Wdrożenie mikroskopu nieliniowego opartego na wymuszonym rozpraszaniu Ramana

Protokół ten może pomóc naukowcom zainteresowanym mikroskopią nieliniową w zrozumieniu kluczowych elementów, konfiguracji i procedury ustawiania mikroskopu opartego na wymuszonym rozpraszaniu Ramana. Głównymi zaletami mikroskopii SRS są jej zdolność do wykonywania obrazowania bez znaczników w oparciu o kontrast wibracyjny oraz do uzyskania obrazu w ciągu kilku sekund. Mikroskopia SRS przeniosła obrazowanie bezznacznikowe na nowy poziom, zwłaszcza badania złożonych struktur biologicznych, takich jak lipidy, które mają fundamentalne znaczenie dla komórek i architektury komórkowej.

Sygnał SRS jest wykrywany jako niewielka zmiana intensywności wiązki sondy i może zostać zniekształcony przez szum. Dlatego tak ważny jest dokładny znak. Aby rozpocząć, ustaw OPO i wiązki lasera tytanowo-szafirowego tak, aby oba docierały do mikroskopu.

Następnie umieść detektory czujnika położenia wiązki laserowej w dwóch pozycjach pomiędzy zwierciadłem dichroicznym numer jeden a lustrem szóstym. Pierwsza pozycja znajduje się w pobliżu zwierciadła dichroicznego pierwszego, a druga znajduje się w pobliżu zwierciadła szóstego. Dla każdej pozycji użyj czujników, aby wykryć współrzędne X i Y wiązki OPO.

Co ważne, sprawdź, czy współrzędne X i Y wiązki laserowej tytanowo-szafirowej mają ten sam OPO w obu pozycjach detektorów czujnika. Jeśli w niektórych pozycjach współrzędne nie pokrywają się, dostosuj nachylenie sąsiedniego lustra, aby to skompensować. Postępuj zgodnie z tą samą procedurą, aby wyrównać pozycje wiązki tytanowo-szafirowej względem OPO dla ścieżki między szóstym a siódmym zwierciadłem.

Zainstaluj dodatkowe lustro na uchwycie typu flip-flop pomiędzy lustrem szóstym a siódmym i obróć mocowanie lustra, aby skierować wiązkę do autokorelatora. Włącz sterownik autokorelatora, uruchom aplikację na komputerze sterującym nim i ustaw regulacji odległości wiązki autokorelatora w normalnym położeniu na 8,35 milimetra. Następnie zatrzymaj wiązkę tytanowo-szafirową i zwolnij i wyświetl wiązkę OPO z dodatkowego lustra na lustro wejściowe autokorelatora.

Spróbuj wyregulować lustro wejściowe, aby zmaksymalizować sygnał impulsu laserowego, jak pokazano tutaj. Następnie zatrzymaj wiązkę OPO, zwolnij i wyświetl wiązkę tytanowo-szafirową z lustra zamontowanego na przerzutniku do lustra wejściowego i do autokorelatora. Powtarzaj optymalną regulację wiązki, aż do uzyskania pokazanego tutaj sygnału autokorelatora.

Teraz ustaw regulacji odległości belki w pozycji krzyżowej na 7,30 milimetra. Zwolnij obie belki i zeskanuj opóźnioną linię, aby nałożyła się na dwie belki. Uzyskaj wynikowy sygnał korelatora krzyżowego, jak pokazano tutaj.

Następnie odwróć lustro zamontowane na klapie tak, aby wiązki mogły dotrzeć do lustra siódmego i głowicy skanującej mikroskopu. Wyjmij kondensator i użyj przycisku ucieczki, aby tymczasowo schować obiektyw subiektywny 60x. Następnie obróć końcówkę, aby przesunąć obiektyw subiektywny 60x poza ścieżkę optyczną.

Następnie zamontuj detektor w górnej części mikroskopu za pomocą zewnętrznego mocowania mechanicznego. Podłącz wyjście detektora przez filtr dolnoprzepustowy 50 omów do oscyloskopu. Teraz włącz procesor sterujący głowicą skanera i skieruj wiązkę OPO na głowicę skanera mikroskopu.

Monitoruj sygnał OPO i maksymalizuj moc mierzoną przez detektor za pomocą translatora XY. Następnie przełącz wiązkę z lasera OPO na laser tytanowo-szafirowy i sprawdź, czy uzyskany jest również sygnał dla lasera tytanowo-szafirowego. Oznacza to, że obie belki są dobrze wyrównane.

Zakończ wyrównanie wiązki, obracając końcówkę nosową do tyłu, aby wprowadzić subiektywny 60x. Następnie użyj przycisku zmiany ostrości na mikroskopie, aby odzyskać ostateczną ostrość na soczewce obiektywu mikroskopu 60x. Na koniec umieść obiektyw z powiększeniem 40x w miejscu kondensatora, nie dotykając ani nie naruszając próbki.

Ustaw moc laserów tytanowo-szafirowych i OPO mierzoną przed mikroskopem na 30 miliwatów dla obu wiązek. Następnie ustaw długość fali lasera OPO na inną wartość, w stosunku do poprzedniej, tak aby pompa i sonda nie były w rezonansie z częstotliwością drgań kulek. Następnie zwolnij obie wiązki, aby weszły do mikroskopu.

Uruchom skomputeryzowany translator linii opóźniającej skanowanie i zarejestruj zmierzoną intensywność za pomocą wzmacniacza blokującego dla każdej pozycji linii opóźniającej. Poczekaj, aż skanowanie linii opóźniającej zostanie zakończone. Teraz ustaw długość fali OPO z powrotem na 1076 nanometrów, tak aby pompa i sonda były w rezonansie z częstotliwością wibracji kulek.

Uruchom skomputeryzowany translator linii opóźnienia skanowania i poczekaj, aż skanowanie linii opóźnienia zostanie zakończone. Na koniec należy ustawić uzyskaną pozycję wiązki nakładającej się oraz linię opóźnienia dla następnej akwizycji wymuszonych obrazów rozpraszania Ramana. Aby zoptymalizować synchronizację przestrzenną wiązek, zacznij od zatrzymania wiązki tytanowo-szafirowej i zmniejszenia mocy OPO do ośmiu miliwatów.

Następnie podłącz odczyt czujki do karty akwizycji danych. Uruchom program do akwizycji danych wraz z konsolą skanowania mikroskopu. Po zakończeniu zapisz plik i przetwórz dane, aby uzyskać obraz podobny do pokazanego tutaj.

Następnie zatrzymaj wiązkę OPO i zmniejsz moc tytanowo-szafirową do 2,5 do 4,5 miliwatów. Połącz czujkę ze wzmacniaczem lock-in, a jego odczyty z kartą akwizycji danych. Następnie ponownie uruchom program do akwizycji danych wraz z konsolą skanowania mikroskopu.

Po zakończeniu zapisz plik i przetwórz dane, aby uzyskać obraz podobny do pokazanego tutaj. Wprowadź stos filtrów pomiędzy obiektywem 40x a fotodiodą, aby usunąć impulsy pompy i uzyskać tylko sygnał skoku. Następnie ustaw sygnał pompy na 810 nanometrów ze skupioną mocą ośmiu miliwatów.

Ustaw sygnał sondy na 1076 nanometrów z tą samą skupioną mocą ośmiu miliwatów, aby zbadać typowe wiązanie węgiel-wodór polistyrenu z przesunięciem Ramana o 3054 centymetry wsteczne. Podłącz detektor do wzmacniacza lock-in i wzmacniacza lock-in odczyt z karty akwizycji danych. Na koniec ustaw format pikseli i czas akwizycji w programie mikroskopowym i uruchom go wraz z systemem akwizycji danych, zapisując plik matrycy po jego zakończeniu.

W tym miejscu wyświetlany jest przykładowy pomiar z pojedynczego punktu próbki. Gdy wiązka nie nakłada się na siebie w czasie lub przestrzeni, uzyskany wynik jest poza rezonansem, gdzie amplituda sygnału, mierzona przez wzmacniacz typu lock-in, wynosi zero. Faza tego sygnału przeskakuje jednak między wartościami ujemnymi i dodatnimi.

Jeśli wiązki zachodzą na siebie w przestrzeni, sygnał wzrasta i osiąga maksimum, gdy wiązki idealnie nakładają się na siebie w czasie, podczas gdy faza zaczyna osiągać stałą wartość w czasie, w którym wiązki się nakładają. W obrazie transmisyjnym wykorzystywana jest pojedyncza wiązka, a natężenie wiązki przesyłanej z próbki jest mierzone za pomocą fotodiody. Po lewej stronie obraz transmisyjny uzyskano za pomocą OPO, natomiast po prawej obraz transmisyjny uzyskano za pomocą szafiru tytanowego.

Typowy przykład obrazu SRS jest pokazany tutaj, w którym przedstawiono obrazy kulek polistyrenowych o średnicy trzech mikrometrów bez etykiet. Aby uzyskać wysokiej jakości obraz, w oparciu o mikroskopię SRS, kluczowe znaczenie ma ustawienie mikroskopu. W związku z tym wszystkie kroki wskazane w protokole muszą być wykonane ostrożnie.