Wdrożenie mikroskopu nieliniowego opartego na wymuszonym rozpraszaniu Ramana
6 lipca 2019
W tym manuskrypcie opisana jest implementacja mikroskopu z wymuszonym rozpraszaniem Ramana (SRS), uzyskanego przez integrację eksperymentalnego zestawu SRS z laserowym mikroskopem skaningowym. Mikroskop SRS oparty jest na dwóch femtosekundowych (fs) źródłach laserowych, Ti-Sapphire (Ti:Sa) i zsynchronizowanym optycznym oscylatorze parametrycznym (OPO).
Protokół ten może pomóc naukowcom zainteresowanym mikroskopią nieliniową w zrozumieniu kluczowych elementów, konfiguracji i procedury ustawiania mikroskopu opartego na wymuszonym rozpraszaniu Ramana. Głównymi zaletami mikroskopii SRS są jej zdolność do wykonywania obrazowania bez znaczników w oparciu o kontrast wibracyjny oraz do uzyskania obrazu w ciągu kilku sekund. Mikroskopia SRS przeniosła obrazowanie bezznacznikowe na nowy poziom, zwłaszcza badania złożonych struktur biologicznych, takich jak lipidy, które mają fundamentalne znaczenie dla komórek i architektury komórkowej.
Sygnał SRS jest wykrywany jako niewielka zmiana intensywności wiązki sondy i może zostać zniekształcony przez szum. Dlatego tak ważny jest dokładny znak. Aby rozpocząć, ustaw OPO i wiązki lasera tytanowo-szafirowego tak, aby oba docierały do mikroskopu.
Następnie umieść detektory czujnika położenia wiązki laserowej w dwóch pozycjach pomiędzy zwierciadłem dichroicznym numer jeden a lustrem szóstym. Pierwsza pozycja znajduje się w pobliżu zwierciadła dichroicznego pierwszego, a druga znajduje się w pobliżu zwierciadła szóstego. Dla każdej pozycji użyj czujników, aby wykryć współrzędne X i Y wiązki OPO.
Co ważne, sprawdź, czy współrzędne X i Y wiązki laserowej tytanowo-szafirowej mają ten sam OPO w obu pozycjach detektorów czujnika. Jeśli w niektórych pozycjach współrzędne nie pokrywają się, dostosuj nachylenie sąsiedniego lustra, aby to skompensować. Postępuj zgodnie z tą samą procedurą, aby wyrównać pozycje wiązki tytanowo-szafirowej względem OPO dla ścieżki między szóstym a siódmym zwierciadłem.
Zainstaluj dodatkowe lustro na uchwycie typu flip-flop pomiędzy lustrem szóstym a siódmym i obróć mocowanie lustra, aby skierować wiązkę do autokorelatora. Włącz sterownik autokorelatora, uruchom aplikację na komputerze sterującym nim i ustaw regulacji odległości wiązki autokorelatora w normalnym położeniu na 8,35 milimetra. Następnie zatrzymaj wiązkę tytanowo-szafirową i zwolnij i wyświetl wiązkę OPO z dodatkowego lustra na lustro wejściowe autokorelatora.
Spróbuj wyregulować lustro wejściowe, aby zmaksymalizować sygnał impulsu laserowego, jak pokazano tutaj. Następnie zatrzymaj wiązkę OPO, zwolnij i wyświetl wiązkę tytanowo-szafirową z lustra zamontowanego na przerzutniku do lustra wejściowego i do autokorelatora. Powtarzaj optymalną regulację wiązki, aż do uzyskania pokazanego tutaj sygnału autokorelatora.
Teraz ustaw regulacji odległości belki w pozycji krzyżowej na 7,30 milimetra. Zwolnij obie belki i zeskanuj opóźnioną linię, aby nałożyła się na dwie belki. Uzyskaj wynikowy sygnał korelatora krzyżowego, jak pokazano tutaj.
Następnie odwróć lustro zamontowane na klapie tak, aby wiązki mogły dotrzeć do lustra siódmego i głowicy skanującej mikroskopu. Wyjmij kondensator i użyj przycisku ucieczki, aby tymczasowo schować obiektyw subiektywny 60x. Następnie obróć końcówkę, aby przesunąć obiektyw subiektywny 60x poza ścieżkę optyczną.
Następnie zamontuj detektor w górnej części mikroskopu za pomocą zewnętrznego mocowania mechanicznego. Podłącz wyjście detektora przez filtr dolnoprzepustowy 50 omów do oscyloskopu. Teraz włącz procesor sterujący głowicą skanera i skieruj wiązkę OPO na głowicę skanera mikroskopu.
Monitoruj sygnał OPO i maksymalizuj moc mierzoną przez detektor za pomocą translatora XY. Następnie przełącz wiązkę z lasera OPO na laser tytanowo-szafirowy i sprawdź, czy uzyskany jest również sygnał dla lasera tytanowo-szafirowego. Oznacza to, że obie belki są dobrze wyrównane.
Zakończ wyrównanie wiązki, obracając końcówkę nosową do tyłu, aby wprowadzić subiektywny 60x. Następnie użyj przycisku zmiany ostrości na mikroskopie, aby odzyskać ostateczną ostrość na soczewce obiektywu mikroskopu 60x. Na koniec umieść obiektyw z powiększeniem 40x w miejscu kondensatora, nie dotykając ani nie naruszając próbki.
Ustaw moc laserów tytanowo-szafirowych i OPO mierzoną przed mikroskopem na 30 miliwatów dla obu wiązek. Następnie ustaw długość fali lasera OPO na inną wartość, w stosunku do poprzedniej, tak aby pompa i sonda nie były w rezonansie z częstotliwością drgań kulek. Następnie zwolnij obie wiązki, aby weszły do mikroskopu.
Uruchom skomputeryzowany translator linii opóźniającej skanowanie i zarejestruj zmierzoną intensywność za pomocą wzmacniacza blokującego dla każdej pozycji linii opóźniającej. Poczekaj, aż skanowanie linii opóźniającej zostanie zakończone. Teraz ustaw długość fali OPO z powrotem na 1076 nanometrów, tak aby pompa i sonda były w rezonansie z częstotliwością wibracji kulek.
Uruchom skomputeryzowany translator linii opóźnienia skanowania i poczekaj, aż skanowanie linii opóźnienia zostanie zakończone. Na koniec należy ustawić uzyskaną pozycję wiązki nakładającej się oraz linię opóźnienia dla następnej akwizycji wymuszonych obrazów rozpraszania Ramana. Aby zoptymalizować synchronizację przestrzenną wiązek, zacznij od zatrzymania wiązki tytanowo-szafirowej i zmniejszenia mocy OPO do ośmiu miliwatów.
Następnie podłącz odczyt czujki do karty akwizycji danych. Uruchom program do akwizycji danych wraz z konsolą skanowania mikroskopu. Po zakończeniu zapisz plik i przetwórz dane, aby uzyskać obraz podobny do pokazanego tutaj.
Następnie zatrzymaj wiązkę OPO i zmniejsz moc tytanowo-szafirową do 2,5 do 4,5 miliwatów. Połącz czujkę ze wzmacniaczem lock-in, a jego odczyty z kartą akwizycji danych. Następnie ponownie uruchom program do akwizycji danych wraz z konsolą skanowania mikroskopu.
Po zakończeniu zapisz plik i przetwórz dane, aby uzyskać obraz podobny do pokazanego tutaj. Wprowadź stos filtrów pomiędzy obiektywem 40x a fotodiodą, aby usunąć impulsy pompy i uzyskać tylko sygnał skoku. Następnie ustaw sygnał pompy na 810 nanometrów ze skupioną mocą ośmiu miliwatów.
Ustaw sygnał sondy na 1076 nanometrów z tą samą skupioną mocą ośmiu miliwatów, aby zbadać typowe wiązanie węgiel-wodór polistyrenu z przesunięciem Ramana o 3054 centymetry wsteczne. Podłącz detektor do wzmacniacza lock-in i wzmacniacza lock-in odczyt z karty akwizycji danych. Na koniec ustaw format pikseli i czas akwizycji w programie mikroskopowym i uruchom go wraz z systemem akwizycji danych, zapisując plik matrycy po jego zakończeniu.
W tym miejscu wyświetlany jest przykładowy pomiar z pojedynczego punktu próbki. Gdy wiązka nie nakłada się na siebie w czasie lub przestrzeni, uzyskany wynik jest poza rezonansem, gdzie amplituda sygnału, mierzona przez wzmacniacz typu lock-in, wynosi zero. Faza tego sygnału przeskakuje jednak między wartościami ujemnymi i dodatnimi.
Jeśli wiązki zachodzą na siebie w przestrzeni, sygnał wzrasta i osiąga maksimum, gdy wiązki idealnie nakładają się na siebie w czasie, podczas gdy faza zaczyna osiągać stałą wartość w czasie, w którym wiązki się nakładają. W obrazie transmisyjnym wykorzystywana jest pojedyncza wiązka, a natężenie wiązki przesyłanej z próbki jest mierzone za pomocą fotodiody. Po lewej stronie obraz transmisyjny uzyskano za pomocą OPO, natomiast po prawej obraz transmisyjny uzyskano za pomocą szafiru tytanowego.
Typowy przykład obrazu SRS jest pokazany tutaj, w którym przedstawiono obrazy kulek polistyrenowych o średnicy trzech mikrometrów bez etykiet. Aby uzyskać wysokiej jakości obraz, w oparciu o mikroskopię SRS, kluczowe znaczenie ma ustawienie mikroskopu. W związku z tym wszystkie kroki wskazane w protokole muszą być wykonane ostrożnie.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten rękopis opisuje implementację mikroskopu rozpraszania Ramana stymulowanego (SRS), integrującego zestaw eksperymentalny SRS z mikroskopem skaningowym laserowym. Mikroskop SRS wykorzystuje dwa źródła laserowe femtosekundowe, Ti-Szafirowy (Ti:Sa) oraz zsynchronizowany optyczny oscylator parametryczny (OPO).
Kluczowe komponenty badania
Obszar nauki
- Mikroskopia nieliniowa
- Obrazy bez etykiet
- Obrazy biologiczne
Tło
- Mikroskopia SRS umożliwia obrazy bez etykiet na podstawie kontrastu wibracyjnego.
- Jest szczególnie przydatna do badania złożonych struktur biologicznych, takich jak lipidy.
- Sygnał SRS jest wykrywany jako zmiana intensywności wiązki sondującej.
- Szum może uszkodzić sygnał SRS, co sprawia, że dokładne wyrównanie jest kluczowe.
Cel badania
- Aby zapewnić protokół dla naukowców zainteresowanych mikroskopią nieliniową.
- Aby wyjaśnić kluczowe komponenty i procedury wyrównania mikroskopu SRS.
- Aby podkreślić zalety mikroskopi SRS w badaniach biologicznych.
Stosowane metody
- Integracja zestawu eksperymentalnego SRS z mikroskopem skaningowym laserowym.
- Wykorzystanie źródeł laserowych Ti-Szafirowego i OPO.
- Wyrównanie wiązek laserowych w celu zapewnienia optymalnej wydajności.
- Wykrywanie sygnałów SRS i zarządzanie ingerencją szumów.
Główne wyniki
- Mikroskop SRS umożliwia szybkie pozyskiwanie obrazów.
- Możliwości obrazowania bez etykiet poprawiają badanie architektury komórkowej.
- Dokładne wyrównanie poprawia niezawodność wykrywania sygnału SRS.
- Zadokumentowana skuteczność w obrazowaniu struktur biologicznych.
Wnioski
- Mikroskopia SRS reprezentuje znaczący postęp w technikach obrazowań.
- Dostarcza cennych informacji na temat złożonych systemów biologicznych.
- Przyszłe zastosowania mogą poszerzyć zrozumienie procesów komórkowych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging based on vibrational contrast, providing rapid acquisition of molecular-specific data without exogenous labels. This capability supports early-stage target validation by allowing direct visualization of lipid-rich structures and other biomolecules in native cellular contexts, reducing reliance on fluorescent tags that may perturb biological function. For biopharma R&D, SRS microscopy offers a mechanistic de-risking tool to interrogate compound effects on lipid metabolism, membrane organization, or subcellular architecture in disease-relevant systems, thereby improving predictive confidence in lead identification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables label-free visualization of lipid droplets and membranes to assess target engagement in organelle-specific pathways.
- Operational Value: Provides vibrational contrast imaging that avoids photobleaching and toxicity associated with fluorescent labels in live-cell studies.
- Predictive Value: Supports hypothesis testing of mechanism-of-action by correlating compound treatment with alterations in lipid distribution or saturation states.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative SRS signal readouts proportional to molecular concentration, enabling dose-response analysis of compound-induced lipid changes.
- Operational Value: Integrates with laser-scanning microscopes using forward detection and lock-in amplification for reproducible, noise-resistant signal detection.
- Assay Readiness: Produces 2D chemical maps that can be synchronized with scanning systems for high-content screening of compound libraries.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges in vitro target validation to preclinical models by maintaining consistent label-free readouts across systems.
- Mechanistic De-risking: Detects subcellular lipid perturbations that may indicate off-target effects or pathway modulation relevant to metabolic disease models.
- Predictive Confidence: Enables longitudinal imaging of dynamic processes such as lipid droplet formation or degradation in response to therapeutic candidates.
Pipeline & Workflow Integration
SRS microscopy fits within the discovery continuum from early target hypothesis testing through lead optimization, where label-free molecular imaging supports go/no-go decisions based on direct observation of biomolecular changes in cellular systems.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis interrogation by visualizing native lipid structures without labels, clarifying pathway involvement in lipid metabolism or signaling.
- Screening: Delivers standardized, quantitative outputs via lock-in amplifier detection, supporting assay reproducibility across compound screening campaigns.
- Analytics: Provides demodulated signal intensity and phase data that allow discrimination between on-resonance and off-resonance conditions for specific bond vibrations.
- Translational Research: Maintains methodological consistency from cell-based assays to tissue explants, supporting biomarker-aligned observations of lipid accumulation or depletion.
- Enterprise Reuse: Represents a adaptable platform for multiple vibrational contrasts (e.g., C-H, C-D bonds) enabling reuse across projects targeting different molecular species.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing direct, label-free visualization of lipid biomolecules in live or fixed cells.
- Operational Value: Ensures reproducibility through beam alignment protocols and noise-resistant lock-in detection, minimizing variability in signal readout.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling rapid screening of compound effects on lipid metabolism without label synthesis or validation.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by identifying early signs of lipid dysregulation that may predict downstream toxicity or efficacy.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nonlinear optics and laser safety for alignment of pulsed pump and probe beams.
- Depends on synchronized femtosecond laser sources (e.g., Ti:Sa and OPO) and precise temporal overlap via scanning delay line.
- Necessitates lock-in amplifier integration with forward detection to extract weak SRS signals from background noise.
- Involves optical filtering to isolate Stokes or anti-Stokes signals and suppress residual pump or probe transmission.
- Demands careful sample preparation to avoid signal degradation from scattering or absorption in thick or highly pigmented specimens.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:58
Alignment of the Microscope Spatial Beam Overlap
1:58
Alignment of the Microscope Temporal Synchronization of the Beams Use of the Autocorrelator
3:24
Alignment of the Microscope Aligning the Femtosecond Laser Beams :OPO and Ti:Sa
4:44
Optimization of Temporal Synchronization of Beams
5:48
Optimization of Spatial Overlap of Beams - Transmission Image Acquisition of OPO and Ti:Sa
6:48
SRS Image Acquisition
7:40
Results: Nonlinear Microscope Based on Stimulated Raman Scattering
8:43
Conclusion
