Izolacja kropelek lipidów komórkowych: dwie techniki oczyszczania, zaczynając od komórek drożdży i ludzkich łożysk

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie kropelek lipidów z tkanki. Osiąga się to poprzez najpierw wypreparowanie i oddzielenie tkanki łożyska. Następnie komórki oleiny są homogenizowane.

Następnie organelle są oddzielane przez kilka etapów wirowania. Na koniec zbierana jest pływająca warstwa zawierająca kropelki lipidów i charakteryzowane są krople lipidów. Ostatecznie mikroskopia fluorescencyjna i zachodnia analiza krwi są wykorzystywane do wykazania czystości frakcji kropelek lipidów.

Główną zaletą tej techniki jest to, że możliwe jest wyizolowanie kropelek lipidów z większości komórek aorty. Należy zauważyć, że w niektórych tkankach liczba kropel może być niższa niż te, które zmniejszają pływającą warstwę G i liczbę kropel. Łożyska pobrano od zdrowych kobiet z ciążami pojedynczymi, które przeszły planowy poród przez cesarskie cięcie przed rozpoczęciem spontanicznego porodu w terminie, które wyraziły pisemną świadomą zgodę na pobranie łożyska.

Pobranie, a następnie wykorzystanie łożysk zostało przeprowadzone za zgodą University of Tennessee i University of Tennessee Graduate School of Medicine w Knoxville. Instytucjonalna komisja rewizyjna w kapturze bezpieczeństwa biologicznego, przenieść łożysko do sterylnego pojemnika nadającego się do sterylizacji w autoklawie i dokładnie zmyć krew z łożyska i błon za pomocą sterylnego roztworu soli fizjologicznej. Wyrzuć krwawą sól fizjologiczną do jednolitrowej zlewki jako płynny odpad biologiczny.

Umieść łożysko na sterylnym polu z tą gładką powierzchnią, na której pępowina jest skierowana do góry ostrymi, cienkimi nożyczkami i kleszczami. Usuń pępowinę i błony płodowe. Następnie odwróć łożysko tak, aby powierzchnia matki była skierowana do góry.

Następnie usuń leżącą nad nią tkankę płytki podstawnej około trzech milimetrów od powierzchni. Analizuj po jednym ołowiu COTA na raz, unikając płytki kosmówkowej, i zbierz tkankę kosmkową do 250-mililitrowej zlewki z solą fizjologiczną. Następnie za pomocą 0,9% sterylnej soli fizjologicznej i kleszczyków kilkakrotnie przepłukać tkankę w osobnej zlewce, mieszając za pomocą jednolitrowej zlewki na odpady płynne.

Przenoś po jednym ołowiu codi na 150 milimetrową szalkę Petriego. Przytrzymaj kleszczami i użyj żyletki, aby zeskrobać tkankę z naczyń na szalkę Petriego. Umieść zeskrobaną tkankę w osobnej zlewce zawierającej 0,9% sterylnego roztworu soli fizjologicznej.

Powtórz tę czynność dla wszystkich kawałków tkanki. Po wypłukaniu zeskrobanej tkanki w procesie dysocjacji komórek, należy ją odsączyć z nadmiaru płynu i masy, aby strawić tkankę łożyska. Po przygotowaniu mieszaniny do trawienia tkanek podzielić tkankę, przenosząc 60 gramów z całkowitej zebranej tkanki do 500-mililitrowej sterylnej kolby Helen Meyer.

Dodać mieszaninę do wytrawiania tkanek do kolby zawierającej tkankę i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wytrząsarce przez 45 minut. Przy 150 obr./min zebrać zdysocjowane komórki po inkubacji i przechylić kolbę, aby tkanka mogła się uspokoić. Zbierz super natin.

Uważaj, aby nie pobrać odłączonej tkanki UND. Dodać równą ilość HBSS do supernatantu przed przeniesieniem do sterylnych 15-mililitrowych probówek wirówkowych. Powtórzyć dysocjację i pobieranie sklarowanego osadu z pozostałymi porcjami tkanki związanej z UND dla każdej partii po odwirowaniu 1000 razy.

Grawitacyjnie przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza zasysać supernatant bez naruszania osadu. Komórki kosmków łożyska znajdują się głównie w białej części osadu pokrywającej czerwone krwinki. Przenieś komórki kosmków w białej części osadu do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 mililitrów i trzymaj na lodzie.

Po zebraniu komórek ze wszystkich trzech etapów trawienia użyj sitka do komórek nylonowych o grubości 100 mikronów umieszczonego w górnej części sterylnej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 mililitrów, aby przefiltrować zawiesinę. Jeśli filtracja zawiesiny komórkowej zwalnia, podnieś filtr do góry, aby zaczerpnąć podciśnienie w wirówce probówkowej o temperaturze czterech stopni Celsjusza i 1000-krotności grawitacji przez 10 minut. Ostrożnie usunąć supernatant bez naruszania osadu, aby homogenizować komórki kosmków łożyska za pomocą świeżo przygotowanej hipotonicznej pożywki do lizy lub HLM w kapturze bezpieczeństwa biologicznego, dodać do komórek czterokrotność objętości osadu komórkowego zimnego LHM

Użyj pipety o pojemności 10 mililitrów, aby delikatnie i dokładnie zregenerować. Zawiesić komórki, pipetując je w górę i w dół. Po inkubacji komórek na lodzie przez 10 minut, przenieś je do lodowatego homogenizatora i powoli homogenizuj komórki za pomocą luźno dopasowanego tłuczka, wykonując od 20 do 25 delikatnych ruchów.

Wiruj lizat w 3000 razy większej grawitacji i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut, aby usunąć nieuszkodzone komórki. Następnie zbierz supernatant do nowej probówki, a następnie ponownie wiruj w temperaturze 25 000 razy grawitacji i czterech stopni Celsjusza przez 20 minut. Aby usunąć mitochondria w celu wyizolowania kropelek lipidów przez ultrawirowanie, zbierz super natynę w 50-mililitrowej probówce wirówkowej.

Dostosować do 20% sacharozy i przenieść na dno probówki ultrawirówki dla wirnika S SW 28 lub równoważnego nakładania super natyny o dostosowanej gęstości z około 10 mililitrami lodowatego buforu węglanu sodu o 100 milimolach i 0,5 do jednego mililitra lodowatego HLM w celu napełnienia probówki za pomocą wirówki z wirnikiem kubełkowym S SW 28 o temperaturze 130, 000 razy grawitacja i cztery stopnie Celsjusza przez 45 minut. Następnie zebrać pływającą warstwę, dostosować do 10% sacharozy i przenieść ją na dno 13,2 mililitrowej probówki ultrawirówkowej do wirnika SW 41 TI lub równoważnego nałożenia supernatantu o dostosowanej gęstości z około pięcioma mililitrami lodowatego zimnego, 100-milimolowego buforu węglanu sodu i 0,5 mililitra lodowatego HLM po odwirowaniu w 274, 000 razy grawitacja i cztery stopnie Celsjusza przez 60 minut. W wirniku SW 41 TI użyj pipety o pojemności jednego mililitra, aby ostrożnie zebrać górną pływającą warstwę zawierającą kropelki lipidów.

Dostosuj objętość do 10% sacharozy i ponownie przenieś do 13,2 mililitrowej probówki ultrawirówkowej przed nałożeniem pięciu mililitrów lodowatego zimnego, 100-milimolowego buforu węglanu sodu i 0,5 mililitra lodowatego HLM. Po odwirowaniu przez 30 minut użyj wygiętej pipety PE, aby ostrożnie zebrać górną białą warstwę pływającą zawierającą kropelki lipidów do trzech 1,5 mililitrowych probówek zawierających 100 mikrolitrów HLM. Scharakteryzuj kropelki lipidów zgodnie z protokołem tekstowym, jak pokazano na tym rysunku, obecność kropelek lipidów wyizolowanych z ludzkich komórek kosmków łożyskowych zweryfikowano przez barwienie neutralnym barwnikiem fluorescencyjnym specyficznym dla lipidów boda P 4 93 5 0 3 i uwidoczniono za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Pokazana tutaj czystość izolowanych frakcji kropelek lipidów oceniano za pomocą western blot z białkami markerowymi dla kropelek lipidów, które zawierały para lippin two kalneksyna dla er, marker goi, GM jeden 30 CO X cztery dla mitochondriów i błony plazmatycznej, MEK jeden. Po zniszczeniu kropelki lipidów z zimnym acetonem i białkami ekstrahować. Frakcje poddano Western blot para lipin.

Po drugie, białko kropelki lipidów wykryto w supernatancie postjądrowym oraz w izolowanej białej pływającej warstwie zawierającej kropelki lipidów. Białka specyficzne dla błon plazmatycznych, takie jak MK one i GM one 30, nie zostały wykryte we frakcjach kropelek lipidów w żadnej warstwie poniżej warstwy pływającej dla spinu czwartego i spinu piątego. Jak wcześniej informowano, białko kalneksyna i słabe barwienie białka błony mitochondrialnej CO X 4 wykryto w innych miejscach frakcji kropelek lipidów.

Wyniki te są zgodne z wcześniejszymi doniesieniami pokazującymi, że kropelki lipidów oddziałują z mitochondriami w komórkach ssaków i z ER r. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak metody proteomiczne i lipidomiczne, aby zbadać dodatkowe pytania, takie jak czynniki związane z kropelkami.