Identyfikacja miejsc fosforylacji specyficznych dla kinazy 1 zależnej od cykliny za pomocą testu kinazy in vitro

Ogólnym celem tego testu kinazy in vitro jest identyfikacja miejsc fosforylacji w białku będącym przedmiotem zainteresowania, które są specyficzne dla kinazy zależnej od cykliny kinazy 1. Identyfikacja specyficznych dla CDK1 miejsc fosforylacji jest ważna, ponieważ dostarczają one mechanistycznego wglądu w to, jak CDK1 kontroluje cykl komórkowy. Regulacja cyklu komórkowego ma kluczowe znaczenie dla pełnej fazy segregacji chromosomów, a defekty prowadzą do aberracji chromosomowych i raka.

Główną zaletą tej techniki jest to, że opiera się na oczyszczonych białkach, dzięki czemu może być stosowana do każdego organizmu modelowego i daje wiarygodne wyniki, zwłaszcza w połączeniu z badaniami funkcjonalnymi na komórkach. Metoda ta jest ważna, ponieważ znana liczba celów CDK1 jest nadal niska, pomimo faktu, że CDK1 fosforyluje około ośmiu do 13% proteum. Chociaż metoda ta identyfikuje miejsca fosforylacji specyficzne dla CDK1, można ją zmodyfikować w celu identyfikacji miejsc fosforylacji dla innych kinaz, pod warunkiem, że oczyszczona kinaza jest dostępna.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ warunki testu kinazy muszą być zoptymalizowane dla każdego docelowego białka, aby uzyskać wysoką wydajność fosforylacji. Najlepiej w 100%Użyj oprogramowania IGPS 3.0 i odwiedź serwer internetowy, aby przewidzieć miejsca fosforylacji specyficzne dla CDK1 w docelowej sekwencji białka CENP-F. Sprawdź miejsca fosforylacji w stosunku do sekwencji konsensusu CDK1.

Rozpocznij ekspresję białka od przygotowania kultury wstępnej. Postępując zgodnie z instrukcjami producenta, przekształć jeden mikrolitr plazmidu ekspresyjnego w 50 mikrolitrów komórek kompetentnych dla E. coli. Po dodaniu plazmidu inkubuj komórki na lodzie przez 30 minut.

Następnie inkubuj komórki przez 45 sekund w temperaturze 42 stopni Celsjusza. Po inkubacji umieść komórki na lodzie na jedną minutę, następnie dodaj 400 mikrolitrów LB do komórek, a następnie inkubuj kulturę przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając. Następnie rozłóż 200 mikrolitrów kultury na płytkach agarowych LB, uzupełnionych interesującymi antybiotykami, w zależności od konstrukcji.

Następnie inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 12 do 20 godzin bez wstrząsania. Następnie wybierz kolonię z płytki agarowej LB i zaszczep kolonię w 50 mililitrach pożywki LB uzupełnionej pożądaną kombinacją antybiotyków. Inkubuj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością od 160 do 180 obrotów na minutę przez 12 do 20 godzin.

Na każdy litr pożywki LB dodać antybiotyki i 10 mililitrów 40% wagowych sterylnego przefiltrowanego roztworu glukozy. Do tego podłoża dodaj 20 mililitrów gęsto rosnącej kultury wstępnej. Następnie inkubuj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością od 160 do 180 obrotów na minutę.

Sprawdzaj absorbancję kultury przy 600 nanometrach w regularnych odstępach czasu. Gdy absorbancja osiągnie 0,5 do 0,6, indukuj ekspresję białka, dodając 0,2 milimolowego IPTG. Następnie inkubuj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny, wstrząsając.

Po trzech godzinach zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 4,100 razy G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, używając odchylanego rotora. Po odwirowaniu usunąć supernatant. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 20 mililitrach buforu wiążącego GST dla CENP-F i jego sześciu wiążących dla karioferyny alfa na każdy litr hodowli.

Następnie przechowuj komórki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby oczyścić CENP-F, najpierw rozmrozić komórki za pomocą konstruktu CENP-F. Następnie dostosuj objętość do 20 mililitrów za pomocą bufora wiążącego GST.

Po dostosowaniu objętości dodaj wszystkie reduktory i inhibitory proteazy jeden po drugim, aby przygotować zawiesinę komórek do późniejszej lizy. Następnie przenieść zawiesinę komórek do szklanej zlewki i zanurzyć zlewkę w lodowatej kąpieli wodnej. Następnie poddaj kulturę dźwiękom.

Po sonikacji dodać 250 mikromolowych PMSF do lizatu, a następnie sprawdzić lizat, który na tym etapie powinien być przezroczysty. Następnie odwirować lizat w temperaturze od 12 000 do 40 000 razy G przez 25 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przygotuj kolumnę, dodając dwa mililitry agarozy glutationowej jeden do jednego zawiesiny do jednorazowej kolumny chromatograficznej.

Aby zrównoważyć kolumnę, umyj ją najpierw 25 mililitrami ultra czystej wody, a następnie 25 mililitrami buforu wiążącego GST. Po zakończeniu wirowania zdekantować supernatant, a następnie przefiltrować supernatant przez wielkość nalewania 0,2 mikrometra. Następnie wlej lizat na zatkaną kolumnę na etap wiązania.

Przykryj kolumnę i inkubuj ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut, delikatnie nutując i unikając pienienia. Po 30 minutach przenieś kolumnę na stojak i pozwól żywicy osiąść. Następnie zebrać przepływ i dwukrotnie przemyć kolumnę 25 mililitrami buforu wiążącego GST.

Po zakończeniu mycia ponownie zatkaj kolumnę. Następnie dodaj do kolumny 400 mikrolitrów buforu wiążącego GST i 250 mikrolitrów bulionu proteazy PS o aktywności 1000 jednostek na miligram. Ponownie zakryj kolumnę i delikatnie zakręć kolumną, aby ponownie zawiesić żywicę w buforze, a następnie inkubuj kolumnę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 16 do 20 godzin.

Po zakończeniu okresu inkubacji dodać cztery mililitry buforu wiążącego GST, aby wymyć fragment CENP-F z kolumny, która została proteolitycznie rozszczepiona. Obok opcji elucji ponownie podłącz kolumnę tagu GST. Następnie dodaj do kolumny cztery mililitry buforu elucyjnego GST zawierającego glutation.

Następnie inkubuj kolumnę przez 10 minut, aby wymyć związany znacznik GST. Po 10 minutach zebrać eluat. Następnie należy wykonać elektroforezę w żelu poliakrylamidowym SDS w celu analizy frakcji elucji proteazy PS i glutationu.

Następnie, aby zagęścić próbkę białka, pipetować eluat proteazy PS do górnej komory odśrodkowej jednostki filtrującej z granicą masy cząsteczkowej wynoszącą trzy kilodaltony. Następnie odwirować eluat w temperaturze 4,100 razy G w odstępach co 10 do 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w odchylanym wirniku, aby zagęścić próbkę. Po każdym zwiększeniu wymieszać próbkę białka w filtrze stężającym, delikatnie pipetując w górę i w dół, aby uniknąć powstania gradientu stężeń.

Aby oczyścić CENP-F przez filtrację żelową, należy podłączyć żelową kolumnę filtracyjną do systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek. Następnie zrównoważyć kolumnę z jedną objętością żelowego buforu filtracyjnego. Następnie odwirować fragment CENP-F w probówce mikrowirówkowej pod ciśnieniem 21 700 razy G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po zakończeniu wirowania wstrzyknąć próbkę do kolumny, a następnie wymyć kolumnę żelowym buforem filtracyjnym i zebrać 0,6 mililitra frakcji fragmentu CENP-F. Następnie przeanalizuj profil filtracji żelu i uruchom SDS-PAGE frakcji szczytowych. Frakcje puli, które zawierają czysty CENP-F.

Następnie stężyć oczyszczony fragment CENP-F do 3,3 miligrama na mililitr. Aby określić stężenie białka, należy rozcieńczyć fragment CENP-F w stosunku jeden do 100 ultra czystą wodą. Następnie zapisz widmo od 220 do 300 nanometrów długości fali w spektrofotometrze.

Następnie przygotuj porcje 50 mikrolitrów oczyszczonego CENP-F w mikroprobówkach o pojemności 0,5 mililitra, a następnie błyskawicznie zamroź probówki w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Do testu kinazy wymieszaj fragment CENP-F z cykliną B ATP i CDK1 wraz z innymi w mikroprobówce o pojemności 0,5 mililitra. Następnie należy przygotować drugą próbkę bez cykliny B CDK1 jako kontroli ujemnej.

Następnie inkubować próbki w łaźni wodnej w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez jedną do 16 godzin. Aby pomyślnie zidentyfikować miejsca fosforylacji za pomocą spektrometrii mas, bardzo ważne jest, aby wydajność fosforylacji była jak najwyższa, najlepiej 100%Aby zwiększyć wydajność fosforylacji, dodaj więcej kinazy i wydłuż czas inkubacji do 16 godzin. Następnie dodać równe objętości sześciomolowego roztworu chlorowodorku guanidyny do pozostałej reakcji oznaczania kinazy i kontroli ujemnej i przeprowadzić spektrometrię mas w celu zidentyfikowania miejsca fosforylacji.

Aby uzyskać wysokiej jakości dane ze spektrometrii mas, ważne jest również, aby oczyszczona próbka białka była wysoce czysta i jednorodna. Najpierw przeprowadzana jest analiza SDS-PAGE, która pokazuje wyraźne przesunięcie w górę pasma na żelu dla fosforylowanego CENP-F w porównaniu z kontrolą ujemną bez CDK1, co wskazuje, że cNLS CENP-F jest substratem CDK1. Następnie przeprowadzana jest spektrometria mas w celu analizy liczby i wydajności miejsc fosforylacji CENP-F.

Widmo masowe pułapki jonowej ESI nienaruszonego CENP-F fosforylowanego in vitro pokazuje, że istnieje pięć pików, co wskazuje na cztery miejsca fosforylacji, a piąty pik to białko nieufosforylowane. Następnie ten profil elucji wykluczający wielkość pokazuje, że objętość elucji piku alfa karioferyny przesuwa się do większej masy po dodaniu dzikiego typu CENP-F, czego nie obserwuje się po dodaniu mutanta CENP-F. Wskazuje to, że fosfomimetyczna wersja S3048D CENP-F osłabia oddziaływanie cNLS CENP-F z karioferyną alfa.

Wreszcie, przeprowadzona analiza SDS-PAGE pokazuje, że fragment CENP-F typu dzikiego z nienaruszonymi cNLS koeluuje z karioferyną alfa, co wskazuje na silne oddziaływanie. Jednak mutant S3048D CENP-F i karioferyny alfa eluuje w oddzielnych pikach. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o sprawdzeniu uzyskanych miejsc fosforylacji w stosunku do sekwencji fosforylacji konsensusu CDK1 i zweryfikowaniu, czy zidentyfikowany substrat lokalizuje się w tym samym przedziale komórkowym co CDK1.

Zgodnie z tą procedurą należy przeprowadzić weryfikację funkcjonalną w komórkach lub modelach zwierzęcych w celu potwierdzenia, że zidentyfikowane miejsca fosforylacji pełnią funkcję fizjologiczną. Dostępnych jest szereg narzędzi do weryfikacji funkcjonalnej, takich jak specyficzne inhibitory CDK1 i mutacje fosfomimetyczne. Ze względu na dużą liczbę substratów CDK1 w proteum, wiele ludzkich substratów CDK1 pozostaje do odkrycia, a test kinazy in vitro będzie ważnym narzędziem do identyfikacji, mapowania i weryfikacji tych miejsc.

Identyfikacja tych miejsc fosforylacji umożliwia mechanistyczne badania tego, w jaki sposób CDK1 kontroluje cykl komórkowy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zidentyfikować specyficzne miejsca fosforylacji CDK1 i białka docelowe za pomocą testu kinazy in vitro.