Identyfikacja par kinaza-substrat za pomocą wysokoprzepustowych badań przesiewowych

Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja kinaz fosforylujących wybrany substrat przy użyciu metod wysokoprzepustowego przesiewania. Osiąga się to poprzez najpierw transfekcję komórek plazmidami wykazującymi kinazy połączone z transferazą S-glutationylującą lub GST. Drugim krokiem jest przeprowadzenie GST-kinazowego pulldownu.

Następnie próbki nanosi się na żele, które następnie poddaje się elektroforezie i barwi barwnikiem Coomassie Brilliant Blue. Ostatnim krokiem jest wysuszenie żeli i naświetlanie ich na kliszach autoradiograficznych. Ostatecznie, poprzez wywołanie i interpretację otrzymanych klisz, można zidentyfikować pary kinaza-substrat, ponieważ każda ścieżka odpowiada osobnemu badaniu aktywności kinazy.

Istniejące metody identyfikacji kinazy dla znanego fosforylowanego substratu obejmują wykorzystanie podejść bioinformatycznych do wyszukiwania miejsca konsensusu w substracie, wykrywanie kompleksów między kinazą a substratami za pomocą technik biochemicznych i metody prób i błędów oraz poszukiwanie substratów konsensusowych na podstawie ich znanej funkcji biologicznej. Podejścia te są czasochłonne i nie zawsze kończą się sukcesem. Nasza metoda umożliwia szybką identyfikację par kinaza-substrat na podstawie wyników funkcjonalnych.

Kiedy po raz pierwszy opracowaliśmy tę metodę, obawialiśmy się, że specyficzność in vitro może być niewystarczająca. Jak się okazało, specyficzność substratowa jest doskonała i często stwierdzamy, że w badaniu przesiewowym tylko kinazy z tej samej rodziny są w stanie fosforylować dany substrat. Jest to szczególnie widoczne podczas stosowania multipleksowania z użyciem wielu substratów w każdym badaniu, co dowodzi skuteczności procedury. Courtney, technik z mojego laboratorium, rozpocznie procedurę od przygotowania odczynników, płytek i komórek zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Jeśli płytki zawierające plazmidy kinazy były zamrożone, należy je rozmrozić w temperaturze pokojowej i odwirować przy 1900 ×g przez trzy minuty, aby zebrać wilgoć na dnie studzienek. Wymieszaj 8,6 ml pożywki z obniżoną zawartością surowicy z 312,7 µl odczynnika do transfekcji opartego na lipidach i pozostaw mieszaninę na pięć minut w każdej studzience. Do płytki 96-dołkowej zawierającej plazmidy kinazy dodaj 10 µl pożywki z obniżoną zawartością surowicy.

Używając automatycznego dozownika cieczy wyposażonego w kasetę do małych objętości, należy dodać 10 µL mieszaniny odczynnika do transfekcji w medium z obniżoną zawartością surowicy do każdej studni, a następnie pozostawić płytkę na 20 do 45 minut. Następnie należy resuspendować komórki 293T w stężeniu 0,75 mln komórek/ml w 80 ml kompletnego medium DMEM lub DMEM z dodatkami, dodając 100 µL zawiesiny komórkowej do każdej studni. Używając automatycznego dozownika cieczy wyposażonego w kasetę do standardowych objętości, należy sprawdzić pod mikroskopem równomierność rozkładu komórek w studniach przed powrotem płytki do inkubatora w temperaturze 37 °C na 24 godziny.

Aby rozpocząć eksperyment z wyciąganiem kinazy GST (GST kinase pull down), należy przygotować roztwór wanadanu o stężeniu 4 mM, mieszając 60 µL 0,2 M wanadanu sodu z 540 µL wody. W drugiej probówce wymieszać 2,7 µL 30% nadtlenku wodoru i 1,4 ml soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS). Połączyć oba roztwory i pozostawić mieszaninę na 15 minut przed użyciem.

Używając pipety wielokanałowej, nanieś dwie mikrolitry 0,25 M chlorku wapnia do każdego dołka, a następnie 2,5 mikrolitry roztworu z datą potwierdzenia. Inkubuj każdą płytkę w temperaturze 37 °C przez 10 minut, a następnie umieść na lodzie, utrzymując płytki w tej temperaturze. Usuń medium z każdego dołka za pomocą odessawania próżniowego, a następnie niezwłocznie dodaj 50 mikrolitrów lodowatego buforu lizującego na dołek.

Używając automatycznego dozownika cieczy z zamontowaną standardową kasetą, pozostaw płytkę na 30 minut na lodzie w celu lizy. Po wirowaniu płytek przy 1900 ×g przez trzy minuty w temperaturze 4 °C, zeskrob komórki z każdej studzienki za pomocą pipety wielokanałowej i przenieś całą zawartość do odpowiednio oznakowanych probówek. Płytki 96-dołkowe wiruj przy 1900 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C; podczas wirowania napełnij płytki powlekane glutationem buforem do lizy o temperaturze 0 °C w ilości 100 µL na studzienkę.

W czasie płukania należy przechowywać płytki na lodzie. Po odwirowaniu płytek dolnych, należy odwrócić płytki z glutationem nad umywalką, aby usunąć bufor lizujący, a następnie osuszyć je ręcznikiem papierowym. Następnie należy przenieść bufor lizujący z płytek z V-kształtnym dnem do płytek z glutationem, przechylając płytkę i używając pipety wielokanałowej, uważając, aby nie naruszyć osadu na dnie.

Następnie przykryć płytki i pozostawić na lodzie przez minimum dwie godziny. Pod koniec dwugodzinnego etapu wiązania przygotować stanowisko do pracy z izotopami promieniotwórczymi, upewniając się, że zachowano niezbędne środki ostrożności wymagane przy pracy z materiałami radioaktywnymi. Ustawić piec do hybrydyzacji na 30 °C.

Odwróć płytki z glutationem nad zlewem, aby wylać bufor do lizy, a następnie osusz je ręcznikiem papierowym. Przepłucz studzienki trzykrotnie, używając 100 µl buforu do lizy bez PMSF. Nie dopuszczaj do wyschnięcia studzienek.

Przechowuj je w płukance do momentu rozpoczęcia kolejnego etapu. Następnie przygotuj 55 ml buforu kinazowego 1X (1x kb) zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Dodaj 50 µl 1x kb do każdego dołka płytki, używając automatycznego dozownika cieczy z zamontowaną kasetą o standardowej objętości.

Następnie przygotuj roztwór A, sporządzając roztwór zawierający odpowiedni substrat oraz podstawowe białko mieliny (MBP) lub MVP, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, przygotowując każdy z nich osobno. Odwróć płytki nad zlewem, aby usunąć płukanie 1X KB, osuszając je ręcznikiem papierowym, a następnie natychmiast dodaj 30 µL roztworu A, używając automatycznego dozownika cieczy wyposażonego w kasetkę do małych objętości. Płytki należy przechowywać w lodzie.

Następnie, w obszarze pracy z materiałami radioaktywnymi, przygotuj roztwór B zgodnie z opisem w protokole tekstowym, w ilości 20 µL roztworu B na studzienkę. Używając pipety wielokanałowej (repeatera), która ułatwia mieszanie dzięki sile wyrzutu, pokryj i inkubuj płytkę w piecu do hybrydyzacji w temperaturze 30 °C przez 30 minut. Po 30 minutach przenieś płytki z powrotem na lód.

Następnie do każdej studzienki należy dodać 50 µL dwukrotnego buforu lizującego z dodecylosiarczanem sodu (SDS), korzystając z pipety wielokanałowej. Wszystkie czynności w tej sekcji powinny być wykonywane w obszarze wyznaczonym do pracy z materiałami radioaktywnymi. Włączyć piec do hybrydyzacji i ustawić temperaturę na 85 °C.

Po osiągnięciu przez piec odpowiedniej temperatury, przenieś płytki do pieca i inkubuj przez 10 minut w celu denaturacji próbek. Następnie nałóż 15 µl każdej reakcji na gotowe żele z 26 studniami.

Podczas używania pipety wielokanałowej do napełniania kilku studni jednocześnie należy upewnić się, że wszystkie końcówki są dopasowane do odpowiadających im studni. Przed dodaniem próbek należy prowadzić elektroforezę żelu przy napięciu 150 V. Nie należy dopuścić do wyjścia niebieskiej linii poza dolną krawędź żelu, ponieważ zawiera ona niewbudowany ATP. Następnie należy wyjąć żele i usunąć niewbudowany ATP, gdyż spowodowałby on przyciemnienie ekspozycji żelu na foliach.

Umieść żele w oznakowanych pojemnikach i przykryj barwnikiem Kumasi na 15 minut. Następnie usuń barwnik Kumasi. Krótko wypłucz żele wodą i dodaj roztwór odbarwiający.

Przechowuj żele, aż białka staną się wyraźnie widoczne. Dla każdej próbki powinna być widoczna prążka dla MVP oraz prążka dla substratu. Aby wysuszyć żele, wytnij duży arkusz papieru filtracyjnego i umieść go w suszarce.

Namocz arkusz celofanu w wodzie destylowanej, aż stanie się gładki i pozbawiony zmarszczek, a następnie połóż go na papierze. Ułóż żele na arkuszu celofanu, zapisując kolejność ich rozmieszczenia. Namocz drugi arkusz celofanu i połóż go na żelach.

Rozprowadź wszystkie pęcherzyki powietrza, aby uzyskać gładką, jednorodną powierzchnię. Zamknij pokrywę, włącz pompę próżniową i susz żele przez trzy godziny w temperaturze 80 °C. Po wysuszeniu żeli poddaj je ekspozycji na film do autoradiografii z podwójną emulsją, używając ekranu w celu wzmocnienia sygnału.

Owiń kasetę folią spożywczą lub plastikową torebką i zabezpiecz taśmą, aby zapobiec przedostawaniu się szronu przed przechowywaniem kasety w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia wyjmij kasetę z zamrażarki i pozwól jej odtajać w temperaturze pokojowej. Wywołaj film w ciemni, używając procesora filmowego zgodnie z przedstawionymi instrukcjami producenta.

Oto reprezentatywne wyniki przesiewu, w którym przebadano 180 kinaz, wykorzystując substrat w postaci peptydu z tagiem GST, odpowiadający aminokwasom od 268 do 283 regulatora transkrypcyjnego współaktywatora dwa (CRTC2), a także klasyczny substrat do analizy kinaz – podstawowe białko mieliny (MBP). Tylko dwie kinazy, MARK2 oraz silnie spokrewniona MARK3, przeprowadziły fosforylację peptydu CRTC2. MBP został włączony jako kontrola wewnętrzna we wszystkich analizach, ponieważ zawiera wiele reszt podatnych na fosforylację i wędruje na poziomie 18 kDa w dolnej części żelu.

Pozwala to na interpretację specyficzności. Niektóre kinazy będą silnie fosforylować substrat oraz MVP. Warto tutaj zauważyć, że w studzienkach zawierających sam GST zawsze oczyszcza się pewna aktywność endogennej kinazy.

W związku z tym w teście zawsze występuje fosforylacja tła. Choć nie wyklucza to faktu, że fosforylacja substratu jest rzeczywista, sugeruje to, że w warunkach in vitro kinaza może być mniej selektywna. Szczególnie pomocne jest zastosowanie wielu substratów o różnych masach cząsteczkowych, aby wyciągnąć wnioski dotyczące specyficzności substratowej kinazy.

Ponieważ badanie przesiewowe odbywa się in vitro, a w warunkach in vivo występują dodatkowe poziomy złożoności, kinaza kandydacka musi zostać zwalidowana w komórkach. Na przykład kinaza kandydacka może posiadać zdolność do fosforylacji substratu in vitro, ale może nie być ona ekspresowana w tym samym typie komórek lub w tych samych przedziałach wewnątrzkomórkowych co substrat. Zazwyczaj przeprowadza się to poprzez wyciszanie genu kandydata za pomocą RNAi.

Możliwe jest również przeprowadzenie wtórnego przesiewu z użyciem mutanta substratu, który nie ulega fosforylacji, aby potwierdzić specyficzność.