do obrazowania, aby lepiej zrozumieć wzajemne zależności między autofagią, metabolizmem lipidów i progresją raka.

Badanie regulacji katabolizmu kropelek lipidów poprzez lipofagię

Poznaj szybką izolację kropelek lipidów z wątroby myszy przy użyciu zmodyfikowanego zestawu do izolacji retikulum endoplazmatycznego. Ta metoda umożliwia jednoczesne oczyszczanie wielu organelli i ułatwia badania biologii lipidów.

Protokół szybkiej izolacji kropelek lipidów przy użyciu dobrze znanego zestawu do izolacji organelli

Przeglądaj więcej filmów