Name: Charakterystyka na poziomie molekularnym przy użyciu solidnych podejść biochemicznych nowego białka kinazy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 23 s
Description: Poznaj metody charakteryzacji nowej kinazy białkowej przy użyciu immunoprecypitacji i Western Blot. Techniki te pozwalają badać interakcje białkowe oraz aktywność kinazową w różnych liniach komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez La Ligue contre le Cancer, l'Association Neurofibromatoses et Recklinghausen, oraz la Région Centre Val de Loire. Wielkie podziękowania dla Aurélie Cosson i Déborah Casas za dane z cytometrii przepływowej oraz dla Keyrona Hickmana-Lewisa za dokładną korektę manuskryptu.

1. Przygotowanie komórek do transfekcji
UWAGA: Wszystkie etapy hodowli komórkowej muszą być wykonywane w dedykowanym laboratorium, a komórki są manipulowane w komorze mikrobiologicznej klasy 2.
<ol>
	<li>Wysiew komórek HEK-293 (ludzka nerka embrionalna) na płytkach Ø 10 cm w 10 ml DMEM (Dulbecco's Modified Eagles Medium) uzupełniony 10% płodową surowicą cielęcą. Hodowla przez 3 do 5 dni w temperaturze poniżej 5% CO2 , w temperaturze 37 °C, aż komórki osiągną ~90% konfluencji.</li>
	<li>Potraktuj płytki Ø 10 cm kolagenem R, aby zwiększyć przyczepność komórek do plastikowych płytek.
	<ol>
		<li>Dodać 5 ml roztworu kolagenu R, 200-krotnie rozcieńczonego w buforze fosforanowym soli fizjologicznej (PBS) na płytce Ø 10 cm. Nałóż płyn na całą powierzchnię płytki.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę w komorze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
		<li>Usuń roztwór kolagenu i wyrzuć go. Dodaj 5 ml PBS, rozprowadź go na całej powierzchni płytki, wyjmij i wyrzuć. Powtórz to pranie raz.</li>
		<li>Dodaj 8 ml DMEM uzupełnionego 10% płodową surowicą cielęcą. Przygotowane płytki należy przechowywać w komorze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Weź płytki HEK-293 z kroku 1.1 w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Usuń podłoże z płytek i wyrzuć je do specjalnego kosza na wybielacz. Dodać 2 ml uzupełnionego DMEM i przepłukać komórki, aby je oderwać, używając przepływu mikropipety o pojemności 1 ml, uważając, aby nie tworzyć piany.</li>
	<li>Zbierz komórki do probówki o pojemności 15 ml i dodaj 4 ml uzupełnionego DMEM. Homogenizować za pomocą pipety o pojemności 10 ml, pipetując 3 razy w górę i w dół.</li>
	<li>Weź 2 ml tego roztworu komórkowego i dodaj je do płytek potraktowanych kolagenem zawierających uzupełniony DMEM z kroku 1.2.4.</li>
	<li>Rosnąć przez 24 godziny w inkubatorze w temperaturze 5% CO2 i temperaturze 37 °C. Komórki powinny być w 50-80% zlewające się w momencie transfekcji.</li>
</ol>
2. Przejściowe transfekcje
<ol>
	<li>Usuń pożywkę z płytek, wyrzuć ją do specjalnego kosza na wybielacz i dodaj 10 ml świeżo uzupełnionego DMEM. Włożyć płytki z powrotem do inkubatora w temperaturze 37 °C, przygotowując mieszaninę do transfekcji.</li>
	<li>W probówce o pojemności 15 ml dodaj 450 μl roztworu 10 mM Tris-HCl pH 7,5/1 mM EDTA (Tris oznacza tris(hydroksymetylo)aminometan, a EDTA - kwas etylenodinitrotetraoctowy) i 50 μl roztworu 2,5 M CaCl2. Wymieszaj przez odwrócenie.</li>
	<li>Dodać 10 μg plazmidowego DNA (kwasu dezoksyrybonukleinowego) przygotowanego z preparatu midi na płynnej kulturze bakterii przekształconej za pomocą dedykowanego plazmidu. Wymieszaj przez odwrócenie.</li>
	<li>Pod płynnym mieszaniem na wirze dodać 500 μL buforowanego koncentratu soli fizjologicznej BES 2x (skład: BES, 10,7 g/L, NaCl, 16,0 g/L, Na2HPO4, 0,27 g/L; BES oznacza kwas N,N-Bis(2-hydroksyetylo)-2-aminoetanosulfonowy, N,N-Bis(2-hydroksyetylo)tauryna) powoli kropla po kropli.</li>
	<li>Inkubować przez co najmniej 15 minut (do 45 minut) w temperaturze pokojowej w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Nie wirować, nie mieszać! Przesuwaj rurki bardzo ostrożnie, aby nie zakłócić złożonego tworzenia się między DNA a fosforanem wapnia.</li>
	<li>Zabierz tabliczki z kroku 2.1 do szafy bezpieczeństwa. Bardzo ostrożnie, kropla po kropli, dodawać kompleksy DNA do komórek na całej powierzchni płytki.</li>
	<li>Inkubować przez 24-72 godziny w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Zazwyczaj maksymalna ekspresja białka osiągana jest w ciągu 48 godzin.</li>
</ol>
3. Liza
UWAGA: Pracuj na lodzie i z zimnymi, aby zapobiec degradacji białek.
<ol>
	<li>Przygotuj bufor do lizy: 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 50 mM NaF, 10 mM pirofosforan sodu, 1 mM Na3VO4, 20 mM fosforan p-nitrofenylu, 20 mM β-glicerofosforan, 10 μg/ml aprotyniny, 0,05 μg/ml kwas okaidynowy, 1 μg/ml leupeptyny i 1 mM PMSF (fluorek fenylometylosulfonylu). Na każdą transfekowaną płytkę wymagane jest około 4 ml buforu do lizy.</li>
	<li>Wyjąć z inkubatora płytki z transfekowanymi komórkami. Połóż je na lodzie. 
	UWAGA: Od tego kroku możliwa jest praca na "normalnej" ławce.</li>
	<li>Wyjmij nośnik i wyrzuć go do specjalnego kosza na wybielacz.</li>
	<li>Przemyć dwukrotnie 3 ml zimnego PBS: dodawać 3 ml PBS z boku płytki kropla po kropli, aby uniknąć oderwania się transfekowanych komórek, rozprowadzić po całej powierzchni płytki, usunąć PBS i wyrzucić; powtórzyć ten krok jeszcze raz. Na koniec ostrożnie usuń resztę PBS, przechylając płytkę, aby zapobiec rozcieńczeniu buforu do lizy do następnego kroku.</li>
	<li>Dodać 500 μl zimnego buforu do lizy na transfekowane przemyte komórki. Rozprowadź go na całej powierzchni talerza.</li>
	<li>Inkubować przez 10 minut na lodzie. Od czasu do czasu (co najmniej dwukrotnie) ponownie rozprowadź bufor na całej powierzchni płytki.</li>
	<li>Złomuj komórki i zbieraj je w probówce do mikrowirówki.</li>
	<li>Wirować przez 10 minut przy 10 000 x g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zebrać supernatant w nowej probówce do mikrowirówki. Frakcja ta odpowiada lizatowi (ekstraktowi z całych komórek). Wyrzuć osad, który odpowiada resztkom błony komórkowej.</li>
	<li>Pobrać podwielokrotność tej frakcji do nowej probówki do mikrowirówki (około 50 μl). Frakcja ta odpowiada "frakcji całkowitej" lub "lizatowi komórkowemu" lub "ekstraktowi z całych komórek", co pozwala na analizę, czy transfekowane białka ulegają ekspresji za pomocą Western Blot. 
	UWAGA: W tym momencie próbki mogą być bezpośrednio wykorzystane do analiz Western Blot. Bufor Laemmli musi zostać dodany do próbki, którą następnie ogrzewa się w temperaturze 95 °C przez 5 minut, odwirowuje przy 10 000 x g przez 5 minut i umieszcza na odpowiedniej karcie charakterystyki. Próbki mogą być również przechowywane w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
4. Immunoprecypitacja
<ol>
	<li>Delikatnie ponownie wymieszaj kulki agarozy w połączeniu z odpowiednim przeciwciałem: HA (hemaglutynina grypy ludzkiej), Flag lub GFP (Zielone Białko Fluorescencyjne) przez płynną inwersję.</li>
	<li>Odetnij końcówkę końcówki o pojemności 200 μl z mikropipety, aby umożliwić wejście kulek do końcówki. Kilkakrotnie pipetuj koraliki w górę iw dół, aby nasycić końcówkę i upewnić się, że pobrano odpowiednią objętość koralików.</li>
	<li>Weź 40 μl kulek do probówki do mikrowirówki.</li>
	<li>Dodać 500 μl buforu TENET (30 mM Tris-HCl pH 7,5, 120 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100). Wymieszaj przez odwrócenie. Wirować przez 2 minuty przy 1 000 x g w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć sklarowany osad i wyrzucić go. Dodać 500 μl TENET. Inkubować przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 4 °C na obracającym się kole. 
	UWAGA: Ten etap wstępnej inkubacji w TENET pozwala na redukcję niespecyficznych interakcji, a tym samym na zmniejszenie sygnału tła.</li>
	<li>Przemyć kulki dwukrotnie 500 μl buforu do lizy.
	<ol>
		<li>Wirować 2 minuty przy 1.000 x g w temperaturze 4°C.</li>
		<li>Ostrożnie usuń bufor sklarowany nad osadem i wyrzuć go. 
		UWAGA: Uważaj, aby nie zasysać koralików podczas tych etapów prania.</li>
		<li>Dodać 500 μl buforu do lizy. Homogenizować przez odwrócenie probówki.</li>
		<li>Powtórz kroki 4.5.1-4.5.3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wirować przez 2 minuty w temperaturze 1 000 x g w temperaturze 4°C. Ostrożnie usunąć bufor sklarowany nad osadem i wyrzucić go.</li>
	<li>Inkubować kulki z lizatem z etapu 3.9 przez 2 do 4 godzin w temperaturze 4 °C na obracającym się kole.</li>
	<li>Umyj koraliki immunoprecypitowane. 
	UWAGA: W tym momencie immunoprecypitowane kulki można przemyć pięciokrotnie buforem do lizy, a następnie eluować buforem Laemmli. Eluat może być używany do analiz Western Blot lub przechowywany w temperaturze -80 °C. Alternatywnie, kulki mogą być dwukrotnie płukane buforem do lizy, a następnie trzykrotnie buforem kinazy w celu przeprowadzenia znakowania ATP γ[32] P.</li>
</ol>
5. Analizy koimmunoprecypitacji
<ol>
	<li>Przemyć kulki immunoprecypitowane z kroku 4.7 buforem do lizy.
	<ol>
		<li>Wirować przez 2 minuty przy 1 000 x g w wirówce z chłodzeniem w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Ostrożnie usunąć supernatant i wyrzucić go.</li>
		<li>Dodać 500 μl buforu do lizy. Homogenizować przez odwrócenie probówki.</li>
		<li>Powtórz kroki 5.1.1-5.1.3 cztery razy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Elucji
	<ol>
		<li>Wirować przez 2 minuty przy 1 000 x g w wirówce z chłodzeniem w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Ostrożnie usunąć supernatant i wyrzucić go. Usunąć ostatnie krople supernatantu za pomocą strzykawki Hamiltona, aby uniknąć aspiracji kulek i wyrzucić supernatant.</li>
		<li>Dodać 40 μl 4x buforu Laemmli (200 mM Tris/HCl pH 6,8, 4% SDS, 40% glicerolu, 0,5 M β-merkaptoetanolu, 0,02% błękitu bromofenolowego). Homogenizować, delikatnie stukając w probówkę.</li>
		<li>Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Wirować przez 5 minut przy 10 000 x g w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Za pomocą strzykawki Hamilton usunąć supernatant i zebrać go w nowej probówce do mikrowirówki. Frakcja ta odpowiada "Eluatowi", który może być przechowywany w temperaturze -80 °C lub bezpośrednio analizowany za pomocą Western Blot.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Test kinazy
<ol>
	<li>Przygotuj bufor kinazy: 50 mM HEPES-NaOH pH 7,5 (HEPES oznacza kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy), 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 5 mM MnCl2, 50 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 20 mM β-glicerofosforanu, 1 μg/ml leupeptyny i 1 mM PMSF. Około 2 ml buforu kinazy jest wymagane dla każdego warunku immunoprecypitacji.</li>
	<li>Przemyć dwukrotnie kulki immunoprecypitowane z kroku 4.7 500 μl buforu do lizy.
	<ol>
		<li>Wirować przez 2 minuty przy 1 000 x g w wirówce z chłodzeniem w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Ostrożnie usunąć supernatant i wyrzucić go. Dodać 500 μl buforu do lizy. Homogenizacja przez inwersję.</li>
		<li>Powtórz kroki 6.2.1 i 6.2.2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przemyć koraliki immunoprecypitowane trzykrotnie 500 μl buforu kinazy.
	<ol>
		<li>Wirować przez 2 minuty przy 1 000 x g w wirówce z chłodzeniem w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Ostrożnie usunąć supernatant i wyrzucić go. Dodać 500 μl buforu kinazy. Homogenizacja przez inwersję.</li>
		<li>Powtórz kroki 6.3.1 i 6.3.2 dwukrotnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wirować przez 2 minuty przy 1 000 x g w wirówce z chłodzeniem w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć supernatant i wyrzucić go. Usunąć ostatnie krople supernatantu za pomocą strzykawki Hamiltona, aby uniknąć aspiracji kulek i wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Dodać 40 μl buforu kinazy do immunoprecypitowanych kulek. Ponownie zawieś koraliki, delikatnie stukając w rurkę.</li>
	<li>Przygotuj mieszaninę do znakowania γ[32P] ATP (końcowa objętość to 22,5 μl, wraz z buforem kinazy) w bezpiecznej probówce.
	<ol>
		<li>Dodać wymaganą objętość buforu kinazy, aby osiągnąć końcową objętość 22,5 μl.</li>
		<li>Odetnij końcówkę końcówki mikropipety o pojemności 20 μl. Zawiesić ponownie immunoprecypitowane kulki z kroku 6.6, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół. Zbierz 10 μl tych koralików do rurki z zamkiem bezpiecznym.</li>
		<li>Dodać ATP z roztworu podstawowego o stężeniu 10 μM, aby osiągnąć 50 mM końcowego stężenia. W zależności od liczby próbki poddanej działaniu substancji, sugeruje się rozcieńczenie roztworu podstawowego ATP w buforze kinazy, aby umożliwić pipetowanie od 1 do 2 μl, aby upewnić się, że objętość jest prawidłowa.</li>
		<li>Dodać 2,5 μg substratu (kofiliny lub podstawowego białka mieliny, MBP w niniejszym badanym przypadku).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 5 μCi γ[32] P] ATP (3,000 Ci/mmol), aby rozpocząć reakcję. Mieszać powoli pipetując w górę i w dół. 
	UWAGA: Od tego momentu prace muszą być wykonywane w bezpiecznym miejscu przeznaczonym do manipulacji radioaktywnością z zachowaniem ostrożnych środków ostrożności, dedykowanych zabezpieczeń i odpowiednich środków kontroli (osłony radioaktywne, licznik Geigera, specjalny pojemnik na odpady, osobiste plakietki na piersi i palcach do wykrywania narażenia radioaktywnego, końcówki filtrów).</li>
	<li>Inkubować przez 20 minut w temperaturze 30 °C.</li>
	<li>Zatrzymać reakcję za pomocą 6 μl 5x buforu Laemmli.</li>
	<li>Podgrzewać w temperaturze 95°C przez 5 min.</li>
	<li>Wirować przy 10 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Załaduj na SDS-PAGE. Przejdź do migration. 
	UWAGA: Należy uważać, aby pierwsza linia wolnego γ[32P] ATP nie wychodziła z żelu, aby uniknąć zanieczyszczenia zbiornika migracyjnego.</li>
	<li>Żel należy zabarwić w temperaturze pokojowej.
	<ol>
		<li>Usuń żel ze szklanych płytek.</li>
		<li>Kontynuuj trzy kąpiele w wodzie o temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Żel należy zabarwić przez noc kolorem Coomassie Blue w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odplamić żel kilkoma kąpielami myjącymi z wodą o temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Owiń żel folią spożywczą.</li>
	<li>Wystaw na światło dzienne przez jedną noc lub dłużej na ekranie luminowizora.</li>
	<li>Odczytaj ekran na luminoimagerze, aby wykryć oznaczone pasma.</li>
</ol>

<ol><li>Manning, G., Plowman, G. D., Hunter, T., Sudarsanam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+protein+kinase+signaling+from+yeast+to+man%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Evolution of protein kinase signaling from yeast to man.</a> Trends in Biochemical Sciences. 27, 514-520 (2002).</li>
<li>Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aManning%2C+G+%22The+protein+kinase+complement+of+the+human+genome%22">The protein kinase complement of the human genome</a>. 298, Science. New York, N.Y. 1912-1934 (2002).</li>
<li>Ochoa, D., Bradley, D., Beltrao, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution%2C+dynamics+and+dysregulation+of+kinase+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Evolution, dynamics and dysregulation of kinase signalling.</a> Current Opinion in Structural Biology. 48, 133-140 (2018).</li>
<li>Bhullar, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinase-targeted+cancer+therapies%3A+progress%2C+challenges+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">Kinase-targeted cancer therapies: progress, challenges and future directions.</a> Molecular Cancer. 17, 48(2018).</li>
<li>Kaboord, B., Perr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+proteins+and+protein+complexes+by+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation.</a> Methods in Molecular Biology. 424, Clifton, N.J. 349-364 (2008).</li>
<li>Arnau, J., Lauritzen, C., Petersen, G. E., Pedersen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+strategies+for+the+use+of+affinity+tags+and+tag+removal+for+the+purification+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins.</a> Protein Expression and Purification. 48, 1-13 (2006).</li>
<li>Wood, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+trends+and+affinity+tag+designs+for+recombinant+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">New trends and affinity tag designs for recombinant protein purification.</a> Current Opinion in Structural Biology. 26, 54-61 (2014).</li>
<li>Young, C. L., Britton, Z. T., Robinson, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+protein+expression+and+purification%3A+a+comprehensive+review+of+affinity+tags+and+microbial+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Recombinant protein expression and purification: a comprehensive review of affinity tags and microbial applications.</a> Biotechnology Journal. 7, 620-634 (2012).</li>
<li>Greenwood, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+assays+for+sensitive+quantification+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+Detection+and+Quantification%22%5BJournal%5D)">Proximity assays for sensitive quantification of proteins.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).</li>
<li>Wang, X., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+Dynamic+and+Heterogeneous+Proteasome+Complexes+Using+In+vivo+Cross-Linking-Assisted+Affinity+Purification+and+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Dissecting Dynamic and Heterogeneous Proteasome Complexes Using In vivo Cross-Linking-Assisted Affinity Purification and Mass Spectrometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1844, Clifton, N.J. 401-410 (2018).</li>
<li>Raykova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Let+There+Be+Light%21%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomes%22%5BJournal%5D)">Let There Be Light!</a> Proteomes. 4, (2016).</li>
<li>Weibrecht, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+ligation+assays%3A+a+recent+addition+to+the+proteomics+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox.</a> Expert Review of Proteomics. 7, 401-409 (2010).</li>
<li>Podobnik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+Study+Protein-protein+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Chimica+Slovenica%22%5BJournal%5D)">How to Study Protein-protein Interactions.</a> Acta Chimica Slovenica. 63, 424-439 (2016).</li>
<li>Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interaction+detection%3A+methods+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interaction detection: methods and analysis.</a> International Journal of Proteomics. 2014, 147648(2014).</li>
<li>Peck, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+phosphorylation%3A+methods+and+strategies+for+studying+kinases+and+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%3A+For+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein phosphorylation: methods and strategies for studying kinases and substrates.</a> The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 45, 512-522 (2006).</li>
<li>Jia, Y., Quinn, C. M., Kwak, S., Talanian, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+in+vitro+kinase+assay+technologies%3A+the+quest+for+a+universal+format%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Drug+Discovery+Technologies%22%5BJournal%5D)">Current in vitro kinase assay technologies: the quest for a universal format.</a> Current Drug Discovery Technologies. 5, 59-69 (2008).</li>
<li>Okano, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+novel+family+of+serine%2Fthreonine+kinases+containing+two+N-terminal+LIM+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a novel family of serine/threonine kinases containing two N-terminal LIM motifs.</a> The Journal of Biological Chemistry. 270, 31321-31330 (1995).</li>
<li>Croft, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53-mediated+transcriptional+regulation+and+activation+of+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">p53-mediated transcriptional regulation and activation of the actin cytoskeleton.</a> Cell Research. 21, 666-682 (2011).</li>
<li>Tastet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIMK2-1+is+a+Hominidae-Specific+Isoform+of+LIMK2+Expressed+in+Central+Nervous+System+and+Associated+with+Intellectual+Disability%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">LIMK2-1 is a Hominidae-Specific Isoform of LIMK2 Expressed in Central Nervous System and Associated with Intellectual Disability.</a> Neuroscience. 399, 199-210 (2019).</li>
<li>Vallee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIMK2-1%2C+a+new+isoform+of+human+LIMK2%2C+regulates+actin+cytoskeleton+remodeling+via+a+different+signaling+pathway+than+that+of+its+two+homologs%2C+LIMK2a+and+LIMK2b%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">LIMK2-1, a new isoform of human LIMK2, regulates actin cytoskeleton remodeling via a different signaling pathway than that of its two homologs, LIMK2a and LIMK2b.</a> The Biochemical Journal. 475, 3745-3761 (2018).</li>
<li>Lee, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Detergents+on+Membrane+Protein+Complex+Isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Impact of Detergents on Membrane Protein Complex Isolation.</a> Journal of Proteome Research. 17, 348-358 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym artykule użyliśmy solidnych narzędzi biochemicznych, aby scharakteryzować na poziomie molekularnym nowe białko, LIMK2-1, uważane za kinazę opartą na jej sekwencji i homologach, LIMK2a i LIMK2b20.
Po pierwsze, wykazaliśmy istnienie LIMK2-1 na poziomie białka za pomocą analizy Western Blot ze specyficznym przeciwciałem. Następnie oceniliśmy jego interakcję z kinazą ROCK1, o której wiadomo, że reguluje LIMK2a i LIMK2b, homologi LIMK2-1. Na koniec oceniliśmy potencjal...

Przez wiele dziesięcioleci wyjaśniano liczne szlaki sygnałowe i wykazano ich udział w kluczowych procesach komórkowych, takich jak podział komórek, różnicowanie, ruchliwość, programowana śmierć komórki, odporność i neurobiologia. Kinazy odgrywają znaczącą rolę w tych szlakach sygnałowych, ponieważ często precyzyjnie regulują swoją aktywację lub inaktywację i są częścią przejściowych wszechstronnych kompleksów, które reagują na bodźce zewnętrzne1,2,3. Mutacje i rozregulowanie kinaz często prowadzą do chorób u ludzi, dlatego stały się one jednym z najważniejszych celów leków w ciągu ostatnich czterdziestu lat4.
W tym kontekście, ważne jest, aby móc wykrywać interakcje kinaz z ich regulatorami lub substratami i identyfikować nowych partnerów. Oczyszczanie powinowactwa i immunoprecypitacja są bardzo skutecznymi technikami izolacji kompleksów białkowych5. Białko przynęty lub kinaza mogą być oznaczone określoną sekwencją peptydową, co pozwala na użycie komercyjnych kulek kowalencyjnie sprzężonych z przeciwciałami skierowanymi przeciwko peptydowi. Materiał ten pozwala na wysoką odtwarzalność w eksperymentach6,7,8. Białka endogenne mogą być również immunoprecypitowane za pomocą przeciwciał skierowanych bezpośrednio na białko przynęty. Przeciwciała mogą być usieciowane z kulkami agarozy białka A lub białka G lub po prostu inkubowane z tymi kulkami przed dodaniem lizatu. Bufor do lizy musi być zoptymalizowany, aby umożliwić solubilizację białek bez utraty interakcji i uniknąć degradacji białek. Główną wadą tego podejścia jest to, że interakcja jest wykrywana podczas lizy komórek; W związku z tym przejściowe lub słabe interakcje, wraz z tymi wymagającymi kontekstu subkomórkowego, mogą zostać pominięte. Inne techniki mogą być używane do pracy bezpośrednio w komórce, takie jak test ligacji zbliżeniowej (PLA)9, oczyszczanie powinowactwa wspomagane sieciowaniem in vivo (XAP)10, transfer energii rezonansu bioluminescencji (BRET) lub transfer energii rezonansu Förster (FRET)11,12. Ponadto immunoprecypitacja nie jest odpowiednia do wyznaczenia stałych termodynamicznych wiązania, dla których wymagane są techniki fizyczne, takie jak powierzchniowy rezonans plazmonowy, kalorymetria miareczkowa izotermiczna lub termoforeza w mikroskali13,14.
Aktywność kinazy może być oceniana przy użyciu wielu technik. W tym miejscu skupiliśmy się na przeciwciałach specyficznych dla fosfon i znakowaniu in vitro γ [32P] ATP (adenozynotrójfosforanu). Przeciwciała swoiste dla fosfo są ukierunkowane na modyfikację fosforanową określonej reszty w białku. Mogą być stosowane w Western Blot lub ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) po lizie komórek, do immunohistochemii, a także na nieuszkodzonych komórkach za pomocą cytometrii przepływowej lub immunofluorescencji. Ich wadą może być brak swoistości, którą można ocenić za pomocą zmutowanej wersji białka docelowego, oraz to, że nie są one dostępne na rynku dla wszystkich białek. Znakowanie ATP in vitro γ[32P] jest bardzo solidną, dobrze ugruntowaną i bardzo czułą metodą15. Można stosować białka immunoprecypitowane lub rekombinowane, a także badać różne substraty. Działanie leków może być również oceniane, ponieważ ta metoda jest ilościowa. Jego główną wadą jest to, że radioaktywność związana z tym podejściem wymaga ostrożnego obchodzenia się z nim. Możliwe są również metody alternatywne oparte na pomiarze substratów peptydowych fluorescencyjnych lub luminescencyjnych i wykorzystaniu zmienionych właściwości fluorescencyjnych/luminescencyjnych po fosforylacji. Takie metody pozwalają również na wysoką przepustowość, co jest wymagane np. przy badaniach przesiewowych cząsteczek, które mogą być potencjalnymi inhibitorami kinazy docelowej. Rzeczywiście, kinazy reprezentują jedną z największych klas celów leków realizowanych przez firmy farmaceutyczne16.
W tym badaniu skupiliśmy się na białku LIMK2-1 (LIMK2-1 to skrót od Lin11, Isle1, Mec3 Kinase isoform 2-1). Białko kinazy LIMK2 zostało po raz pierwszy opisane w 1995 roku17. Trzy izoformy LIMK2 są wytwarzane przez alternatywne łączenie: LIMK2a, LIMK2b i LIMK2-1. Obecnie LIMK2-1 został opisany tylko na poziomie mRNA w jednym badaniu18. W niniejszym artykule scharakteryzowaliśmy to potencjalne nowe białko kinazy na poziomie molekularnym przy użyciu solidnych podejść biochemicznych. Po pierwsze, pokazujemy, że LIMK2-1 jest rzeczywiście zsyntetyzowany. Podobnie jak jego dwa odpowiedniki, LIMK2a i LIMK2b, oddziałuje z poprzedzającą go kinazą ROCK (kinaza białkowa związana z Rho). Pokazujemy, że LIMK2-1 ma aktywność kinazy na podstawowym białku mieliny (MBP), ale nie na kofilinie, kanonicznym substracie kinaz LIM.

<table><tbody><tr><td>Przeciwciało anty-aktyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1978</td><td>dla przeciwciała Western Blot</td></tr><tr><td>anty-c-Myc</td><td>Invitrogen</td><td>MA1-21316</td><td>dla przeciwciała Western Blot</td></tr><tr><td>antykofilina</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>3312/5175</td><td>dla przeciwciała Western Blot</td></tr><tr><td>anty-GFP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-9996</td><td>dla przeciwciała Western Blot</td></tr><tr><td>anty-HA</td><td>Roche Nauki stosowane</td><td>11687423001</td> dla przeciwciała <td>Western Blot</td></tr><tr><td>anty-fosfo-kofiliny</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>3313</td> dla przeciwciała <td>Western Blot</td></tr><tr><td>Anti-PP1i</td><td>Eurogentec</td><td>zaprojektowany do tego badania</td><td>dla Western Blot</td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Euromedex</td><td>A-162B</td><td>dla buforu do lizy</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Invitrogen</td><td>PV3227</td><td>dla &#947;[ 32P] etykietowanie</td></tr><tr><td>&#947;[ 32P] ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG502A</td><td>dla &#947;[ 32P] etykietowanie</td></tr><tr><td>BES buforowana sól fizjologiczna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14280</td><td>do transfekcji</td></tr><tr><td>&#946;-glicerofosforan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9422</td><td>do lizy i buforu kinazy</td></tr><tr><td>&#946;-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td>dla Laemmli</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td>do buforu blokującego</td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126</td><td>dla Laemmli</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td>do wirówki transfekcyjnej</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>111-541</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen R</td><td>Pan Biotech</td><td>P06-20166</td><td>do kontroli transfekcji</td></tr><tr><td>siRNA</td><td>Ambion</td><td>AM4611</td><td>dla swoistości</td></tr> <tr><td>przeciwciała PP1iCoomassie PageBlue Roztwór do barwienia białek</td><td>Thermo-Fisher</td><td>24620</td><td>do barwienia żelem</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3690</td><td>do buforu do lizy</td></tr><tr><td>Jednostka do elektroforezy</td><td>Biorad</td><td>Mini-Protean</td><td>do Western Blot</td></tr><tr><td>EZview Czerwony żel o powinowactwie do anty-HA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6779</td><td>do immunoprecypitacji</td></tr><tr><td>Oprogramowanie GeneSys</td><td>Ozyme</td><td></td><td>na przejęcie Western Blot</td></tr><tr><td>Oprogramowanie GeneTolls</td><td>Ozyme</td><td></td><td>do kwantyfikacji Western Blot</td></tr><tr><td>Koraliki pułapki GFP</td><td>Chromtek</td><td></td><td>do immunoprecypitacji</td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Euromedex</td><td>26-128-6405</td><td>do buforu transferowego</td></tr><tr><td>GST-kofilina</td><td>Sygnalizacja komórkowa Upstate</td><td>12-556</td><td>dla &#947;[ 32P] oznakowanie</td></tr><tr><td>Strzykawka Hamilton 100 ml</td><td>Hamilton</td><td>710</td><td>do ostrożnego usuwania supernatantu z kulek bez ich zasysania</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>do buforu kinazy</td></tr><tr><td>Oprogramowanie ImageQuant TL</td> GE <td>Healthcare</td><td></td><td>do akwizycji i kwantyfikacji radioaktywności</td></tr><tr><td>LIMK2 siRNA</td><td>Ambion</td><td>s8191</td><td>dla PP1i specyficzność przeciwciała</td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SP-04-2217</td><td>do lizy i buforu kinazy</td></tr><tr><td>MBP</td><td>Upstate Cell sygnalizacja</td><td>13-173</td><td>dla &#947;[ 32P] znakowanie</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>dla buforu kinazy</td></tr><tr><td>MnCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244589</td><td>dla buforu kinazy</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Euromedex</td><td>1112</td><td>do lizy i buforu kinazy</td></tr><tr><td>NaF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-1504</td><td>do lizy i buforu kinazy</td></tr><tr><td>Okaidic kwas</td><td>Euromedex</td><td>0-2220</td><td>do buforu do lizy</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>78830</td><td>do lizy i buforu kinazy</td></tr><tr><td>p-nitrofenylofosforanu</td><td>Euromedex</td><td>1026</td><td>do buforu do lizy membrana</td></tr><tr><td>PVDF Immobillon-P</td><td>Merck-Millipore</td><td>IPVH00010 wielkość porów 0,45 mm</td><td>dla Western Blot</td></tr><tr><td>Koło obrotowe</td><td>Labinco</td><td></td><td>do inkubacji kulek</td></tr><tr><td>Zamek awaryjny</td><td>eppendorf Eppendorf</td><td>0030120.086</td><td>do testu kinazy</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5030</td><td>dla Laemmli i buforu migracyjnego</td></tr><tr><td>Ortowanadan sodu</td><td>LC Laboratories</td><td>S8507</td><td>do lizy i buforu kinazy</td></tr><tr><td>Pirofosforan sodu</td><td>Fluka</td><td>71501</td><td>do buforu do lizy</td></tr><tr><td>Super Signal West Dura</td><td>Protein Biology</td><td>34075</td><td>dla Western Blot</td></tr><tr><td>Syngene Pxi</td><td>Ozyme</td><td></td> dla ekstraktów <td>z tkanek Western Blot</td></tr><tr><td> &nbsp;</td><td>Biołańcuch &nbsp;</td><td>P1234035 Mózg P12345152 Płuca P1234149 Wątroba P1234188 Trzustka P1234260 Jądra</td><td>do analizy Western Blot &nbsp;</td></tr><tr><td>Jednostka transferowa</td><td>Biorad</td><td>Mini-Trans-Blot</td><td>dla Western Blot</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Euromedex</td><td>26-128-3094 B</td><td>do buforu do lizy</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949</td><td>do buforu blokującego</td></tr><tr><td>Typhoon FLA9500</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>do odczytu autoradiografii</td></tr><tr><td>Typhoon Trio</td><td>Amersham Bioscience</td><td></td><td>do odczytu autoradiografii</td></tr><tr><td>Papier Whatman</td><td>GE Healthcare</td><td>3030-672</td><td>dla Western Blot</td></tr></tbody></table>

charakterystyka na poziomie molekularnym przy użyciu solidnych podejść biochemicznych nowego białka kinazy

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Obszerne sekwencjonowanie całego genomu zidentyfikowało wiele otwartych ramek odczytu (ORF), dostarczających wielu potencjalnych białek. Białka te mogą odgrywać ważną rolę w komórce i mogą zapoczątkowywać nowe procesy komórkowe. Wśród białek kinazy są głównymi aktorami, ponieważ należą do komórkowych szlaków sygnałowych i mają zdolność włączania lub wyłączania wielu procesów kluczowych dla losu komórki, takich jak wzrost, podział, różnicowanie, ruchliwość i śmierć komórki.
W tym badaniu skupiliśmy się na nowym potencjalnym białku kinazy, LIMK2-1. Wykazaliśmy jego istnienie za pomocą Western Blot przy użyciu specyficznego przeciwciała. Oceniliśmy jego interakcję z białkiem regulującym za pomocą eksperymentów z koimmunoprecypitacją. Koimmunoprecypitacja jest bardzo skuteczną techniką zdolną do wykrycia interakcji między dwoma białkami docelowymi. Może być również używany do wykrywania nowych partnerów białka przynęty. Białko przynęty może być oczyszczone za pomocą znacznika zmodyfikowanego do jego sekwencji lub za pomocą przeciwciała specjalnie na nie skierowanego. Te kompleksy białkowe można następnie rozdzielić za pomocą SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel) i zidentyfikować za pomocą spektrometrii mas. Immunoprecypitowany LIMK2-1 wykorzystano również do zbadania jego aktywności kinazy in vitro poprzez znakowanie γ[32] P] ATP. Ten dobrze ugruntowany test może wykorzystywać wiele różnych substratów, a zmutowane wersje przynęty mogą być używane do oceny roli określonych pozostałości. Można również ocenić działanie środków farmakologicznych, ponieważ technika ta jest zarówno bardzo czuła, jak i ilościowa. Niemniej jednak obchodzenie się z promieniotwórczością wymaga szczególnej ostrożności. Aktywność kinazy można również ocenić za pomocą specyficznych przeciwciał skierowanych przeciwko grupie fosfo zmodyfikowanego aminokwasu. Tego rodzaju przeciwciała nie są dostępne w handlu dla wszystkich reszt modyfikowanych fosfo.

Synteza białka LIMK2-1 
LIMK2-1 jest wymienione w bazach danych, jednak do tej pory tylko jedna publikacja wykazała istnienie jego mRNA18. W porównaniu do dwóch homologów, LIMK2a i LIMK2b, LIMK2-1 posiada dodatkową domenę C-końcową zidentyfikowaną jako domena inhibicyjna fosfatazy białkowej 1 (PP1i). Zaprojektowaliśmy przeciwciało skierowane przeciwko peptydowi tej domeny, obejmującemu aminokwasy 671-684 (Rycina 1A)...

Scharakteryzowaliśmy nowe białko kinazy za pomocą solidnych podejść biochemicznych: analiza Western Blot z dedykowanym specyficznym przeciwciałem na różnych liniach komórkowych i tkankach, interakcje za pomocą eksperymentów z koimmunoprecypitacją, aktywność kinazy wykryta przez Western Blot przy użyciu przeciwciała specyficznego dla fosfy oraz znakowanie γ[32P] ATP.

Charakterystyka na poziomie molekularnym przy użyciu solidnych podejść biochemicznych nowego białka kinazy

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Immunoprecypitacja jest bardzo skuteczną techniką izolowania i oczyszczania białka docelowego. W gładkich warunkach białka, regulatory lub substraty mogą być współimmunoprecypitowane. Wtedy może zostać odkryta nowa sieć interakcji.Można również ocenić aktywność białka immunoprecypitowanego. W szczególności aktywność kinazy może być badana na różnych substratach za pomocą znakowania P32-ATP. Niemniej jednak można ocenić aktywność inhibitorów ukierunkowanych na kinazę zaangażowaną w chorobę.Mogą one stanowić związki ołowiowe do opracowywania nowych leków. Metodę tę można rozszerzyć ze ssaków na drożdże lub bakterie. Ta technika nie jest taka trudna.Do kluczowych punktów: upewnij się, że masz kontrolę negatywną, aby mieć pewność, że wykryta interakcja jest specyficzna, i starannie wybierz warunki lizy, aby utrzymać interakcje i aktywność. Drobne szczegóły i gesty są ważne dla zapewnienia sukcesu tej techniki i nigdy nie są opisane w materiałach i metodach artykułów. Procedurę zademonstruje Fabienne Godin, technik z naszego laboratorium.Po przygotowaniu komórek w pomieszczeniu do hodowli komórkowej w komorze bezpieczeństwa biologicznego, użyj 10-mililitrowej pipety, aby usunąć pożywkę z płytek i wyrzucić ją do specjalnej butelki na odpady z wybielaczem. Następnie dodaj 10 mililitrów świeżego suplementu DMEM i włóż płytki z powrotem do inkubatora w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby przygotować mieszaninę transfekcji, w 15-mililitrowej probówce dodać 450 mikrolitrów 10-milimolowego roztworu chlorowodorku Tris o pH 7,5, uzupełnionego jednym milimolowym EDTA i 50 mikrolitrów 2,5-molowego roztworu chlorku wapnia.Wymieszaj przez odwrócenie. Do probówki dodać objętość odpowiadającą 10 mikrogramom DNA osocza, amplifikowanego za pomocą zestawu do pomiaru midiprepu DNA i rozcieńczonego buforem elucyjnym tego zestawu, którego stężenie zostało określone. Odwróć rurkę, aby wymieszać.Następnie, płynnie mieszając na mieszalniku wirowym, powoli dodaj 500 mikrolitrów buforowanego koncentratu soli fizjologicznej BES 2X, kropla po kropli do probówki. Poruszaj nim bardzo ostrożnie, aby nie zakłócać złożonego tworzenia się między DNA a fosforanem wapnia. Inkubować przez co najmniej 15 minut lub do 45 minut w temperaturze pokojowej.Teraz przenieś płytkę do transfekcji z inkubatora do szafy bezpieczeństwa. Dodawaj przygotowane kompleksy DNA kropla po kropli na komórki na całej powierzchni płytki. Inkubować przez 24 do 72 godzin w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Aby zapobiec degradacji białek, należy przygotować bufor do lizy na lodzie, biorąc pod uwagę cztery mililitry buforu do lizy na każdą transfekowaną płytkę. Pobrać płytkę z transfekowanymi komórkami z inkubatora. Wyjmij nośnik i wyrzuć go do specjalnej butelki na odpady wybielacza.Aby umyć komórki, dodaj trzy mililitry zimnego PBS na bok płytki kropla po kropli, aby uniknąć oderwania transfekowanych komórek. I delikatnie zakręć płytką, aby rozprowadzić bufor na całej powierzchni. Przechyl płytkę, aby wyjąć PBS i wyrzuć ją do butelki na odpady.Powtórz pranie jeszcze raz. Połóż talerz na lodzie. Na koniec ostrożnie wyjmij resztę PBS.Następnie dodaj 500 mikrolitrów buforu do lizy na zimno do transfekowanych przemytych komórek. Rozprowadź go na całej powierzchni talerza. Inkubować przez 10 minut na lodzie.Od czasu do czasu ponownie rozprowadź bufor na całej powierzchni płytki. Następnie za pomocą szpatułki do komórek zeskrob komórki z powierzchni i zbierz je w probówce do mikrowirówki. Wirować przez 10 minut w temperaturze 10 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza.Zebrać lizat sklarowany nad osadem do nowej probówki do mikrowirówki i zebrać 50 mikrolitrów podwielokrotności tej frakcji do innej nowej probówki do mikrowirówki. Podwielokrotność ta zostanie wykorzystana do sprawdzenia, czy transfekowane białka są dobrze eksprymowane. Wyrzuć granulkę do kosza.Najpierw delikatnie zawiesić roztwór podstawowy kulek agarozy w połączeniu z odpowiednim przeciwciałem. Odetnij koniec końcówki o pojemności 200 mikrolitrów, aby uzyskać otwór o średnicy od jednego do dwóch milimetrów. Przymocuj końcówkę do mikropipety i nabierz 40 mikrolitrów roztworu, pozwalając kulkom dostać się do końcówki.Kilkakrotnie pipetuj kulki w górę iw dół, aby nasycić końcówkę, aby zapewnić odpowiednią objętość kulek i przenieś je do probówki mikrowirówkowej. Dodać 500 mikrolitrów buforu TNET, wymieszać przez inwersję i wirować przez dwie minuty w temperaturze 1000 razy G i czterech stopniach Celsjusza. Ostrożnie usunąć supernatant i dodać 500 mikrolitrów buforu TNET.Inkubować na obracającym się kole przez co najmniej godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie odwirować probówkę przez dwie minuty w temperaturze 1,000 razy G i czterech stopniach Celsjusza i dwukrotnie przemyć kulki 500 mikrolitrami buforu do lizy, odwracając i odwirowując. Po umyciu przenieś wcześniej zebrany lizat frakcji całkowitej do probówki i inkubuj na obracającym się kole w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie do czterech godzin.Teraz odwiruj probówkę zawierającą kulki immunoprecypitowane przez dwie minuty w temperaturze 1000 razy G i czterech stopniach Celsjusza. Przemyć kulki pięciokrotnie 500 mikrolitrami buforu do lizy, odwracając i odwirowując. Podczas mycia kulek należy uważać, aby nie zbliżać się zbyt blisko kulek podczas usuwania supernatantu.W przeciwnym razie koraliki zostaną zassane, a pod koniec eksperymentu nie pozostaną już żadne koraliki. W celu elucji najpierw wirować przez dwie minuty w temperaturze 1 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza. Użyj mikropipety o pojemności jednego mililitra, aby ostrożnie usunąć supernatant.Następnie, za pomocą strzykawki Hamiltona wyposażonej w zacementowaną igłę, usuń ostatnie krople supernatantu, aby uniknąć aspiracji kulek. Następnie dodaj 40 mikrolitrów buforu 4X Laemmli. Homogenizować, delikatnie stukając w probówkę.Inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie wirować przez pięć minut w temperaturze 10 000 G i temperaturze pokojowej. Za pomocą strzykawki Hamiltona przenieść sklarowany sklarowany płyn eluowany do nowej probówki do mikrowirówki.Przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Komórki HEK-293 transfekowano nieoznakowanym LIMK 2-1 lub jedną z izoform LIMK 2 znakowanych HA. LIMK 2-1 jest dobrze wyrażony w różnych warunkach.Przeciwciało anty LIMK 2-1 nie rozpoznaje izoform LIMK 2a i LIMK 2b i jest specyficzne, ponieważ jego sygnał zmniejsza się, gdy komórki są transfekowane małym interferującym RNA LIMK2, w porównaniu z kontrolnym małym interferującym RNA. W różnych ludzkich liniach komórkowych LIMK 2-1 wydawał się być wyrażany w HEK-293 i HeLa, ale nie w C6. Eksperymenty z koimmunoprecypitacją wykorzystano do oceny interakcji LIMK2-1 z kinazą ROCK. Każde z różnych białek kodowanych przez transfekowane wektory było dobrze wyrażone.Trzy izoformy LIMK2, a także larp6, zostały skutecznie immunoprecypitowane. W eluatach wykryto ROCK, a tym samym koimmunoprecypitację z trzema izoformami LIMK2, ale nie z larpem6. Wykryta interakcja jest wtedy specyficzna.Koimmunoprecypitowany LIMK 2-1 przetestowano pod kątem aktywności kinazy poprzez znakowanie gamma P32 ATP. LIMK 2-1 nie fosforylował kofiliny, podczas gdy fosforylował podstawowe białko mieliny lub MBP. LIMK 2-1 jest skutecznie immunoprecypitowany w tym teście.Bardzo ważne jest, aby mieć kontrolę negatywną podczas wykonywania immunoprecypitacji, aby mieć pewność, że interakcja jest specyficzna. Skład buforu do lizy musi być starannie ustalony, aby zachować interakcję i aktywność. Po immunoprecypitacji aktywność kinazy można ocenić w celu zliczenia różnych substratów.Mutacja może być łatwo wprowadzona i może odkryć rolę określonych reszt. Można również przeprowadzić badania funkcjonalne w celu zrozumienia fizjologicznej roli nowych, podkreślonych interakcji. Komórki muszą być hodowane w przeznaczonym do tego pomieszczeniu hodowlanym w komorze bezpieczeństwa biologicznego.Z P32 ATP należy obchodzić się ze szczególną ostrożnością. Osłona chroniąca przed promieniowaniem, licznik Geigera, specjalny pojemnik na odpady, osobiste plakietki na piersi i palcach do wykrywania narażenia na promieniowanie oraz końcówki filtrów.

characterization-at-molecular-level-using-robust-biochemical

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Kinaza 2 z powtórzeniami bogatymi w leucynę (LRRK2) jest dużą, wielodomenową kinazą, której mutacje stanowią najczęstszą genetyczną przyczynę choroby Parkinsona. Analiza aktywności kinazowej tego białka okazała się kluczowym narzędziem w zrozumieniu biologii i dysfunkcji tego białka. W niniejszej pracy opisano badanie aktywności kinazowej LRRK2 oraz wybranych jej mutantów in vitro, zapewniając system eksperymentalny do badania fosforylacji domniemanych substratów oraz potencjalnej dysfunkcji...

Oznaczanie aktywności kinazy LRRK2 in vitro

Korzystając z mikromacierzy białkowych zawierających prawie cały proteom S. cerevisiae, sonduje się szybkie, bezstronne badanie tysięcy równoległych interakcji białko-białko. Metoda ta może być stosowana do małych cząsteczek białek, modyfikacji potranslacyjnych i innych testów o wysokiej przepustowości.

Sondowanie funkcjonalnych mikromacierzy białkowych o dużej gęstości w celu wykrycia interakcji białko-białko

Fosforylacja białek jest główną cechą tego, jak komórki interpretują i reagują na informacje w swoim środowisku zewnątrzkomórkowym. W tym miejscu przedstawiamy wysokoprzepustowy protokół badań przesiewowych wykorzystujący kinazy oczyszczone z komórek ssaków w celu szybkiej identyfikacji kinaz, które fosforylują substrat (substraty) będący przedmiotem zainteresowania.

Identyfikacja par kinaza-substrat za pomocą wysokoprzepustowych badań przesiewowych

Kinazy białkowe to wysoce rozwinięte enzymy sygnalizacyjne i rusztowania, które są kluczowe dla między- i wewnątrzkomórkowej transdukcji sygnału. Przedstawiamy protokół pomiaru aktywności kinazy za pomocą znakowanego radioaktywnie trifosforanu adenozyny ([γ-32P] ATP), niezawodnej metody pomagającej w wyjaśnieniu regulacji sygnalizacji komórkowej.

Oznaczanie aktywności kinazy białkowej za pomocą znakowanego radioaktywnie ATP

Ten protokół opisuje strategię optogenetyczną do modulowania aktywności kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK) podczas różnicowania komórek i rozwoju embrionalnego Xenopus. Metoda ta pozwala na odwracalną aktywację szlaku sygnałowego MAPK w hodowli komórek ssaków oraz w wielokomórkowych organizmach żywych, takich jak zarodki Xendopus, z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową.

Odwracalna modulacja szlaku kinazy białkowej aktywowanej mitogenem za pośrednictwem światła podczas różnicowania komórek i rozwoju embrionalnego Xenopus

Kinaza zależna od cykliny 1 (Cdk1) jest aktywowana w fazie G2 cyklu komórkowego i reguluje wiele szlaków komórkowych. W tym miejscu przedstawiamy protokół testu kinazy in vitro z Cdk1, który umożliwia identyfikację miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1 w celu ustalenia celów komórkowych tej ważnej kinazy.

Identyfikacja miejsc fosforylacji specyficznych dla kinazy 1 zależnej od cykliny za pomocą testu kinazy in vitro

Celem tego protokołu jest etykietowanie, wzbogacanie i identyfikowanie substratów kinazy białkowej CK2 ze złożonej próbki biologicznej, takiej jak lizat komórkowy lub homogenat tkankowy. W tym celu metoda ta wykorzystuje unikalne aspekty biologii CK2.

Identyfikacja nowych substratów kinazy CK2 przy użyciu wszechstronnego podejścia biochemicznego

Przedstawiono procedurę wizualizacji aktywności kinazy białkowej A u myszy zachowujących się jak myszy. Ulepszony reporter aktywności kinazy A, tAKARα, ulega ekspresji w neuronach korowych i jest dostępny do obrazowania przez okno czaszkowe. Mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji dwufotonowej służy do wizualizacji aktywności PKA in vivo podczas wymuszonej lokomocji.

Wizualizacja aktywności kinazy białkowej A u myszy zachowujących się z głową przy użyciu mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji dwufotonowej in vivo

W tym artykule przedstawiliśmy zestaw praktycznych i wykonalnych metod charakteryzowania mutantów kinaz rodziny RAF związanych z chorobą, które obejmują test kinazy in vitro, test koaktywacji RAF i komplementarny test rozszczepionej lucyferazy.

Scharakteryzować związane z chorobą mutanty kinaz z rodziny RAF przy użyciu zestawu praktycznych i wykonalnych metod

Przedstawiono szczegółowy protokół generowania samodzielnie składających się mikromacierzy białek ludzkich do badań przesiewowych inhibitorów kinaz.

Badania przesiewowe inhibitorów kinaz w samoorganizujących się mikromacierzach białek ludzkich

Poznaj metody charakteryzacji nowej kinazy białkowej przy użyciu immunoprecypitacji i Western Blot. Techniki te pozwalają badać interakcje białkowe oraz aktywność kinazową w różnych liniach komórkowych.

Charakterystyka na poziomie molekularnym przy użyciu solidnych podejść biochemicznych nowego białka kinazy

Przeglądaj więcej filmów