Name: Identyfikacja par kinaza-substrat za pomocą wysokoprzepustowych badań przesiewowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Poznaj metodę identyfikacji par kinaza-substrat za pomocą wysokoprzepustowych badań przesiewowych z wykorzystaniem kinaz oczyszczonych z komórek ssaków. Ta technika umożliwia szybką analizę aktywności kinazowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez 386634 grantowe NSERC. Chcielibyśmy podziękować członkom Screaton Lab za pomocne dyskusje.

1. Przygotowanie odczynników, płytek i komórek
<ol>
	<li>Przygotuj 500 ml buforu do lizy: 25 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 50 mM NaF, 0,5 mM EDTA pH 8,0, 0,5% TritonX-100, 5 mM beta-glicerofosforanu, 5% glicerolu. Przechowywać w temperaturze 4 °C. Bezpośrednio przed użyciem dodać 1 mM ditiotreitolu (DTT), 1 mM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF) i 1 mM wanadanu sodu. Po tym etapie PMSF nie jest wymagany w żadnym buforze do płukania.</li>
	<li>Przygotuj 20 ml 10x buforu kinazy: 200 mM Tris pH 7,5, 50 mM beta-glicerofosforanu (FW 216), 2 mM wanadanu sodu. Porcjować w probówkach o pojemności 1 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C. Bezpośrednio przed użyciem dodać 5 mM DTT.</li>
	<li>Przygotować 20 ml 10x buforu M-ATP: 300 μM trifosforanu adenozyny (ATP), 66 mM MgCl2, 33 mM MnCl2. Podwielokrotność porcji rozlać do probówek o pojemności 1 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotować 100 ml 2x dodecylosiarczanu sodu (SDS) buforu do lizy: 1,5 g zasady TRIS, 20 ml glicerolu, 30 mlH2O. Rozpuść i dostosuj pH do 6,8 za pomocą HCl. Dodać 40 ml 10% SDS, dostosuj objętość do 100 ml. Dodać 25 mg błękitu bromofenolowego.</li>
	<li>Plamka 4 μl plazmidu ekspresyjnego ssaków o stężeniu 25 ng / μl kodującego kinazę GST 14 na dołek w zestawach 96 płytek dołkowych i odpowiednio płytki znakowane. Uszczelnić i zamrozić płytki w temperaturze -20 °C do czasu użycia.</li>
	<li>1-2 dni przed transfekcją należy przeprowadzić hodowlę komórek HEK293T w kompletnym zmodyfikowanym pożywce Eagle (DMEM) firmy Dulbecco + 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i antybiotykach w inkubatorze o temperaturze 37 °C uzupełnionej CO2 (ostatnie 5%). Przejście z trypsyną i nie pozwól, aby bulion stał się >80% zlewający się podczas ekspansji. Do ekranu wymagane jest co najmniej 6 x 107 komórek (około 3 x 15 cm szalki z HEK293T komórek przy 80% zbieżności).</li>
</ol>
2. Transfekcja
Uwaga: Zobacz Rysunek 1, aby zobaczyć schemat blokowy całego protokołu.
<ol>
	<li>Jeśli płytki zawierające plazmidy kinazy zostały zamrożone, rozmrozić w temperaturze pokojowej i odwirować przy 1,900 x g przez 3 minuty, aby zebrać wilgoć na dnie studzienek.</li>
	<li>Zmieszać 8,6 ml zredukowanej pożywki surowicy (np. OPTI-MEM) z 312,7 μl odczynnika do transfekcji na bazie lipidów. Odstaw na 5 minut.</li>
	<li>Dodać 10 μl zredukowanej pożywki surowicy do każdej studzienki za pomocą automatycznego dozownika płynów wyposażonego w kasetę o małej objętości.</li>
	<li>Dodać 10 μl na studzienkę zredukowanej pożywki surowicy/odczynnika do transfekcji z kroku 2.2 za pomocą automatycznego dozownika cieczy wyposażonego w kasetę o małej objętości. Odstaw na 20 do 45 minut.</li>
	<li>Zawiesić komórki 293T przy 7,5 x 105 komórek/ml w 80 ml kompletnego DMEM. Dodać 100 μl zawiesiny komórek (tj. 7,5 x 104 komórek) do dołka za pomocą automatycznego dozownika płynów wyposażonego w kasetę o standardowej objętości.</li>
	<li>Sprawdź studzienki pod mikroskopem pod kątem równomiernego rozmieszczenia komórek i wróć do inkubatora na 24 godziny.</li>
</ol>
3. Ściąganie kinazy GST
<ol>
	<li>Przygotować świeży: 4 mM roztwór perwanadatu, mieszając 60 μl 0,2 M wanadanu sodu z 540 μlH2O. W drugiej probówce wymieszać 2,7 μl 30% nadtlenku i 1,4 ml PBS. Dodaj oba roztwory razem i odstaw na 15 minut przed użyciem.</li>
	<li>Za pomocą pipety wielokanałowej (nie należy używać automatycznego dozownika cieczy, ponieważ powoduje on zbyt duże turbulencje w studzince) dozuje 2 μl 0,25 M CaCl2 do każdej studzienki, a następnie 2,5 μl perwanadatemu przygotowanego w kroku 3.1. Inkubować każdą płytkę w temperaturze 37 °C przez 10 minut, a następnie umieścić na lodzie.</li>
	<li>Przygotować 35 ml buforu do lizy, dodając DTT, PMSF i wanadan sodu, jak wskazano w sekcji 1 (Przygotowanie odczynników).</li>
	<li>Trzymając talerze na lodzie, usuń pożywkę z każdej studzienki za pomocą aspiratora próżniowego. Natychmiast dodać 50 μl/studzienkę lodowatego buforu do lizy za pomocą automatycznego dozownika cieczy wyposażonego w standardową kasetę. Pozostaw na lodzie na 30 minut do lizy (opcjonalnie: w razie potrzeby można tu zatrzymać, uszczelniając płytkę i przechowując w temperaturze -80 °C. Aby kontynuować, rozmrozić talerze na lodzie).</li>
	<li>Obracać płytki przy 1 900 x g przez 3 min w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zeskrob komórki z każdej studzienki za pomocą wielokanałowej pipety i przenieś całą zawartość na odpowiednio oznakowane płytki z 96 dołkami z dnem w kształcie litery V. Obracać płytki przy 1 900 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Podczas wirowania napełnij płytki pokryte glutationem (po jednej na każdą 96-dołkową płytkę) 100 μl/dołek lodowatego buforu do lizy (bez PMSF) jako płukanie. Trzymaj talerze na lodzie.</li>
	<li>Wyjmij płytki z dnem w kształcie litery V z wirówki. Pojedynczo odwróć płytki glutationu nad zlewem, aby wytrząsnąć bufor do lizy i osuszyć ręcznikiem papierowym. Przenieść bufor do lizy z płytek z dnem w kształcie litery V na płytki glutationowe, przechylając płytkę i używając pipety wielokanałowej, uważając, aby nie naruszyć osadu na dnie. Przykryj talerze i pozostaw na lodzie na minimum 2 godziny, aby się związały.</li>
	<li>Blisko końca 2-godzinnego etapu wiązania należy przygotować stanowisko pracy radioaktywnej, upewniając się, że zastosowano niezbędne środki ostrożności dotyczące pracy radioaktywnej. Ustawić piec do hybrydyzacji na 30 °C.</li>
	<li>Przygotować 200 ml buforu do lizy, dodając DTT i wanadan sodu, jak wskazano w sekcji 1. Na tym etapie PMSF nie jest wymagany.</li>
	<li>Odwróć płytki glutationu nad zlewem, aby wytrząsnąć bufor do lizy i osuszyć ręcznik papierowy. Przepłukać studzienki 3x 100 μl buforem do lizy (bez PMSF). Nie pozwól, aby studzienki pozostały suche — trzymaj je w płukance, aż będą gotowe do kontynuowania.</li>
	<li>Przygotować 55 ml 1x buforu kinazy (KB), rozcieńczając 10x bulion i dodając DTT, jak wskazano w sekcji 1. Przepłukać płytki raz 50 μl 1x KB za pomocą automatycznego dozownika płynów wyposażonego w kasetę o standardowej objętości. Pozostaw 1x KB w studzienkach, aż roztwór A będzie gotowy:
	<ol>
		<li>Przygotuj roztwór A, dodając 500 do 530 μg interesującego Cię substratu, 500 μg zasadowego białka mielinowego (MBP), 2,65 ml 10x KB, 13,25 μl 1 M DTT iH2Odo 15,9 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pojedynczo odwróć talerze nad zlewem, aby usunąć 1x KB płukania, osusz ręcznikiem papierowym i natychmiast dodaj 30 μl roztworu A za pomocą automatycznego dozownika płynów wyposażonego w kasetę o małej pojemności. Trzymaj talerze na lodzie.</li>
	<li>Przygotować roztwór B w obszarze roboczym radioaktywności, dodając 2,5 ml 10x M-ATP, 500 μCi gamma-32P ATP iH2Odo 10 ml.
	<ol>
		<li>Dodać 20 μl roztworu B do dołka za pomocą pipety powtarzalnej, która pomaga w mieszaniu dzięki sile wyrzutu. Przykryć i inkubować w piecu do hybrydyzacji w temperaturze 30 °C przez 30 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po 30 minutach przenieś talerze z powrotem na lód. Dodaj 50 μl 2x buforu do lizy SDS do każdego dołka za pomocą pipety wielokanałowej. W tym momencie można przejść do następnego kroku lub uszczelnić płytki folią aluminiową i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu, aż będzie to wygodne.</li>
</ol>
4. Żele do biegania, barwienia i suszenia
Uwaga: Wszystkie prace powinny być wykonywane w obszarze przeznaczonym dla radioaktywności.
<ol>
	<li>Włącz piekarnik do hybrydyzacji i ustaw na 85 °C. Rozmrozić talerze w temperaturze pokojowej. Gdy piec osiągnie temperaturę, przenieś płytki do pieca i inkubuj przez 10 minut w celu denaturacji próbek.</li>
	<li>Załaduj 26-dołkowe wstępnie oblane żele po 15 μl każdej reakcji za pomocą pipety wielokanałowej, aby napełnić kilka studzienek jednocześnie. Należy zadbać o to, aby wszystkie końcówki dobrze się zrównały z odpowiednimi otworami przed dodaniem próbek. Uruchom żel pod napięciem 150 V. Nie pozwól, aby barwnik śledzący (niebieska linia) spłynął z dna żelu, ponieważ zawiera on niewłączone ATP.</li>
	<li>Zdemontuj żele i odetnij niewłączone ATP (niebieska linia) za pomocą skalpela lub prostej krawędzi, ponieważ spowoduje to prześwietlenie folii. Umieść żele w oznaczonych pojemnikach i przykryj bejcą Coomassie na 15 minut.</li>
	<li>Usuń plamę Coomassie, krótko spłucz żele wodą i dodaj roztwór odplamiający. Odbarwić żele, aż białka będą wyraźnie widoczne. Dla każdej próbki powinna być widoczna prążek dla MBP i prążek dla substratu.</li>
	<li>Aby wysuszyć żele:
	<ol>
		<li>Wytnij duży arkusz bibuły filtracyjnej i umieść go na suszarce.</li>
		<li>Zwilż arkusz celofanu w wodzie destylowanej, aż będzie gładki i bez zmarszczek, a następnie połóż go na papierze.</li>
		<li>Połóż żele na wierzchu arkusza celofanu, notując kolejność żeli. Zwilż drugi arkusz celofanu i ułóż na wierzchu żeli.</li>
		<li>Rozwałkuj wszystkie bąbelki (dobrze sprawdza się do tego wałek uszczelniający płytkę), aby uzyskać ładną, jednolitą powierzchnię. Zamknij klapkę, włącz odkurzacz i susz żele przez 3 godziny w temperaturze 80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po wyschnięciu żeli wystaw je na folię XAR za pomocą ekranu, aby wzmocnić sygnał. Owiń kasetę folią saran lub plastikową torbą i zaklej taśmą, aby chronić przed szronem. Kasetę należy przechowywać przez noc w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
5. Wywoływanie filmów XAR
<ol>
	<li>Następnego dnia wyjmij kasetę z zamrażarki i pozostaw do rozmrożenia w temperaturze pokojowej. Wywołaj film w ciemni za pomocą procesora filmu zgodnie z instrukcjami producenta. 
	Uwaga: Zbadaj filmy pod kątem dowodów na istnienie par kinaza-substrat. Druga, dłuższa ekspozycja może być również przydatna do wykrywania słabszych zdarzeń fosforylacji.</li>
</ol>

<ol><li>Meisenhelder, J., Hunter, T., van der Geer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphopeptide+mapping+and+identification+of+phosphorylation+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Phosphopeptide mapping and identification of phosphorylation sites.</a> Curr Protoc Mol Biol. 18, Unit 18 19(2001).</li>
<li>Doll, S., Burlingame, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+detection+and+assignment+of+protein+posttranslational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+chem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based detection and assignment of protein posttranslational modifications.</a> ACS chem. 10, 63-71 (2015).</li>
<li>Sharma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultradeep+human+phosphoproteome+reveals+a+distinct+regulatory+nature+of+Tyr+and+Ser%2FThr-based+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+rep%22%5BJournal%5D)">Ultradeep human phosphoproteome reveals a distinct regulatory nature of Tyr and Ser/Thr-based signaling.</a> Cell rep. 8, 1583-1594 (2014).</li>
<li>Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+protein+function+by+multisite+phosphorylation--a+25+year+update%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">The regulation of protein function by multisite phosphorylation--a 25 year update.</a> Trends Biochem Sci. 25, 596-601 (2000).</li>
<li>Walsh, C. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalsh%2C+CT+%22Posttranslation+Modification+of+Proteins%3A+Expanding+Nature%27s+Inventory%22">Posttranslation Modification of Proteins: Expanding Nature's Inventory</a>. , 1st edn, Roberts and Company Publishers. (2006).</li>
<li>Boersema, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-depth+qualitative+and+quantitative+profiling+of+tyrosine+phosphorylation+using+a+combination+of+phosphopeptide+immunoaffinity+purification+and+stable+isotope+dimethyl+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">In-depth qualitative and quantitative profiling of tyrosine phosphorylation using a combination of phosphopeptide immunoaffinity purification and stable isotope dimethyl labeling.</a> Mol Cell Proteomics. 9, 84-99 (2010).</li>
<li>Hutti, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+determining+protein+kinase+phosphorylation+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A rapid method for determining protein kinase phosphorylation specificity.</a> Nat Methods. 1, 27-29 (2004).</li>
<li>Johnson, S. A., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinomics%3A+methods+for+deciphering+the+kinome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Kinomics: methods for deciphering the kinome.</a> Nat Methods. 2, 17-25 (2005).</li>
<li>Pawson, T., Nash, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+cell+regulatory+systems+through+protein+interaction+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Assembly of cell regulatory systems through protein interaction domains.</a> Science. 300, 445-452 (2003).</li>
<li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+yeast+protein+kinases+using+protein+chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Analysis of yeast protein kinases using protein chips.</a> Nat Genet. 26, 283-289 (2000).</li>
<li>Shah, K., Shokat, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+genetic+approach+for+the+identification+of+direct+substrates+of+protein+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A chemical genetic approach for the identification of direct substrates of protein kinases.</a> Methods Mol Biol. 233, 253-271 (2003).</li>
<li>Zou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKIS%3A+computational+identification+of+protein+kinases+for+experimentally+discovered+protein+phosphorylation+sites%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+bioinform%22%5BJournal%5D)">PKIS: computational identification of protein kinases for experimentally discovered protein phosphorylation sites.</a> BMC bioinform. 14, 247(2013).</li>
<li>Varjosalo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+active+and+kinase-deficient+kinome+collection+for+identification+of+kinases+regulating+hedgehog+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Application of active and kinase-deficient kinome collection for identification of kinases regulating hedgehog signaling.</a> Cell. 133, 537-548 (2008).</li>
<li>Jansson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+controls+CREB+activity+in+islet+cells+via+regulated+phosphorylation+of+TORC2%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Glucose controls CREB activity in islet cells via regulated phosphorylation of TORC2.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10161-10166 (2008).</li>
<li>Fu, A., Screaton, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+kinomics+to+delineate+signaling+pathways%3A+control+of+CRTC2%2FTORC2+by+the+AMPK+family%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Using kinomics to delineate signaling pathways: control of CRTC2/TORC2 by the AMPK family.</a> Cell Cycle. 7, 3823-3828 (2008).</li>
<li>Abu-Thuraia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axl+phosphorylates+elmo+scaffold+proteins+to+promote+rac+activation+and+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Axl phosphorylates elmo scaffold proteins to promote rac activation and cell invasion.</a> Mol Cell Biol. 35, 76-87 (2015).</li>
<li>Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+kinase+complement+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The protein kinase complement of the human genome.</a> Science. 298, 1912-1934 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Od czasu oryginalnych publikacji opisujących podejście 14,15, oryginalna biblioteka 180 kinaz GST została rozszerzona do 420 członków, czyli ~80% ludzkiego kinomu białkowego. Dzięki rozszerzonej bibliotece opisany protokół zajmuje 4-5 dni, a następnie 1-4 dni na wywołanie filmów (w razie potrzeby), które można skrócić poprzez zastosowanie fosforobrazowania i cyfrowego wzmocnienia sygnału. Istnieje kilka kluczowych kroków, w których należy zachować ostrożność (patrz rysunek 1 , aby zapoznać się...

Modyfikacje potranslacyjne białek (PTM) są niezbędne do komunikacji wewnątrzkomórkowej. Być może najlepiej zbadaną ze wszystkich PTM jest fosforylacja, katalizowana przez kinazy białkowe, które regulują niezliczone funkcje białek, w tym ich aktywność biochemiczną, lokalizację subkomórkową, konformację i stabilność. Identyfikacja miejsc fosforylacji na białkach docelowych może być dokonana przez mapowanie fosfopeptydów tryptycznych lub za pomocą obecnie standardowych technik proteomicznych przy użyciu próbek wzbogaconych o fosforylowane peptydy 1,2. Podczas gdy oczekuje się, że trzy czwarte eksprymowanego proteomu będzie fosforylowane 3 i zidentyfikowanych 200 000 miejsc fosforylacji 5, z szacunkami do 1 miliona 6, wiele z nich nie ma przypisanej biologii, szlaku sygnałowego ani kinazy białkowej.
Podczas gdy identyfikacja fosforylowanych miejsc jest stosunkowo prosta, stosunkowo większym wyzwaniem jest zidentyfikowanie pokrewnych kinaz, które celują w te miejsca, proces, który nazywamy mapowaniem par kinaza:substrat. Opisano kilka podejść do identyfikacji par kinaza:substrat, zaczynając od kinazy będącej przedmiotem zainteresowania i szukając jej substratów lub zaczynając od interesującego substratu i próbując znaleźć modyfikującą kinazę eksperymentalnie 7-11 lub obliczeniowo 12. Aby zidentyfikować kinazy dla znanego fosforylowanego substratu, bioinformatyka może być wykorzystana do identyfikacji białek, które zawierają krótką konserwatywną sekwencję aminokwasów flankujących fosforylowaną resztę (miejsce konsensusu), a także do identyfikacji kinaz, które tworzą wytrącający się kompleks z substratem. Podejścia te są jednak czasochłonne i często nie spotykają się z sukcesem.
Opracowaliśmy systematyczne podejście funkcjonalne do szybkiej identyfikacji kinaz, które mogą fosforylować dany substrat 13. Test przesiewowy daje doskonałą swoistość, z bardzo wyraźną selekcją potencjalnych kinaz pokrewnych. Biorąc pod uwagę centralne znaczenie fosforylacji dla sygnalizacji biologicznej, badanie przesiewowe jest przydatne do odkrywania praktycznie wszystkich szlaków sygnalizacji komórkowej 14-16. Badanie przesiewowe polega na wykonaniu testu kinazy na dużą skalę z biblioteką ludzkich kinaz białkowych. Kinazy zostały oznaczone białkiem S-transferazy glutationowej (GST) i są oczyszczane z ekstraktów z komórek ssaków, co oznacza, że rekombinowane enzymy - w przeciwieństwie do tych przygotowanych z bakterii - są wytwarzane w obecności kinaz białkowych w górę, często wymaganych do aktywności rekombinowanych enzymów in vitro. Rzeczywiście, podczas gdy aktywność kinazy seryny, treoniny i tyrozyny wymagana do dalszej aktywacji kinazy jest obecna w drożdżach 10, genom drożdży koduje 122 kinazy białkowe, co wskazuje, że kinom ssaków, z ponad 500 genami 17, stał się znacznie bardziej złożony w celu regulacji procesów unikalnych dla organizmów wyższego rzędu. Co więcej, wpływ różnych bodźców istotnych dla biologii komórki i chorób człowieka (takich jak małe cząsteczki, czynniki wzrostu, hormony itp.) może być wykorzystany do 14,15modulowania aktywności kinazy w odpowiednim kontekście.

<table><tbody><tr><td>Bufor do lizy</td><td>Wyprodukowany w domu</td><td></td><td>Patrz Protokół krok 1.1</td></tr><tr><td>10x bufor kinazy</td><td>Wyprodukowany w domu</td><td></td><td>Zobacz Protokół krok 1.2</td></tr><tr><td>10x M-ATP</td><td>Wyprodukowano w domu</td><td></td><td>Zobacz krok protokołu 1.3</td></tr><tr><td>Plazmidy ludzkiej kinazy</td><td>Orfeome, Invitrogen, Origene</td><td></td><td>Oznaczone GST w domu</td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki</td><td>Fisher Scientific</td><td>CS003595</td><td></td></tr><tr><td>Komórki 293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher Scientific SH3002201</td><td></td><td>suplement ze 100&nbsp; U/ml penicyliny, 100&nbsp; &#956; g/ml streptomycyny, 10% płodowa surowica cielęca.</td></tr><tr><td>Inkubator CO2</td><td>Sanyo</td><td>MCO-17AIC</td><td></td></tr><tr><td>15 cm naczynia do hodowli komórkowych</td><td>Fisher Scientific</td><td>877224</td><td></td></tr><tr><td>Zredukowana pożywka surowicy</td><td>Invitrogen</td><td>22600-050</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji na bazie lipidów</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny dozownik płynów</td><td>Thermo Scientific</td><td>5840300</td><td></td></tr><tr><td>Mała nasadka kasetowa</td><td>Thermo Scientific</td><td>24073295</td><td></td></tr><tr><td>Standardowa nasadka kasetowa</td><td>Thermo Scientific</td><td>14072670</td><td></td></tr><tr><td>4 mM perwanadate</td><td>Made in house</td><td></td><td>Patrz krok protokołu 3.1</td></tr><tr><td>0,25 M CaCl2</td><td>Made in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta wielokanałowa (20-200 &#956; l)</td><td>Labnet</td><td>p4812-200</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta wielokanałowa (1-10 &#956; l)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>4661040</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 6-dołkowe z dnem w kształcie litery V</td><td>Evergreen Scientific</td><td>290-8116-01V</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 96-dołkowe pokryte glutationem</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-15240</td><td></td></tr><tr><td>Piec do hybrydyzacji</td><td>Biostad</td><td>350355</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże oznaczone GST</td><td>Wyprodukowano w domu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Podstawowe białko mielinowe (MBP)</td><td>Pipeta Sigma</td><td>M1891</td><td></td></tr><tr><td>Repeater (1 ml)</td><td>Eppendorf</td><td>22266209</td><td></td></tr><tr><td>32P gamma-ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>BLU502Z500UC</td><td></td></tr><tr><td>2x bufor do lizy SDS (100&nbsp; ml)</td> <td>Wyprodukowano we własnym zakresie</td><td></td><td>Zobacz protokół krok 1.4</td></tr><tr><td>26-dołkowe prefabrykowane żele TGX Wymagany</td> procent żelu <td>BioRad</td><td>567-1045</td><td>zależy od masy cząsteczkowej interesującego podłoża</td></tr><tr><td>Bejca Coomassie</td><td>Wykonana w domu</td><td></td><td>0,1% Coomassie R250, 10% kwas octowy, 40% metanol</td></tr><tr><td>Coomassie destain</td><td>Wykonane we własnym zakresie</td><td></td><td>10% kwas octowy, 20% metanol</td></tr><tr><td>Oznaczone pojemniki na żel</td><td>Wyprodukowano we własnym zakresie</td><td></td><td>Używane plastikowe pokrywki z pustych pudełek na końcówki, wystarczająco duże, aby pomieścić jeden żel</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna Whatman</td><td>Fisher Scientific</td><td>57144</td><td></td></tr><tr><td>Arkusze celofanu (2)</td><td>BioRad</td><td>165-0963</td><td></td></tr><tr><td>Suszarka do żelu</td><td>Labconco</td><td>4330150</td><td></td></tr><tr><td>Podwójna emulsyjna folia autoradiograficzna</td><td>VWR</td><td>IB1651454</td><td></td></tr><tr><td>Kaseta filmowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBAC-1417</td><td></td></tr><tr><td>Ekran intensyfikujący</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBIS-1417</td><td></td></tr><tr><td>Wałek gumowy uszczelniający</td><td>płytę Sigma</td><td>R1275</td><td></td></tr></tbody></table>

identyfikacja par kinaza-substrat za pomocą wysokoprzepustowych badań przesiewowych

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

Opracowaliśmy platformę przesiewową do identyfikacji dedykowanych ludzkich kinaz białkowych dla fosforylowanych substratów, które mogą być wykorzystane do wyjaśnienia nowych szlaków transdukcji sygnału. Nasze podejście polega na wykorzystaniu biblioteki oczyszczonych ludzkich kinaz białkowych znakowanych GST oraz rekombinowanego substratu białkowego, który jest przedmiotem zainteresowania. Wykorzystaliśmy tę technologię do identyfikacji kinazy 2 regulującej powinowactwo MAP / mikrotubul (MARK2) jako kinazy dla miejsca regulowanego glukozą na regulowanym przez CREB koaktywatorze transkrypcji 2 (CRTC2), białku wymaganym do proliferacji komórek beta, a także rodziny kinaz tyrozynowych Axl jako regulatorów przerzutów komórkowych poprzez fosforylację białka adaptorowego ELMO. Opisujemy tę technologię i omawiamy, w jaki sposób może ona pomóc w ustaleniu kompleksowej mapy tego, jak komórki reagują na bodźce środowiskowe.

Reprezentatywne wyniki przesiewu przedstawiono na Rysunku 2. Przesiewowi poddano 180 kinaz, wykorzystując peptydowy substrat z tagiem GST odpowiadający aminokwasom 268-283 białka CRTC2, a także klasyczny substrat do analiz kinaz – podstawowe białko mieliny (MBP). Tylko dwie kinazy, MARK2 oraz silnie spokrewniona kinaza MARK3, fosforylowały peptyd CRTC2. MBP jest dołączane jako kontrola wewnętrzna we wszystkich analizach, ponieważ zawiera wiele reszt podatnych na fosforylację i wędruje w żelu na poziomie ...

Fosforylacja białek jest główną cechą tego, jak komórki interpretują i reagują na informacje w swoim środowisku zewnątrzkomórkowym. W tym miejscu przedstawiamy wysokoprzepustowy protokół badań przesiewowych wykorzystujący kinazy oczyszczone z komórek ssaków w celu szybkiej identyfikacji kinaz, które fosforylują substrat (substraty) będący przedmiotem zainteresowania.

Identyfikacja par kinaza-substrat za pomocą wysokoprzepustowych badań przesiewowych


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja kinaz fosforylujących wybrany substrat przy użyciu metod wysokoprzepustowego przesiewania. Osiąga się to poprzez najpierw transfekcję komórek plazmidami wykazującymi kinazy połączone z transferazą S-glutationylującą lub GST. Drugim krokiem jest przeprowadzenie GST-kinazowego pulldownu.Następnie próbki nanosi się na żele, które następnie poddaje się elektroforezie i barwi barwnikiem Coomassie Brilliant Blue. Ostatnim krokiem jest wysuszenie żeli i naświetlanie ich na kliszach autoradiograficznych. Ostatecznie, poprzez wywołanie i interpretację otrzymanych klisz, można zidentyfikować pary kinaza-substrat, ponieważ każda ścieżka odpowiada osobnemu badaniu aktywności kinazy.Istniejące metody identyfikacji kinazy dla znanego fosforylowanego substratu obejmują wykorzystanie podejść bioinformatycznych do wyszukiwania miejsca konsensusu w substracie, wykrywanie kompleksów między kinazą a substratami za pomocą technik biochemicznych i metody prób i błędów oraz poszukiwanie substratów konsensusowych na podstawie ich znanej funkcji biologicznej. Podejścia te są czasochłonne i nie zawsze kończą się sukcesem. Nasza metoda umożliwia szybką identyfikację par kinaza-substrat na podstawie wyników funkcjonalnych.Kiedy po raz pierwszy opracowaliśmy tę metodę, obawialiśmy się, że specyficzność in vitro może być niewystarczająca. Jak się okazało, specyficzność substratowa jest doskonała i często stwierdzamy, że w badaniu przesiewowym tylko kinazy z tej samej rodziny są w stanie fosforylować dany substrat. Jest to szczególnie widoczne podczas stosowania multipleksowania z użyciem wielu substratów w każdym badaniu, co dowodzi skuteczności procedury. Courtney, technik z mojego laboratorium, rozpocznie procedurę od przygotowania odczynników, płytek i komórek zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Jeśli płytki zawierające plazmidy kinazy były zamrożone, należy je rozmrozić w temperaturze pokojowej i odwirować przy 1900 ×g przez trzy minuty, aby zebrać wilgoć na dnie studzienek. Wymieszaj 8,6 ml pożywki z obniżoną zawartością surowicy z 312,7 µl odczynnika do transfekcji opartego na lipidach i pozostaw mieszaninę na pięć minut w każdej studzience. Do płytki 96-dołkowej zawierającej plazmidy kinazy dodaj 10 µl pożywki z obniżoną zawartością surowicy.Używając automatycznego dozownika cieczy wyposażonego w kasetę do małych objętości, należy dodać 10 µL mieszaniny odczynnika do transfekcji w medium z obniżoną zawartością surowicy do każdej studni, a następnie pozostawić płytkę na 20 do 45 minut. Następnie należy resuspendować komórki 293T w stężeniu 0,75 mln komórek/ml w 80 ml kompletnego medium DMEM lub DMEM z dodatkami, dodając 100 µL zawiesiny komórkowej do każdej studni. Używając automatycznego dozownika cieczy wyposażonego w kasetę do standardowych objętości, należy sprawdzić pod mikroskopem równomierność rozkładu komórek w studniach przed powrotem płytki do inkubatora w temperaturze 37 °C na 24 godziny.Aby rozpocząć eksperyment z wyciąganiem kinazy GST (GST kinase pull down), należy przygotować roztwór wanadanu o stężeniu 4 mM, mieszając 60 µL 0,2 M wanadanu sodu z 540 µL wody. W drugiej probówce wymieszać 2,7 µL 30% nadtlenku wodoru i 1,4 ml soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS). Połączyć oba roztwory i pozostawić mieszaninę na 15 minut przed użyciem.Używając pipety wielokanałowej, nanieś dwie mikrolitry 0,25 M chlorku wapnia do każdego dołka, a następnie 2,5 mikrolitry roztworu z datą potwierdzenia. Inkubuj każdą płytkę w temperaturze 37 °C przez 10 minut, a następnie umieść na lodzie, utrzymując płytki w tej temperaturze. Usuń medium z każdego dołka za pomocą odessawania próżniowego, a następnie niezwłocznie dodaj 50 mikrolitrów lodowatego buforu lizującego na dołek.Używając automatycznego dozownika cieczy z zamontowaną standardową kasetą, pozostaw płytkę na 30 minut na lodzie w celu lizy. Po wirowaniu płytek przy 1900 ×g przez trzy minuty w temperaturze 4 °C, zeskrob komórki z każdej studzienki za pomocą pipety wielokanałowej i przenieś całą zawartość do odpowiednio oznakowanych probówek. Płytki 96-dołkowe wiruj przy 1900 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C; podczas wirowania napełnij płytki powlekane glutationem buforem do lizy o temperaturze 0 °C w ilości 100 µL na studzienkę.W czasie płukania należy przechowywać płytki na lodzie. Po odwirowaniu płytek dolnych, należy odwrócić płytki z glutationem nad umywalką, aby usunąć bufor lizujący, a następnie osuszyć je ręcznikiem papierowym. Następnie należy przenieść bufor lizujący z płytek z V-kształtnym dnem do płytek z glutationem, przechylając płytkę i używając pipety wielokanałowej, uważając, aby nie naruszyć osadu na dnie.Następnie przykryć płytki i pozostawić na lodzie przez minimum dwie godziny. Pod koniec dwugodzinnego etapu wiązania przygotować stanowisko do pracy z izotopami promieniotwórczymi, upewniając się, że zachowano niezbędne środki ostrożności wymagane przy pracy z materiałami radioaktywnymi. Ustawić piec do hybrydyzacji na 30 °C.Odwróć płytki z glutationem nad zlewem, aby wylać bufor do lizy, a następnie osusz je ręcznikiem papierowym. Przepłucz studzienki trzykrotnie, używając 100 µl buforu do lizy bez PMSF. Nie dopuszczaj do wyschnięcia studzienek.Przechowuj je w płukance do momentu rozpoczęcia kolejnego etapu. Następnie przygotuj 55 ml buforu kinazowego 1X (1x kb) zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Dodaj 50 µl 1x kb do każdego dołka płytki, używając automatycznego dozownika cieczy z zamontowaną kasetą o standardowej objętości.Następnie przygotuj roztwór A, sporządzając roztwór zawierający odpowiedni substrat oraz podstawowe białko mieliny (MBP) lub MVP, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, przygotowując każdy z nich osobno. Odwróć płytki nad zlewem, aby usunąć płukanie 1X KB, osuszając je ręcznikiem papierowym, a następnie natychmiast dodaj 30 µL roztworu A, używając automatycznego dozownika cieczy wyposażonego w kasetkę do małych objętości. Płytki należy przechowywać w lodzie.Następnie, w obszarze pracy z materiałami radioaktywnymi, przygotuj roztwór B zgodnie z opisem w protokole tekstowym, w ilości 20 µL roztworu B na studzienkę. Używając pipety wielokanałowej (repeatera), która ułatwia mieszanie dzięki sile wyrzutu, pokryj i inkubuj płytkę w piecu do hybrydyzacji w temperaturze 30 °C przez 30 minut. Po 30 minutach przenieś płytki z powrotem na lód.Następnie do każdej studzienki należy dodać 50 µL dwukrotnego buforu lizującego z dodecylosiarczanem sodu (SDS), korzystając z pipety wielokanałowej. Wszystkie czynności w tej sekcji powinny być wykonywane w obszarze wyznaczonym do pracy z materiałami radioaktywnymi. Włączyć piec do hybrydyzacji i ustawić temperaturę na 85 °C.Po osiągnięciu przez piec odpowiedniej temperatury, przenieś płytki do pieca i inkubuj przez 10 minut w celu denaturacji próbek. Następnie nałóż 15 µl każdej reakcji na gotowe żele z 26 studniami.Podczas używania pipety wielokanałowej do napełniania kilku studni jednocześnie należy upewnić się, że wszystkie końcówki są dopasowane do odpowiadających im studni. Przed dodaniem próbek należy prowadzić elektroforezę żelu przy napięciu 150 V. Nie należy dopuścić do wyjścia niebieskiej linii poza dolną krawędź żelu, ponieważ zawiera ona niewbudowany ATP. Następnie należy wyjąć żele i usunąć niewbudowany ATP, gdyż spowodowałby on przyciemnienie ekspozycji żelu na foliach.Umieść żele w oznakowanych pojemnikach i przykryj barwnikiem Kumasi na 15 minut. Następnie usuń barwnik Kumasi. Krótko wypłucz żele wodą i dodaj roztwór odbarwiający.Przechowuj żele, aż białka staną się wyraźnie widoczne. Dla każdej próbki powinna być widoczna prążka dla MVP oraz prążka dla substratu. Aby wysuszyć żele, wytnij duży arkusz papieru filtracyjnego i umieść go w suszarce.Namocz arkusz celofanu w wodzie destylowanej, aż stanie się gładki i pozbawiony zmarszczek, a następnie połóż go na papierze. Ułóż żele na arkuszu celofanu, zapisując kolejność ich rozmieszczenia. Namocz drugi arkusz celofanu i połóż go na żelach.Rozprowadź wszystkie pęcherzyki powietrza, aby uzyskać gładką, jednorodną powierzchnię. Zamknij pokrywę, włącz pompę próżniową i susz żele przez trzy godziny w temperaturze 80 °C. Po wysuszeniu żeli poddaj je ekspozycji na film do autoradiografii z podwójną emulsją, używając ekranu w celu wzmocnienia sygnału.Owiń kasetę folią spożywczą lub plastikową torebką i zabezpiecz taśmą, aby zapobiec przedostawaniu się szronu przed przechowywaniem kasety w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia wyjmij kasetę z zamrażarki i pozwól jej odtajać w temperaturze pokojowej. Wywołaj film w ciemni, używając procesora filmowego zgodnie z przedstawionymi instrukcjami producenta.Oto reprezentatywne wyniki przesiewu, w którym przebadano 180 kinaz, wykorzystując substrat w postaci peptydu z tagiem GST, odpowiadający aminokwasom od 268 do 283 regulatora transkrypcyjnego współaktywatora dwa (CRTC2), a także klasyczny substrat do analizy kinaz – podstawowe białko mieliny (MBP). Tylko dwie kinazy, MARK2 oraz silnie spokrewniona MARK3, przeprowadziły fosforylację peptydu CRTC2. MBP został włączony jako kontrola wewnętrzna we wszystkich analizach, ponieważ zawiera wiele reszt podatnych na fosforylację i wędruje na poziomie 18 kDa w dolnej części żelu.Pozwala to na interpretację specyficzności. Niektóre kinazy będą silnie fosforylować substrat oraz MVP. Warto tutaj zauważyć, że w studzienkach zawierających sam GST zawsze oczyszcza się pewna aktywność endogennej kinazy.W związku z tym w teście zawsze występuje fosforylacja tła. Choć nie wyklucza to faktu, że fosforylacja substratu jest rzeczywista, sugeruje to, że w warunkach in vitro kinaza może być mniej selektywna. Szczególnie pomocne jest zastosowanie wielu substratów o różnych masach cząsteczkowych, aby wyciągnąć wnioski dotyczące specyficzności substratowej kinazy.Ponieważ badanie przesiewowe odbywa się in vitro, a w warunkach in vivo występują dodatkowe poziomy złożoności, kinaza kandydacka musi zostać zwalidowana w komórkach. Na przykład kinaza kandydacka może posiadać zdolność do fosforylacji substratu in vitro, ale może nie być ona ekspresowana w tym samym typie komórek lub w tych samych przedziałach wewnątrzkomórkowych co substrat. Zazwyczaj przeprowadza się to poprzez wyciszanie genu kandydata za pomocą RNAi.Możliwe jest również przeprowadzenie wtórnego przesiewu z użyciem mutanta substratu, który nie ulega fosforylacji, aby potwierdzić specyficzność.

identification-kinase-substrate-pairs-using-high-throughput

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Kinaza 2 z powtórzeniami bogatymi w leucynę (LRRK2) jest dużą, wielodomenową kinazą, której mutacje stanowią najczęstszą genetyczną przyczynę choroby Parkinsona. Analiza aktywności kinazowej tego białka okazała się kluczowym narzędziem w zrozumieniu biologii i dysfunkcji tego białka. W niniejszej pracy opisano badanie aktywności kinazowej LRRK2 oraz wybranych jej mutantów in vitro, zapewniając system eksperymentalny do badania fosforylacji domniemanych substratów oraz potencjalnej dysfunkcji...

Oznaczanie aktywności kinazy LRRK2 in vitro

W tym filmie opisujemy metodę identyfikacji małocząsteczkowych inhibitorów kinaz, które modulują apoptozę podwójnie dodatnich niedojrzałych tymocytów samoreaktywnych CD4+CD8+. Apoptoza jest indukowana w podwójnie dodatnich tymocytach poprzez aktywację ich za pomocą kulek magnetycznych pokrytych anty-CD3 i anty-CD28; Następnie przeprowadza się leczenie inhibitorami małocząsteczkowymi i analizę cytometrii przepływowej w celu wykrycia, czy inhibitory modulują ekspresję markera apoptotycznego.

Identyfikacja inhibitorów kinaz, które modulują odpowiedź tymocytów na silne sygnały TCR

Korzystając z mikromacierzy białkowych zawierających prawie cały proteom S. cerevisiae, sonduje się szybkie, bezstronne badanie tysięcy równoległych interakcji białko-białko. Metoda ta może być stosowana do małych cząsteczek białek, modyfikacji potranslacyjnych i innych testów o wysokiej przepustowości.

Sondowanie funkcjonalnych mikromacierzy białkowych o dużej gęstości w celu wykrycia interakcji białko-białko

Badanie przesiewowe macierzy peptydowej to wysokoprzepustowy test do identyfikacji miejsc interakcji białko-białko. Pozwala to na mapowanie wielu interakcji białka docelowego i może służyć jako metoda identyfikacji miejsc dla inhibitorów, które celują w białko. Tutaj opisujemy protokół badania przesiewowego i analizy macierzy peptydowych.

Identyfikacja miejsc interakcji białko-białko za pomocą macierzy peptydowych

Tutaj prezentujemy ilościowy i skalowalny protokół do przeprowadzania ukierunkowanych badań przesiewowych małych cząsteczek dla regulatorów kinaz naiwnie zaszczepionego przejścia pluripotencjalnego.

Prosta metoda identyfikacji kinaz, które regulują pluripotencję embrionalnych komórek macierzystych za pomocą wysokoprzepustowych badań przesiewowych inhibitorów

Testy konkurencji peptydowej są szeroko stosowane w różnych eksperymentach molekularnych i immunologicznych. W artykule opisano szczegółową metodę testu kinazy konkurującej z oligopeptydami in vitro i związane z nią procedury walidacyjne, które mogą być przydatne do znalezienia określonych miejsc fosforylacji.

Test konkurencji oligopeptydowej do oznaczania miejsca fosforylacji

Kinaza zależna od cykliny 1 (Cdk1) jest aktywowana w fazie G2 cyklu komórkowego i reguluje wiele szlaków komórkowych. W tym miejscu przedstawiamy protokół testu kinazy in vitro z Cdk1, który umożliwia identyfikację miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1 w celu ustalenia celów komórkowych tej ważnej kinazy.

Identyfikacja miejsc fosforylacji specyficznych dla kinazy 1 zależnej od cykliny za pomocą testu kinazy in vitro

Celem tego protokołu jest etykietowanie, wzbogacanie i identyfikowanie substratów kinazy białkowej CK2 ze złożonej próbki biologicznej, takiej jak lizat komórkowy lub homogenat tkankowy. W tym celu metoda ta wykorzystuje unikalne aspekty biologii CK2.

Identyfikacja nowych substratów kinazy CK2 przy użyciu wszechstronnego podejścia biochemicznego

Scharakteryzowaliśmy nowe białko kinazy za pomocą solidnych podejść biochemicznych: analiza Western Blot z dedykowanym specyficznym przeciwciałem na różnych liniach komórkowych i tkankach, interakcje za pomocą eksperymentów z koimmunoprecypitacją, aktywność kinazy wykryta przez Western Blot przy użyciu przeciwciała specyficznego dla fosfy oraz znakowanie γ[32P] ATP.

Charakterystyka na poziomie molekularnym przy użyciu solidnych podejść biochemicznych nowego białka kinazy

Przedstawiono szczegółowy protokół generowania samodzielnie składających się mikromacierzy białek ludzkich do badań przesiewowych inhibitorów kinaz.

Badania przesiewowe inhibitorów kinaz w samoorganizujących się mikromacierzach białek ludzkich

Poznaj metodę identyfikacji par kinaza-substrat za pomocą wysokoprzepustowych badań przesiewowych z wykorzystaniem kinaz oczyszczonych z komórek ssaków. Ta technika umożliwia szybką analizę aktywności kinazowej.

Identyfikacja par kinaza-substrat za pomocą wysokoprzepustowych badań przesiewowych

Przeglądaj więcej filmów