Identyfikacja par kinaza-substrat za pomocą wysokoprzepustowych badań przesiewowych

Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja kinaz, które fosforylują substrat będący przedmiotem zainteresowania przy użyciu wysokoprzepustowych metod przesiewowych. Osiąga się to poprzez pierwsze transektowanie komórek z plazmidami eksprymującymi kinazy FU do glutationu jako transferazy lub GST. Drugim krokiem jest wykonanie pulldown kinazy GST.

Następnie próbki są ładowane do żeli, które są następnie uruchamiane i barwione brylantowym niebieskim barwnikiem kumasi. Ostatnim krokiem jest wysuszenie żeli i wystawienie ich na działanie filmu z auto radiografii. Ostatecznie, opracowując i interpretując powstałe filmy, można zidentyfikować pary substratów kinazy, ponieważ każda ścieżka jest reprezentatywna dla odrębnego testu kinazy.

Istniejące metody identyfikacji kinazy dla znanego fosforylowanego substratu obejmują stosowanie podejść bioinformatycznych w celu poszukiwania miejsca konsensusu w substracie, wykrywanie kompleksów między kinazą a substratami przy użyciu technik biochemicznych oraz podejście prób i błędów, poszukiwanie substratów conte consensus na podstawie ich znanej funkcji biologicznej. Takie podejścia są czasochłonne i nie zawsze kończą się sukcesem. Nasze podejście pozwala na szybką identyfikację par substratów kinaz na podstawie wyników funkcjonalnych.

Kiedy po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, obawialiśmy się, że swoistość in vitro będzie niewystarczająca. Jak się okazuje, specyficzność substratu jest doskonała i często stwierdzamy, że tylko kinazy należące do rodziny są w stanie fosforylować dany substrat na ekranie. Jest to szczególnie widoczne, gdy multipleksujemy przy użyciu wielu substratów na każdym ekranie, demonstrując, że procedura będzie Courtney, technik z mojego laboratorium Rozpocznij procedurę od przygotowania odczynników, płytek i komórek zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Jeśli płytki zawierające plazmidy kinazy zostały zamrożone, rozmrozić w temperaturze pokojowej i odwirować w temperaturze 1900 razy G przez trzy minuty, aby zebrać wilgoć na dnie studzienek. Wymieszaj 8,6 mililitra zredukowanej pożywki surowicy z 312,7 mikrolitrami odczynnika do transfekcji na bazie lipidów i pozostaw mieszaninę na pięć minut do każdego dołka. Z 96-dołkowej płytki zawierającej plazmidy kinazy w 10 mikrolitrach zredukowanej pożywki surowicy.

Używając automatycznego dozownika cieczy wyposażonego w kasetę o małej objętości, dodaj 10 mikrolitrów mieszanki odczynników do transfekcji pożywki w surowicy na dołek, używając automatycznego dozownika płynów wyposażonego w kasetę o małej objętości i pozostaw płytkę na 20 do 45 minut. Następnie resus zawiesić 2 93 limfocyty T przy 0,75 miliona komórek na mililitr w 80 mililitrach kompletnego zmodyfikowanego delcos równa się pożywce lub DMEM przy 100 mikrolitrach zawiesiny komórek na studzienkę. Używając automatycznego dozownika cieczy wyposażonego w kasetę o standardowej objętości, sprawdź studzienki pod mikroskopem pod kątem równomiernego rozmieszczenia komórek przed powrotem do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 24 godziny.

Aby rozpocząć eksperyment z kinazą GST pull down. Przygotować roztwór czteromilimolowy na wanadan, mieszając 60 mikrolitrów 0,2-molowego wanadanu sodu z 540 mikrolitrami wody w drugiej probówce zmieszanej z 2,7 mikrolitrami 30% nadtlenku i 1,4 mililitra soli fizjologicznej buforowanej fosforanem lub PBS. Dodaj oba roztwory razem i pozostaw mieszaninę na 15 minut przed użyciem.

Za pomocą pipety wielokanałowej dozuj dwa mikrolitry 0,25 molowego chlorku wapnia do każdej studzienki, a następnie 2,5 mikrolitra sprawdzonego roztworu daty. Inkubuj każdą płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut, a następnie ułóż na lodzie, trzymając płytki na lodzie. Usunąć pożywkę z każdej studzienki, natychmiast używając próżni o temperaturze 50 mikrolitrów na studzienkę lodowatego buforu do lizy

Korzystając z automatycznego dozownika płynów wyposażonego w standardową kasetę, pozostaw talerz na 30 minut na lodzie do. Po obracaniu płytek w temperaturze 1900 razy G przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza, zeskrob komórki z każdej studzienki za pomocą pipety wielokanałowej i przenieś całą zawartość do odpowiednio oznakowanego vbo. 96-dołkowe płytki obracają płytki pod kątem 1900 razy G przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza podczas wirowania, napełnij płytki pokryte glutationem 100 mikrolitrami na studzienkę lodowatego buforu do lizy

Podczas płukania trzymaj talerze na lodzie. Po odwirowaniu dolnych płytek odwróć płytki glutationu nad zlewem, aby wytrząsnąć bufor do lizy i osuszyć ręcznikiem papierowym. Przenieść bufor do lizy z płytek dolnych w kształcie litery V na płytki z glutationem, przechylając płytkę i używając pipety wielokanałowej, uważając, aby nie naruszyć osadu na dnie.

Następnie przykryj talerze i pozostaw na lodzie na minimum dwie godziny. Aby związać się blisko końca dwugodzinnego etapu wiązania, należy przygotować stanowisko pracy radioaktywnej, upewniając się, że zastosowano niezbędne środki ostrożności dotyczące pracy radioaktywnej. Ustaw piekarnik do hybrydyzacji na 30 stopni Celsjusza.

Odwróć płytki glutationu nad zlewem, aby wytrząsnąć bufor do lizy i osuszyć ręcznik papierowy. Przepłukać studzienki trzykrotnie 100 mikrolitrami buforu do lizy bez PMSF. Nie pozwól, aby studzienki pozostały suche.

Trzymaj je w płukaniu, aż będą gotowe do kontynuowania. Następnie przygotuj 55 mililitrów jednego buforu kinazy X lub jednego x kb zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Dodaj 50 mikrolitrów jednego x kb do każdego dołka płytki za pomocą automatycznego dozownika płynów wyposażonego w kasetę o standardowej objętości.

Następnie przygotuj roztwór A, przygotowując roztwór zawierający interesujący substrat i zasadowe białko mielinowe lub MVP, jak opisano w protokole tekstowym, pojedynczo. Odwróć talerze nad zlewem, aby usunąć jedną działkę płukania XKB na ręczniku papierowym i natychmiast dodaj 30 mikrolitrów roztworu A. Za pomocą automatycznego dozownika płynów wyposażonego w kasetę o małej objętości. Trzymaj talerze na lodzie.

Następnie przygotować roztwór B w obszarze roboczym promieniotwórczości zgodnie z opisem w protokole tekstowym w ilości 20 mikrolitrów roztworu B na studzienkę. Za pomocą pipety powtarzalnej, która pomaga w mieszaniu dzięki sile wyrzutu, przykryj i inkubuj płytkę w piecu do hybrydyzacji o temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 30 minut. Po 30 minutach przenieś talerze z powrotem do lodu.

Następnie dodaj 50 mikrolitrów dwóch x siarczanu sodu lub buforu do lizy SDS do każdej studzienki za pomocą pipety wielokanałowej. Wszystkie prace w tej sekcji powinny być wykonywane w obszarze wyznaczonym do prowadzenia działalności radiokomunikacyjnej. Włącz piekarnik do hybrydyzacji i ustaw go na 85 stopni Celsjusza.

Gdy piec osiągnie temperaturę, przenieś płytki do pieca i inkubuj przez 10 minut w celu denaturacji próbek. Następny ładunek. 26 dobrze prefabrykowanych żeli po 15 mikrolitrów każdej reakcji.

Używając pipety wielokanałowej do napełniania kilku studzienek jednocześnie, należy uważać, aby wszystkie końcówki były wyrównane z odpowiednimi studzienkami. Przed dodaniem próbek uruchom żel pod napięciem 150 woltów. Nie pozwól, aby niebieska linia spływała z dolnej części żelu, ponieważ zawiera ona niewbudowaną A TP. Następnie zdemontuj żele i usuń niewbudowany TP, ponieważ przyciemni to ekspozycję żelu na foliach.

Umieść żele w oznaczonych pojemnikach i przykryj plamą kumasi na 15 minut. Następnie usuń plamę kumasi. Krótko spłucz żele wodą i dodaj roztwór detain.

Żele należy przechowywać do momentu, aż białka będą wyraźnie widoczne. Dla każdej próbki powinno być widoczne pasmo dla MVP i pasmo dla podłoża. Aby wysuszyć żele, wytnij duży arkusz bibuły filtracyjnej i umieść go na suszarce.

Zwilż arkusz celofanu w wodzie destylowanej, aż będzie gładki i pozbawiony zmarszczek, a następnie umieść go na papierze. Połóż żele na wierzchu arkusza celofanu, notując kolejność żeli. Zwilż drugi arkusz celofanu i ułóż na wierzchu żeli.

Rozwałkuj wszystkie bąbelki, aby uzyskać ładną, jednolitą powierzchnię. Zamknij klapkę, włącz odkurzacz i napędzaj żele przez trzy godziny w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Po wyschnięciu żeli należy je poddać działaniu podwójnej emulsyjnej folii do automatycznej radiografii za pomocą ekranu w celu zintensyfikowania sygnału.

Owiń kasetę folią saran lub plastikową torbą i uszczelnij taśmą, aby chronić przed szronem przed przechowywaniem kasety w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia wyjmij kasetę z zamrażarki i pozwól jej rozmrozić się w temperaturze pokojowej. Wywołaj film w ciemnym pomieszczeniu za pomocą procesora filmowego zgodnie z instrukcjami producenta.

Oto reprezentatywne wyniki z badania przesiewowego: 180 kinaz przebadano przy użyciu substratu peptydowego oznaczonego GST odpowiadającego aminokwasom od 268 do 283 z regulowanego przez Kreb koaktywatora transkrypcji dwa lub C RTC dwa, a także klasycznego substratu do oznaczania kinaz białka zasadowego mieliny lub MBP tylko dwa. Kinazy oznaczają dwa, a wysoce spokrewniona kinaza oznacza, że trzy są fosforylowane. CRTC dwupeptydowy MBP jest uwzględniany jako kontrola wewnętrzna we wszystkich testach, ponieważ zawiera wiele reszt powiązanych z fosforylem i biegnie z prędkością 18 kilodaltonów w kierunku dna żelu.

Pozwala to na interpretację specyfiki. Niektóre kinazy silnie fosforylują substrat i MVP. Warto tutaj zauważyć, że studnie zawierające sam GST zawsze oczyszczają pewną aktywność kinazy endogennej.

W związku z tym w teście zawsze występuje fosforylacja tła. Chociaż nie wyklucza to, że fosforylacja substratu jest prawdziwa, sugeruje, że w warunkach in vitro kinaza może być mniej selektywna. Szczególnie pouczające jest uwzględnienie wielu substratów o różnej masie cząsteczkowej w celu wyciągnięcia wniosków dotyczących specyficzności substratów kinazy.

Ponieważ badanie przesiewowe jest prowadzone in vitro, a dodatkowe poziomy złożoności występują in vivo, kinaza kandydująca musi zostać zwalidowana w komórkach. Na przykład kinaza kandydująca może mieć zdolność fosforylacji substratu in vitro, ale nie ulega ekspresji w tym samym typie komórki lub w tych samych podkomórkach przedziału co substrat. Zwykle odbywa się to za pomocą wyciszania kandydata za pośrednictwem RNAi.

Możliwe jest również wykonanie wtórnego badania przesiewowego przy użyciu nieodnośnego mutantu substratu bez fosforylu w celu potwierdzenia specyficzności.