Name: Izolacja kropelek lipidów komórkowych: dwie techniki oczyszczania, zaczynając od komórek drożdży i ludzkich łożysk (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Poznaj izolację kropelek lipidów z komórek drożdży i łożysk ludzkich przy użyciu ultrawirowania z gradientem gęstości. Metoda ta pozwala badać skład i funkcję organelli lipidowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez American Heart Association award 13SDG14500046 dla P.D., Nagrodę Centrum Edukacji i Badań nad Zrównoważoną Energią (Univ. of Tennessee) dla P.D., oraz przez Physicians' Medical Education and Research Foundation (Univ. of Tennessee) nagrodę dla J.M. Autorzy dziękują Caroline Leplante (Yale Univ.) za protokół przekształcania drożdży rozszczepieniowych w sferoplasty; Eric T. Boder (Univ. of Tennessee) za korzystanie z jego inkubatorów do wytrząsania, wirówki stołowej i sprzętu do analizy Western Blot; oraz Center for Environmental Biotechnology (Univ. Tennessee) za korzystanie z ich ultra-wirówki; Günther Daum dla przeciwciał drożdżowych (Uniwersytet Techniczny w Grazu, Austria); personelowi Oddziału Położnictwa i Ginekologii (Univ. Tennessee Medical Center) w celu uzyskania pomocy technicznej.

1. Izolowanie kropelek lipidów z komórek drożdży (rozszczepienia)
Izolacja kropelek z popularnego organizmu modelowego, pączkującego drożdży Saccharomyces cerevisiae, jest prawie identyczna z następującym protokołem6. Odnotowuje się różnice w przygotowaniach.
1. Hodowla komórek drożdży
<ol>
	<li>Przygotuj nośnik. Połączyć 36 g proszku YE5S na litr dH2O w szklanych butelkach lub kolbach hodowlanych. Potrzebne będzie około 2 L pożywki. Autoklawować pożywkę w temperaturze 121 °C przez 20 min. Poczekaj, aż nośnik ostygnie do temperatury pokojowej. Dla S. cerevisiae zastąp YE5S przez YPD.</li>
	<li>Umieścić 10-20 ml schłodzonej pożywki YE5S w kolbie hodowlanej o pojemności 250 ml przy użyciu sterylnych technik. Zaszczepić pożywkę niewielką ilością komórek drożdży z płytki agarowej za pomocą sterylnego drewnianego patyczka lub jego odpowiednika. Pozwól komórkom urosnąć do pożądanej gęstości optycznej w temperaturze 30 °C. Zmierzyć gęstość optyczną przy długości fali 595 nm za pomocą spektrofotometru.</li>
	<li>Umieścić pozostałą pożywkę w kolbach o pojemności 2,8 l. Stosować nie więcej niż 1 l pożywki na kolbę o pojemności 2,8 l, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie podczas wzrostu komórek w inkubatorze z wytrząsaniem. Ostateczna wydajność mokrych komórek powinna wynosić około 10 g, aby móc uzyskać wystarczającą ilość kropelek lipidów do analizy proteomicznej i lipidomicznej.</li>
	<li>Wprowadzić komórki z kroku 1.2 do kolb o pojemności 2,8 l, z których każda zawiera 1 l pożywki, które zostały przygotowane w kroku 1.1.</li>
	<li>Wyhodować komórki do pożądanej gęstości w temperaturze 30 °C.</li>
	<li>Upewnij się, że komórki mają kropelki lipidów. Zachowaj 1 ml komórek. Zmierzyć gęstość optyczną (Øn) próbki. Do próbki dodać 0,1 ml 100 mM zapasu BODIPY 493/503 w etanolu na średnicę zewnętrzną komórek. Umieścić 3 μl próbki między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym. Wizualizacja pod mikroskopem fluorescencyjnym z filtrem GFP (rysunek 1A).</li>
	<li>Osadzać komórki z kroku 1.5 w temperaturze 4 °C przy 3 800 x g przez 10 minut. Pracować partiami w zależności od pojemności probówek wirówkowych.</li>
	<li>Odlej pożywkę YE5S i umyj ogniwa buforem EMM + 600 mM sorbitolu. Sorbitol zapewnia wsparcie osmotyczne.</li>
	<li>Przenieść komórki do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i granulować komórki w temperaturze 4 °C przy 2 000 x g przez 10 minut. Usunąć supernatant. Zważ mokre komórki. Zawiesić komórki w 2 ml (EMM + 600 mM sorbitolu) buforu na gram komórek.</li>
</ol>
2. Przekształcanie komórek drożdży w sferoplasty i późniejsza liza
<ol>
	<li>Dodać po 5 mg 1) enzymu litycznego drożdży i 2) enzymów lizy drożdży z Trichoderma harzianum na gram mokrych komórek, które zważono w kroku 1.9. W przypadku S. cerevisiae należy wzmocnić te enzymy taką samą ilością Zymolyase.</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 30 °C pod delikatnym wstrząsaniem z prędkością 100 obr./min przez 60 minut.</li>
	<li>Sprawdź, czy sferoplasty mają kropelki lipidów. Powtarzając krok 1.6 (Rysunek 1B).</li>
</ol>
3. Wirowanie w gradiencie gęstości
<ol>
	<li>Sferoplasty osadzać przez odwirowanie w temperaturze 4 °C przy 2 000 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą plastikowej pipety transferowej.</li>
	<li>Delikatnie zawieś granulowane sferoplasty za pomocą lodowatego 10 mM Tris-HCl, 600 mM sorbitolu i 200 μM EDTA. Należy pamiętać, że sferoplasty są bardzo delikatne.</li>
	<li>Ponownie otocz sferoplasty, używając tych samych ustawień, co w kroku 3.1. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić sferoplasty za pomocą plastikowej pipety transferowej w 12% Ficoll, 10 mM Tris-HCl i 200 μM EDTA w stężeniu 2 ml/g-komórek.</li>
	<li>Przenieś zawieszone sferoplasty do szklanego homogenizatora i delikatnie homogenizuj na lodzie, 20-30 ruchów, za pomocą luźno dopasowanego tłuczka szklanego homogenizatora.</li>
	<li>Przenieść zlizowane sferoplasty do probówek wirówkowych i nałożyć na tę samą objętość 12% Ficoll, 10 mM Tris-HCl i 200 μM buforu EDTA. Wybierz liczbę probówek wirówkowych, których chcesz użyć, tak aby każda probówka była wypełniona w około dwóch trzecich.</li>
	<li>Wirować w temperaturze 4 °C przy 100 000 x g przez 1,5 godziny w wirniku SW28 lub równoważnym. Pozwól, aby wirnik wybiegł do zatrzymania (opóźnienie wirnika = 0).</li>
	<li>Delikatnie przenieść górną pływającą białą warstwę (rysunek 2A), która zawiera kropelki, do nowej probówki wirówkowej za pomocą pipetora lub wygiętej pipety Pasteura. Dodaj do próbki wystarczającą objętość 12% Ficollu, 10 mM Tris-HCl i 200 μM buforu EDTA, aby wypełniła około jednej trzeciej probówki wirówkowej.</li>
	<li>Dodać równoważną objętość 8% Ficollu, 10 mM buforu Tris-HCl i 200 μM EDTA do górnej części próbki (próbek) w nowej probówce wirówkowej. Po dodaniu tego buforu probówki powinny być wypełnione w około dwóch trzecich.</li>
	<li>Wirować w temperaturze 4 °C przy 100 000 x g przez 1 godzinę w wirniku SW28 lub równoważnym. Pozwól, aby wirnik wybiegł do zatrzymania (opóźnienie wirnika = 0).</li>
	<li>Delikatnie przenieść górną pływającą białą warstwę (Rysunek 2B), która będzie zawierać kropelki, do nowej probówki wirówkowej za pomocą pipetora lub wygiętej pipety Pasteura. Dodać 600 mM sorbitolu, 8% Ficoll, 10 mM Tris-HCl i 200 μM buforu EDTA do próbki, tak aby wypełniła około jednej trzeciej probówki wirówkowej.</li>
	<li>Dodać równoważną objętość 250 mM sorbitolu, 10 mM Tris-HCl i 200 μM buforu EDTA do górnej części próbki (próbek) w nowej probówce wirówkowej. Po dodaniu tego buforu probówki powinny być wypełnione w około dwóch trzecich.</li>
	<li>Wirować w temperaturze 4 °C przy 100 000 x g przez 1 godzinę w wirniku SW28 lub równoważnym. Pozwól, aby wirnik wybiegł do zatrzymania (opóźnienie wirnika = 0).</li>
	<li>Przenieś górną białą warstwę (ryc. 2C), która powinna zawierać tylko kropelki lipidów i związane białka, do rurki dializacyjnej i dializuj O/N do 10 mM buforu Tris-HCl i 200 μM EDTA w celu wyeliminowania Ficollu.</li>
</ol>
2. Izolowanie kropelek lipidów z ludzkich komórek kosmków łożyskowych
Łożyska pobrano od zdrowych kobiet z ciążą pojedynczą, które przeszły planowy poród przez cesarskie cięcie przed rozpoczęciem spontanicznego porodu w terminie. Badani wyrazili pisemną, świadomą zgodę na pobranie łożyska. Pobranie, a następnie wykorzystanie łożysk zostało przeprowadzone za zgodą University of Tennessee i University of Tennessee Graduate School of Medicine w Knoxville Institutional Review Board (odpowiednio #8757B i #3338).
1. Izolowanie ludzkich komórek kosmków łożyskowych
Część 1 protokołu jest modyfikacją wcześniej opublikowanego protokołu przez Petroffa i wsp.26
Przygotuj następujące rozwiązania:
<ul>
	<li>NaCl (1 l): rozpuścić 9 g NaCl (M 58,4 g/mol) w dH2O, aby otrzymać 1 l roztworu. Sterylizacja filtra (membrana 0,2 μm).</li>
	<li>10x zbilansowany roztwór soli Hanka (10x HBSS) (1 l): 4 g KCl (M 74,5 g/mol); 0,6 g KH2PO4 (M 136,086 g/mol); 80 g NaCl (M 58,44 g/mol); Na2HPO4 (M 141,96 g/mol); 10 g D-glukozy (M 180,16 g/mol). Rozpuścić każdy ze składników w dH2O, aby otrzymać 1 l roztworu. Sterylizacja filtra (membrana 0,2 μm).</li>
	<li>Bufor do wytrawiania enzymatycznego (0,6 ml): połączyć 70 ml 10x HBSS z 3,3 ml 7,5% wodorowęglanu Na, 17,5 ml 1 M HEPES i 266,1 ml dH2O; sterylizować filtrem (membrana 0,2 μm). Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>DNaza I: tuż przed użyciem dodać 5 ml sterylnego 0,9% NaCl do fiolki z DNazą. Przechowywać na lodzie do czasu użycia lub przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
</ul>
<ol>
	<li>Przygotowanie łożyska do rozwarstwienia
	<ol>
		<li>Pozyskaj ludzkie łożysko i przetwórz je jak najbliżej czasu porodu. Do transportu łożyska należy użyć szczelnego naczynia, takiego jak lodówka. Zawsze należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z ludzkimi materiałami biologicznymi.</li>
		<li>W kapturze bezpieczeństwa biologicznego przenieś łożysko do sterylnego pojemnika nadającego się do sterylizacji w autoklawie i ostrożnie zmyj krew z łożyska i błon za pomocą sterylnego 0,9% roztworu NaCl (soli fizjologicznej). Wylać krwawą sól fizjologiczną do zlewki o pojemności 1 l jako płynny odpad biologiczny.</li>
		<li>Umieść łożysko na sterylnym polu, tak aby gładka powierzchnia pępowiny była skierowana do góry. Ostrymi, cienkimi nożyczkami i kleszczami usuń błony płodowe i pępowinę.</li>
		<li>Odwróć łożysko tak, aby powierzchnia matki (szorstka powierzchnia) była skierowana do góry. Usuń leżącą nad nią tkankę płytki podstawnej, około 3 mm od powierzchni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wypreparowanie łożyska
	<ol>
		<li>Wypreparuj jeden lień na raz, unikając płytki kosmówkowej. Zebrać tkankę kosmków do zlewki z solą fizjologiczną o pojemności 250 ml.</li>
		<li>Wypłucz tkankę kilka razy w oddzielnej zlewce z 0,9% NaCl, mieszając kleszkami, używając zlewki o pojemności 1 l do odpadów płynnych.</li>
		<li>Przenoś po jednym liścieniu na szalkę Petriego o średnicy 150 mm. Przytrzymaj kleszczami i zeskrob żyletką tkankę z naczyń na szalce Petriego. Umieść zeskrobaną tkankę w osobnej zlewce zawierającej 0,9% NaCl. Powtórz tę czynność dla wszystkich kawałków tkanki.</li>
		<li>Przenieść niewielką część tkanki na sito dysocjacji komórek i dokładnie przepłukać 0,9% NaCl, aż eluat stanie się klarowny. Powtórz dla całej tkanki.</li>
		<li>Po wypłukaniu zeskrobanej tkanki na sicie dysocjacji komórek, odsączyć ją z nadmiaru płynu i wagi. 
		W tym momencie tkanka może być przechowywana w stanie O/N w sterylnej kolbie Erlenmeyera w temperaturze 4 °C w DMEM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trawienie enzymatyczne tkanki łożyska
	<ol>
		<li>Przygotować mieszaninę do trawienia tkankowego: 100 ml podgrzanego buforu rozcieńczającego enzymy, 1 ml DNazy I i 20 ml 2,5% 10x trypsyna.</li>
		<li>Podzielić tkankę, przenosząc 60 g z całkowitej pobranej tkanki (zwykle około 250-300 g) do 500 ml sterylnej kolby Erlenmeyera.</li>
		<li>Dodać mieszaninę do wytrawiania tkanek do kolby Erlenmeyera zawierającej tkankę i inkubować w temperaturze 37 °C w wytrząsarce przez 45 minut przy 150 obr./min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbieranie zdysocjowanych komórek
	<ol>
		<li>Po pierwszych 45 minutach dysocjacji należy ustawić kolbę wytrawiania pod kątem, aż tkanka się uspokoi.</li>
		<li>Zebrać supernatant, uważając, aby nie zebrać niezdysocjowanej tkanki. Dodać równą ilość HBSS do zebranego supernatantu i przenieść do sterylnych probówek wirówkowych o pojemności 15 ml. W przypadku dodatkowych porcji niezdysocjowanej tkanki powtórzyć procedurę, zaczynając od kroku 3.2 z niezdysocjowaną tkanką.</li>
		<li>Odwirować homogenat w temperaturze 4 °C przy 1 000 x g przez 15 minut.</li>
		<li>Dla każdej partii, po odwirowaniu, odessać supernatant bez naruszania osadu. Komórki kosmków łożyska znajdują się głównie w białej części osadu, pokrywając czerwone krwinki.</li>
		<li>Przenieść komórki kosmkowe (białą część osadu) do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i przechowywać na lodzie.</li>
		<li>Po zebraniu komórek ze wszystkich trzech etapów trawienia, przefiltrować zawiesinę za pomocą nylonowego sitka o wielkości 100 μm umieszczonego w górnej części sterylnej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Jeśli filtracja zawiesiny komórek zwalnia, podnieś filtr do góry, aby wciągnąć podciśnienie do rurki.</li>
		<li>Wirować w temperaturze 4 °C przy 1 000 x g przez 10 min. Ostrożnie usunąć sklarowany osad, nie naruszając osadu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Homogenizacja komórek kosmków łożyskowych
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem procesu izolacji należy przygotować 50 ml hipotonicznego podłoża do lizy (HLM) zawierającego 20 mM Tris-HCl, pH 7,4 i 1 mM EDTA. Dodaj inhibitory proteazy do HLM tuż przed użyciem i trzymaj pożywkę na lodzie.</li>
	<li>W kapturze bezpieczeństwa biologicznego dodaj do komórek 4-krotność objętości osadu komórkowego lodowatego HLM. Delikatnie i dokładnie zawiesić komórki, pipetując je w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 10 ml.</li>
	<li>Inkubować zawieszone komórki na lodzie przez 10 minut.</li>
	<li>Przenieś komórki do homogenizatora Dounce, który powinien znajdować się na lodzie. Powoli homogenizuj komórki, wykonując 20-25 delikatnych pociągnięć luźno dopasowanym tłuczkiem homogenizatora.</li>
	<li>Odwirować lizat komórkowy w temperaturze 4 °C przy 3 000 x g przez 10 minut w celu usunięcia nieuszkodzonych komórek, resztek komórkowych i jąder.</li>
	<li>Zebrać supernatant i przenieść do probówki SW28 (lub alternatywy, którą można odwirować przy 25 000 x g). Wirować w temperaturze 4 °C przy 25 000 x g przez 20 minut w celu usunięcia mitochondriów.</li>
</ol>
3. Izolowanie kropelek lipidów za pomocą ultrawirowania
<ol>
	<li>Przygotować 50 ml 100 mM buforu węglanu sodu (M 106 g/mol) (pH 11,5) i 50 ml 60% roztworu sacharozy (m/m). Inhibitory proteazy dodać do buforu węglanu sodu tuż przed użyciem i przechowywać na lodzie.</li>
	<li>Zebrać supernatant z kroku 2.6 do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, dostosować do 20% sacharozy i przenieść na dno probówki ultrawirówki dla wirnika SW28 lub równoważnego. Supernatant o dostosowanej gęstości nałożyć na ~10 ml lodowatego buforu węglanu sodu o pojemności 100 mM (pH 11,5) i 0,5-1 ml lodowatego HLM do napełnienia probówki.</li>
	<li>Wirować w temperaturze 4 °C przy 130 000 x g przez 45 minut za pomocą wahliwego wirnika kubełkowego SW28. Pozwól, aby wirnik wybiegł do zatrzymania (opóźnienie wirnika = 0).</li>
	<li>Zebrać pływającą warstwę, dostosować do 10% sacharozy i przenieść na dno probówki ultrawirówkowej o pojemności 13,2 ml do wirnika SW41Ti lub odpowiednika. Supernatant o dostosowanej gęstości nałożyć na około 5 ml lodowatego buforu węglanu sodu o pojemności 100 mM (pH 11,5) i 0,5 ml lodowatego HLM.</li>
	<li>Wirować w temperaturze 4 °C przy 274 000 x g przez 60 minut za pomocą wahliwego wirnika kubełkowego SW41Ti. Pozwól, aby wirnik wybiegł do zatrzymania (opóźnienie wirnika = 0), aby zminimalizować zakłócenie warstwy kropel lipidów.</li>
	<li>Ostrożnie zebrać górną pływającą warstwę (Rysunek 2D) zawierającą kropelki lipidów za pomocą pipety o pojemności 1 ml i powtórzyć krok 3.4.</li>
	<li>Wirować w temperaturze 4 °C przy 274 000 x g przez 30 minut za pomocą wahliwego wirnika kubełkowego SW41Ti. Pozwól, aby wirnik wybiegł do zatrzymania (opóźnienie wirnika = 0).</li>
	<li>Ostrożnie zebrać wygiętą pipetą Pasteura górną białą warstwę pływającą zawierającą kropelki lipidów do trzech probówek o pojemności 1,5 ml zawierających 100 μl HLM.</li>
</ol>
Charakterystyka frakcji kropelek lipidów (Protokoły 1 i 2)
Odzyskanie i czystość frakcji kropelek lipidowych można zweryfikować za pomocą Western Blot w połączeniu z mikroskopią świetlną lub elektronową. Ponadto podwielokrotności po różnych etapach wirowania mogą być zbierane i przechowywane w celu określenia wydajności oczyszczania. W Western Blot bardziej odpowiednie jest porównanie objętości frakcji kropelek lipidów, która stanowi odpowiednik lizatu komórkowego całego kraju, niż porównywanie kropelek lipidów z innymi frakcjami błonowymi na podstawie całkowitej zawartości białka24.

<ol><li>Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lipid-based+model+for+the+creation+of+an+escape+hatch+from+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A lipid-based model for the creation of an escape hatch from the endoplasmic reticulum.</a> Nature. 448, 435-438 (2007).</li>
<li>Herker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+hepatitis+C+virus+particle+formation+requires+diacylglycerol+acyltransferase-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Efficient hepatitis C virus particle formation requires diacylglycerol acyltransferase-1.</a> Nat. Med. 16, 1295-1298 (2010).</li>
<li>Ding, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+lipid+droplets+from+multiple+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolating lipid droplets from multiple species.</a> Nat. Protoc. 8, 43-51 (2013).</li>
<li>Kalscheuer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparative+isolation+of+lipid+inclusions+from+Rhodococcus+opacus+and+Rhodococcus+rubber+and+identification+of+granule-associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Preparative isolation of lipid inclusions from Rhodococcus opacus and Rhodococcus rubber and identification of granule-associated proteins.</a> Arch. Microbiol. 177, 20-28 (2001).</li>
<li>Low, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplet-associated+proteins+are+involved+in+the+biosynthesis+and+hydrolysis+of+triacylglycerol+in+mycobacterium+bovis+bacillus+calmette-guerin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Lipid droplet-associated proteins are involved in the biosynthesis and hydrolysis of triacylglycerol in mycobacterium bovis bacillus calmette-guerin.</a> J. Biol. Chem. 285, 21662-21670 (2010).</li>
<li>Leber, R., Zinser, E., Zellnig, G., Paltauf, F., Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+lipid+particles+of+the+yeast%2C+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Characterization of lipid particles of the yeast, Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 10, 1421-1428 (1994).</li>
<li>Grillitsch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+particles%2Fdroplets+of+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+revisitied%3A+lipidome+meets+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Lipid particles/droplets of the yeast Saccharomyces cerevisiae revisitied: lipidome meets proteome.</a> Biochim. Biophys. Acta. , 1165-1176 (2011).</li>
<li>Binns, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intimate+collaboration+between+peroxisomes+and+lipid+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">An intimate collaboration between peroxisomes and lipid bodies.</a> J. Cell Biol. 173, 719-731 (2006).</li>
<li>Ivashov, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidome+and+proteome+of+lipid+droplets+from+the+methylotropic+yeast+Pichia+pastoris%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Lipidome and proteome of lipid droplets from the methylotropic yeast Pichia pastoris.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1831, 282-290 (2013).</li>
<li>Connerth, M., Grillitsch, K., Kofeler, H., Daum, G. Analysis of lipid particles from yeast. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aConnerth%2C+M+%22Lipidomics%3A+Vol.+1%3A+Methods+and+Protocols%22">Lipidomics: Vol. 1: Methods and Protocols</a>. 579, 359-374 (2009).</li>
<li>Wolinski, H., Kohlwein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+analysis+of+lipid+droplet+metabolism+and+dynamics+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Microscopic analysis of lipid droplet metabolism and dynamics in yeast.</a> Methods Mol. Biol. 457, 151-163 (2008).</li>
<li>Jolivet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+composition+of+oil+bodies+in+Arabidopsis+thaliana+ecotype+WS%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Protein composition of oil bodies in Arabidopsis thaliana ecotype WS.</a> Plant Physiol. Biochem. 42, 501-509 (2004).</li>
<li>Katavic, V., Agrawal, G. K., Hajduch, M., Harris, S. L., Thelen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+and+lipid+composition+analysis+of+oil+bodies+from+two+Brassica+napus+cultivers%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Protein and lipid composition analysis of oil bodies from two Brassica napus cultivers.</a> Proteomics. 6, 4586-4598 (2006).</li>
<li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+study+and+marker+protein+identification+of+Caenorhabditis+elegans+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic study and marker protein identification of Caenorhabditis elegans lipid droplets.</a> Mol. Cell. Proteomics. 11, 317-328 (2012).</li>
<li>Krahmer, N., Hilger, M., Kory, N., Wilfling, F., Stoehr, G., Mann, M., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+correlation+profiles+identify+lipid+droplet+proteins+with+high+confidence%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Protein correlation profiles identify lipid droplet proteins with high confidence.</a> Mol. Cell Proteomics. 12, 1115-1126 (2013).</li>
<li>Cermelli, S., Gou, Y., Gross, S. P., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lipid-droplet+proteome+reveals+that+droplets+are+a+protein-storage+depot%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The lipid-droplet proteome reveals that droplets are a protein-storage depot.</a> Curr. Biol. 16, 1783-1795 (2006).</li>
<li>Brasaemle, D. L., Dolios, G., Shapiro, L., Wang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+proteins+associated+with+lipid+droplets+of+basal+and+lipolytically+stimulated+3T3-L1+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of proteins associated with lipid droplets of basal and lipolytically stimulated 3T3-L1 adipocytes.</a> J. Biol. Chem. 279, 46835-46842 (2004).</li>
<li>Liu, P. S., Ying, Y. S., Zhao, Y. M., Mundy, D. I., Zhu, M. F., Anderson, R. G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chinese+hamster+ovary+K2+cell+lipid+droplets+appear+to+be+metabolic+organelles+involved+in+membrane+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Chinese hamster ovary K2 cell lipid droplets appear to be metabolic organelles involved in membrane traffic.</a> J. Biol. Chem. 279, 3787-3792 (2004).</li>
<li>Fujimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+major+proteins+in+the+lipid+droplet-enriched+fraction+isolated+from+the+human+hepatocyte+cell+line+HuH7%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Identification of major proteins in the lipid droplet-enriched fraction isolated from the human hepatocyte cell line HuH7.</a> Biochim. Biophys. Acta. , 47-59 (2004).</li>
<li>Sato, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+profiling+of+lipid+droplet+proteins+in+hepatoma+cell+lines+expressing+hepatitis+C+virus+core+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein.</a> J. Biochem. 139, 921-930 (2006).</li>
<li>Umlauf, E., Csaszar, E., Moertelmaier, M., Schuetz, G. J., Parton, R. G., Prohaska, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+stomatin+with+lipid+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Association of stomatin with lipid bodies.</a> J. Biol. Chem. 279, 23699-23709 (2004).</li>
<li>Zhang, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+of+skeletal+muscle+lipid+droplet+reveals+association+with+mitochondria+and+apolipoprotein+A-I%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Proteome of skeletal muscle lipid droplet reveals association with mitochondria and apolipoprotein A-I.</a> J. Proteome Res. 10, 4757-4768 (2011).</li>
<li>Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R., McManaman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+reveal+a+link+between+the+endoplasmic+reticulum+and+lipid+secretory+mechanisms+in+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells.</a> Electrophoresis. 21, 3470-3482 (2000).</li>
<li>Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+lipid+droplets+from+cells+by+density+gradient+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of lipid droplets from cells by density gradient centrifugation.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. , 3.15.1-3.15.12 (2005).</li>
<li>Long, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplet+de+novo+formation+and+fission+are+linked+to+the+cell+cycle+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast.</a> Traffic. 13, 705-714 (2012).</li>
<li>Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+term+human+trophoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of term human trophoblast cells.</a> Methods Mol. Med. 121, 203-217 (2006).</li>
<li>Cho, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+mouse+Prp19p+as+a+lipid+droplet-associated+protein+and+its+possible+involvement+in+the+biogenesis+of+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of mouse Prp19p as a lipid droplet-associated protein and its possible involvement in the biogenesis of lipid droplets.</a> J. Biol. Chem. 282, 2456-2465 (2007).</li>
<li>Ding, Y. B., Wu, Y. B., Zeng, R., Liao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+profiling+of+lipid+droplet-associated+proteins+in+primary+adipocytes+of+normal+and+obese+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Proteomic profiling of lipid droplet-associated proteins in primary adipocytes of normal and obese mouse.</a> Biochim. Biophys. Acta. 44, 394-406 (2012).</li>
<li>Jagerstrom, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+interact+with+mitochondria+using+SNAP23%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol.+Int%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets interact with mitochondria using SNAP23.</a> Cell Biol. Int. 33, 934-940 (2009).</li>
<li>Xu, N. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FATP1-DGAT2+complex+facilitates+lipid+droplet+expansion+at+the+ER-lipid+droplet+interface%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The FATP1-DGAT2 complex facilitates lipid droplet expansion at the ER-lipid droplet interface.</a> J. Cell Biol. 198, 895-911 (2012).</li>
<li>Ozeki, S., Cheng, J. L., Tauchi-Sato, K., Hatano, N., Taniguchi, H., Fujimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab18+localizes+to+lipid+droplets+and+induces+their+close+apposition+to+the+endoplasmic+reticulum-derived+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Rab18 localizes to lipid droplets and induces their close apposition to the endoplasmic reticulum-derived membrane.</a> J. Cell Sci. 118, 2601-2611 (2005).</li>
<li>Yang, H. Y., Galea, A., Sytnyk, V., Crossley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+size+of+lipid+droplets%3A+lipid+and+protein+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Controlling the size of lipid droplets: lipid and protein factors.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 24, 509-516 (2012).</li>
<li>Jacquier, N., Choudhary, V., Mari, M., Toulmay, A., Reggiori, F., Schneiter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+are+functionally+connected+to+the+endoplasmic+reticulum+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets are functionally connected to the endoplasmic reticulum in Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Cell Sci. 124, 2424-2437 (2011).</li>
<li>Pu, J., Ha, C. W., Zhang, S., Jung, J. P., Huh, W. K., Liu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactomic+study+on+interaction+between+lipid+droplets+and+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Interactomic study on interaction between lipid droplets and mitochondria.</a> Protein Cell. 2, 487-496 (2011).</li>
<li>Shaw, C. S., Jones, D. A., Wagemakers, A. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+distribution+of+mitochondria+and+lipid+droplets+in+human+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Network distribution of mitochondria and lipid droplets in human muscle fibres.</a> Histochem. Cell Biol. 129, 65-72 (2008).</li>
<li>Goodman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gregarious+lipid+droplet%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The gregarious lipid droplet.</a> J. Biol. Chem. 283, 28005-28009 (2008).</li>
<li>Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Packaging+of+fat%3A+an+evolving+model+of+lipid+droplet+assembly+and+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Packaging of fat: an evolving model of lipid droplet assembly and expansion.</a> J. Biol. Chem. 287, 2273-2279 (2012).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Krytyczne kroki w ramach tego protokołu
Upewnij się, że jesteś spójny z pożywką i gęstością komórek podczas wzrostu hodowanych komórek. Komórkowe kropelki lipidów są wyjątkowe, ponieważ związane z nimi białka są w dużym stopniu zależne od środowiska, w którym hodowane są komórki17. Dlatego pożywka, w której hodowane są komórki, oraz gęstość komórek powinny być ściśle monitorowane przed lizą.
Skład białkowy kropelek lipidó...

Komórkowe kropelki lipidowe to dynamiczne organelle, które pełnią wiele funkcji w komórkach. Są one węzłami magazynowania neutralnych lipidów, które mogą być przekształcane w energię lub wykorzystywane do syntezy fosfolipidów. Kropelki odgrywają kluczową rolę w stanach fizjologicznych i patologicznych, w tym miażdżycy, otyłości i powiązanych chorobach metabolicznych, a także w chorobach zakaźnych1,2. Ponadto są one intrygującym źródłem paliw biodiesel.

Wiele informacji na temat komórkowych ról kropelek lipidowych uzyskano z analizy proteomicznej i lipidomicznej kropelek oczyszczonych z organizmów o szerokim zasięgu3. Organizmy te obejmowały bakterie4,5, drożdże6-11, rośliny12,13, nicienie14 i muchy15,16. Biorąc pod uwagę zainteresowanie rolą kropelek lipidów w chorobach metabolicznych ludzi, kropelki wyizolowano również z hodowanych komórek zwierzęcych i tkanek zwierzęcych. Hodowlane linie komórkowe obejmowały adipocyty 3T3-L117, komórki K2 jajnika chomika chińskiego (CHO)18, ludzkie hepatocye19,20 i linie komórek nabłonkowych21. Tkanki zwierzęce, z których wyizolowano kropelki, obejmowały mięśnie szkieletowe myszy22, wątrobę23 i gruczoły sutkowe23. Jak wspomniano powyżej, celem większości badań izolacji kropel jest przeprowadzenie analizy proteomicznej czynników związanych i analizy lipidomicznej czynników obojętnych i fosfolipidów.
Ponieważ neutralne lipidy - najliczniejszy składnik kropelek lipidów - są mniej gęste niż większość innych materiałów komórkowych, izolacja kropelek była tradycyjnie przeprowadzana za pomocą wirowania w gradiencie gęstości. Ta technika jest centralnym elementem obu prezentowanych tutaj przygotowań. Poprzednie techniki6,24 są łączone i modyfikowane w celu wizualnego przedstawienia izolacji kropelek z hodowanych komórek drożdży rozszczepieniowych i niehodowanych komórek ludzkich uzyskanych z tkanki łożyska. Celem jest pokazanie szerokiego zastosowania tej techniki poprzez wybór dwóch bardzo różnych typów komórek jako punktów wyjścia do izolacji kropel. Ta technika powinna być przydatna dla tych, którzy chcą wyizolować kropelki z większości organizmów.
Protokół 1 opisuje izolację kropelek lipidów z drożdży rozszczepialnych, Schizosaccharomyces pombe, które zostały użyte jako model do obserwacji tworzenia się kropel podczas podziału komórek eukariotycznych25. Pączkujące drożdże Saccharomyces cerevisiae są szeroko stosowane jako organizm modelowy do badania biologii kropelek lipidów. Protokół 1 ma zastosowanie do obu organizmów i podkreślono różnice w preparatach. 

Protokół 2 opisuje izolację kropelek lipidów z komórek kosmków łożyskowych, które z kolei są uzyskiwane z ludzkich łożysk terminowych. Pobranie łożysk terminowych daje niepowtarzalną możliwość bezpiecznego i etycznego pozyskania 200-250 g łatwo dostępnej tkanki ludzkiej26, która zawiera znaczną liczbę kropelek lipidów. Jest to przeciwieństwo większości izolacji kropelek lipidów u wyższych eukariontów, gdzie kropelki pochodzą z hodowanych komórek. W tych badaniach kwasy tłuszczowe są często dodawane do hodowli, aby promować syntezę obojętnych lipidów, a tym samym wzrost kropelek. Jest to przeciwieństwo prac tutaj, w których kropelki lipidów powstają w warunkach natywnych w tkance łożyska. 

Czystość frakcji kropelek lipidów jest określana za pomocą analizy Western Blot przy użyciu przeciwciał markerów organelli. Te dwa protokoły pozwolą uzyskać frakcje kropelek lipidów, które są odpowiednie do późniejszej analizy proteomicznej i lipidomicznej.

<table><tbody><tr><td>Protokół 1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1. Hodowla komórek drożdży i przekształcanie ich w sferoplasty</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Edinburgh Minimal Media (EMM)</td><td>Sunrise Science Products</td><td>2005</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy z 5 suplementami (YE5S)</td><td>Sunrise Science Products</td><td>2011</td><td>Pożywka YE5S z 225 mg/ml każdego suplementu: adeninie, histydyna, leucyna, lizyna, uracyl. Odpowiednikiem drożdży pączkujących byłby YPD.</td></tr><tr><td>Proszek YPD</td><td>Sunrise Science Products</td><td>1875</td><td>Dla S. cerevisiae</td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP439</td><td></td></tr><tr><td>Drożdżowy enzym lityczny</td><td>MP Biomedicals</td><td>215352610</td><td></td></tr><tr><td>Enzymy lizujące z Trichoderma harzianum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1412</td><td></td></tr><tr><td>Zymolayse-20T</td><td>Sunrise Science Products</td><td>N0766391</td><td>Do S. cerevisiae</td></tr><tr><td>BODIPY 493/503</td><td>Invitrogen</td><td>D-3922</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>Szklana osłona mikroskopu</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa pipeta transferowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>137115AM</td><td></td></tr><tr><td>Szklana butelka</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>1 LKolba</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ml Kolby</td><td></td><td></td><td></td> 2,8 L</tr><tr><td><mocne>2. Izolacja kropelek lipidów drożdży</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP525</td><td></td></tr><tr><td>12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane</td><td>SpectrumLabs</td><td>132680</td><td></td></tr><tr><td>Tabletki koktajlowe inhibitora proteazy bez EDTA</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11873580001</td><td>drażniący</td></tr><tr><td>homogenizator Dounce&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9938</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówki 25 mm x 89 mm (do SW28)</td>Membrana dializowa <td>Beckman-Coulter</td><td>355642</td><td></td></tr><tr><td>12-14k Spectra/Por</td><td>SpectrumLabs</td><td>132680</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka z kontrolowaną</td><td>temperaturą New Brunswick Scientific</td><td>C25KC</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Sorvall Legend XTR Wirówka</td><td>Thermo-Scientific</td><td>75004521</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka kubełkowa wahliwa</td><td>Rotor Thermo-Scientific</td><td>75003607</td><td></td></tr><tr><td>Fiberlite* F15-6x100Y Wirnik o stałym kącie</td><td>nachylenia Thermo-Scientific</td><td>75003698</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka LB-M</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW28 Ultrawirówka</td><td>Beckman-Coulter</td><td>342204</td><td></td></tr><tr><td>Protokół 2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><silny>1. Izolacja komórek kosmków łożyskowych</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe podkładki</td><td>Fisher Scientific 23666062</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Patelnia (pojemnik) do sterylizacji w autoklawie, 3 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>1336110</td><td></td></tr><tr><td>Cienkie nożyczki, ostre, proste</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>1406011</td><td></td></tr><tr><td>Londynie</td><td>Kleszcze Narzędzia do nauki 1108002</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7b Kleszcze</td><td>Narzędzia do nauki o tematyce precyzyjnej</td><td>1127020</td><td></td></tr><tr><td>Żyletki</td><td>Fisher Scientific</td><td>S65921</td><td></td></tr><tr><td>Kubek sitowy do CD-1</td><td>Fisher Scientific</td><td>S1145</td><td></td></tr><tr><td>40 siatkowy ekran&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S0770</td><td></td></tr><tr><td>Barwniki komórkowe Fisherbrand 100 &mu; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>150 mm Szalki Petriego</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9054771</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S642</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P333</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>P386</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO 4</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374</td><td></td></tr><tr><td>D-Glukoza</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310</td><td></td></tr><tr><td>2,5% Trypsyna 10x</td><td>Invitrogen</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>DNaza I stopnia II, z trzustki bydlęcej</td><td>Roche Applied Science</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór</td> <td>wodorowęglanu soduSigma-Aldrich</td><td>S8761</td><td></td></tr><tr><td>500 ml Kolby</td><td></td><td></td><td></td>Erlenmeyera</tr><tr><td>250 ml Zlewki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml Probówki</td><td></td><td></td><td></td>wirówkowe</tr><tr><td>10 ml Pipety</td><td></td><td></td><td></td>serologiczne</tr><tr><td>50 ml Probówki</td><td></td><td></td><td></td>wirówkowe</tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965084</td><td></td></tr><tr><td><silny>2. Izolacja kropelek lipidów z komórek kosmków łożyska</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120</td><td></td></tr><tr><td>D-Sacharoza</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220</td><td></td></tr><tr><td>Węglan sodu&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP357</td><td></td></tr><tr><td>Tabletki koktajlowe z inhibitorem proteazy bez EDTA</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11873580001</td><td>drażniący</td></tr><tr><td>homogenizator Dounce&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9938</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do ultrawirówek 25 mm x 89 mm (do SW28)Probówki</td> wirówkowe <td>Beckman-Coulter</td><td>355642</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Clear 14 mm x 89 mm (do SW41)</td><td>Beckman-Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe pipety Pasteura ze szkła borokrzemianowego</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367820C</td><td></td></tr><tr><td>Kaptur bezpieczeństwa biologicznego&nbsp;</td><td>Thermo-Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka z kontrolowaną temperaturą</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>C25KC</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Thermo Sorvall Legend XTR</td><td>Thermo-Scientific</td><td>75004521</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka z wiadrem wahadłowym</td><td>Rotor Thermo-Scientific</td><td>75003607</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka LB-M</td> Rotor ultrawirówkowy <td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW28</td><td>Redlica Beckman-Coulter</td><td>342204</td><td></td></tr><tr><td>SW41 Ti Ultrawirówka</td><td>Rotor Beckman-Coulter</td><td>331336</td><td></td></tr><tr><td>Western blot</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680 Kozia IgG</td><td>LI-COR</td><td>926-68071</td><td>rozcieńczenie 1:15 000</td></tr><tr><td>IRDye 800CW Koza Anty-mysie IgG</td><td>LI-COR</td><td>926-32210</td><td>rozcieńczenie 1:5 000</td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 12% żele Bis-Tris</td><td>Invitrogen</td><td>NP0341</td><td></td></tr><tr><td>Pierwotne przeciwciała dla Protokołu 1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Erg6p</td><td>prezent od Dr. G. Daum</td><td>Graz University of Technology, Austria</td><td>rozcieńczenie 1:5,000</td></tr><tr><td>Dpm1p</td><td>Abcam</td><td>ab113686</td><td>4 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Por1p</td><td>prezent od Dr. G. Daum</td><td>Graz University of Technology, Austria</td><td>rozcieńczenie 1:5,000</td></tr><tr><td>Pma1p</td><td>prezent od Dr. G. Daum</td><td>Graz University of Technology, Austria</td><td>rozcieńczenie 1:10,000</td></tr><tr><td>Vma1p (anty-ATP6V1A)</td><td>Abcam</td><td>ab113745</td><td>0,5 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Pierwszorzędowe przeciwciała dla Protokołu 2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perilipin 2 (anty-ADFP)</td><td>Abcam</td><td>ab52355</td><td>2 &mu; g / ml</td></tr><tr><td>Calnexin</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2679</td><td>rozcieńczenie 1:1,000</td></tr><tr><td>GM130</td><td>Biorbyt</td><td>orb40533</td><td>rozcieńczenie 1:25</td></tr><tr><td>COX IV</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>4850</td><td>rozcieńczenie 1:1,000</td></tr><tr><td>MEK1</td><td>Biorbyt</td><td>orb38775</td><td>rozcieńczenie 1:50</td></tr></tbody></table>

izolacja kropelek lipidów komórkowych: dwie techniki oczyszczania, zaczynając od komórek drożdży i ludzkich łożysk

Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

Kropelki lipidów to dynamiczne organelle, które można znaleźć w większości komórek eukariotycznych i niektórych prokariotycznych. Strukturalnie kropelki składają się z rdzenia z obojętnych lipidów otoczonych monowarstwą fosfolipidową. Jedną z najbardziej użytecznych technik określania ról komórkowych kropelek jest proteomiczna identyfikacja związanych białek, które można wyizolować wraz z kropelkami. W tym miejscu opisano dwie metody izolowania kropelek lipidów i związanych z nimi białek z dwóch szeroko zakrojonych eukariontów: drożdży rozszczepialnych i ludzkich komórek kosmków łożyska. Chociaż obie techniki różnią się między sobą, główna metoda - wirowanie w gradionym przepływie gęstości - jest wspólna dla obu preparatów. Świadczy to o szerokim zastosowaniu prezentowanych technik izolacji kropel.

W pierwszym protokole, komórki drożdży są przekształcane w sferoplasty poprzez enzymatyczne trawienie ich ścian komórkowych. Powstałe sferoplasty są następnie delikatnie lizowane w luźnym homogenizatorze. Ficoll dodaje się do lizatu w celu uzyskania gradientu gęstości, a mieszaninę odwirowuje się trzykrotnie. Po pierwszym wirowaniu kropelki lipidów są zlokalizowane w białej pływającej warstwie probówek wirówkowych wraz z retikulum endoplazmatycznym (ER), błoną plazmatyczną i wakuolami. Dwa kolejne spiny są używane do usunięcia tych pozostałych trzech organelli. Rezultatem jest warstwa, która składa się tylko z kropelek i związanych białek.

W drugim protokole, komórki kosmkowe łożyska są izolowane z ludzkich łożysk donoszonych przez trawienie enzymatyczne z trypsyną i DNazą I. Komórki są homogenizowane w luźno dopasowanym homogenizatorze. Etapy wirowania z niską i średnią prędkością służą do usuwania nieuszkodzonych komórek, szczątków komórkowych, jąder i mitochondriów. Sacharoza jest dodawana do homogenatu w celu uzyskania gradientu gęstości, a mieszaninę odwirowuje się w celu oddzielenia kropelek lipidów od innych frakcji komórkowych.

Czystość kropelek lipidów w obu protokołach jest potwierdzona przez analizę Western Blot. Frakcje kropelkowe z obu preparatów nadają się do późniejszej analizy proteomicznej i lipidomicznej.

Jeśli wirowanie w gradiencie gęstości przebiegło zgodnie z oczekiwaniami, warstwa pływająca powinna zawierać kropelki lipidowe i być pozbawiona innych organelli w trakcie kolejnych etapów wirowania przy wysokich prędkościach.
W ramach protokołu 1 wykonano analizę Western Blot z użyciem przeciwciał markerowych przeciwko kropelkom lipidowym (Erg6p) oraz organellom, co do których stwierdzono, że wchodzą one w interakcje z kropelkami lipidowymi u drożdży: retikulum endoplazmatycznym (Dpm1p), mitoc...

Przedstawiono dwie techniki izolowania kropelek lipidów komórkowych z 1) komórek drożdży i 2) ludzkich łożysk. Centralnym elementem obu procedur jest wirowanie w gradionym gradimencie gęstości, w którym powstałą pływającą warstwę zawierającą kropelki można łatwo zwizualizować za pomocą oka, wyekstrahować i określić ilościowo za pomocą analizy Western Blot w celu uzyskania czystości.

Izolacja kropelek lipidów komórkowych: dwie techniki oczyszczania, zaczynając od komórek drożdży i ludzkich łożysk

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie kropli lipidowych z tkanki. Jest to realizowane poprzez wstępne wycięcie i odseparowanie tkanki łożyska. Następnie homogenizuje się komórki oleiny.Następnie organelle są rozdzielane w kilku etapach wirowania. Na koniec zbiera się warstwę pływającą zawierającą kropelki lipidowe, a następnie przeprowadza się ich charakterystykę. Ostatecznie, w celu wykazania czystości frakcji kropelek lipidowych, stosuje się mikroskopię fluorescencyjną oraz analizę western blot.Główną zaletą tej techniki jest możliwość izolacji kropel lipidowych z większości komórek aorty. Należy zauważyć, że w niektórych tkankach liczba kropelek może być mniejsza, co zmniejsza warstwę pływającą G oraz liczbę kropelek. Łożyska pobrano od zdrowych kobiet z ciążami pojedynczymi, poddanych planowemu cięciu cesarskiemu przed wystąpieniem samoistnych bólów porodowych w terminie; badane wyraziły pisemną świadomą zgodę na pobranie łożyska.Pobieranie i późniejsze wykorzystanie łożysk zostało przeprowadzone za zgodą Uniwersytetu Tennessee oraz Szkoły Medycznej dla Studentów Studiów Podyplomowych Uniwersytetu Tennessee w Knoxville. W komorze z laminarnym przepływem powietrza, wewnątrz dygestorium biologicznego, przenieść łożysko do sterylnego pojemnika autoklawowalnego i ostrożnie wypłukać krew z łożyska oraz błon, używając sterylnej soli fizjologicznej. Zużyta sól fizjologiczna z krwią powinna zostać wylana do zlewki o pojemności jednego litra jako ciekły odpad biologiczny.Umieść łożysko na sterylnym polu, tak aby gładka powierzchnia z pępowiną była skierowana do góry; użyj do tego ostrych nożyczek z cienką końcówką oraz pęsety. Usuń pępowinę i błony płodowe. Następnie odwróć łożysko tak, aby powierzchnia maciczna była skierowana do góry.Następnie usuń nadległą tkankę płytki podstawnej na głębokość około trzech milimetrów od powierzchni. Przeprowadź sekcję każdego naczynia prowadzącego COTA po kolei, unikając płytki kosmowej, i zbierz tkankę kosmkową do zlewki o pojemności 250 ml z solą fizjologiczną. Następnie użyj 0,9% sterylnej soli fizjologicznej i pincety, aby kilkakrotnie wypłukać tkankę w osobnej zlewce, obracając ją, wykorzystując zlewkę o pojemności jednego litra na odpady płynne.Przenosić po jednym leadingu dorsalnym dorsalnemu kodzioru do szalki Petriego o średnicy 150 mm. Przytrzymać pęsetą i za pomocą żyletki zeskrobać tkankę z naczyń na szalkę Petriego. Umieścić zeskrobaną tkankę w oddzielnym zlewce zawierającej 0,9% sterylną sól fizjologiczną.Powtórz czynność dla wszystkich fragmentów tkanki. Po wypłukaniu zeskrobionej tkanki w buforze do dysocjacji komórek, odlej nadmiar cieczy i zważ tkankę łożyskową w celu przeprowadzenia trawienia. Po przygotowaniu mieszaniny do trawienia tkanki, podziel materiał, przenosząc 60 g z całkowitej zebranej tkanki do sterylnej kolby Helen Meyer o pojemności 500 ml.Dodać mieszaninę do trawienia tkanek do kolby zawierającej tkankę i inkubować w temperaturze 37 °C w wytrząsarce przez 45 minut. Przy 150 RPM zebrać dysocjowane komórki po inkubacji, przechylając kolbę, aby tkanka osiadła. Zebrać nadsącz.Należy uważać, aby nie zbierać tkanek niedysocjowanych. Do supernatantu należy dodać równą ilość HBSS przed przeniesieniem go do sterylnych probówek wirówek o pojemności 15 mililitrów. Procedurę dysocjacji i zbierania supernatantu należy powtórzyć dla pozostałych części tkanek powiązanych z UND w każdej partii, po wirowaniu przy 1000 ×g.Odstawić do sedymentacji grawitacyjnej przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie odessać supernatant, nie naruszając osadu. Komórki kosmków bliźniakowych znajdują się głównie w białej części osadu, znajdującej się nad erytrocytami. Przenieść komórki kosmków z białej części osadu do sterylnej, 50 mililitrowej stożkowej probówki do wirowania i przechowywać w lodzie.Po zebraniu komórek ze wszystkich trzech etapów trawienia, należy przefiltrować zawiesinę, używając nylonowego sitka do komórek o oczkach 100 µm umieszczonego w górnej części sterylnej stożkowatej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Jeśli filtracja zawiesiny komórkowej zwolni, należy lekko unieść filtr, aby stworzyć podciśnienie w probówce, a następnie wirować w temperaturze 4 °C przy 1000 ×g przez 10 minut. Ostrożnie usunąć nadsącz, nie naruszając osadu, aby przeprowadzić homogenizację komórek kosmków błonowych w komorze z laminarnym przepływem powietrza, używając świeżo przygotowanego hipotonicznego medium do lizy (HLM); do komórek należy dodać HLM w ilości czterokrotnie przekraczającej objętość osadu komórkowego, schłodzone w lodzie.Użyj pipety o pojemności 10 ml, aby delikatnie i dokładnie resuspendować komórki, zasysając i wypuszczając je kilkakrotnie. Po inkubowaniu komórek na lodzie przez 10 minut, przenieś je do schłodzonego homogenizatora i powoli homogenizuj komórki za pomocą luźno dopasowanego tłoka, wykonując od 20 do 25 delikatnych ruchów.Wirować lizat z prędkością 3000 ×g w temperaturze 4 °C przez 10 minut, aby usunąć niezniszczone komórki. Następnie zebrać nadosad do nowej probówki i ponownie wirować z prędkością 25 000 ×g w temperaturze 4 °C przez 20 minut. Aby usunąć mitochondria i wyizolować krople lipidowe metodą ultrawirowania, zebrać nadosad do probówki wirówkowej o pojemności 50 mL.Dostosuj stężenie do 20% sacharozy i przenieś do dna probówki do ultrawirówki przeznaczonej do rotora S SW 28 lub odpowiednika; przykryj supernatant o dostosowanej gęstości około 10 mililitrami lodowatego buforu węglanu sodu 100 milimol i od 0,5 do 1 mililitra lodowatego HLM, aby wypełnić probówkę. Następnie wiruj w centryfudze z rotorem z koszykami S SW 28 przy 130 000 ×g i temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 45 minut. Zbierz warstwę pływającą, dostosuj stężenie do 10% sacharozy i przenieś ją do dna probówki do ultrawirówki o pojemności 13,2 mililitra przeznaczonej do rotora SW 41 TI lub odpowiednika; przykryj supernatant o dostosowanej gęstości około pięcioma mililitrami lodowatego buforu węglanu sodu 100 milimol i 0,5 mililitra lodowatego HLM. Po wirowaniu przy 274 000 ×g i temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 60 minut, użyj pipety o pojemności jednego mililitra, aby ostrożnie zebrać górną warstwę pływającą zawierającą krople lipidowe w rotorze SW 41 TI.Dostosuj objętość do 10% sacharozy i ponownie przenieś do probówki do ultrawirówki o pojemności 13,2 ml, a następnie przykryj pięcioma mililitrami lodowatego buforu węglanu sodu 100 mM oraz 0,5 mililitra lodowatego HLM. Po wirowaniu przez 30 minut, używając zagiętej pipety PE, ostrożnie zbierz górną, białą warstwę pływającą zawierającą kropelki lipidowe do trzech probówek o pojemności 1,5 ml zawierających 100 µl HLM. Scharakteryzuj kropelki lipidowe zgodnie z protokołem tekstowym przedstawionym na tej figurze; obecność kropelek lipidowych wyizolowanych z ludzkich komórek kosmków łożyskowych potwierdzono poprzez barwienie specyficznym dla lipidów neutralnych barwnikiem fluorescencyjnym boda P 4 93 5 0 3 i wizualizację za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.Przedstawiono tutaj ocenę czystości wyizolowanych frakcji kropel lipidowych za pomocą techniki western blotting z użyciem białek markerowych dla kropel lipidowych, w tym perilipiny 2, kalneksyny dla ER, markera aparatu Golgiego GM130, COX IV dla mitochondriów oraz MEK1 dla błony plazmatycznej. Po delirpidacji kropel lipidowych zimnym acetonem wyekstrahowano białka. Frakcje poddano analizie western blotting w kierunku perilipiny.Po drugie, białko kropli lipidowych wykryto w nadosadzie ponuklearnym oraz w wyizolowanej białej warstwie pływającej zawierającej krople lipidowe. Białek specyficznych dla błon komórkowych, takich jak MK 1 i GM 130, nie wykryto w frakcjach kropli lipidowych w żadnej z warstw pod warstwą pływającą dla wirowania 4 i 5. Jak zgłoszono wcześniej, białko kalneksyna oraz słabe barwienie białka błony mitochondrialnej CO X IV zostały wykryte w innych miejscach w frakcji kropli lipidowych.Wyniki te są zgodne z wcześniejszymi doniesieniami wskazującymi, że krople lipidowe oddziałują z mitochondriami w komórkach ssaków oraz z siateczką endoplazmatyczną. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak analiza proteomiczna i lipidomiczna, aby zbadać dodatkowe kwestie, na przykład to, jakie czynniki są związane z kroplami.

isolation-cellular-lipid-droplets-two-purification-techniques

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Izolacja lipidowych kropel komórkowych: Dwie techniki oczyszczania zaczynając od komórek drożdży i łożysk ludzkich

Opisujemy nową ilościową metodę lipidomiki służącą do identyfikacji licznych gatunków lipidów w drożdżach z wykorzystaniem spektrometrii mas z jonizacją przez elektroryś spray w trybie skanowania przeglądowego (ESI/MS). Metoda ta przewyższa obecnie dostępne metody identyfikacji i oznaczania ilościowego lipidów pod względem zdolności do rozdzielania różnych form cząsteczkowych lipidów, czułości oraz szybkości analizy.

Ilościowa ocena lipidomu drożdży z wykorzystaniem spektrometrii mas z jonizacją elektrorsprayową

Ten film demonstruje izolację lipidów od ludzkich neutrofili za pomocą dwufazowego systemu rozpuszczalnikowego z użyciem metanolu i chloroformu.

Izolacja lipidów z neutrofili pochodzenia ludzkiego przez separację dwufazową

MikroRNA odgrywają ważną rolę regulacyjną i stają się nowymi celami terapeutycznymi dla różnych chorób ludzkich. Wykazano, że miRNA są przenoszone w lipoproteinach o dużej gęstości. Opracowaliśmy uproszczoną metodę szybkiego izolowania oczyszczonego HDL nadającego się do analizy miRNA z ludzkiego osocza.

Szybka i uproszczona metoda wysokoprzepustowej izolacji miRNA z wysoko oczyszczonej lipoproteiny o wysokiej gęstości

Ten protokół opisuje izolację i kwantyfikację małych RNA lipoprotein o dużej gęstości.

Izolacja lipoprotein o dużej gęstości do niekodującej kwantyfikacji małego RNA

Kropelki lipidów są ważnymi organellami do replikacji kilku patogenów, w tym wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV). Opisujemy metodę izolowania kropelek lipidów do ilościowej spektrometrii mas powiązanych białek; Może być stosowany w różnych warunkach, takich jak infekcja wirusowa, stres środowiskowy lub leczenie farmakologiczne.

Izolacja kropelek lipidów do ilościowej analizy spektrometrii mas

Ten protokół ustanawia nowatorską metodę izolacji i oczyszczania kropelek lipidów z wątroby myszy, przy użyciu dobrze znanego zestawu do izolacji retikulum endoplazmatycznego.

Protokół szybkiej izolacji kropelek lipidów przy użyciu dobrze znanego zestawu do izolacji organelli

Prezentujemy protokół wykorzystujący chromatografię cieczową w połączeniu z tandemową spektrometrią mas do identyfikacji i ilościowego oznaczania głównych lipidów komórkowych u Saccharomyces cerevisiae. Opisana metoda ilościowej oceny głównych klas lipidów w komórce drożdży jest wszechstronna, solidna i czuła.

Analiza ilościowa lipidomu komórkowego Saccharomyces cerevisiae przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas

Tutaj przedstawiono protokół metabolicznego znakowania drożdży kwasem 14C-octowym, który jest sprzężony z chromatografią cienkowarstwową w celu oddzielenia obojętnych lipidów.

Analiza neutralnej syntezy lipidów w Saccharomyces cerevisiae za pomocą znakowania metabolicznego i chromatografii cienkowarstwowej

Ten artykuł przedstawia protokół izolacji błony plazmatycznej na małą skalę w celu scharakteryzowania białka Cdr1 Candida albicans ABC (ATP-binding cassette), którego nadekspresja występuje w Saccharomyces cerevisiae. Podwójny znacznik c-końcowy mGFPHis z rozszczepialnym proteazą z łącznikiem 16 reszt między Cdr1 a znacznikiem został zaprojektowany w celu ułatwienia oczyszczania i przesiewania detergentem Cdr1.

Preparat błony plazmatycznej na małą skalę do analizy Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Przedstawiono szybki i skuteczny protokół izolacji kropelek lipidów plastoglobul związanych z różnymi organizmami fotosyntetycznymi. Pomyślne przygotowanie wyizolowanych plastoglobul jest kluczowym pierwszym krokiem, który poprzedza szczegółowe badania molekularne, takie jak analizy proteomiczne i lipidomiczne.

Izolacja kropelek lipidów plastoglobuli z tkanki liści roślin i cyjanobakterii

Poznaj izolację kropelek lipidów z komórek drożdży i łożysk ludzkich przy użyciu ultrawirowania z gradientem gęstości. Metoda ta pozwala badać skład i funkcję organelli lipidowych.

Izolacja kropelek lipidów komórkowych: dwie techniki oczyszczania, zaczynając od komórek drożdży i ludzkich łożysk

Przeglądaj więcej filmów