Name: Identyfikacja miejsc fosforylacji specyficznych dla kinazy 1 zależnej od cykliny za pomocą testu kinazy in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: Poznaj metodę identyfikacji miejsc fosforylacji specyficznych dla kinazy Cdk1 za pomocą testu kinazy in vitro. Ta technika pozwala badać regulację cyklu komórkowego i mechanizmy raka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. Davidowi Kingowi, Howard Hughes Medical Institute, University of California at Berkeley za analizę spektrometrii mas i pomocne komentarze. Dziękujemy dr Xuelian Zhu z Szanghaju, Instytutom Nauk Biologicznych, Chińskiej Akademii Nauk, Szanghaj, Chiny, za dostarczenie pełnowymiarowej konstrukcji CENP-F. Na koniec dziękujemy dr Susan Bane, dr Brianowi Callahanowi i dr Christofowi Grewerowi z Uniwersytetu Binghamton za dostęp do sprzętu. Badania te zostały sfinansowane przez Fundację Badawczą Uniwersytetu Stanowego Nowego Jorku i Wydział Chemii Uniwersytetu Stanowego Nowego Jorku w Binghamton.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Nasz test kinazy in vitro jest bardzo skuteczną metodą identyfikacji celów molekularnych dla kinazy Cdk1, która jest głównym kontrolerem cyklu komórkowego i reguluje wiele ważnych procesów komórkowych. Metoda określa, czy oczyszczone białko jest substratem dla Cdk1 i pozwala na identyfikację określonych miejsc fosforylacji. Ułatwia to badania mechanistyczne nad regulacją procesów komórkowych poprzez fosforylację przez Cdk1.
Najbardziej krytycznym czynnikiem dla pomyślnej identyfikacji...

Kinazy to enzymy, które przenoszą grupy fosforanowe z ATP na substraty i regulują wiele procesów komórkowych. Ta fosforylacja jest odwracalna, szybka, dodaje dwa ładunki ujemne i magazynuje darmową energię i jest jedną z najczęstszych modyfikacji potranslacyjnych stosowanych przez komórki. Cdk1, który jest również znany jako homolog białka 2 cyklu podziału komórki (CDC2) jest głównym kontrolerem cyklu komórkowego u wszystkich eukariontów1,2,3,4,5, i fosforyluje około 8-13% proteomu6,7.
Podczas gdy ostatnie badania proteomiczne zidentyfikowały wiele miejsc fosforylacji w białkach, w większości przypadków kinaza odpowiedzialna za te modyfikacje jest nieznana. Liczba znanych celów Cdk1, szczególnie w komórkach ludzkich, jest niska7. Identyfikacja miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1 jest ważna, ponieważ umożliwia badania mechanistyczne, które określają, w jaki sposób Cdk1 kontroluje cykl komórkowy. Regulacja cyklu komórkowego jest ważna dla wiernej segregacji chromosomów i podziału komórek, a niezliczone procesy komórkowe muszą zachodzić, aby wspierać tę ważną funkcję fizjologiczną. Obejmuje to zatrzymanie transkrypcji i translacji przed nadejściem mitozy, a także dramatyczną reorganizację struktury i organizacji komórkowej, taką jak demontaż otoczki jądrowej, kondensacja chromosomów i montaż wrzeciona mitotycznego. Deregulacja i błędy w tych procesach powodują raka, wady wrodzone lub mitotyczną śmierć komórki. Opracowano specyficzne inhibitory Cdk1, takie jak RO-3306 8, które dostarczają potężnych narzędzi do badań funkcjonalnych, a niektóre z tych inhibitorów są obecnie w badaniach klinicznych w leczeniu raka (zobacz9 w celu przeglądu).
Tutaj opisujemy test kinazy in vitro, który pozwala na identyfikację miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1. W tym teście dostępny na rynku ludzki Cdk1 / cyklina B jest używany do fosforylacji oczyszczonego białka docelowego in vitro. Fosforylacja substratu zwiększa jego masę i dodaje dwa ładunki ujemne; dlatego udana fosforylacja jest potwierdzana przez przesunięcie w górę pasma żelu białkowego na SDS-PAGE. Miejsca fosforylacji specyficzne dla Cdk1 są następnie identyfikowane za pomocą analizy spektrometrii mas fosforylowanego białka in vitro. Aby pomóc w projektowaniu eksperymentalnym, dokonujemy również przeglądu narzędzi obliczeniowych i odniesień do przewidywania miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1 z sekwencji białka. Ponadto opisujemy również protokoły oczyszczania, które dają wysoce czyste i jednorodne preparaty białkowe odpowiednie do testu kinazy. Wreszcie, zidentyfikowane miejsca fosforylacji muszą zostać zweryfikowane za pomocą badań funkcjonalnych, a w tym celu opisano tutaj prosty test wiązania. W połączeniu jest to bardzo potężne podejście, które pozwala uzyskać specyficzne dla Cdk1 miejsca fosforylacji i umożliwia mechanistyczne badania nad tym, jak Cdk1 kontroluje cykl komórkowy7,10,11. Ponieważ metoda ta opiera się na oczyszczonych białkach, może być stosowana do każdego organizmu modelowego i daje wiarygodne wyniki. Zaleca się jednak funkcjonalną weryfikację uzyskanych miejsc fosforylacji in vitro, ponieważ komórki mają dodatkowe mechanizmy regulacyjne, takie jak modyfikacje potranslacyjne, partnerzy interakcji lub lokalizacja komórkowa, która może sprawić, że miejsca fosforylacji będą dostępne lub niedostępne do rozpoznania przez Cdk1.
Cdk1 rozpoznaje miejsce fosforylacji konsensusu, które składa się z (Ser/Thr-Pro-X-Lys/Arg), gdzie X to dowolna reszta, a seryna lub treonina to miejsce fosforylacji. Szczególnie ważna dla rozpoznania jest obecność proliny w pozycji +1. Ponadto reszty zasadowe są preferowane w pozycjach +2 lub +3, przy czym większość miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1 zawiera Lys lub Arg na pozycji +36,12.
Aktywacja Cdk1 jest ściśle regulowana i prowadzi do wystąpienia mitozy1,2,3,4,5. Aktywność kinaz zależnych od cyklin ogólnie zależy od ich związku z różnymi cyklinami (cyklina A, B, C, D i E u ludzi), które ulegają ekspresji na oscylacyjnych poziomach w całym cyklu komórkowym13. Ekspresja Cdk1 jest stała w całym cyklu komórkowym, a regulacja jej aktywności opiera się na jego powiązaniu z podjednostkami regulatorowymi cykliną A i cykliną B5,13,14,15, a także modyfikacje potranslacyjne. Do aktywacji kinazy wymagane jest wytworzenie kompleksu Cdk1/cyklina B5,14,15,16,17,18. W fazie G2 cyklina B ulega translacji w cytozolu i jest importowana do jądra, gdzie wiąże się z Cdk15,14,15,16,17,18; jednak Cdk1 / cyklina B jest utrzymywana w stanie inaktywowanym przez fosforylację na resztach Thr14 i Tyr15 przez ludzkie kinazy hamujące Cdk1 Myt1 (kinaza hamująca cdc2 specyficzna dla tyrozyny i treoniny specyficzna dla błony) i Wee1, odpowiednio19,20,21. W późnej fazie G2 defosforylacja Thr14 i Tyr15 przez fosfatazę 25 cyklu podziału komórki (cdc25) aktywuje aktywność kinazy kompleksu Cdk1/cyklina B i wyzwala inicjację mitozy12,14,18,20,22,23. Fosforylacja Thr161 jest również wymagana do aktywacji Cdk1 / cykliny B i odbywa się za pośrednictwem Cdk7, kinazy aktywującej Cdk (CAK)18. Degradacja cykliny B w anafazie dezaktywuje Cdk1, umożliwiając wyjście z mitozy24,25. Aktywacja Cdk1/cykliny B jest zatem skomplikowanym procesem. Prezentowany tutaj protokół jest wykonywany z użyciem dostępnego na rynku Cdk1/cykliny B. Podczas rekombinowanej ekspresji tego kompleksu w komórkach owadów jest on aktywowany in vivo przez endogenne kinazy14,20 i pozostaje aktywny w stanie oczyszczonym. Otrzymany w ten sposób aktywny, rekombinowany ludzki Cdk1/cyklina B nadaje się do testów kinazy in vitro.
Tutaj opisujemy protokół identyfikacji miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1 w ludzkim białku centromerowym F (CENP-F)10. CENP-F jest białkiem kinetochorowym, które znajduje się w jądrze podczas większości interfazy (faza G1 i S) i jest eksportowane do cytozolu w fazie G226,27,28 w sposób zależny od Cdk110,11. Lokalizacja jądrowa jest nadawana przez dwudzielną klasę cNLS<sup="xref">26. cNLS są rozpoznawane przez czynnik transportu jądrowego karyoferyna α, który ułatwia, wraz z β karyoferyny i RanGDP, import ładunku cNLS do jądra29. Eksport jądrowy w fazie G2 jest ułatwiony przez nieznaną ścieżkę eksportu10. Gdy CENP-F znajdzie się w cytozolu, jest rekrutowany do otoczki jądrowej i z kolei rekrutuje kompleks białek motorycznych dynein30,31. Szlak ten jest ważny dla ułożenia jądra odpowiednio do centrosomu podczas początkowych etapów składania wrzeciona mitotycznego w sposób zależny od dyneiny, co jest ważne dla prawidłowego czasu wejścia mitotycznego i dla podstawowego procesu rozwoju mózgu30,31,32. Począwszy od fazy G2, CENP-F jest również montowany w kinetochorze, gdzie odgrywa ważną rolę w wiernej segregacji chromosomów27,28,33,34,35. Kluczowym krokiem regulacyjnym tych ścieżek jest eksport jądrowy CENP-F w fazie G2, który jest zależny od Cdk110,11. Opisujemy tutaj protokół identyfikacji miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1 w cNLS CENP-F. Mutacje fosfomimetyczne tych miejsc spowalniają import jądrowy CENP-F, co sugeruje, że Cdk1 / cyklina B bezpośrednio reguluje komórkową lokalizację CENP-F poprzez fosforylację jego klasy cNLS<sup="xref">10.
Ogólnie rzecz biorąc, ten test kinazy in vitro pozwala na identyfikację specyficznych substratów dla kinazy Cdk1. Oczyszczone białka docelowe są fosforylowane in vitro przez komercyjnie dostępny kompleks Cdk1/cyklina B, a miejsca fosforylacji są następnie identyfikowane za pomocą spektrometrii mas. Identyfikacja miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1 wspiera badania mechanistyczne, które ujawniają, w jaki sposób Cdk1 kontroluje cykl komórkowy.

<table><tbody><tr><td>2800 ml przegrodowa kolba Fernbacha</td><td>Corning</td><td>44232XL</td><td></td></tr><tr><td>ampicylina</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-301-25</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Fisher Scientfiic</td><td>BP413-25</td><td></td></tr><tr><td>chlorowodorek benzamidyny</td> Filtr butelkowy <td>Millipore Sigma</td><td>B6506-25</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Corning</td><td>431161</td><td></td></tr><tr><td>rekombinant Cdk1/cyklina B, ludzki 20 000 U/ml</td><td>New England Biolabs</td><td>P6020</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1 / cyklina B (alternatywne źródło)</td> <td>EMD Milipore</td><td>14-450</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1 / cyklina B (alternatywne źródło)</td> <td>Invitrogen</td><td>PV3292</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1 / cyklina B + 10x bufor PK</td><td>New England Biolabs</td><td>P6020</td><td></td></tr><tr><td>CENP-F (reszty 2987 i ndash; 3065) plazmid pGEX6P1</td><td>Dostępne na życzenie.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>wirówka: Heraeus Multifuge X3R, chłodzona, z rotorem wychylnym TX-1000</td><td>Thermo Scientific</td><td>10033-778</td><td></td></tr><tr><td>odśrodkowe jednostki filtracyjne: Odśrodkowe jednostki filtracyjne Amicon Ultra-15, odcięcie 3 kDa, membrany Ultracel-PL</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>chlorampenicol</td><td>Gold Biotechnology</td><td>C-105-100</td><td></td></tr><tr><td>D/L metionina</td><td>Agros Organics / Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do odsalania 125650010: Końcówki do zamków błyskawicznych</td><td>Millipore Sigma</td><td>ZTC18S008</td><td></td></tr><tr><td>jednorazowe kolumny chromatograficzne, Econo-Pac 1,5 x 12 cm</td><td>Biorad</td><td>7321010</td><td></td></tr><tr><td>ditiotreitol</td><td>Gold Biotechnology</td><td>DTT50</td><td></td></tr><tr><td>E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS szczep</td><td>EMD Millipore</td><td>71403</td><td></td></tr><tr><td>jonizacja elektrorozpylania Jon transformacyjny Fouriera</td><td></td><td></td> Spektrometr masowy rezonansu cyklotronowego Amazon Apex III <td></td></tr> spektrometr masowy z <tr><td>jonizacją elektrorozpylania pułapka jonowa spektrometr</td><td>masowy Bruker Amazon</td><td>niestandardowy</td><td></td></tr><tr><td>wirnik o stałym kącie: Fiberlite F15-8x-50cy</td><td>Thermo Scientific</td><td>97040-276</td><td></td></tr> System <tr><td></td> FPLC: &Auml;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> kta Pure FPLC</td><td>GE Healthcare</td><td>29032697</td><td></td></tr><tr><td>Żelowa kolumna filtracyjna: Superdex 200 Increase 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td></td></tr><tr><td>glutation agaroza</td><td>Pierce</td><td>16101</td><td></td></tr><tr><td>glutation, zredukowany</td><td>Millipore Sigma</td><td>G4251-50g</td><td></td></tr><tr><td>wytrząsarka inkubacyjna: Multitron shaker</td><td>Infors</td><td>I10102</td><td></td></tr><tr><td>izopropyl &beta;-D-1-tiogalaktopiranozyd</td><td>Złoto Biotechnologia</td><td>I2481C50</td><td></td></tr><tr><td>kanamycyna</td><td>Złoto Biotechnologia</td><td>K-120-25</td><td></td></tr><tr><td>karyoferyna i plazmid pres alfa; pet-28a</td><td>Dostępne na życzenie.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani medium</td><td>Fisher Scientfiic</td><td>BP1426-2</td><td></td></tr><tr><td>mikrowirówka 5418R, chłodzona</td><td>Eppendorf</td><td>5401000013</td><td></td></tr><tr><td>mikroprobówki (0,5 ml)</td><td>Eppendorf</td><td>30121023</td><td></td></tr><tr><td>mikroprobówki (1,5 ml)</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>Żel powinowactwa do niklu: His-Select Żel powinowactwa do niklu</td><td>Millipore Sigma</td><td>P6611-100ml</td><td></td></tr><tr><td>pGEX-6P-1 plazmid</td><td>Millipore Sigma</td><td>GE28-9546-48</td><td></td></tr><tr><td>fluorek fenylometylosulfonylu</td><td>Złoto Biotechnologia</td><td>P470-10</td><td></td></tr><tr><td>PS proteaza: Proteaza PreScission</td><td>GE Healthcare</td><td>27084301</td><td></td></tr><tr><td>Akrylamid ze znacznikiem fosowym</td><td>Wako Pure Chem. Ind.</td><td>304-93521</td><td></td></tr><tr><td>zredukowany gluthathion</td><td>Millipore Sigma</td><td>G4251-50g</td><td></td></tr><tr><td>probówki wirówkowe okrągłodenne (probówki Oakridge)</td><td>Fisher Scientfiic</td><td>055291D</td><td></td></tr><tr><td>zestaw do mutagenezy ukierunkowanej: QuikChange Lightning</td><td>Agilent</td><td>210518</td><td></td></tr><tr><td>Site-Directed Mutagenesis Kit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sonifier: sonifier Branson S-250D</td><td>Branson</td><td>15 338 125</td><td></td></tr><tr><td>Membrana do dializy Spectra/Por 1RC (odcięcie 6-8 kDa)</td><td>Spectrum Labs</td><td>08 670B</td><td></td></tr><tr><td>Rotor wychylny TX-1000</td><td>Thermo Scientific</td><td>10033-778</td><td></td></tr></tbody></table>

identyfikacja miejsc fosforylacji specyficznych dla kinazy 1 zależnej od cykliny za pomocą testu kinazy in vitro

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Kinaza zależna od cykliny 1 (Cdk1) jest głównym kontrolerem cyklu komórkowego u wszystkich eukariontów i fosforyluje około 8 - 13% proteomu; jednak liczba zidentyfikowanych celów dla Cdk1, szczególnie w komórkach ludzkich, jest nadal niska. Identyfikacja miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1 jest ważna, ponieważ dostarczają one mechanistycznego wglądu w to, jak Cdk1 kontroluje cykl komórkowy. Regulacja cyklu komórkowego ma kluczowe znaczenie dla wiernej segregacji chromosomów, a defekty w tym skomplikowanym procesie prowadzą do aberracji chromosomowych i raka.
Tutaj opisujemy test kinazy in vitro, który służy do identyfikacji miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1. W tym teście oczyszczone białko jest fosforylowane in vitro przez komercyjnie dostępny ludzki Cdk1 / cyklinę B. Pomyślna fosforylacja jest potwierdzana przez SDS-PAGE, a miejsca fosforylacji są następnie identyfikowane za pomocą spektrometrii mas. Opisujemy również protokoły oczyszczania, które dają wysoce czyste i jednorodne preparaty białkowe odpowiednie do testu kinazy oraz test wiązania do funkcjonalnej weryfikacji zidentyfikowanych miejsc fosforylacji, który bada interakcję między klasycznym sygnałem lokalizacji jądrowej (cNLS) a jego receptorem transportu jądrowego karioferyną α. Aby pomóc w projektowaniu eksperymentalnym, dokonujemy przeglądu podejść do przewidywania miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1 na podstawie sekwencji białek. Razem protokoły te stanowią bardzo skuteczne podejście, które pozwala uzyskać specyficzne dla Cdk1 miejsca fosforylacji i umożliwia mechanistyczne badania nad tym, jak Cdk1 kontroluje cykl komórkowy. Ponieważ metoda ta opiera się na oczyszczonych białkach, może być stosowana do każdego organizmu modelowego i daje wiarygodne wyniki, zwłaszcza w połączeniu z badaniami funkcjonalnymi komórki.

Niedawno wykorzystaliśmy test kinazy in vitro (Rycina 1), aby zidentyfikować specyficzne dla Cdk1 miejsca fosforylacji w fragmencie CENP-F zawierającym cNLS10. Sygnał ten warunkuje lokalizację jądrową CENP-F podczas większości interfazy. W fazie G2 CENP-F jest eksportowany z jądra do cytosolu w sposób zależny od Cdk1. Aby uzyskać wgląd w mechanizmy regulacji lokalizacji komórkowej CENP-F przez Cdk1, przeanalizowaliśmy sekwencj...

Kinaza zależna od cykliny 1 (Cdk1) jest aktywowana w fazie G2 cyklu komórkowego i reguluje wiele szlaków komórkowych. W tym miejscu przedstawiamy protokół testu kinazy in vitro z Cdk1, który umożliwia identyfikację miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1 w celu ustalenia celów komórkowych tej ważnej kinazy.

Identyfikacja miejsc fosforylacji specyficznych dla kinazy 1 zależnej od cykliny za pomocą testu kinazy in vitro

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Ogólnym celem tego testu kinazy in vitro jest identyfikacja miejsc fosforylacji w białku będącym przedmiotem zainteresowania, które są specyficzne dla kinazy zależnej od cykliny kinazy 1. Identyfikacja specyficznych dla CDK1 miejsc fosforylacji jest ważna, ponieważ dostarczają one mechanistycznego wglądu w to, jak CDK1 kontroluje cykl komórkowy. Regulacja cyklu komórkowego ma kluczowe znaczenie dla pełnej fazy segregacji chromosomów, a defekty prowadzą do aberracji chromosomowych i raka.Główną zaletą tej techniki jest to, że opiera się na oczyszczonych białkach, dzięki czemu może być stosowana do każdego organizmu modelowego i daje wiarygodne wyniki, zwłaszcza w połączeniu z badaniami funkcjonalnymi na komórkach. Metoda ta jest ważna, ponieważ znana liczba celów CDK1 jest nadal niska, pomimo faktu, że CDK1 fosforyluje około ośmiu do 13% proteum. Chociaż metoda ta identyfikuje miejsca fosforylacji specyficzne dla CDK1, można ją zmodyfikować w celu identyfikacji miejsc fosforylacji dla innych kinaz, pod warunkiem, że oczyszczona kinaza jest dostępna.Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ warunki testu kinazy muszą być zoptymalizowane dla każdego docelowego białka, aby uzyskać wysoką wydajność fosforylacji. Najlepiej w 100%Użyj oprogramowania IGPS 3.0 i odwiedź serwer internetowy, aby przewidzieć miejsca fosforylacji specyficzne dla CDK1 w docelowej sekwencji białka CENP-F. Sprawdź miejsca fosforylacji w stosunku do sekwencji konsensusu CDK1.Rozpocznij ekspresję białka od przygotowania kultury wstępnej. Postępując zgodnie z instrukcjami producenta, przekształć jeden mikrolitr plazmidu ekspresyjnego w 50 mikrolitrów komórek kompetentnych dla E. coli. Po dodaniu plazmidu inkubuj komórki na lodzie przez 30 minut.Następnie inkubuj komórki przez 45 sekund w temperaturze 42 stopni Celsjusza. Po inkubacji umieść komórki na lodzie na jedną minutę, następnie dodaj 400 mikrolitrów LB do komórek, a następnie inkubuj kulturę przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając. Następnie rozłóż 200 mikrolitrów kultury na płytkach agarowych LB, uzupełnionych interesującymi antybiotykami, w zależności od konstrukcji.Następnie inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 12 do 20 godzin bez wstrząsania. Następnie wybierz kolonię z płytki agarowej LB i zaszczep kolonię w 50 mililitrach pożywki LB uzupełnionej pożądaną kombinacją antybiotyków. Inkubuj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością od 160 do 180 obrotów na minutę przez 12 do 20 godzin.Na każdy litr pożywki LB dodać antybiotyki i 10 mililitrów 40% wagowych sterylnego przefiltrowanego roztworu glukozy. Do tego podłoża dodaj 20 mililitrów gęsto rosnącej kultury wstępnej. Następnie inkubuj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością od 160 do 180 obrotów na minutę.Sprawdzaj absorbancję kultury przy 600 nanometrach w regularnych odstępach czasu. Gdy absorbancja osiągnie 0,5 do 0,6, indukuj ekspresję białka, dodając 0,2 milimolowego IPTG. Następnie inkubuj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny, wstrząsając.Po trzech godzinach zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 4,100 razy G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, używając odchylanego rotora. Po odwirowaniu usunąć supernatant. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 20 mililitrach buforu wiążącego GST dla CENP-F i jego sześciu wiążących dla karioferyny alfa na każdy litr hodowli.Następnie przechowuj komórki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby oczyścić CENP-F, najpierw rozmrozić komórki za pomocą konstruktu CENP-F. Następnie dostosuj objętość do 20 mililitrów za pomocą bufora wiążącego GST.Po dostosowaniu objętości dodaj wszystkie reduktory i inhibitory proteazy jeden po drugim, aby przygotować zawiesinę komórek do późniejszej lizy. Następnie przenieść zawiesinę komórek do szklanej zlewki i zanurzyć zlewkę w lodowatej kąpieli wodnej. Następnie poddaj kulturę dźwiękom.Po sonikacji dodać 250 mikromolowych PMSF do lizatu, a następnie sprawdzić lizat, który na tym etapie powinien być przezroczysty. Następnie odwirować lizat w temperaturze od 12 000 do 40 000 razy G przez 25 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przygotuj kolumnę, dodając dwa mililitry agarozy glutationowej jeden do jednego zawiesiny do jednorazowej kolumny chromatograficznej.Aby zrównoważyć kolumnę, umyj ją najpierw 25 mililitrami ultra czystej wody, a następnie 25 mililitrami buforu wiążącego GST. Po zakończeniu wirowania zdekantować supernatant, a następnie przefiltrować supernatant przez wielkość nalewania 0,2 mikrometra. Następnie wlej lizat na zatkaną kolumnę na etap wiązania.Przykryj kolumnę i inkubuj ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut, delikatnie nutując i unikając pienienia. Po 30 minutach przenieś kolumnę na stojak i pozwól żywicy osiąść. Następnie zebrać przepływ i dwukrotnie przemyć kolumnę 25 mililitrami buforu wiążącego GST.Po zakończeniu mycia ponownie zatkaj kolumnę. Następnie dodaj do kolumny 400 mikrolitrów buforu wiążącego GST i 250 mikrolitrów bulionu proteazy PS o aktywności 1000 jednostek na miligram. Ponownie zakryj kolumnę i delikatnie zakręć kolumną, aby ponownie zawiesić żywicę w buforze, a następnie inkubuj kolumnę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 16 do 20 godzin.Po zakończeniu okresu inkubacji dodać cztery mililitry buforu wiążącego GST, aby wymyć fragment CENP-F z kolumny, która została proteolitycznie rozszczepiona. Obok opcji elucji ponownie podłącz kolumnę tagu GST. Następnie dodaj do kolumny cztery mililitry buforu elucyjnego GST zawierającego glutation.Następnie inkubuj kolumnę przez 10 minut, aby wymyć związany znacznik GST. Po 10 minutach zebrać eluat. Następnie należy wykonać elektroforezę w żelu poliakrylamidowym SDS w celu analizy frakcji elucji proteazy PS i glutationu.Następnie, aby zagęścić próbkę białka, pipetować eluat proteazy PS do górnej komory odśrodkowej jednostki filtrującej z granicą masy cząsteczkowej wynoszącą trzy kilodaltony. Następnie odwirować eluat w temperaturze 4,100 razy G w odstępach co 10 do 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w odchylanym wirniku, aby zagęścić próbkę. Po każdym zwiększeniu wymieszać próbkę białka w filtrze stężającym, delikatnie pipetując w górę i w dół, aby uniknąć powstania gradientu stężeń.Aby oczyścić CENP-F przez filtrację żelową, należy podłączyć żelową kolumnę filtracyjną do systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek. Następnie zrównoważyć kolumnę z jedną objętością żelowego buforu filtracyjnego. Następnie odwirować fragment CENP-F w probówce mikrowirówkowej pod ciśnieniem 21 700 razy G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po zakończeniu wirowania wstrzyknąć próbkę do kolumny, a następnie wymyć kolumnę żelowym buforem filtracyjnym i zebrać 0,6 mililitra frakcji fragmentu CENP-F. Następnie przeanalizuj profil filtracji żelu i uruchom SDS-PAGE frakcji szczytowych. Frakcje puli, które zawierają czysty CENP-F.Następnie stężyć oczyszczony fragment CENP-F do 3,3 miligrama na mililitr. Aby określić stężenie białka, należy rozcieńczyć fragment CENP-F w stosunku jeden do 100 ultra czystą wodą. Następnie zapisz widmo od 220 do 300 nanometrów długości fali w spektrofotometrze.Następnie przygotuj porcje 50 mikrolitrów oczyszczonego CENP-F w mikroprobówkach o pojemności 0,5 mililitra, a następnie błyskawicznie zamroź probówki w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Do testu kinazy wymieszaj fragment CENP-F z cykliną B ATP i CDK1 wraz z innymi w mikroprobówce o pojemności 0,5 mililitra. Następnie należy przygotować drugą próbkę bez cykliny B CDK1 jako kontroli ujemnej.Następnie inkubować próbki w łaźni wodnej w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez jedną do 16 godzin. Aby pomyślnie zidentyfikować miejsca fosforylacji za pomocą spektrometrii mas, bardzo ważne jest, aby wydajność fosforylacji była jak najwyższa, najlepiej 100%Aby zwiększyć wydajność fosforylacji, dodaj więcej kinazy i wydłuż czas inkubacji do 16 godzin. Następnie dodać równe objętości sześciomolowego roztworu chlorowodorku guanidyny do pozostałej reakcji oznaczania kinazy i kontroli ujemnej i przeprowadzić spektrometrię mas w celu zidentyfikowania miejsca fosforylacji.Aby uzyskać wysokiej jakości dane ze spektrometrii mas, ważne jest również, aby oczyszczona próbka białka była wysoce czysta i jednorodna. Najpierw przeprowadzana jest analiza SDS-PAGE, która pokazuje wyraźne przesunięcie w górę pasma na żelu dla fosforylowanego CENP-F w porównaniu z kontrolą ujemną bez CDK1, co wskazuje, że cNLS CENP-F jest substratem CDK1. Następnie przeprowadzana jest spektrometria mas w celu analizy liczby i wydajności miejsc fosforylacji CENP-F.Widmo masowe pułapki jonowej ESI nienaruszonego CENP-F fosforylowanego in vitro pokazuje, że istnieje pięć pików, co wskazuje na cztery miejsca fosforylacji, a piąty pik to białko nieufosforylowane. Następnie ten profil elucji wykluczający wielkość pokazuje, że objętość elucji piku alfa karioferyny przesuwa się do większej masy po dodaniu dzikiego typu CENP-F, czego nie obserwuje się po dodaniu mutanta CENP-F. Wskazuje to, że fosfomimetyczna wersja S3048D CENP-F osłabia oddziaływanie cNLS CENP-F z karioferyną alfa.Wreszcie, przeprowadzona analiza SDS-PAGE pokazuje, że fragment CENP-F typu dzikiego z nienaruszonymi cNLS koeluuje z karioferyną alfa, co wskazuje na silne oddziaływanie. Jednak mutant S3048D CENP-F i karioferyny alfa eluuje w oddzielnych pikach. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o sprawdzeniu uzyskanych miejsc fosforylacji w stosunku do sekwencji fosforylacji konsensusu CDK1 i zweryfikowaniu, czy zidentyfikowany substrat lokalizuje się w tym samym przedziale komórkowym co CDK1.Zgodnie z tą procedurą należy przeprowadzić weryfikację funkcjonalną w komórkach lub modelach zwierzęcych w celu potwierdzenia, że zidentyfikowane miejsca fosforylacji pełnią funkcję fizjologiczną. Dostępnych jest szereg narzędzi do weryfikacji funkcjonalnej, takich jak specyficzne inhibitory CDK1 i mutacje fosfomimetyczne. Ze względu na dużą liczbę substratów CDK1 w proteum, wiele ludzkich substratów CDK1 pozostaje do odkrycia, a test kinazy in vitro będzie ważnym narzędziem do identyfikacji, mapowania i weryfikacji tych miejsc.Identyfikacja tych miejsc fosforylacji umożliwia mechanistyczne badania tego, w jaki sposób CDK1 kontroluje cykl komórkowy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zidentyfikować specyficzne miejsca fosforylacji CDK1 i białka docelowe za pomocą testu kinazy in vitro.

identification-cyclin-dependent-kinase-1-specific-phosphorylation

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Reportery oparte na FRET są coraz częściej wykorzystywane do monitorowania aktywności kinaz i fosfataz w żywych komórkach. W niniejszej pracy opisujemy metodę wykorzystania reporterów opartych na FRET do oceny zmian w fosforylacji celu zależnych od cyklu komórkowego.

Monitorowanie aktywności kinaz i fosfataz w cyklu komórkowym za pomocą ratiometrycznego FRET

Kinaza 2 z powtórzeniami bogatymi w leucynę (LRRK2) jest dużą, wielodomenową kinazą, której mutacje stanowią najczęstszą genetyczną przyczynę choroby Parkinsona. Analiza aktywności kinazowej tego białka okazała się kluczowym narzędziem w zrozumieniu biologii i dysfunkcji tego białka. W niniejszej pracy opisano badanie aktywności kinazowej LRRK2 oraz wybranych jej mutantów in vitro, zapewniając system eksperymentalny do badania fosforylacji domniemanych substratów oraz potencjalnej dysfunkcji...

Oznaczanie aktywności kinazy LRRK2 in vitro

Fosforylacja białek jest główną cechą tego, jak komórki interpretują i reagują na informacje w swoim środowisku zewnątrzkomórkowym. W tym miejscu przedstawiamy wysokoprzepustowy protokół badań przesiewowych wykorzystujący kinazy oczyszczone z komórek ssaków w celu szybkiej identyfikacji kinaz, które fosforylują substrat (substraty) będący przedmiotem zainteresowania.

Identyfikacja par kinaza-substrat za pomocą wysokoprzepustowych badań przesiewowych

Tutaj opisujemy, jak badać mitochondrialną lokalizację kinazy (cyklu komórkowego) i jak określić jej submitochondrialne położenie, a także potencjalne substraty/cele mitochondrialne. Wymuszona ekspresja białek w mitochondriach stanowi użyteczne narzędzie do badania funkcjonalnych konsekwencji mitochondrialnej lokalizacji białka będącego przedmiotem zainteresowania.

Eksperymentalne podejścia do badania lokalizacji mitochondrialnej i funkcji kinazy jądrowego cyklu komórkowego, Cdk1

Kinazy białkowe to wysoce rozwinięte enzymy sygnalizacyjne i rusztowania, które są kluczowe dla między- i wewnątrzkomórkowej transdukcji sygnału. Przedstawiamy protokół pomiaru aktywności kinazy za pomocą znakowanego radioaktywnie trifosforanu adenozyny ([γ-32P] ATP), niezawodnej metody pomagającej w wyjaśnieniu regulacji sygnalizacji komórkowej.

Oznaczanie aktywności kinazy białkowej za pomocą znakowanego radioaktywnie ATP

Testy konkurencji peptydowej są szeroko stosowane w różnych eksperymentach molekularnych i immunologicznych. W artykule opisano szczegółową metodę testu kinazy konkurującej z oligopeptydami in vitro i związane z nią procedury walidacyjne, które mogą być przydatne do znalezienia określonych miejsc fosforylacji.

Test konkurencji oligopeptydowej do oznaczania miejsca fosforylacji

Ogniskowanie izoelektryczne kapilarne to oparta na przeciwciałach, ultraczuła, wysokoprzepustowa technika, umożliwiająca szczegółową charakterystykę białek i ich izoform z bardzo małych próbek biologicznych. Poniżej opisano protokół wykrywania i oznaczania ilościowego określonych białek i ich izoform w sposób zautomatyzowany i zrobotyzowany.

Wysoce czułe i ilościowe wykrywanie białek i ich izoform metodą kapilarnego ogniskowania izoelektrycznego

Celem tego protokołu jest etykietowanie, wzbogacanie i identyfikowanie substratów kinazy białkowej CK2 ze złożonej próbki biologicznej, takiej jak lizat komórkowy lub homogenat tkankowy. W tym celu metoda ta wykorzystuje unikalne aspekty biologii CK2.

Identyfikacja nowych substratów kinazy CK2 przy użyciu wszechstronnego podejścia biochemicznego

Scharakteryzowaliśmy nowe białko kinazy za pomocą solidnych podejść biochemicznych: analiza Western Blot z dedykowanym specyficznym przeciwciałem na różnych liniach komórkowych i tkankach, interakcje za pomocą eksperymentów z koimmunoprecypitacją, aktywność kinazy wykryta przez Western Blot przy użyciu przeciwciała specyficznego dla fosfy oraz znakowanie γ[32P] ATP.

Charakterystyka na poziomie molekularnym przy użyciu solidnych podejść biochemicznych nowego białka kinazy

Obecny protokół podkreśla zastosowanie techniki western blotting do badania funkcji i aktywności kotransportera neuronalnego K-Cl KCC2. Protokół opisuje badanie fosforylacji KCC2 w miejscach regulatora kinazy Thr906/1007 poprzez western blot. W tym tekście pokrótce omówiono również dodatkowe metody potwierdzania aktywności KCC2.

Badanie funkcji i aktywności neuronalnego kotransportera K-Cl KCC2 z wykorzystaniem Western Blotting

Poznaj metodę identyfikacji miejsc fosforylacji specyficznych dla kinazy Cdk1 za pomocą testu kinazy in vitro. Ta technika pozwala badać regulację cyklu komórkowego i mechanizmy raka.

Identyfikacja miejsc fosforylacji specyficznych dla kinazy 1 zależnej od cykliny za pomocą testu kinazy in vitro

Przeglądaj więcej filmów