Name: Wdrożenie mikroskopu nieliniowego opartego na wymuszonym rozpraszaniu Ramana (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Poznaj implementację mikroskopu SRS do bezbarwnego obrazowania biologicznego opartego na kontraście wibracyjnym. Protokół wyjaśnia kluczowe komponenty, procedury ustawiania i wyrównania wiązek laserowych Ti-Sapphire oraz OPO.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Doceniamy V. Tufano z IMM CNR za jego cenną pomoc techniczną oraz Giacomo Cozziego, specjalistę ds. produktów z Nikon Instruments, za użyteczne dyskusje i ciągłe wsparcie. Prace te były częściowo wspierane przez włoskie krajowe programy operacyjne PONa3 00025 (BIOforIU) oraz przez zakrojony na szeroką skalę ogólnoeuropejski projekt infrastruktury badawczej Euro-Bioobrazing.

1. Uruchamianie systemu laserowego
<ol>
	<li>Sprawdzić, czy temperatura agregatów chłodniczych jest utrzymywana na poziomie 20 °C lub niższym.</li>
	<li>Sprawdź, czy regulator wilgotności działa prawidłowo, a wilgotność jest utrzymywana na poziomie około 40%.</li>
	<li>Włącz laser Ti:Sa, ściśle przestrzegając instrukcji zawartych w instrukcji.</li>
	<li>Ustaw długość fali na 810 nm.</li>
	<li>Włącz OPO i podłączony minikomputer. Uruchom aplikację sterującą laserem OPO.</li>
	<li>Wybierz obejście, jeśli wymagane jest 100% wyjścia lasera Ti:Sa na wyjściu ze skrzynki OPO.</li>
	<li>Usuń zaznaczenie obejścia, jeśli przy wyjściu ze skrzynki OPO wymagane jest 20% wyjścia lasera Ti:Sa i wyjścia lasera OPO.</li>
	<li>Otwórz migawkę Ti:Sa i zwolnij wiązkę Ti:Sa do wejścia OPO.</li>
	<li>Zwolnij dwie wiązki laserowe na wyjściu OPO, klikając sygnał out i pump-out.</li>
	<li>Poczekaj, aż oba lasery Ti:Sa i OPO ustabilizują się (około 45–60 minut).</li>
	<li>Sprawdź punkt wiązki na wyjściu ze skrzynki OPO zarówno dla Ti:Sa, jak i OPO za pomocą papierowej karty detektora i sprawdź moc za pomocą miernika mocy.</li>
	<li>Dostosuj długość fali lasera OPO do 1076 nm.</li>
	<li>Zmniejsz moc do ~10 mW dla każdej wiązki laserowej, aby wykonać wyrównanie.</li>
</ol>
2. Ustawianie mikroskopu
<ol>
	<li>Implementacja metody transferu modulacji wysokiej częstotliwości
	<ol>
		<li>Przeprowadzić procedurę optycznego wyrównania modulatora w taki sposób, aby wiązka Ti:Sa wchodziła i wychodziła bez żadnych zniekształceń.</li>
		<li>Włącz generator funkcyjny i wygeneruj sygnał TTL (fala prostokątna o amplitudzie = 5 V, przesunięcie = 2,5 V, częstotliwość = 5 MHz).</li>
		<li>Podziel sygnał TTL na dwie części za pomocą złącza T; jedna dla EOM, a druga dla wzmacniacza lock-in (LIA) (patrz Rysunek 2).</li>
		<li>Sprawdź wszystkie poziomy sygnałów za pomocą oscyloskopu.</li>
		<li>Włącz LIA i podłącz kanał wyjściowy generatora do kanału referencyjnego LIA.</li>
		<li>Podłącz kanał wyjściowy generatora do wysokiego napięcia amplifier mocy EOM.</li>
		<li>Włącz wzmacniacz i ustaw napięcie na prawie maksymalny poziom. Monitoruj moc wiązki na wyjściu z EOM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Integracja montażu mechanicznego w celu ustalenia PD i przypisania ruchu względnego x i y 
	UWAGA: Wraz z mikroskopem wprowadzany jest zewnętrzny montaż, wyposażony w mikrometr, który ma kontrolę ruchu w kierunkach x i y.
	<ol>
		<li>Zamontuj dwa stopnie translacji ruchu, aby umożliwić ruchy wzdłuż kierunków x i y (patrz Rysunek 3).</li>
		<li>Zamocuj stolik na słupku Ø1.5" o odpowiedniej wysokości.</li>
		<li>Zamontuj PD na zewnętrznym uchwycie.</li>
		<li>Zmaksymalizuj moc wiązki na WNZ, dostosowując pozycje WNZ (współrzędne x i y) za pomocą mikrometrów dołączonych do uchwytu (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ustawienie mikroskopu
<ol>
	<li>Przestrzenne zachodzenie na siebie belek 
	UWAGA: Biorąc pod uwagę wiązkę OPO jako odniesienie i korzystając z detektora czułego na położenie, Ti:Sa powinien nakładać się na OPO zgodnie z następującą procedurą:
	<ol>
		<li>Ustaw wiązki lasera OPO i Ti:Sa tak, aby obie docierały do mikroskopu.</li>
		<li>Umieść czujniki położenia wiązki laserowej w dwóch pozycjach pomiędzy lustrem dichroicznym 1 a lustrem 6, pierwsza pozycja znajduje się w pobliżu lustra dichroicznego 1, a druga znajduje się w pobliżu lustra 6. Dla każdej pozycji użyj czujników, aby wykryć współrzędne x i y wiązki OPO (postępuj zgodnie z Rysunek 1).</li>
		<li>Sprawdź, czy współrzędne x i y wiązki laserowej Ti:Sa są takie same OPO w obu pozycjach detektorów czujników. Jeśli w niektórych pozycjach współrzędne Ti:Sa i OPO nie pokrywają się, dostosuj nachylenie sąsiedniego lustra, aby skompensować różnicę (postępuj zgodnie z Rysunek 1).</li>
		<li>Postępuj zgodnie z tą samą procedurą, aby wyrównać pozycje belki Ti:Sa względem OPO dla ścieżki między M6-M7 (postępuj zgodnie z Rysunek 1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Synchronizacja czasowa wiązek
	<ol>
		<li>Zastosowanie szybkiej fotodiody plus oscyloskop:
		<ol>
			<li>Zatrzymaj propagację wiązek Ti:Sa i OPO i umieść szybki detektor przed wiązką OPO (pomiędzy M6 i M7).</li>
			<li>Podłącz sygnał wyzwalający dostarczany przez skrzynkę laserową Ti:Sa do oscyloskopu w kanale 2.</li>
			<li>Połącz przewód detektora z oscyloskopem w kanale 1 i zobrazuj profil czasowy OPO.</li>
			<li>Zapisz czas (odcięte) zmierzony przez oscyloskop odpowiadający jego wartości maksymalnej, czyli t1.</li>
			<li>Zatrzymaj wiązkę OPO i zwolnij wiązkę Ti:Sa.</li>
			<li>Wizualizuj profil czasowy Ti:Sa i zapisz czas (odcięte) odpowiadający jego maksymalnej wartości, czyli t2.</li>
			<li>Zminimalizuj różnicę między t1-t2, używając linii opóźniającej, aby nałożyć na siebie dwie wiązki. W naszym przypadku minimalna mierzalna różnica wynosi 10 ps.</li>
			<li>Usuń szybki detektor pomiędzy M6 i M7.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Korzystanie z autokorelatora: 
		UWAGA: Na schemacie ideowym pokazanym na rysunku 1 zainstalowany jest autokorelator bez ingerencji w ścieżki optyczne wiązek. Ponadto wprowadzane jest dodatkowe zwierciadło i montowane na uchwycie typu flip-flop (określanym jako FFM/AM) pomiędzy M6 i M7 w celu skierowania wiązki do autokorelatora.
		<ol>
			<li>Odwróć AM, aby skierować wiązkę do autokorelatora.</li>
			<li>Zatrzymaj Ti:Sa i zwolnij OPO.</li>
			<li>Ustaw mikrometr regulacyjnej odległości wiązki autokorelatora w pozycji normalnej (8.35 mm).</li>
			<li>Włącz kontroler autokorelatora i uruchom aplikację na komputerze osobistym, który go steruje.</li>
			<li>Rzutuj wiązkę OPO z FFM/AM na lustro wejściowe do autokorelatora.</li>
			<li>Kontroluj punkt odbicia (za pomocą papierowej karty detektora) wiązki w oknie wyrównania autokorelatora.</li>
			<li>W przypadku natężenia świateł bezwiązkowych lub mijania należy dostosować położenie i orientację FFM/AM w optymalnym stopniu i spróbować wyregulować lustro wejściowe (zamontowane na autokorelatorze), aby zmaksymalizować sygnał impulsu laserowego. Sygnał autokorelatora uzyskuje się, jak pokazano na rysunku Rysunek 5a.</li>
			<li>Zatrzymaj OPO i rzutuj wiązkę Ti:Sa z FFM/AM, aby wprowadzić lustro do autokorelatora. Powtórz kroki 3.2.2.6 i 3.2.2.7. Sygnał autokorelatora uzyskuje się, jak pokazano na rysunku Rysunek 5b.</li>
			<li>Ustaw mikrometr regulacji odległości wiązki w pozycji krzyżowej (7.30 mm).</li>
			<li>Zwolnij obie belki.</li>
			<li>Zeskanuj linię opóźniającą, aby uzyskać nakładanie się dwóch wiązek OPO i Ti:Sa. Sygnał korelatora krzyżowego uzyskuje się, jak pokazano na rysunku Rysunek 6.</li>
			<li>Odwróć lustro FFM/AM tak, aby wiązki mogły dotrzeć do M7 i głowicy skanującej mikroskopu.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyrównanie mikroskopu
	<ol>
		<li>Wykonaj obserwację mikroskopową w świetle białym: 
		UWAGA: Przed obserwacją mikroskopową upewnij się, że mikroskop jest prawidłowo ustawiony.
		<ol>
			<li>Przygotować próbkę do badań, która składa się z roztworu buforu fosforanowego, w którym rozproszone są kulki polistyrenu o średnicy 3 μm. Roztwór umieszcza się w kanapce składającej się z dwóch szklanych szkiełek.</li>
			<li>Włącz mikroskop i zasilanie światłem białym. Postępuj zgodnie z instrukcją obserwacji w białym świetle.</li>
			<li>Użyj kondensatora, aby oświetlić próbkę. Użyj celu 60x, aby zebrać światło. Umieścić próbkę na stoliku. Zoptymalizuj ogniskową obiektywu mikroskopu 60x.</li>
			<li>Wybierz pole widzenia, które Cię interesuje. Weź obraz CCD próbki (Rysunek 7).</li>
			<li>Wyłącz zasilanie białym światłem.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Osiowanie mikroskopu za pomocą femtosekundowych wiązek laserowych: OPO i Ti:Sa
		<ol>
			<li>Wyjmij kondensor za pomocą przycisku ucieczki, aby tymczasowo schować soczewkę obiektywu mikroskopu 60x. Przesuń soczewkę obiektywu mikroskopu 60x poza tor optyczny, obracając końcówkę.</li>
			<li>Zamontuj detektor w górnej części mikroskopu za pomocą zewnętrznego mocowania mechanicznego. Podłącz wyjście detektora przez filtr dolnoprzepustowy 50Ω do oscyloskopu i monitoruj sygnał OPO.</li>
			<li>Włącz procesor sterujący głowicą skanera. Skieruj wiązkę OPO na głowicę skanera mikroskopu.</li>
			<li>Sprawdź położenie wiązki wewnątrz mikroskopu, upewnij się, że położenie wiązki znajduje się w środku lub blisko środka.</li>
			<li>Sprawdź, czy położenie belki wewnątrz głowicy wyładowań niezupełnych znajduje się pośrodku.</li>
			<li>Zmaksymalizuj moc mierzoną przez detektor za pomocą translatora x-y.</li>
			<li>Przełącz wiązkę z OPO na Ti:Sa i sprawdź, czy maksymalny sygnał jest uzyskiwany również dla lasera tytanowo-szafirowego. Oznacza to, że obie belki są dobrze wyrównane.</li>
			<li>Zakończ wyrównanie wiązki, wprowadzając soczewkę obiektywu mikroskopu 60x i obracając końcówkę do tyłu.</li>
			<li>Użyj przycisku zmiany ostrości na mikroskopie, aby odzyskać ostateczną ostrość na obiektywie mikroskopu 60x.</li>
			<li>Umieść obiektyw z powiększeniem 40x w miejscu kondensora bez dotykania lub naruszania próbki.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Optymalizacja synchronizacji przestrzennych i czasowych belek
	<ol>
		<li>Synchronizacja czasowa
		<ol>
			<li>Ustaw moc Ti:Sa i OPO mierzoną przed mikroskopem na 30 mW dla obu wiązek. Ustaw długość fali OPO na inną wartość w stosunku do poprzedniej, aby pompa i sonda nie były w rezonansie z częstotliwością drgań koralików.</li>
			<li>Zwolnij obie wiązki (Ti:Sa i OPO), aby weszły do mikroskopu.</li>
			<li>Uruchom skomputeryzowany translator linii opóźniającej skanowanie i zapisz zmierzoną intensywność za pomocą LIA dla każdej pozycji linii opóźniającej. Poczekaj, aż skanowanie linii opóźniającej zostanie zakończone. Uzyskany profil czasowy jest wizualizowany w <silna klasa="xfig">Rysunek 8a.</li>
			<li>Ponownie ustaw długość fali OPO na 1076 nm, tak aby pompa i sonda były w rezonansie z częstotliwością drgań koralików. Powtórz krok 3.4.1.3 (uzyskany profil czasowy jest wizualizowany w Rysunek 8b).</li>
			<li>Ustaw uzyskaną pozycję wiązki nakładającej się na linii opóźnienia, aby uzyskać obrazy SRS.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Synchronizacja przestrzenna belek 
		UWAGA: Obrazy transmisyjne są przydatne do optymalizacji pola widzenia, oświetlenia i położenia ogniskowej obiektywów mikroskopu oraz do sprawdzenia, czy dwie wiązki nakładają się przestrzennie.
		<ol>
			<li>Akwizycja obrazu transmisyjnego OPO
			<ol>
				<li>Zatrzymaj wiązkę Ti:Sa i zmniejsz moc OPO do 8 mW.</li>
				<li>Podłącz odczyt czujki do karty akwizycji danych.</li>
				<li>Uruchom program do akwizycji danych wraz z konsolą skanowania mikroskopu.</li>
				<li>Zapisz plik i przetwórz dane, aby uzyskać obraz. Surowy obraz wygląda tak, jak pokazano na Rysunek 9a.</li>
			</ol>
			</li>
			<li>Akwizycja obrazu transmisyjnego Ti:Sa
			<ol>
				<li>Zatrzymaj wiązkę OPO i zmniejsz moc Ti:Sa do 2,5–4,5 mW.</li>
				<li>Połącz czujkę z odczytami LIA i LIA z kartą akwizycji danych.</li>
				<li>Powtórz kroki 3.4.2.1.3 i 3.4.2.1.4. Surowy obraz wygląda tak, jak pokazano na rysunku Rysunek 9b.</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Akwizycja obrazu SRS
UWAGA: Dedykowany algorytm został zrealizowany w celu przechowywania danych. Obsługuje następujące formaty obrazów: 512 x 512 px i 256 px x 256 px, z czasami akwizycji 16 s, 8 s, 4 s i 2 s.
<ol>
	<li>Wprowadź stos filtrów pomiędzy obiektyw 40x a PD, aby usunąć impulsy pompy (Ti:Sa) i uzyskać tylko sygnał Stokesa (OPO).</li>
	<li>Ustaw sygnał pompy na 810 nm z mocą skupioną 8 mW, a sygnał sondy na 1076 nm z mocą skupioną 8 mW, aby zbadać typowe wiązanie C-H polistyrenu (przesunięcie Ramana 3054 cm−1).</li>
	<li>Podłącz czujkę z odczytem LIA i LIA do karty akwizycji danych.</li>
	<li>Ustaw format pikseli akwizycji obrazu zgodnie z wymaganiami i ustaw czas pozyskiwania.</li>
	<li>Uruchom program sterujący sterownikiem mikroskopu.</li>
	<li>Uruchom dedykowany program algorytmu, który działa jako synchronizacja między sterownikiem mikroskopu, systemem detekcji i DAQ (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 4).</li>
	<li>Zapisz plik macierzy po zakończeniu akwizycji.</li>
	<li>Zaimportuj plik danych RAW i zapisz obraz w wymaganym formacie (zwykle zapisywanym w formacie .tif) za pomocą oprogramowania ImageJ. Obraz jest pokazany w Rysunek 10.</li>
</ol>

<ol><li>Saar, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video-Rate+Molecular+Imaging+in+Vivo+with+Stimulated+Raman+Scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Video-Rate Molecular Imaging in Vivo with Stimulated Raman Scattering.</a> Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).</li>
<li>Zhang, D., Wang, P., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+Vibrational+Imaging+of+Single+Cells+and+Tissues+by+Stimulated+Raman+Scattering+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Fast Vibrational Imaging of Single Cells and Tissues by Stimulated Raman Scattering Microscopy.</a> Accounts of Chemical Research. 47 (8), 2282-2290 (2014).</li>
<li>Alfonso-García, A., Mittal, R., Lee, E. S., Potma, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+imaging+with+coherent+Raman+scattering+microscopy%3A+a+tutorial%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Biological imaging with coherent Raman scattering microscopy: a tutorial.</a> Journal of Biomedical Optics. 19 (7), 071407(2014).</li>
<li>Cheng, J. X., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrational+spectroscopic+imaging+of+living+systems%3A+An+emerging+platform+for+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine.</a> Science. 350 (6264), aaa8870(2015).</li>
<li>Camp, C. H., Cicerone, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+sensitive+bioimaging+with+coherent+Raman+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Photonics%22%5BJournal%5D)">Chemically sensitive bioimaging with coherent Raman scattering.</a> Nature Photonics. 9 (5), 295-305 (2015).</li>
<li>D’Arco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+chemical+and+morphological+analysis+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy+and+image+analysis+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Subcellular chemical and morphological analysis by stimulated Raman scattering microscopy and image analysis techniques.</a> Biomedical Optics Express. 7 (5), 1853(2016).</li>
<li>D'Arco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+small+lipid+droplets+by+femtosecond-stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nonlinear+Optical+Physics+%26+Materials%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of small lipid droplets by femtosecond-stimulated Raman scattering microscopy.</a> Journal of Nonlinear Optical Physics & Materials. 26 (4), (2017).</li>
<li>Ranjan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+stimulated+Raman+gain+and+stimulated+Raman+losses+detection+modes+in+a+single+nonlinear+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Integration of stimulated Raman gain and stimulated Raman losses detection modes in a single nonlinear microscope.</a> Optics Express. 26 (20), 26317(2018).</li>
<li>Reid, D. T., Sun, J., Lamour, T. P., Ferreiro, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+ultrafast+optical+parametric+oscillators%5BTitle%5D)+AND+%22Laser+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Advances in ultrafast optical parametric oscillators.</a> Laser Physics Letters. 8 (1), 8-15 (2011).</li>
<li>Zumbusch, A., Langbein, W., Borri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+vibrational+microscopy+applied+to+lipid+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Nonlinear vibrational microscopy applied to lipid biology.</a> Progress in Lipid Research. 52 (4), 615-632 (2013).</li>
<li>Suzuki, M., Shinohara, Y., Ohsaki, Y., Fujimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets%3A+Size+matters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Electron+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets: Size matters.</a> Journal of Electron Microscopy. 60 (1), S101-S116 (2011).</li>
<li>Rizzatti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+characterization+in+adipocyte+differentiated+3T3-L1+cells%3A+size+and+optical+density+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets characterization in adipocyte differentiated 3T3-L1 cells: size and optical density distribution.</a> European Journal of Histochemistry. 57 (3), 159-162 (2013).</li>
<li>Alfonso Garcia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((D38-cholesterol+as+a+Raman+active+probe+for+imaging+intracellular+cholesterol+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">D38-cholesterol as a Raman active probe for imaging intracellular cholesterol storage.</a> Journal of Biomedical Optics. 21 (6), (2016).</li>
<li>Mukherjee, S., Zha, X., Tabas, I., Maxfield, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+distribution+in+living+cells%3A+fluorescence+imaging+using+dehydroergosterol+as+a+fluorescent+cholesterol+analog%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cholesterol distribution in living cells: fluorescence imaging using dehydroergosterol as a fluorescent cholesterol analog.</a> Biophysical Journal. 75 (4), 1915-1925 (1998).</li>
<li>Fukumoto, S., Fujimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deformation+of+lipid+droplets+in+fixed+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Deformation of lipid droplets in fixed samples.</a> Histochemistry and Cell Biology. 118 (5), 423-428 (2002).</li>
<li>Kinkel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oil+red-O+stains+non-adipogenic+cells%3A+A+precautionary+note%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Oil red-O stains non-adipogenic cells: A precautionary note.</a> Cytotechnology. 46 (1), 49-56 (2004).</li>
<li>Wei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-Cell+Bioorthogonal+Chemical+Imaging%3A+Stimulated+Raman+Scattering+Microscopy+of+Vibrational+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Live-Cell Bioorthogonal Chemical Imaging: Stimulated Raman Scattering Microscopy of Vibrational Probes.</a> Accounts of Chemical Research. 49 (8), 1494-1502 (2016).</li>
<li>Ozeki, Y., Asai, T., Shou, J., Yoshimi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+Stimulated+Raman+Scattering+Microscopy+with+Fast+Wavelength-Tunable+Yb+Fiber+Laser%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Journal+of+Selected+Topics+in+Quantum+Electronics%22%5BJournal%5D)">Multicolor Stimulated Raman Scattering Microscopy with Fast Wavelength-Tunable Yb Fiber Laser.</a> IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 25 (1), 1-11 (2019).</li>
<li>Saar, B. G., Contreras-Rojas, L. R., Xie, X. S., Guy, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Drug+Delivery+to+Skin+with+Stimulated+Raman+Scattering+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Imaging Drug Delivery to Skin with Stimulated Raman Scattering Microscopy.</a> Molecular Pharmaceutics. 8 (3), 969-975 (2011).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volumetric+chemical+imaging+by+stimulated+Raman+projection+microscopy+and+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Volumetric chemical imaging by stimulated Raman projection microscopy and tomography.</a> Nature Communications. 8, 15117(2017).</li>
<li>Ferrara, M. A., Filograna, A., Ranjan, R., Corda, D., Valente, C., Sirleto, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Threedimensional+label-free+imaging+throughout+adipocyte+differentiation+by+stimulated+Raman+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Threedimensional label-free imaging throughout adipocyte differentiation by stimulated Raman microscopy.</a> PLoS ONE. 14 (5), e0216811(2019).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Mikroskopia SRS przeniosła obrazowanie bezznacznikowe na nowy poziom, zwłaszcza w badaniach złożonych struktur biologicznych, takich jak lipidy, które mają fundamentalne znaczenie dla komórek i architektury komórkowej. Lipidy biorą udział w wielu szlakach fizjologicznych, takich jak produkcja błon biologicznych, i służą jako prekursory biosyntezy i przetworniki sygnałów10. Lipidy są pakowane w wyspecjalizowane organelle wewnątrzkomórkowe, zwane również kropelkami lipidów (LD). Ich średnice wahają ...

W zastosowaniach nauk przyrodniczych, mikroskopia SRS stała się potężnym narzędziem do obrazowania bez znaczników. Podstawową ideą mikroskopii SRS jest połączenie siły kontrastu wibracyjnego i jego zdolności do pozyskiwania obrazów w ciągu kilku sekund.
SRS to proces, w którym różnica częstotliwości między dwoma częstotliwościami wiązki laserowej (sygnał pompy i sygnał Stokesa o różnych częstotliwościach) odpowiada drganiom molekularnym badanej próbki, powodując stymulowane rozpraszanie Ramana i znaczny wzrost sygnału Stokesa. W przeciwieństwie do liniowej spektroskopii Ramana, SRS wykazuje nieliniową zależność od przychodzących pól świetlnych i wytwarza promieniowanie koherentne. SRS ma dwie podstawowe zalety: 1) szybkość, która sprawia, że obrazy są mniej wrażliwe na artefakty wynikające z ruchu lub degradacji próbki, oraz 2) doskonały stosunek sygnału do szumu (SNR). Ponadto SRS wykazuje widmo identyczne ze spontanicznym Ramanem, a sygnał SRS jest liniowo proporcjonalny do stężenia wzbudzonego wiązania chemicznego sup class=1,2,3,4,5.
W naszym mikroskopie, femtosekundowy (fs) eksperymentalny układ SRS jest zintegrowany z odwróconym mikroskopem optycznym wyposażonym w szybki moduł skanowania luster (Rysunek 1)6,7,8. Do realizacji tego mikroskopu wykorzystywane są dwa impulsowe źródła laserowe. Pierwszym z nich jest fs-Ti:Sa o czasie trwania impulsu około 140 fs, częstotliwości powtarzania 80 MHz i długościach fal emisyjnych w zakresie 680-1080 nm. Drugi, używany jako wiązka sondy i pompowany przez Ti:Sa, to femtosekundowy zsynchronizowany optyczny oscylator parametryczny (SOPO), o czasie trwania impulsu około 200 fs, częstotliwości powtarzania 80 MHz i długościach fal emisji w zakresie 1000-1600 nm. Należy zauważyć, że minimalna różnica energii fotonów pomiędzy wiązką Ti:Sa a SOPO wynosi 2500 cm-1. W związku z tym, korzystając z tej kombinacji systemów laserowych, można badać tylko obszar C-H o wysokiej częstotliwości (2800-3200 cm-1) widm Ramana6,7,8.
Aby skonfigurować mikroskop SRS, należy rozważyć trzy kluczowe kwestie, które są opisane w kolejnych akapitach. Pierwszym z nich jest implementacja metody transferu modulacji wysokiej częstotliwości (zobacz opis Rysunek 2 i krok 2.1 protokołu). W badaniu eksperymentalnym SRS kluczowym parametrem jest czułość systemu. Sygnał SRS jest wykrywany jako niewielka zmiana intensywności wiązek wzbudzenia; Dlatego może zostać uszkodzony przez hałas o natężeniu lasera i odgłos strzału. Ten problem można rozwiązać, integrując ten system z metodą przesyłania modulacji wysokiej częstotliwości (zobacz Rysunek 2 i krok 2.1 protokołu, aby uzyskać szczegółowe informacje). W tej metodzie do modulacji pompy stosuje się modulator elektrooptyczny (EOM). Modulacja przekazywana do wiązki sondy może być następnie wykryta przez wyładowanie niezupełnego po zablokowaniu wiązki pompy stosem filtrów optycznych [tryb detekcji stymulowanego wzmocnienia Ramana (SRG)]. Wyjście PD jest połączone filtrem dolnoprzepustowym ze wzmacniaczem blokującym (LIA), który demoduluje mierzony sygnał. Zwiększając częstotliwość modulacji wiązki do częstotliwości powyżej 1 MHz, można uzyskać wewnętrzną granicę wyładowań niezupełnych.
Drugą kwestią do rozważenia jest instalacja mechanicznego montażu, który pozwala na przeprowadzenie detekcji do przodu i jednocześnie zachowanie obserwacji mikroskopowej w jasnym polu. Ponadto musi redukować szumy spowodowane drganiami mechanicznymi podczas generowania obrazów i umożliwiać precyzyjną zmianę położenia systemu detekcji (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 3 i krok 2.2 protokołu).
Trzeci to synchronizacja sygnału uzyskanego przez schemat detekcji czułej na fazę, z wiązką skierowaną na próbkę monitorowaną przez głowicę skanującą mikroskopu. Aby uzyskać obrazy, SM wymagają trzech sygnałów TTL, które są udostępniane przez kontroler mikroskopu podłączony do jednostki głównej skanowania: zegar pikseli, synchronizacja linii i synchronizacja klatek. Synchronizacja jest osiągana poprzez sterowanie za pomocą karty PCI, trzema sygnałami TTL oraz akwizycję sygnału napięciowego na kanale wyjściowym LIA6,7,8. Wcześniej opracowano i opisano domowe oprogramowanie6,7,8, podczas gdy sprzęt systemu synchronizacji jest opisany w Rysunek 4.
Podstawową procedurą podczas wykonywania obrazowania SRS jest ustawienie mikroskopu. Realizuje się to w czterech krokach, które zostały opisane w kolejnych akapitach. Pierwszym z nich jest przestrzenne zachodzenie na siebie dwóch wiązek (zob. krok 3.1 protokołu). W tym eksperymentalnym układzie obie wiązki zostały przestrzennie współliniowo połączone przez dichroiczne zwierciadło. Wstępnym krokiem jest wyrównanie OPO i Ti:Sa tak, aby każdy z nich dotarł do mikroskopu. Następnie, biorąc pod uwagę OPO jako wiązkę odniesienia i wykorzystując detektor czuły na położenie, Ti:Sa nakłada się przestrzennie na OPO.
Drugim kluczowym aspektem jest czasowe nakładanie się dwóch wiązek (zobacz krok 3.2 protokołu). Nawet jeśli wiązki pompy i OPO są idealnie zsynchronizowane9, ponieważ podążają nieco innymi ścieżkami wiązki wewnątrz obudowy OPO, na wyjściu OPO mają opóźnienie czasowe około 5 ns i różnicę przestrzenną 5 cm. W związku z tym Ti:Sa i OPO wymagają optycznego ponownego dopasowania czasu, aby zapewnić czasowe nakładanie się próbki. Zazwyczaj osiąga się to za pomocą precyzyjnie przestrajalnej optycznej linii opóźniającej, która w tym przypadku jest wprowadzana między Ti:Sa a mikroskop (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1). Aby uzyskać czasowe nakładanie się dwóch belek, stosuje się dwie techniki. Pierwsza z nich jest realizowana za pomocą szybkiego PD i oscyloskopu, podczas gdy druga opiera się na auto- i krzyżowych korelacjach optycznych. Za pomocą pierwszej techniki uzyskuje się przybliżone nakładanie się dwóch wiązek (niepewność 10 ps), natomiast dokładne czasowe nakładanie się dwóch wiązek uzyskuje się za pomocą korelatora krzyżowego (rozdzielczość 1 fs).
Trzecim kluczowym aspektem jest wyrównanie dwóch wiązek wewnątrz mikroskopu (zobacz krok 3.3 protokołu). Wstępna obserwacja próbki w świetle białym pozwala na indywidualizację pożądanego pola widzenia (FOV). Następnie wiązki laserowe, wchodzące do mikroskopu przez boczny port mikroskopu, są ustawiane tak, aby dotrzeć do PD zamontowanego w górnej części (<silna klasa="xfig">Rysunek 3). Jednak aby uzyskać poprawną akwizycję obrazu, wymagane jest ustawienie szeregu parametrów (na przykład wymiaru piksela i czasu przebywania piksela). Częstotliwość próbkowania musi respektować ograniczenie nałożone przez twierdzenie Nyquista w celu zachowania wszystkich informacji na obrazie, podczas gdy dla prawidłowej zgodności między współrzędnymi przestrzennymi pikseli a wartością SRS mierzoną w każdym pikselu, czas całkowania LIA powinien być równy lub porównywalny z czasem przebywania piksela.
W końcowym etapie ustawiania mikroskopu przeprowadzane są liczne testy optymalizujące wyrównanie przestrzenne i czasowe (zobacz krok 3.4 protokołu). Pewna liczba obrazów transmisyjnych (TI) zarówno dla Ti:SA, jak i OPO jest pozyskiwana w celu optymalizacji nakładania się przestrzennego. W TI używana jest pojedyncza wiązka, a natężenie wiązki przesyłanej z próbki jest mierzone za pomocą wyładowań niezupełnych. W przypadku TI realizowanego przez OPO, sygnał wyjściowy PD jest bezpośrednio podłączony do karty PCI, podczas gdy w przypadku TI realizowanego przez Ti:Sa, sygnał wyjściowy PD jest podłączony do LIA, a wyjście analogowe LIA jest podłączone do karty PCI. Obrazy transmisyjne są bardzo przydatne do optymalizacji pola widzenia, oświetlenia, ogniskowej obiektywów mikroskopu oraz do sprawdzenia, czy dwie wiązki przestrzennie zachodzą na siebie6,7,8.
Optymalizacja czasowego nakładania się pompy i wiązki sondy jest uzyskiwana poprzez skanowanie linii opóźniającej z krokami 0,001 mm odpowiadającymi przesunięciu czasowemu o 3,3 fs i przeprowadzenie pomiaru SRS w jednym punkcie próbki kulki polistyrenowej o średnicy 3 μm. Amplituda sygnału SRS mierzy wartości z LIA w funkcji opóźnienia sonda-pompa i zapewnia maksimum odpowiadające dokładnemu czasowemu nakładaniu się dwóch wiązek6,7,8. Przed zakończeniem należy zauważyć, że wszystkie omówione kroki są obowiązkowe w celu uzyskania obrazu wysokiej jakości.

<table><tbody><tr><td>Narzędzie do analizy</td><td>dźwięku Nikon</td><td>Nikon C2Tool</td><td>Narzędzie obsługiwane przez technologię Acquisation</td></tr><tr><td>Oprogramowanie sterujące łączem impulsowym</td><td>APE-APE</td> <td>Oprogramowanie do sterowania łączem impulsowym</td><td>Sterowanie</td></tr><tr><td>autokorelatorem</td><td>APE</td><td>APE PulseCheck USB 50</td><td>Autokorelator</td></tr><tr><td>Detektor</td><td>Thorlabs</td><td>Thorlabs DET10A</td><td></td></tr><tr><td>Karta detektora</td> fotodiody <td>Thorlabs</td><td>Detektor podczerwieni</td> <td>Thorlabs VRC</td></tr><tr><td>Lustro dichroiczne</td><td>Semrock</td><td>Semrock FF875-Di01-25X36</td><td>Lustro dichroiczne</td></tr><tr><td>Lustro dichroiczne</td><td>Semrock</td><td>FF875-Di01-25x36</td><td>Lustro dichroiczne</td></tr><tr><td>EOM</td><td>Conoptics</td> <td>(EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P).</td><td>Komórka Pockelsa</td></tr><tr><td>Szybki detektor</td><td>Thorlabs</td><td>Thorlabs DET025AL/M</td><td>Fotodioda</td></tr><tr><td>Szybki skaner lustrzany</td><td>Nikon</td><td>C2</td><td>Głowica skanująca Microscpe</td></tr><tr><td>Laser femtosekundowy Ti:SA</td><td>Spójny</td><td>Koherentny Kameleon Ultra II</td><td>Chameleon Ultra II</td></tr><tr><td>Generator funkcyjny</td><td>TTi</td><td>TG5011 AIM &ndash; </td><td>Generator funkcyjny</td>TTi</tr><tr><td>Odwrócony mikroskop optyczny</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TE-2000-E, Nikon</td><td>Eclipse TE-2000-E,</td></tr><tr><td>Nikon Lock-in Amplifier</td><td>Standford Research System</td><td>SR844-200 MHz dwufazowy</td><td>wzmacniacz blokujący A firmy Stanford Research Systems</td></tr><tr><td>Filtr wycinający,</td> <td>Semrock</td><td>NF03-808E-25</td><td>Filtr wycinający</td></tr><tr><td>Optyczny przewód opóźniający</td><td>Newport</td><td>Newport Newport M-ILS200CC</td><td>Przestrajalna optyczna linia opóźniająca</td></tr><tr><td>Optyczny oscylator parametryczny</td><td>Koherentny</td><td>koherentny Kompaktowy OPO</td><td>Koherentny Kompaktowy</td></tr><tr><td>oscyloskop</td> OPO <td>WaveRunner</td><td>640Zi 4GHz OSC/LeCroy</td><td>Oscyloskop</td></tr><tr><td>cyfrowy Karta PCI Przyrząd</td><td>krajowy</td><td>NI PCIe 6363</td><td>Karta do gromadzenia danych</td></tr><tr><td>Czujniki położenia Detektory</td><td>Newport</td><td>Newport Conex PSD9</td><td>Czujnik czujnika położenia</td></tr><tr><td>Głowica miernika mocy</td><td>Coherent</td><td>PowerMax PM10,</td> <td>Laserowy detektor mocy</td></tr><tr><td>Etapy translacji</td><td>Thorlabs</td><td>Thorlabs PT1/M</td><td>Mechaniczny stolik translacyjny ze standardowym mikrometrem</td></tr></tbody></table>

wdrożenie mikroskopu nieliniowego opartego na wymuszonym rozpraszaniu ramana

Implementation of a Nonlinear Microscope Based on Stimulated Raman Scattering

Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) wykorzystuje światło wzbudzające w bliskiej podczerwieni; dlatego ma wiele właściwości obrazowania mikroskopowego wielofotonowego. Metodę obrazowania SRS można uzyskać przy użyciu komercyjnych laserowych mikroskopów skaningowych, wyposażając się w detektor przednie bez deskryptacji z odpowiednimi filtrami pasmowoprzepustowymi i schematem wykrywania wzmacniacza blokującego (LIA). Schematyczny układ typowego mikroskopu SRS obejmuje: dwie impulsowe wiązki laserowe (tj. pompę i sondę skierowane w mikroskopie skaningowym), które muszą nakładać się na siebie zarówno w przestrzeni, jak i czasie na płaszczyźnie obrazu, a następnie zogniskowane przez obiektyw mikroskopu w próbce przez dwa lustra skanujące (SM), które rasterują ognisko w płaszczyźnie x-y. Po interakcji z próbką, transmitowane impulsy wyjściowe są zbierane przez górny obiektyw i mierzone przez system detekcji do przodu umieszczony w odwróconym mikroskopie. Impulsy pompy są usuwane przez stos filtrów optycznych, natomiast impulsy sondy, które są wynikiem procesu SRS zachodzącego w objętości ogniskowej próbki, są mierzone za pomocą fotodiody (PD). Odczyt wyładowań niezupełnych jest demodulowany przez LIA w celu wyodrębnienia głębokości modulacji. Obraz dwuwymiarowy (2D) uzyskuje się poprzez synchronizację jednostki detekcji do przodu z jednostką skanującą mikroskopu. W artykule opisano i z powodzeniem zademonstrowano zastosowanie mikroskopu SRS, a także raportowanie bezznacznikowych obrazów kulek polistyrenowych o średnicy 3 μm. Warto zauważyć, że mikroskopy SRS nie są dostępne na rynku, więc aby skorzystać z tych cech, jedyną opcją jest domowa konstrukcja. Ponieważ mikroskopia SRS staje się coraz bardziej popularna w wielu dziedzinach, uważa się, że ten dokładny opis wdrożenia mikroskopu SRS może być bardzo przydatny dla społeczności naukowej.

Przykład pomiaru SRS (tj. pomiaru SRS w pojedynczym punkcie próbki) przedstawiono na Rysunku 7. Wynik uzyskany w sytuacji, gdy wiązki nie nakładają się w czasie lub przestrzeni, przedstawiono na Rysunku 8a. Poza rezonansem amplituda sygnału mierzonego przez LIA wynosi zero, natomiast faza sygnału mierzonego przez LIA gwałtownie zmienia się między wartościami ujemnymi a dodatnimi. Z kolei w przypadku nakładania się wiązek w przestrzeni, przy przesunięciu l...

W tym manuskrypcie opisana jest implementacja mikroskopu z wymuszonym rozpraszaniem Ramana (SRS), uzyskanego przez integrację eksperymentalnego zestawu SRS z laserowym mikroskopem skaningowym. Mikroskop SRS oparty jest na dwóch femtosekundowych (fs) źródłach laserowych, Ti-Sapphire (Ti:Sa) i zsynchronizowanym optycznym oscylatorze parametrycznym (OPO).

Wdrożenie mikroskopu nieliniowego opartego na wymuszonym rozpraszaniu Ramana

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy uses near-infrared excitation light; therefore, it shares many multi-photon microscopic imaging properties. ...

Protokół ten może pomóc naukowcom zainteresowanym mikroskopią nieliniową w zrozumieniu kluczowych elementów, konfiguracji i procedury ustawiania mikroskopu opartego na wymuszonym rozpraszaniu Ramana. Głównymi zaletami mikroskopii SRS są jej zdolność do wykonywania obrazowania bez znaczników w oparciu o kontrast wibracyjny oraz do uzyskania obrazu w ciągu kilku sekund. Mikroskopia SRS przeniosła obrazowanie bezznacznikowe na nowy poziom, zwłaszcza badania złożonych struktur biologicznych, takich jak lipidy, które mają fundamentalne znaczenie dla komórek i architektury komórkowej.Sygnał SRS jest wykrywany jako niewielka zmiana intensywności wiązki sondy i może zostać zniekształcony przez szum. Dlatego tak ważny jest dokładny znak. Aby rozpocząć, ustaw OPO i wiązki lasera tytanowo-szafirowego tak, aby oba docierały do mikroskopu.Następnie umieść detektory czujnika położenia wiązki laserowej w dwóch pozycjach pomiędzy zwierciadłem dichroicznym numer jeden a lustrem szóstym. Pierwsza pozycja znajduje się w pobliżu zwierciadła dichroicznego pierwszego, a druga znajduje się w pobliżu zwierciadła szóstego. Dla każdej pozycji użyj czujników, aby wykryć współrzędne X i Y wiązki OPO.Co ważne, sprawdź, czy współrzędne X i Y wiązki laserowej tytanowo-szafirowej mają ten sam OPO w obu pozycjach detektorów czujnika. Jeśli w niektórych pozycjach współrzędne nie pokrywają się, dostosuj nachylenie sąsiedniego lustra, aby to skompensować. Postępuj zgodnie z tą samą procedurą, aby wyrównać pozycje wiązki tytanowo-szafirowej względem OPO dla ścieżki między szóstym a siódmym zwierciadłem.Zainstaluj dodatkowe lustro na uchwycie typu flip-flop pomiędzy lustrem szóstym a siódmym i obróć mocowanie lustra, aby skierować wiązkę do autokorelatora. Włącz sterownik autokorelatora, uruchom aplikację na komputerze sterującym nim i ustaw regulacji odległości wiązki autokorelatora w normalnym położeniu na 8,35 milimetra. Następnie zatrzymaj wiązkę tytanowo-szafirową i zwolnij i wyświetl wiązkę OPO z dodatkowego lustra na lustro wejściowe autokorelatora.Spróbuj wyregulować lustro wejściowe, aby zmaksymalizować sygnał impulsu laserowego, jak pokazano tutaj. Następnie zatrzymaj wiązkę OPO, zwolnij i wyświetl wiązkę tytanowo-szafirową z lustra zamontowanego na przerzutniku do lustra wejściowego i do autokorelatora. Powtarzaj optymalną regulację wiązki, aż do uzyskania pokazanego tutaj sygnału autokorelatora.Teraz ustaw regulacji odległości belki w pozycji krzyżowej na 7,30 milimetra. Zwolnij obie belki i zeskanuj opóźnioną linię, aby nałożyła się na dwie belki. Uzyskaj wynikowy sygnał korelatora krzyżowego, jak pokazano tutaj.Następnie odwróć lustro zamontowane na klapie tak, aby wiązki mogły dotrzeć do lustra siódmego i głowicy skanującej mikroskopu. Wyjmij kondensator i użyj przycisku ucieczki, aby tymczasowo schować obiektyw subiektywny 60x. Następnie obróć końcówkę, aby przesunąć obiektyw subiektywny 60x poza ścieżkę optyczną.Następnie zamontuj detektor w górnej części mikroskopu za pomocą zewnętrznego mocowania mechanicznego. Podłącz wyjście detektora przez filtr dolnoprzepustowy 50 omów do oscyloskopu. Teraz włącz procesor sterujący głowicą skanera i skieruj wiązkę OPO na głowicę skanera mikroskopu.Monitoruj sygnał OPO i maksymalizuj moc mierzoną przez detektor za pomocą translatora XY. Następnie przełącz wiązkę z lasera OPO na laser tytanowo-szafirowy i sprawdź, czy uzyskany jest również sygnał dla lasera tytanowo-szafirowego. Oznacza to, że obie belki są dobrze wyrównane.Zakończ wyrównanie wiązki, obracając końcówkę nosową do tyłu, aby wprowadzić subiektywny 60x. Następnie użyj przycisku zmiany ostrości na mikroskopie, aby odzyskać ostateczną ostrość na soczewce obiektywu mikroskopu 60x. Na koniec umieść obiektyw z powiększeniem 40x w miejscu kondensatora, nie dotykając ani nie naruszając próbki.Ustaw moc laserów tytanowo-szafirowych i OPO mierzoną przed mikroskopem na 30 miliwatów dla obu wiązek. Następnie ustaw długość fali lasera OPO na inną wartość, w stosunku do poprzedniej, tak aby pompa i sonda nie były w rezonansie z częstotliwością drgań kulek. Następnie zwolnij obie wiązki, aby weszły do mikroskopu.Uruchom skomputeryzowany translator linii opóźniającej skanowanie i zarejestruj zmierzoną intensywność za pomocą wzmacniacza blokującego dla każdej pozycji linii opóźniającej. Poczekaj, aż skanowanie linii opóźniającej zostanie zakończone. Teraz ustaw długość fali OPO z powrotem na 1076 nanometrów, tak aby pompa i sonda były w rezonansie z częstotliwością wibracji kulek.Uruchom skomputeryzowany translator linii opóźnienia skanowania i poczekaj, aż skanowanie linii opóźnienia zostanie zakończone. Na koniec należy ustawić uzyskaną pozycję wiązki nakładającej się oraz linię opóźnienia dla następnej akwizycji wymuszonych obrazów rozpraszania Ramana. Aby zoptymalizować synchronizację przestrzenną wiązek, zacznij od zatrzymania wiązki tytanowo-szafirowej i zmniejszenia mocy OPO do ośmiu miliwatów.Następnie podłącz odczyt czujki do karty akwizycji danych. Uruchom program do akwizycji danych wraz z konsolą skanowania mikroskopu. Po zakończeniu zapisz plik i przetwórz dane, aby uzyskać obraz podobny do pokazanego tutaj.Następnie zatrzymaj wiązkę OPO i zmniejsz moc tytanowo-szafirową do 2,5 do 4,5 miliwatów. Połącz czujkę ze wzmacniaczem lock-in, a jego odczyty z kartą akwizycji danych. Następnie ponownie uruchom program do akwizycji danych wraz z konsolą skanowania mikroskopu.Po zakończeniu zapisz plik i przetwórz dane, aby uzyskać obraz podobny do pokazanego tutaj. Wprowadź stos filtrów pomiędzy obiektywem 40x a fotodiodą, aby usunąć impulsy pompy i uzyskać tylko sygnał skoku. Następnie ustaw sygnał pompy na 810 nanometrów ze skupioną mocą ośmiu miliwatów.Ustaw sygnał sondy na 1076 nanometrów z tą samą skupioną mocą ośmiu miliwatów, aby zbadać typowe wiązanie węgiel-wodór polistyrenu z przesunięciem Ramana o 3054 centymetry wsteczne. Podłącz detektor do wzmacniacza lock-in i wzmacniacza lock-in odczyt z karty akwizycji danych. Na koniec ustaw format pikseli i czas akwizycji w programie mikroskopowym i uruchom go wraz z systemem akwizycji danych, zapisując plik matrycy po jego zakończeniu.W tym miejscu wyświetlany jest przykładowy pomiar z pojedynczego punktu próbki. Gdy wiązka nie nakłada się na siebie w czasie lub przestrzeni, uzyskany wynik jest poza rezonansem, gdzie amplituda sygnału, mierzona przez wzmacniacz typu lock-in, wynosi zero. Faza tego sygnału przeskakuje jednak między wartościami ujemnymi i dodatnimi.Jeśli wiązki zachodzą na siebie w przestrzeni, sygnał wzrasta i osiąga maksimum, gdy wiązki idealnie nakładają się na siebie w czasie, podczas gdy faza zaczyna osiągać stałą wartość w czasie, w którym wiązki się nakładają. W obrazie transmisyjnym wykorzystywana jest pojedyncza wiązka, a natężenie wiązki przesyłanej z próbki jest mierzone za pomocą fotodiody. Po lewej stronie obraz transmisyjny uzyskano za pomocą OPO, natomiast po prawej obraz transmisyjny uzyskano za pomocą szafiru tytanowego.Typowy przykład obrazu SRS jest pokazany tutaj, w którym przedstawiono obrazy kulek polistyrenowych o średnicy trzech mikrometrów bez etykiet. Aby uzyskać wysokiej jakości obraz, w oparciu o mikroskopię SRS, kluczowe znaczenie ma ustawienie mikroskopu. W związku z tym wszystkie kroki wskazane w protokole muszą być wykonane ostrożnie.

implementation-nonlinear-microscope-based-on-stimulated-raman

Research

JoVE Journal

Engineering

Inżynieria

Omówiono konstrukcję i działanie złożonego nieliniowego układu optycznego, który wykorzystuje ultraszybkie przełączanie całkowicie optyczne do izolacji sygnałów Ramanowskich od sygnałów fluorescencyjnych. Dzięki zastosowaniu tego układu możliwe jest skuteczne rozdzielenie sygnałów Ramanowskich i fluorescencyjnych przy użyciu energii impulsów oraz mocy średniej, które pozostają bezpieczne biologicznie.

Eliminacja tła fluorescencyjnego w rezonansowej i spontanicznej mikrospektroskopii Ramana

Źródło: Espinoza, R., et al. Dwukolorowe, stymulowane w czasie rzeczywistym obrazowanie rozpraszania Ramana mózgu myszy w celu diagnozowania tkanek. J. Vis. exp. (2022).  Film przedstawia dwukolorowe, stymulowane rozpraszanie Ramana (SRS) wycinków tkanki mózgowej myszy. Dwie zsynchronizowane wiązki laserowe są kierowane na przekrój tkanki w celu wzbudzenia drgań molekularnych, co powoduje względną zmianę intensywności wiązek. Lipidy i białka w tkance są wykrywane za pomocą różnych par...

Dwukolorowe, stymulowane obrazowanie rozpraszania Ramana tkanki mózgowej myszy

W tym artykule przedstawiono efektywne generowanie zjawisk nieliniowych związanych z optyczną podatnością Χ(3) trzeciego rzędu w potrójnie rezonansowych mikrosferach krzemionkowych. Opisane tutaj interakcje to: Wymuszone rozpraszanie Ramana (SRS) i cztery procesy mieszania fal składające się na wymuszone rozpraszanie Ramana Anti-Stokes (SARS).

Stymulowane rozpraszanie Ramana Stokesa i antystokesa w mikrosferycznych rezonatorach w trybie galerii szeptów

Mikroskopia koherentnego rozpraszania Ramanowskiego (CARS) oparta na naturalnej wibracji wiązań molekułowych pozwala na chemicznie selektywne obrazowanie żywych komórek bez znaczników. W pracy przedstawiono implementację komplementarnej techniki mikroskopowej na standardowym wielofotonowym laserowym mikroskopie skaningowym opartym na laserze femtosekundowym Ti:sapphire i laserze OPO.

Implementacja koherentnego systemu rozpraszania Ramana (CARS) na standardowym laserowym mikroskopie skaningowym Ti:Sapphire i OPO

Opisano szczegóły generowania i optymalizacji sygnału, pomiaru, akwizycji danych i obsługi danych dla femtosekundowego, czasowo rozdzielczego, stymulowanego spektrometrem Ramana w bliskiej podczerwieni. Jako reprezentatywne zastosowanie pokazano badanie Ramana stymulowane bliską podczerwienią dynamiki stanu wzbudzonego β-karotenu w toluenie.

Ultraszybkie, czasowo-rozdzielcze, stymulowane bliską podczerwienią pomiary ramanowskie funkcjonalnych układów π-sprzężonych

Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) umożliwia selektywne, bezznacznikowe obrazowanie określonych cząsteczek chemicznych i została skutecznie wykorzystana do obrazowania cząsteczek lipidów in vivo. W tym miejscu przedstawiamy krótkie wprowadzenie do zasady działania mikroskopii SRS i opisujemy metody jej wykorzystania w obrazowaniu magazynowania lipidów w Caenorhabditis elegans.

Bezznacznikowe obrazowanie dynamiki magazynowania lipidów u Caenorhabditis elegans przy użyciu mikroskopii wymuszonego rozpraszania Ramana

Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) umożliwia bezznacznikowe obrazowanie biomolekuł na podstawie ich wewnętrznej wibracji określonych wiązań chemicznych. W tym protokole opisano instrumentalną konfigurację zintegrowanego mikroskopu SRS i dwufotonowego mikroskopu fluorescencyjnego w celu wizualizacji struktur komórkowych w rdzeniu kręgowym żywych myszy.

In vivo (in vivo) Obrazowanie tkanek biologicznych za pomocą połączonej mikroskopii fluorescencji dwufotonowej i wymuszonego rozpraszania Ramana

Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) jest potężną, nieniszczącą i bezznacznikową techniką obrazowania. Jednym z pojawiających się zastosowań jest stymulowana histologia Ramana, w której dwukolorowe obrazowanie SRS w przejściach Ramana białek i lipidów jest wykorzystywane do generowania obrazów pseudo-hematoksyliny i eozyny. W tym miejscu demonstrujemy protokół dwukolorowego obrazowania SRS w czasie rzeczywistym w diagnostyce tkanek.

Dwukolorowe, stymulowane rozpraszaniem Ramana w czasie rzeczywistym mózgu myszy w celu diagnozowania tkanek

Ten artykuł bezpośrednio porównuje rozdzielczość, czułość i kontrasty obrazowania stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) i spójnego rozpraszania anty-Stokesa Ramana (CARS) zintegrowanych w tej samej platformie mikroskopowej. Wyniki pokazują, że CARS ma lepszą rozdzielczość przestrzenną, SRS daje lepsze kontrasty i rozdzielczość spektralną, a obie metody mają podobną czułość.

Bezpośrednie porównanie hiperspektralnie stymulowanego rozpraszania Ramana i koherentnej mikroskopii rozpraszania Ramana antystokesa do obrazowania chemicznego

Przedstawiamy protokół do pozyskiwania obrazów chemicznych za pomocą mikroskopii SRS (ang. broadband stimulated Raman scattering). Opierając się na mikroskopie SRS, który działa z różnicową detekcją wielokanałową typu lock-in, protokół opisuje przygotowanie próbki, regulację aparatury SRS i chemometrię w celu rozplątania różnych składników chemicznie niejednorodnych próbek.

Multipleksowe obrazowanie chemiczne oparte na szerokopasmowej mikroskopii rozpraszania Ramana stymulowanego

Mikroskop szerokokątowy z transformatem Fouriera, oparty na kompaktowym i ultrastabilnym interferometrze dwułamannym, umożliwia równoległe pozyskiwanie widm dla wszystkich pikseli detektora 2D. Podejście w dziedzinie czasowej umożliwia rozplątanie sygnałów fotoluminescencyjnych i Ramana oraz umożliwia szybkie mapowanie Ramana (~5 ms/piksel) z rozdzielczością przestrzenną ~1 μm i spektralną 23 cm-1 .

Wielomodalny mikroskop Ramana z szeroką polową transformacją Fouriera

Poznaj implementację mikroskopu SRS do bezbarwnego obrazowania biologicznego opartego na kontraście wibracyjnym. Protokół wyjaśnia kluczowe komponenty, procedury ustawiania i wyrównania wiązek laserowych Ti-Sapphire oraz OPO.

Wdrożenie mikroskopu nieliniowego opartego na wymuszonym rozpraszaniu Ramana

Przeglądaj więcej filmów