Izolacja kropelek lipidów komórkowych: dwie techniki oczyszczania, zaczynając od komórek drożdży i ludzkich łożysk

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie kropli lipidowych z tkanki. Jest to realizowane poprzez wstępne wycięcie i odseparowanie tkanki łożyska. Następnie homogenizuje się komórki oleiny.

Następnie organelle są rozdzielane w kilku etapach wirowania. Na koniec zbiera się warstwę pływającą zawierającą kropelki lipidowe, a następnie przeprowadza się ich charakterystykę. Ostatecznie, w celu wykazania czystości frakcji kropelek lipidowych, stosuje się mikroskopię fluorescencyjną oraz analizę western blot.

Główną zaletą tej techniki jest możliwość izolacji kropel lipidowych z większości komórek aorty. Należy zauważyć, że w niektórych tkankach liczba kropelek może być mniejsza, co zmniejsza warstwę pływającą G oraz liczbę kropelek. Łożyska pobrano od zdrowych kobiet z ciążami pojedynczymi, poddanych planowemu cięciu cesarskiemu przed wystąpieniem samoistnych bólów porodowych w terminie; badane wyraziły pisemną świadomą zgodę na pobranie łożyska.

Pobieranie i późniejsze wykorzystanie łożysk zostało przeprowadzone za zgodą Uniwersytetu Tennessee oraz Szkoły Medycznej dla Studentów Studiów Podyplomowych Uniwersytetu Tennessee w Knoxville. W komorze z laminarnym przepływem powietrza, wewnątrz dygestorium biologicznego, przenieść łożysko do sterylnego pojemnika autoklawowalnego i ostrożnie wypłukać krew z łożyska oraz błon, używając sterylnej soli fizjologicznej. Zużyta sól fizjologiczna z krwią powinna zostać wylana do zlewki o pojemności jednego litra jako ciekły odpad biologiczny.

Umieść łożysko na sterylnym polu, tak aby gładka powierzchnia z pępowiną była skierowana do góry; użyj do tego ostrych nożyczek z cienką końcówką oraz pęsety. Usuń pępowinę i błony płodowe. Następnie odwróć łożysko tak, aby powierzchnia maciczna była skierowana do góry.

Następnie usuń nadległą tkankę płytki podstawnej na głębokość około trzech milimetrów od powierzchni. Przeprowadź sekcję każdego naczynia prowadzącego COTA po kolei, unikając płytki kosmowej, i zbierz tkankę kosmkową do zlewki o pojemności 250 ml z solą fizjologiczną. Następnie użyj 0,9% sterylnej soli fizjologicznej i pincety, aby kilkakrotnie wypłukać tkankę w osobnej zlewce, obracając ją, wykorzystując zlewkę o pojemności jednego litra na odpady płynne.

Przenosić po jednym leadingu dorsalnym dorsalnemu kodzioru do szalki Petriego o średnicy 150 mm. Przytrzymać pęsetą i za pomocą żyletki zeskrobać tkankę z naczyń na szalkę Petriego. Umieścić zeskrobaną tkankę w oddzielnym zlewce zawierającej 0,9% sterylną sól fizjologiczną.

Powtórz czynność dla wszystkich fragmentów tkanki. Po wypłukaniu zeskrobionej tkanki w buforze do dysocjacji komórek, odlej nadmiar cieczy i zważ tkankę łożyskową w celu przeprowadzenia trawienia. Po przygotowaniu mieszaniny do trawienia tkanki, podziel materiał, przenosząc 60 g z całkowitej zebranej tkanki do sterylnej kolby Helen Meyer o pojemności 500 ml.

Dodać mieszaninę do trawienia tkanek do kolby zawierającej tkankę i inkubować w temperaturze 37 °C w wytrząsarce przez 45 minut. Przy 150 RPM zebrać dysocjowane komórki po inkubacji, przechylając kolbę, aby tkanka osiadła. Zebrać nadsącz.

Należy uważać, aby nie zbierać tkanek niedysocjowanych. Do supernatantu należy dodać równą ilość HBSS przed przeniesieniem go do sterylnych probówek wirówek o pojemności 15 mililitrów. Procedurę dysocjacji i zbierania supernatantu należy powtórzyć dla pozostałych części tkanek powiązanych z UND w każdej partii, po wirowaniu przy 1000 ×g.

Odstawić do sedymentacji grawitacyjnej przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie odessać supernatant, nie naruszając osadu. Komórki kosmków bliźniakowych znajdują się głównie w białej części osadu, znajdującej się nad erytrocytami. Przenieść komórki kosmków z białej części osadu do sterylnej, 50 mililitrowej stożkowej probówki do wirowania i przechowywać w lodzie.

Po zebraniu komórek ze wszystkich trzech etapów trawienia, należy przefiltrować zawiesinę, używając nylonowego sitka do komórek o oczkach 100 µm umieszczonego w górnej części sterylnej stożkowatej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Jeśli filtracja zawiesiny komórkowej zwolni, należy lekko unieść filtr, aby stworzyć podciśnienie w probówce, a następnie wirować w temperaturze 4 °C przy 1000 ×g przez 10 minut. Ostrożnie usunąć nadsącz, nie naruszając osadu, aby przeprowadzić homogenizację komórek kosmków błonowych w komorze z laminarnym przepływem powietrza, używając świeżo przygotowanego hipotonicznego medium do lizy (HLM); do komórek należy dodać HLM w ilości czterokrotnie przekraczającej objętość osadu komórkowego, schłodzone w lodzie.

Użyj pipety o pojemności 10 ml, aby delikatnie i dokładnie resuspendować komórki, zasysając i wypuszczając je kilkakrotnie. Po inkubowaniu komórek na lodzie przez 10 minut, przenieś je do schłodzonego homogenizatora i powoli homogenizuj komórki za pomocą luźno dopasowanego tłoka, wykonując od 20 do 25 delikatnych ruchów.

Wirować lizat z prędkością 3000 ×g w temperaturze 4 °C przez 10 minut, aby usunąć niezniszczone komórki. Następnie zebrać nadosad do nowej probówki i ponownie wirować z prędkością 25 000 ×g w temperaturze 4 °C przez 20 minut. Aby usunąć mitochondria i wyizolować krople lipidowe metodą ultrawirowania, zebrać nadosad do probówki wirówkowej o pojemności 50 mL.

Dostosuj stężenie do 20% sacharozy i przenieś do dna probówki do ultrawirówki przeznaczonej do rotora S SW 28 lub odpowiednika; przykryj supernatant o dostosowanej gęstości około 10 mililitrami lodowatego buforu węglanu sodu 100 milimol i od 0,5 do 1 mililitra lodowatego HLM, aby wypełnić probówkę. Następnie wiruj w centryfudze z rotorem z koszykami S SW 28 przy 130 000 ×g i temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 45 minut. Zbierz warstwę pływającą, dostosuj stężenie do 10% sacharozy i przenieś ją do dna probówki do ultrawirówki o pojemności 13,2 mililitra przeznaczonej do rotora SW 41 TI lub odpowiednika; przykryj supernatant o dostosowanej gęstości około pięcioma mililitrami lodowatego buforu węglanu sodu 100 milimol i 0,5 mililitra lodowatego HLM. Po wirowaniu przy 274 000 ×g i temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 60 minut, użyj pipety o pojemności jednego mililitra, aby ostrożnie zebrać górną warstwę pływającą zawierającą krople lipidowe w rotorze SW 41 TI.

Dostosuj objętość do 10% sacharozy i ponownie przenieś do probówki do ultrawirówki o pojemności 13,2 ml, a następnie przykryj pięcioma mililitrami lodowatego buforu węglanu sodu 100 mM oraz 0,5 mililitra lodowatego HLM. Po wirowaniu przez 30 minut, używając zagiętej pipety PE, ostrożnie zbierz górną, białą warstwę pływającą zawierającą kropelki lipidowe do trzech probówek o pojemności 1,5 ml zawierających 100 µl HLM. Scharakteryzuj kropelki lipidowe zgodnie z protokołem tekstowym przedstawionym na tej figurze; obecność kropelek lipidowych wyizolowanych z ludzkich komórek kosmków łożyskowych potwierdzono poprzez barwienie specyficznym dla lipidów neutralnych barwnikiem fluorescencyjnym boda P 4 93 5 0 3 i wizualizację za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Przedstawiono tutaj ocenę czystości wyizolowanych frakcji kropel lipidowych za pomocą techniki western blotting z użyciem białek markerowych dla kropel lipidowych, w tym perilipiny 2, kalneksyny dla ER, markera aparatu Golgiego GM130, COX IV dla mitochondriów oraz MEK1 dla błony plazmatycznej. Po delirpidacji kropel lipidowych zimnym acetonem wyekstrahowano białka. Frakcje poddano analizie western blotting w kierunku perilipiny.

Po drugie, białko kropli lipidowych wykryto w nadosadzie ponuklearnym oraz w wyizolowanej białej warstwie pływającej zawierającej krople lipidowe. Białek specyficznych dla błon komórkowych, takich jak MK 1 i GM 130, nie wykryto w frakcjach kropli lipidowych w żadnej z warstw pod warstwą pływającą dla wirowania 4 i 5. Jak zgłoszono wcześniej, białko kalneksyna oraz słabe barwienie białka błony mitochondrialnej CO X IV zostały wykryte w innych miejscach w frakcji kropli lipidowych.

Wyniki te są zgodne z wcześniejszymi doniesieniami wskazującymi, że krople lipidowe oddziałują z mitochondriami w komórkach ssaków oraz z siateczką endoplazmatyczną. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak analiza proteomiczna i lipidomiczna, aby zbadać dodatkowe kwestie, na przykład to, jakie czynniki są związane z kroplami.