Charakterystyka na poziomie molekularnym przy użyciu solidnych podejść biochemicznych nowego białka kinazy

Immunoprecypitacja jest bardzo skuteczną techniką izolowania i oczyszczania białka docelowego. W gładkich warunkach białka, regulatory lub substraty mogą być współimmunoprecypitowane. Wtedy może zostać odkryta nowa sieć interakcji.

Można również ocenić aktywność białka immunoprecypitowanego. W szczególności aktywność kinazy może być badana na różnych substratach za pomocą znakowania P32-ATP. Niemniej jednak można ocenić aktywność inhibitorów ukierunkowanych na kinazę zaangażowaną w chorobę.

Mogą one stanowić związki ołowiowe do opracowywania nowych leków. Metodę tę można rozszerzyć ze ssaków na drożdże lub bakterie. Ta technika nie jest taka trudna.

Do kluczowych punktów: upewnij się, że masz kontrolę negatywną, aby mieć pewność, że wykryta interakcja jest specyficzna, i starannie wybierz warunki lizy, aby utrzymać interakcje i aktywność. Drobne szczegóły i gesty są ważne dla zapewnienia sukcesu tej techniki i nigdy nie są opisane w materiałach i metodach artykułów. Procedurę zademonstruje Fabienne Godin, technik z naszego laboratorium.

Po przygotowaniu komórek w pomieszczeniu do hodowli komórkowej w komorze bezpieczeństwa biologicznego, użyj 10-mililitrowej pipety, aby usunąć pożywkę z płytek i wyrzucić ją do specjalnej butelki na odpady z wybielaczem. Następnie dodaj 10 mililitrów świeżego suplementu DMEM i włóż płytki z powrotem do inkubatora w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby przygotować mieszaninę transfekcji, w 15-mililitrowej probówce dodać 450 mikrolitrów 10-milimolowego roztworu chlorowodorku Tris o pH 7,5, uzupełnionego jednym milimolowym EDTA i 50 mikrolitrów 2,5-molowego roztworu chlorku wapnia.

Wymieszaj przez odwrócenie. Do probówki dodać objętość odpowiadającą 10 mikrogramom DNA osocza, amplifikowanego za pomocą zestawu do pomiaru midiprepu DNA i rozcieńczonego buforem elucyjnym tego zestawu, którego stężenie zostało określone. Odwróć rurkę, aby wymieszać.

Następnie, płynnie mieszając na mieszalniku wirowym, powoli dodaj 500 mikrolitrów buforowanego koncentratu soli fizjologicznej BES 2X, kropla po kropli do probówki. Poruszaj nim bardzo ostrożnie, aby nie zakłócać złożonego tworzenia się między DNA a fosforanem wapnia. Inkubować przez co najmniej 15 minut lub do 45 minut w temperaturze pokojowej.

Teraz przenieś płytkę do transfekcji z inkubatora do szafy bezpieczeństwa. Dodawaj przygotowane kompleksy DNA kropla po kropli na komórki na całej powierzchni płytki. Inkubować przez 24 do 72 godzin w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Aby zapobiec degradacji białek, należy przygotować bufor do lizy na lodzie, biorąc pod uwagę cztery mililitry buforu do lizy na każdą transfekowaną płytkę. Pobrać płytkę z transfekowanymi komórkami z inkubatora. Wyjmij nośnik i wyrzuć go do specjalnej butelki na odpady wybielacza.

Aby umyć komórki, dodaj trzy mililitry zimnego PBS na bok płytki kropla po kropli, aby uniknąć oderwania transfekowanych komórek. I delikatnie zakręć płytką, aby rozprowadzić bufor na całej powierzchni. Przechyl płytkę, aby wyjąć PBS i wyrzuć ją do butelki na odpady.

Powtórz pranie jeszcze raz. Połóż talerz na lodzie. Na koniec ostrożnie wyjmij resztę PBS.

Następnie dodaj 500 mikrolitrów buforu do lizy na zimno do transfekowanych przemytych komórek. Rozprowadź go na całej powierzchni talerza. Inkubować przez 10 minut na lodzie.

Od czasu do czasu ponownie rozprowadź bufor na całej powierzchni płytki. Następnie za pomocą szpatułki do komórek zeskrob komórki z powierzchni i zbierz je w probówce do mikrowirówki. Wirować przez 10 minut w temperaturze 10 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza.

Zebrać lizat sklarowany nad osadem do nowej probówki do mikrowirówki i zebrać 50 mikrolitrów podwielokrotności tej frakcji do innej nowej probówki do mikrowirówki. Podwielokrotność ta zostanie wykorzystana do sprawdzenia, czy transfekowane białka są dobrze eksprymowane. Wyrzuć granulkę do kosza.

Najpierw delikatnie zawiesić roztwór podstawowy kulek agarozy w połączeniu z odpowiednim przeciwciałem. Odetnij koniec końcówki o pojemności 200 mikrolitrów, aby uzyskać otwór o średnicy od jednego do dwóch milimetrów. Przymocuj końcówkę do mikropipety i nabierz 40 mikrolitrów roztworu, pozwalając kulkom dostać się do końcówki.

Kilkakrotnie pipetuj kulki w górę iw dół, aby nasycić końcówkę, aby zapewnić odpowiednią objętość kulek i przenieś je do probówki mikrowirówkowej. Dodać 500 mikrolitrów buforu TNET, wymieszać przez inwersję i wirować przez dwie minuty w temperaturze 1000 razy G i czterech stopniach Celsjusza. Ostrożnie usunąć supernatant i dodać 500 mikrolitrów buforu TNET.

Inkubować na obracającym się kole przez co najmniej godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie odwirować probówkę przez dwie minuty w temperaturze 1,000 razy G i czterech stopniach Celsjusza i dwukrotnie przemyć kulki 500 mikrolitrami buforu do lizy, odwracając i odwirowując. Po umyciu przenieś wcześniej zebrany lizat frakcji całkowitej do probówki i inkubuj na obracającym się kole w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie do czterech godzin.

Teraz odwiruj probówkę zawierającą kulki immunoprecypitowane przez dwie minuty w temperaturze 1000 razy G i czterech stopniach Celsjusza. Przemyć kulki pięciokrotnie 500 mikrolitrami buforu do lizy, odwracając i odwirowując. Podczas mycia kulek należy uważać, aby nie zbliżać się zbyt blisko kulek podczas usuwania supernatantu.

W przeciwnym razie koraliki zostaną zassane, a pod koniec eksperymentu nie pozostaną już żadne koraliki. W celu elucji najpierw wirować przez dwie minuty w temperaturze 1 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza. Użyj mikropipety o pojemności jednego mililitra, aby ostrożnie usunąć supernatant.

Następnie, za pomocą strzykawki Hamiltona wyposażonej w zacementowaną igłę, usuń ostatnie krople supernatantu, aby uniknąć aspiracji kulek. Następnie dodaj 40 mikrolitrów buforu 4X Laemmli. Homogenizować, delikatnie stukając w probówkę.

Inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie wirować przez pięć minut w temperaturze 10 000 G i temperaturze pokojowej. Za pomocą strzykawki Hamiltona przenieść sklarowany sklarowany płyn eluowany do nowej probówki do mikrowirówki.

Przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Komórki HEK-293 transfekowano nieoznakowanym LIMK 2-1 lub jedną z izoform LIMK 2 znakowanych HA. LIMK 2-1 jest dobrze wyrażony w różnych warunkach.

Przeciwciało anty LIMK 2-1 nie rozpoznaje izoform LIMK 2a i LIMK 2b i jest specyficzne, ponieważ jego sygnał zmniejsza się, gdy komórki są transfekowane małym interferującym RNA LIMK2, w porównaniu z kontrolnym małym interferującym RNA. W różnych ludzkich liniach komórkowych LIMK 2-1 wydawał się być wyrażany w HEK-293 i HeLa, ale nie w C6. Eksperymenty z koimmunoprecypitacją wykorzystano do oceny interakcji LIMK2-1 z kinazą ROCK. Każde z różnych białek kodowanych przez transfekowane wektory było dobrze wyrażone.

Trzy izoformy LIMK2, a także larp6, zostały skutecznie immunoprecypitowane. W eluatach wykryto ROCK, a tym samym koimmunoprecypitację z trzema izoformami LIMK2, ale nie z larpem6. Wykryta interakcja jest wtedy specyficzna.

Koimmunoprecypitowany LIMK 2-1 przetestowano pod kątem aktywności kinazy poprzez znakowanie gamma P32 ATP. LIMK 2-1 nie fosforylował kofiliny, podczas gdy fosforylował podstawowe białko mieliny lub MBP. LIMK 2-1 jest skutecznie immunoprecypitowany w tym teście.

Bardzo ważne jest, aby mieć kontrolę negatywną podczas wykonywania immunoprecypitacji, aby mieć pewność, że interakcja jest specyficzna. Skład buforu do lizy musi być starannie ustalony, aby zachować interakcję i aktywność. Po immunoprecypitacji aktywność kinazy można ocenić w celu zliczenia różnych substratów.

Mutacja może być łatwo wprowadzona i może odkryć rolę określonych reszt. Można również przeprowadzić badania funkcjonalne w celu zrozumienia fizjologicznej roli nowych, podkreślonych interakcji. Komórki muszą być hodowane w przeznaczonym do tego pomieszczeniu hodowlanym w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

Z P32 ATP należy obchodzić się ze szczególną ostrożnością. Osłona chroniąca przed promieniowaniem, licznik Geigera, specjalny pojemnik na odpady, osobiste plakietki na piersi i palcach do wykrywania narażenia na promieniowanie oraz końcówki filtrów.