Name: Ocena uszkodzeń oksydacyjnych w pierwotnych komórkach powierzchni oka/komórkach macierzystych myszy w odpowiedzi na uszkodzenie ultrafioletem-C (UV-C) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: Poznaj metodę jednoczesnego wykrywania ROS, żywych i martwych komórek w pierwotnych kulturach komórek powierzchni oka myszy po napromieniowaniu UV-C. Technika wykorzystuje barwienie DCFDA, jodkiem propidyny i Hoechst.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za wsparcie ze strony Centrum Badawczego Yenepoya, Yenepoya (Uważanego za Uniwersytet) dla obiektów infrastrukturalnych.

Eksperyment został przeprowadzony na pierwotnych komórkach oka/komórkach macierzystych pochodzących z oka szwajcarskiej myszy albinosa. Wykorzystanie zwierząt do pobierania oczu w tym eksperymencie zostało zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Etyki Zwierząt, Yenepoya (Uznany za Uniwersytet) (numer zatwierdzenia IEAC, 6a/19.10.2016).
1. Przygotowanie odczynników
UWAGA: Pobieranie komórek pierwotnych/komórek macierzystych z powierzchni oka myszy wykracza poza zakres tego protokołu. W związku z tym demonstrujemy dawki ekspozycji na promieniowanie UV-C, przygotowanie odczynnika do oceny ROS, żywych i martwych komórek oraz ich ilościowe określenie. Proszę zapoznać się z Tabelą 1 dla odpowiednich objętości odczynników (10% płodowa surowica bydlęca, DCFDA, Hoechst i roztwory podstawowe jodku propidyny, które należy dodać w celu uzyskania końcowego roztworu barwiącego).
<ol>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy 10 mM DCFDA, rozpuszczając 25 mg proszku DCFDA w 5,13 ml DMSO. Podamy po 250 μl w bursztynowych probówkach o pojemności 1,5 ml i przechowujemy w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy 10 mg/ml (16,23 mM roztwór) Hoechst 33342, rozpuszczając całą zawartość fiolki 25 mg w 2,5 ml wody dejonizowanej. Porcje 100 μl należy rozlać do mikrowirówek w kolorze bursztynowym i przechowywać w temperaturze 2-6 °C przez okres do 6 miesięcy. W przypadku dłuższego przechowywania przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy 1 mg/ml jodku propidyny w wodzie dejonizowanej, po 1 ml w bursztynowych probówkach o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
2. Posiewanie komórek i leczenie promieniowaniem UV-C
<ol>
	<li>Przed posiewem należy zdysocjować pierwotne komórki powierzchni oka myszy wyizolowane w naszym laboratorium (wyniki niepublikowane; takie komórki są mieszaniną komórek nabłonka rogówki, komórek zrębu i keratocytów) za pomocą delikatnego środka dysocjacji komórek (tabela materiałów).</li>
	<li>Płytka 0,2 x 106 pierwotnych komórek powierzchni oka myszy w 35 mm 0,2% macierzy błony podstawnej pokryte szalkami do hodowli komórkowych w 2,5 ml kompletnej pożywki. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w 5% nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5%CO2. 
	UWAGA: Kompletna pożywka do hodowli komórek pierwotnych z powierzchni oka myszy składa się z DMEM o wysokiej zawartości glukozy zawierającej 20% FBS, 1% Pen-strep, 1% Glutamax, 1% aminokwasów endogennych (NEAA), 1% pirogronianu sodu i 0,1% β-merkaptoetanolu.</li>
	<li>Przed wystawieniem komórek na działanie różnych dawek UV-C należy wyrzucić maksymalną objętość pożywki i pozwolić, aby tylko cienka warstwa pożywki (~500 μL) pozostała w kontakcie z komórkami, tylko tyle, aby je pokryć.</li>
	<li>Zabierz naczynia, pojedynczo do źródła/komory UV-C (dolna komora pieca do hybrydyzacji/sieciownika UV; Tabela materiałów). Umieść naczynie w komorze i zdejmij pokrywkę naczynia. Otwarta pokrywka naczynia zapewnia, że komórki otrzymują maksymalną dawkę UV-C podczas ekspozycji na UV-C.</li>
	<li>Wystaw komórki na działanie różnych stopni/dawek UV-C: 1 J/m2, 100J/m2, 1,000 J/m2 i 10,000 J/m2.</li>
	<li>Po ekspozycji na promieniowanie UV-C należy natychmiast założyć pokrywę każdej z naczyń i wyjąć je z komory źródła UV-C.</li>
	<li>Przynieś każdą z naczyń do okapu z laminarnym przepływem powietrza i uzupełnij każde z naczyń 2 ml świeżej, kompletnej pożywki.</li>
	<li>Inkubować komórki przez 3 godziny w inkubatorze CO2 o temperaturze 37 °C. Trzy godziny inkubacji po ekspozycji na promieniowanie UV-C są optymalne do wizualizacji i ilościowego określenia wczesnych efektów.</li>
</ol>
3. Przygotowanie pożywki do barwienia żywych komórek
<ol>
	<li>Przygotować podłoże barwiące na świeżo w ciągu ostatnich 15 minut 3-godzinnej inkubacji komórek po ekspozycji na promieniowanie UV-C.</li>
	<li>Podgrzej 10 ml podłoża barwiącego zawierającego 10% FBS-DMEM, uzupełnionego 1% Pen-Strep do temperatury 37 °C.</li>
	<li>Dodać 5 μl 10 mM DCFDA, 5 μl 10 mg/ml roztworu Hoechsta i 200 μl 1 mg/ml jodku propidyny. Końcowe stężenia DCFDA, Hoechst i PI wynoszą odpowiednio 5 μM, 5 μg/ml i 20 μg/ml w 10 ml podłoża barwiącyego.</li>
</ol>
4. Barwienie DCFDA pierwotnych komórek oka myszy narażonych na promieniowanie UV-C
<ol>
	<li>Po 3 godzinach inkubacji pierwotnych komórek oka myszy wystawionych na działanie promieniowania UV-C w różnych dawkach, należy odessać pożywkę z szalek o średnicy 35 mm.</li>
	<li>Uzupełnij 2 ml świeżo przygotowanego barwnika DCFDA do każdej z potraw delikatnie z boków.</li>
	<li>Inkubować komórki z pożywką barwiącą przez 15 minut w ciemności w inkubatorze CO2 o temperaturze 37 °C do barwienia żywych komórek.</li>
</ol>
5. Przeglądanie komórek barwionych DCFDA (ROS), Hoechst i PI
<ol>
	<li>Po zakończeniu inkubacji wyrzuć podłoże barwiące.</li>
	<li>Dodaj świeże, kompletne podłoże do komórek i obserwuj komórki pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym/kamerą komórkową (tabela materiałów). Sfotografuj żądane pola: jasne pole, niebieska fluorescencja, czerwona fluorescencja, zielona fluorescencja. 
	UWAGA: Niebieskie fluorescencyjnie zabarwione komórki to jądra, zielona fluorescencja jest przeznaczona dla komórek generujących ROS, a czerwona fluorescencja wskazuje na martwe komórki PI dodatnie.</li>
</ol>
6. Kwantyfikacja barwionych komórek (Hoechst-Blue, PI-Dead i Green-ROS) przy użyciu technik obrazowania
<ol>
	<li>Eksportuj obrazy zarejestrowane pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym/kamerą komórkową do ImageJ w celu oceny ilościowej.</li>
	<li>Otwórz każdy z obrazów pojedynczo, używając każdego kanału (tj. niebieskiego (Nuclei/Hoechst), zielonego (ROS), czerwonego (Dead/PI dodatni)) sekwencyjnie, do zliczania. Zacznij od nienaświetlonej kontroli i kolejno przechodź do 1, 100, 1 000 i 10 000 J/m-2.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą narzędzia do liczenia komórek oznaczonych jako krzyżyk w menu oprogramowania dla każdego z pól [niebieski dodatni (dodatni wynik Hoechsta; jądra), czerwony dodatni (dodatni PI; martwe komórki); zielony dodatni (ROS)] na każdym z obrazów odpowiadających każdemu z zabiegów.</li>
	<li>Policz, klikając każdy z określonych sygnałów w każdym z pól. Na przykład, kliknięcie na jądra wybarwione na niebiesko/Hoechst da całkowitą liczbę jąder w danym polu.</li>
	<li>Oblicz wyniki jako procent śmierci komórek w wyniku uszkodzenia UV (liczba komórek PI dodatnich x 100 podzielona przez liczbę komórek dodatnich Hoechst) i procent produkcji ROS przez uszkodzenie UV (liczba komórek dodatnich DCFDA x 100 podzielona przez liczbę komórek dodatnich Hoechst).</li>
</ol>

<ol><li>Gipson, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ocular+surface%3A+the+challenge+to+enable+and+protect+vision%3A+the+Friedenwald+lecture%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The ocular surface: the challenge to enable and protect vision: the Friedenwald lecture.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (10), 4391-4398 (2007).</li>
<li>Sridhar, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+cornea+and+ocular+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Ophthalmoogy%22%5BJournal%5D)">Anatomy of cornea and ocular surface.</a> Indian Journal of Ophthalmoogy. 66 (2), 190-194 (2018).</li>
<li>Betteridge, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolism%22%5BJournal%5D)">What is oxidative stress.</a> Metabolism. 49 (2), Suppl 1 3-8 (2000).</li>
<li>Ray, P. D., Huang, B. W., Tsuji, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+%28ROS%29+homeostasis+and+redox+regulation+in+cellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signaling%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species (ROS) homeostasis and redox regulation in cellular signaling.</a> Cell Signaling. 24 (5), 981-990 (2012).</li>
<li>Nita, M., Grzybowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+the+Reactive+Oxygen+Species+and+Oxidative+Stress+in+the+Pathomechanism+of+the+Age-Related+Ocular+Diseases+and+Other+Pathologies+of+the+Anterior+and+Posterior+Eye+Segments+in+Adults%5BTitle%5D)+AND+%22Oxidative+Medicine+and+Cellular+Longevity%22%5BJournal%5D)">The Role of the Reactive Oxygen Species and Oxidative Stress in the Pathomechanism of the Age-Related Ocular Diseases and Other Pathologies of the Anterior and Posterior Eye Segments in Adults.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3164734(2016).</li>
<li>Covarrubias, L., Hernandez-Garcia, D., Schnabel, D., Salas-Vidal, E., Castro-Obregon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+reactive+oxygen+species+during+animal+development%3A+passive+or+active%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Function of reactive oxygen species during animal development: passive or active.</a> Developmental Biology. 320 (1), 1-11 (2008).</li>
<li>Behar-Cohen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraviolet+damage+to+the+eye+revisited%3A+eye-sun+protection+factor+%28E-SPF%28R%29%29%2C+a+new+ultraviolet+protection+label+for+eyewear%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Ultraviolet damage to the eye revisited: eye-sun protection factor (E-SPF(R)), a new ultraviolet protection label for eyewear.</a> Clinical Ophthalmology. 8, 87-104 (2014).</li>
<li>Izadi, M., Jonaidi-Jafari, N., Pourazizi, M., Alemzadeh-Ansari, M. H., Hoseinpourfard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photokeratitis+induced+by+ultraviolet+radiation+in+travelers%3A+A+major+health+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Postgraduate+Medicine%22%5BJournal%5D)">Photokeratitis induced by ultraviolet radiation in travelers: A major health problem.</a> Journal of Postgraduate Medicine. 64 (1), 40-46 (2018).</li>
<li>de Jager, T. L., Cockrell, A. E., Du Plessis, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraviolet+Light+Induced+Generation+of+Reactive+Oxygen+Species%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Ultraviolet Light Induced Generation of Reactive Oxygen Species.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 996, 15-23 (2017).</li>
<li>Degl'Innocenti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxadiazon+affects+the+expression+and+activity+of+aldehyde+dehydrogenase+and+acylphosphatase+in+human+striatal+precursor+cells%3A+A+possible+role+in+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Oxadiazon affects the expression and activity of aldehyde dehydrogenase and acylphosphatase in human striatal precursor cells: A possible role in neurotoxicity.</a> Toxicology. 411, 110-121 (2019).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APC-Cdh1+Regulates+Neuronal+Apoptosis+Through+Modulating+Glycolysis+and+Pentose-Phosphate+Pathway+After+Oxygen-Glucose+Deprivation+and+Reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">APC-Cdh1 Regulates Neuronal Apoptosis Through Modulating Glycolysis and Pentose-Phosphate Pathway After Oxygen-Glucose Deprivation and Reperfusion.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 39, 123-135 (2019).</li>
</ol>

Autorzy otrzymali wsparcie finansowe od Bio-Rad Laboratories India Private Limited na sponsorowanie artykułu.

Opisana tutaj metoda barwienia DCFDA umożliwia wizualizację ROS w pierwotnych żywych komórkach oka myszy poddanych działaniu promieniowania UV-C. Zaletą tej metody barwienia jest to, że pozwala ona również naukowcom na badanie natychmiastowego wpływu promieniowania UV-C (3 godziny po ekspozycji na UVC) na żywe komórki i ich jednoczesne zliczenie pod kątem odsetka komórek dodatnich i martwych ROS. Ponadto, ponieważ metoda barwienia jest stosowana na żywych komórkach, komórki mogą być dalej inkubowane w tym samym pożywce p...

Powierzchnia oka (OS) to jednostka funkcjonalna składająca się głównie z zewnętrznej warstwy i nabłonka gruczołowego rogówki, gruczołu łzowego, gruczołu Meiboma, spojówki, części brzegów powiek i unerwienia, które przekazują sygnały1. Przezroczysta warstwa rogówki w kształcie kopuły skupia światło na siatkówce. Ta beznaczynkowa tkanka składa się ze składników komórkowych, takich jak komórki nabłonkowe, keratocyty i komórki śródbłonka oraz składników bezkomórkowych, takich jak kolagen i glikozaminoglikany2. Obszar ten jest drenowany przez łzy, które również dostarczają większość składników odżywczych. Anatomiczne położenie systemu operacyjnego zmusza go do bezpośredniego kontaktu ze środowiskiem zewnętrznym, często narażając go na różne ostre elementy, takie jak jasne światło, drobnoustroje, cząsteczki kurzu i chemikalia. Czynnik ten predysponuje OS do urazów fizycznych i sprawia, że jest podatny na różne choroby.
Stres oksydacyjny jest spowodowany brakiem równowagi między produkcją reaktywnych form tlenu (ROS) a mechanizmami obrony antyoksydacyjnej endogennej3. ROS są klasyfikowane jako cząsteczki reaktywne i wolne rodniki, z których oba pochodzą z tlenu cząsteczkowego (O2) poprzez mitochondrialną fosforylację oksydacyjną4. Pierwsza grupa składa się z form nierodnikowych, takich jak nadtlenek wodoru (H2O2), tlen singletowy (1O2), a druga obejmuje między innymi takie gatunki, jak aniony ponadtlenkowe (O2-) i rodniki hydroksylowe (•OH). Cząsteczki te są produktami ubocznymi normalnych procesów komórkowych, a ich rola jest związana z ważnymi funkcjami fizjologicznymi, takimi jak transdukcja sygnału, ekspresja genów i obrona gospodarza5. Wiadomo, że zwiększona produkcja ROS jest generowana w odpowiedzi na takie czynniki, jak inwazja patogenów, ksenobiotyki i ekspozycja na promieniowanie ultrafioletowe (UV)4. Ta nadprodukcja ROS powoduje stres oksydacyjny, który prowadzi do uszkodzenia cząsteczek, takich jak kwasy nukleinowe, białka i lipidy6.
Naturalne światło słoneczne, najbardziej dominujące źródło promieniowania UV, składa się z UV-A (400-320 nm), UV-B (320-290 nm) i UV-C (290-200 nm)7. Odnotowano odwrotną korelację między długością fali a energiami spektralnymi. Chociaż naturalne promieniowanie UV-C jest pochłaniane przez atmosferę, sztuczne źródła, takie jak lampy rtęciowe i przyrządy spawalnicze, emitują je, a zatem stanowią zagrożenie zawodowe. Objawy ekspozycji na oczy obejmują fotokeratitis i fotorogówkowe zapalenie spojówek8. Produkcja ROS jest jednym z głównych mechanizmów powodowania uszkodzeń komórek wywołanych promieniowaniem UV9. W obecnym badaniu pokazujemy wykrywanie ROS za pomocą metody barwienia dioctanu 2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny (DCFDA) w pierwotnych komórkach powierzchni oka myszy / komórkach macierzystych wystawionych na działanie UV-C. Zielona fluorescencja została uchwycona za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Komórki przebarwiono przeciwstawnie dwoma barwnikami, Hoechst 33342 i czerwonym jodkiem propidyny, w celu zabarwienia odpowiednio żywych i martwych komórek.

<table><tbody><tr><td>Dioctan 2',7'-dichlorofluoresceiny (DCFDA)</td><td>Sigma</td><td>D6883</td><td>Dioctan 2',7'-dichlorofluoresceiny jest sondą fluorogenną i jest przepuszczalny dla komórek. Służy do ilościowego oznaczania reaktywnych form tlenu.</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych (35 mm)</td><td>Eppendorf</td><td>SA 003700112</td><td>Sterylne naczynia do hodowli komórek.</td></tr><tr><td>DMEM High Glucose</td><td>HiMedia</td><td>AT007</td><td>Najczęściej stosowana pożywka do hodowli komórkowych, zawiera 4500 mg/L glukozy.</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu, pochodząca z UE</td><td>HiMedia</td><td>RM99955</td><td>Jeden z najważniejszych składników pożywek do hodowli komórkowych. Dostarcza czynników wzrostu, aminokwasów, białek, witamin rozpuszczalnych w tłuszczach, takich jak A, D, E i K, węglowodanów, lipidów, hormonów, minerałów i pierwiastków śladowych.</td></tr><tr><td>GlutMax</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Stosowany jako suplement i alternatywa dla L-glutaminy. Pomaga w poprawie żywotności i wzrostu komórek.</td></tr><tr><td>HL-2000 Hybrilinker</td><td>UVP</td><td></td><td>Piec do hybrydyzacji/sieciownik UV</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma</td><td>B2261</td><td>Barwnik Hoechst jest przepuszczalny zarówno dla żywych, jak i martwych komórek. Wiąże się z podwójnie wygładzonym DNA niezależnie od tego, czy komórka jest martwa, czy żywa.</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td></td><td>Matrix Podstawna matryca błony MEM</td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne (100X)</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>11140050</td><td>Stosowany jako suplement zwiększający wzrost i żywotność komórek.</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (Pen-Strep)</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Penicylina i streptomycyna są stosowane w celu zapobiegania skażeniu bakteryjnemu w hodowli.</td></tr><tr><td>Jodek propidium</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td>Barwnik fluorescencyjny, który jest przepuszczalny tylko dla martwych komórek. Wiąże się z DNA i pomaga w rozróżnianiu żywych i martwych komórek.</td></tr><tr><td>TryplE Express</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Delikatny środek do dysocjacji komórek</td></tr><tr><td>ZOE Fluorescencyjny obrazownik komórek</td><td>Bio-rad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ocena uszkodzeń oksydacyjnych w pierwotnych komórkach powierzchni oka/komórkach macierzystych myszy w odpowiedzi na uszkodzenie ultrafioletem-c (uv-c)

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Powierzchnia oka jest narażona na regularne zużycie z powodu różnych czynników środowiskowych. Narażenie na promieniowanie UV-C stanowi zagrożenie dla zdrowia w miejscu pracy. Tutaj pokazujemy ekspozycję pierwotnych komórek macierzystych z powierzchni oka myszy na promieniowanie UV-C. Powstawanie reaktywnych form tlenu (ROS) to odczyt zakresu stresu/uszkodzeń oksydacyjnych. W warunkach eksperymentalnych in vitro niezbędna jest również ocena odsetka martwych komórek powstałych w wyniku stresu oksydacyjnego. W tym artykule zademonstrujemy barwienie 2',7'-dichlorofluoresceindioctanu (DCFDA) pierwotnych komórek macierzystych myszy wystawionych na działanie promieniowania UV-C oraz ich kwantyfikację na podstawie fluorescencyjnych obrazów barwienia DCFDA. Barwienie DCFDA bezpośrednio odpowiada generacji ROS. Pokazujemy również kwantyfikację martwych i żywych komórek poprzez jednoczesne barwienie jodkiem propidyny (PI) i Hoechst 3332 odpowiednio oraz odsetek komórek DCFDA (ROS dodatnich) i PI dodatnich.

DCFDA to bezbarwny barwnik będący chemicznie zredukowaną formą fluoresceiny, stosowany jako wskaźnik do wykrywania ROS w komórkach. Barwnik ten zostaje uwięziony wewnątrz komórek i jest łatwo utleniany do fluorescencyjnego dichlorodihydrofluoresceiny (DCF), który emituje zieloną fluorescencję. Fluorescencję tę można wykryć za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Komórki można wizualizować i korelować z akumulacją ROS w następujący sposób: (i) żywe komórki bez ROS emitują silną niebieską fluorescencję; (ii) żywe komórki z...

Ten protokół demonstruje jednoczesne wykrywanie reaktywnych form tlenu (ROS), żywych komórek i martwych komórek w żywych hodowlach pierwotnych z komórek powierzchni oka myszy. 2',7'-Dichlorofluoresceindiacetat, jodek propidyny i barwienie Hoechst są używane do oceny ROS, martwych komórek i żywych komórek, odpowiednio, a następnie obrazowania i analizy.

Ocena uszkodzeń oksydacyjnych w pierwotnych komórkach powierzchni oka/komórkach macierzystych myszy w odpowiedzi na uszkodzenie ultrafioletem-C (UV-C)

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Witam wszystkich, nazywam się Dr.Bipasha Bose. Pracuję jako profesor nadzwyczajny i kierownik w Centrum Komórek Macierzystych i Medycyny Regeneracyjnej, Yenepoya Research Center, Yenepoya University, Mangalore, Indie. Teraz pokażemy, jak wykryć obecność ROS, czyli reaktywnych form tlenu "w żywych kulturach z powierzchni oczu myszy, które zostały wystawione na działanie różnych dawek promieniowania ultrafioletowego C.Zaletą tej techniki jest to, że tutaj możemy jednocześnie wykrywać obecność reaktywnych form tlenu, żywych i martwych komórek, bez konieczności posiadania komórek Vester. Zasada tej techniki polega zasadniczo na przepuszczalności żywych komórek barwnika DCFDA. DCFDA jest bezbarwnym barwnikiem przenikanym przez żywą komórkę, który podczas stresu oksydacyjnego jest oddziaływany przez oksydazy wewnątrzkomórkowe i przekształcany w fluorescencyjny DCF na zielono.W związku z tym zielony kwiatostan umożliwia nam wykrycie obecności reaktywnych form tlenu w żywych komórkach. Z drugiej strony, jodek propidyny jest barwnikiem przepuszczalnym wyłącznie dla martwych komórek, który fluoryzuje na czerwono. Jest to dwuniciowy barwnik interkalacyjny rDNA.Jednak barwnik Hoechst przenika zarówno do żywych, jak i martwych komórek. Jest to plama jądrowa w kolorze niebieskim. Jest to więc bardzo prosta metoda, w której możemy wykryć obecność reaktywnych form tlenu w długoterminowych hodowlach w sposób zależny od czasu wraz z oceną martwych komórek.Punkt płytki dwa miliony komórek na 35 milimetrowych szalkach hodowlanych. Komórki, które stosujemy, to komórki z powierzchni oka myszy. Usuń maksymalną objętość pożywki z każdej z naczyń do hodowli komórkowych.Pozostaw około 500 mikrolitrów pożywki do hodowli komórkowych w bliskim kontakcie z komórkami. Minimalna ilość podłoża zapobiegnie wysuszeniu komórek. Jednak celem minimalnej ilości mediów jest umożliwienie maksymalnej penetracji ekspozycji na promieniowanie UVC.Weź komórki pod źródło UV, może to być środek sieciujący UV lub dowolne inne źródło ultrafioletu C. Wystaw komórki na działanie różnych dawek promieniowania UVC, takich jak jeden, 10, 100, 1 000 i 10 000 dżuli na metr kwadratowy. Gdy ogniwa zostaną wystawione na działanie promieniowania ultrafioletowego C, pokrywki powinny być w pozycji otwartej.Pozwoli to na maksymalną penetrację ultrafioletu-C do komórek, a tym samym pokaże optymalną odpowiedź komórek na dawkę i odpowiedź na promieniowanie ultrafioletowo-C. Przynieś komórki do okapu z laminarnym przepływem powietrza i uzupełnij każde z naczyń dwoma mililitrami kompletnego podłoża. Ta kompletna pożywka zawiera 20% płodowej surowicy bydlęcej w DMEM, uzupełnioną suplementami, takimi jak 1% minimum aminokwasów endogennych, a także 1% antybiotyku, czyli penicyliny i streptomycyny.Następnie, po uzupełnieniu maksymalną objętością, czyli dwoma mililitrami kompletnej pożywki, należy umieścić płytki z powrotem w inkubatorze i inkubować przez okres trzech godzin, aby zobaczyć wczesne efekty promieniowania ultrafioletowego C. Przygotuj pożywkę do barwienia żywych komórek w ciągu ostatnich 15 minut trzech godzin po inkubacji komórek UVC. Środek barwiący przygotowuje się w 10% FBS zawierającym DMEM wstępnie podgrzany do 37 stopni.Aby zrobić 10 mililitrów pożywki barwiącej, najpierw dodaj pięć mikrolitrów DCFDA z zapasu 10 milimolowców, aby uzyskać końcowe stężenie pięciu mikromolowych. Dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół. Po drugie, dodać pięć mikrolitrów roztworu Hoechsta z zapasu 10 miligramów na ml, aby uzyskać końcowe stężenie pięciu mikrogramów na ml.Teraz dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół. Na koniec dodaj 200 mikrolitrów jodku propidyny z zapasu jednego miligrama na ml, aby uzyskać końcowe stężenie 20 mikrogramów na ml. Dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół.Teraz roztwór barwiący jest gotowy do użycia. Po trzech godzinach inkubacji po ekspozycji na promieniowanie UVC wyjmij płytki z inkubatora CO2. Odessać pożywkę z każdej z naczyń, które zostały wystawione na działanie różnych dawek UVC, takich jak jeden, 10, 100, 1 000 i 10 000 dżuli na metr kwadratowy.Teraz delikatnie dodaj dwa mililitry świeżo przygotowanej pożywki do barwienia żywych komórek do każdej z naczyń od boków naczyń. Ponownie umieścić płytki w inkubatorze CO2 i inkubować przez 15 minut w celu barwienia żywych komórek. Po 15 minutach inkubacji w pożywce do barwienia żywych komórek należy usunąć pożywkę barwiącą z każdej z naczyń zawierających komórki wystawione na działanie różnych dawek promieniowania ultrafioletowego C.Uzupełnij komórki dwoma mililitrami kompletnego podłoża. Teraz komórki są gotowe do przeglądania. Teraz umieść komórki kontrolne pod jasnym polem kamery fluorescencyjnej.Komórki wyglądają pozornie normalnie, ponieważ są komórkami kontrolnymi. Pod niebieskim polem możemy zobaczyć fluoryzujące komórki całkowite. Pod zielonym polem pokazuje generację ROS.Ponieważ są to komórki kontrolne, nie jest generowany ROS. Pod czerwonym polem widoczne są martwe komórki barwione jodkiem propidyny. Następnie utrzymuj promieniowanie UV naświetlone 100 dżuli na metr kwadratowy pod jasnym polem.Pod niebieskim polem, a także możemy zobaczyć całkowitą liczbę komórek pod niebieskim polem. Jednak gdy wystawiamy się na działanie pola zielonego, widoczne są komórki dodatnie DCFDA, a także martwe komórki PI dodatnie. Na koniec umieść maksymalną dawkę UV, czyli 10 000 dżuli na metr kwadratowy naświetlonych komórek, pod jasnym polem.Widzimy nieprawidłową morfologię komórek. Jednak pod niebieskim polem możemy zobaczyć całkowitą liczbę niebieskich komórek. Pod zielonym polem widoczne są zielone fluorescencyjne komórki dodatnie DCFDA, wskazujące na generację ROS.Kiedy komórki są wystawione na działanie czerwonego pola, wszystkie komórki fluoryzują na czerwono, co wskazuje na dużą liczbę śmierci komórek, gdy komórki są traktowane dawką 10 000 dżuli na metr kwadratowy promieniowania UV. Teraz ułóż obrazy uchwycone w różnych kanałach w jeden złożony panel obrazu odpowiadający dawkom ultrafioletu-C i nienaświetlonym kontrolom. Obrazy są ułożone w jednym panelu w grupie.Po pierwsze, jasne pole. Po drugie, niebieska plama jądrowa Hoechsta. Po trzecie, barwienie jodkiem propidyny, jak w przypadku martwych jąder.Po czwarte, DCFDA dla komórek dodatnich ROS. I po piąte, scalony obraz. Kiedy spojrzymy na pierwszy i drugi rząd obrazów, czyli nienaświetloną kontrolę i komórki wystawione na działanie dawki UVC jeden dżul na metr kwadratowy, zaobserwowaliśmy, że nie było ani komórek PI, ani ROS dodatnich, które się zaświeciły, co wskazuje na całkowity brak ROS i śmierci komórek w nienaświetlonych kontrolach i tak niską dawkę UVC wynoszącą jeden dżul na metr kwadratowy.Przejdźmy teraz do trzeciego rzędu złożonych obrazów komórek, które zostały wystawione na działanie 100 dżuli na metr kwadratowy. Bardzo niski odsetek komórek, około 10%, był dodatni zarówno dla PI, jak i DCFDA w tej dawce, co wskazuje na niską ilość wytwarzania ROS i śmierć komórki. Teraz przechodzimy do kolejnej, wyższej dawki ekspozycji na promieniowanie UVC, czyli 1000 dżuli na metr kwadratowy, jak wskazano w czwartym rzędzie złożonego obrazu.W tym przypadku około 70% komórek było dodatnich dla PI i DCFDA. Na koniec przechodzimy do najwyższej dawki ekspozycji na promieniowanie UVC, czyli 10 000 dżuli na metr kwadratowy, jak przedstawiono w piątym rzędzie obrazu kompozytowego. Okazało się, że prawie 100% komórek było dodatnich zarówno dla PI, jak i DCFDA, co wskazuje na 100% śmierć komórki i wytwarzanie ROS przy tej konkretnej dawce UVC.Prześlij obrazy do oprogramowania do obrazowania. Najpierw otwórz niebieski obraz wskazujący jądra barwione Hoeschtem, czyli całkowitą liczbę komórek. Otwórz narzędzie do liczenia i klikaj każdą z komórek pojedynczo, aby uzyskać liczbę.Teraz otwórz obraz przechwycony pod czerwonym kanałem wskazującym martwe komórki PI dodatnie. Otwórz narzędzie do liczenia i kliknij każdy z czerwonych punktów wskazujących liczbę martwych komórek PI dodatnich. Po zakończeniu zliczania martwych komórek kliknij przechwycone komórki z zielonym kanałem i otwórz narzędzie do liczenia, a następnie kliknij każde z zielonych miejsc wskazujących komórki pokazujące generację ROS.Zakończ liczenie zielonych komórek przechwyconych pod zielonym kanałem, a następnie za pomocą wzoru policz procent śmierci komórki przez uszkodzenie UVC i procent produkcji ROS przez uszkodzenie UVC. Oblicza się to za pomocą prostego wzoru liczba komórek PI dodatnich, czyli komórek fluoryzujących na czerwono, podzielona przez liczbę komórek dodatnich Hoechsta pomnożoną przez 100. Procent produkcji ROS przez uszkodzenia UV oblicza się za pomocą wzoru, liczba komórek dodatnich DCFDA lub komórek fluoryzujących na zielono, podzielona przez liczbę komórek dodatnich Hoechst pomnożona przez 100.Gdy masz już obie wartości procentowe, czyli procent śmierci komórki i procent produkcji ROS, użyj tych wartości do wykreślenia wykresu słupkowego. Oś X wskazuje dawkę promieniowania UV, podczas gdy oś y wskazuje procent komórek. Zielone paski wskazują procent generacji ROS, podczas gdy czerwony pasek wskazuje procent śmierci komórki.Po analizie oczywiste jest, że przy dawce UVC 100 dżuli występuje 10% komórek generujących ROS, a także 10% śmierć komórki. Podczas gdy przy dawce UVC 10 podniesionej do trzech dżuli na metr kwadratowy, 70% komórek wykazywało wytwarzanie ROS, a także śmierć komórki. Podczas gdy przy najwyższej dawce UVC, czyli 10 podniesionej do czterech dżuli na metr kwadratowy, około 100% komórek wykazywało śmierć komórkową, a także produkcję ROS.W związku z tym można wywnioskować, że istnieje silna dodatnia korelacja między wytwarzaniem ROS a śmiercią komórki. Podsumowując, technika ta jest bardzo przydatna do jednoczesnej oceny reaktywnych form tlenu, żywych i martwych komórek w żywych, normalnych kulturach zdarzeń. Technika ta jest również przydatna do ograniczonej oceny reaktywnych form tlenu, żywych i martwych komórek, w długotrwałych hodowlach, które były wystawione na działanie różnych czynników uszkadzających komórki, takich jak promieniowanie ultrafioletowe lub czynniki chemiczne.Technika ta może również pomóc badaczowi w określeniu optymalnego czasu na pobranie komórek, takiego jak 50% ROS, 75% ROS, i tak dalej, tak i tak dalej, jak może to mieć miejsce w przypadku wielu dalszych zastosowań, takich jak QR do PCR i Western blotting.

assessment-oxidative-damage-primary-mouse-ocular-surface-cellsstem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Metodą przesiewową służącą do wykrywania utleniającego środowiska wewnątrzkomórkowego jest pomiar utleniania CM-H2DCFDA. Po utlenieniu wewnątrz komórki CM-H2DCFDA zmienia się z związku niewykazującego fluorescencji w związek fluorescencyjny. Zmianę fluorescencji mierzy się za pomocą cytometrii przepływowej, co pozwala określić liczbę komórek znajdujących się w środowisku utleniającym.

Test przesiewowy stresu oksydacyjnego w linii komórkowej astrocytów kotów, G355-5

Katarakta jest główną przyczyną ślepoty na świecie. Promieniowanie ultrafioletowe (UVR) pochodzące ze słońca stanowi główny czynnik ryzyka rozwoju katarakty. Opracowano model zwierzęcy katarakty indukowanej dalekim UVR-B. W niniejszym artykule opisujemy metody badania powstawania katarakty: ekspozycję na UVR, ilościową RT-PCR oraz immunohistochemię.

Charakterystyka mechanizmów molekularnych zaćmy indukowanej promieniowaniem UVR in vivo

Poniższy artykuł przedstawia łatwą, powtarzalną technikę skutecznego tworzenia trwałego mysiego modelu niedoboru rąbków komórek macierzystych (LSCD). Ten model zwierzęcy jest przydatny w testowaniu i porównywaniu skuteczności leczenia chorób rąbkowych komórek macierzystych.

Prosta mechaniczna procedura powodująca niedobór rąbkowych komórek macierzystych u myszy

Keratynocyty naskórka tworzą funkcjonalną barierę skórną i są umieszczone na pierwszej linii obrony gospodarza przed zewnętrznymi zniewagami środowiskowymi. W tym miejscu opisano metody izolacji i pierwotnej hodowli keratynocytów naskórka ze skóry noworodków i dorosłych myszy oraz indukcji różnicowania końcowego i odpowiedzi zapalnej wywołanej promieniowaniem UVB przez keratynocyty.

Izolacja i hodowla pierwotnych keratynocytów myszy ze skóry noworodków i dorosłych myszy

Celem tego protokołu jest wywołanie przejściowej produkcji in vivo nieśmiertelnych poziomów reaktywnych form tlenu (ROS) w skórze myszy, co dodatkowo promuje reakcje fizjologiczne w tkance.

Stymulacja nisz komórek macierzystych i regeneracji tkanek w skórze myszy za pomocą przełączanej fotogeneracji reaktywnych form tlenu in situ zależnej od protoporfiryny IX

Przedstawiamy protokół rozwoju i wykorzystania modelu stresu oksydacyjnego poprzez traktowanie komórek nabłonka barwnikowego siatkówki za pomocąH2O2, analizując morfologię komórek, żywotność, gęstość, glutation i poziom UCP-2. Jest to użyteczny model do badania działania przeciwutleniającego białek wydzielanych przez komórki transpozonowe w celu leczenia zwyrodnienia neuroretinalnego.

Indukcja i analiza stresu oksydacyjnego w komórkach nabłonka ludzkiej siatkówki transposkanych transpozonem

Ten artykuł opisuje procedury używane do oceny toksyczności promieniowania UV i toksyn chemicznych na pierwotnej i nieśmiertelnej linii komórkowej.

Określanie toksyczności promieniowania UV i substancji chemicznych na pierwotne i nieśmiertelne ludzkie komórki nabłonka rogówki

Ten protokół opisuje metodę wywoływania dokładnego i powtarzalnego uszkodzenia rogówki i rąbków w modelu mysim. Protokół jest korzystny, ponieważ pozwala na równomierne rozłożenie uszkodzenia silnie zakrzywionej rogówki i rąbka myszy.

Indukcja alkaliów rogówki i rąbka za pomocą techniki stempla i trepanacji w modelu mysim

Protokół opisuje badanie ogólnoustrojowych i miejscowych skutków skórnych ekspozycji na promieniowanie ultrafioletowe B u myszy.

Badanie przewlekłej ekspozycji myszy na promieniowanie ultrafioletowe B

Tutaj prezentujemy protokoły, które oferują elastyczną i strategiczną podstawę do wirusowego manipulowania komórkami prekursorowymi oligodendrocytów w celu nadekspresji interesujących białek w celu specyficznego zbadania ich roli w oligodendrocytach za pomocą modelu mielinizacji ośrodkowego układu nerwowego in vitro.

Produkcja i wykorzystanie lentiwirusa do selektywnej transdukcji pierwotnych komórek prekursorowych oligodendrocytów do testów mielinizacji in vitro

Poznaj metodę jednoczesnego wykrywania ROS, żywych i martwych komórek w pierwotnych kulturach komórek powierzchni oka myszy po napromieniowaniu UV-C. Technika wykorzystuje barwienie DCFDA, jodkiem propidyny i Hoechst.

Ocena uszkodzeń oksydacyjnych w pierwotnych komórkach powierzchni oka/komórkach macierzystych myszy w odpowiedzi na uszkodzenie ultrafioletem-C (UV-C) (Wideo) | JoVE Journal

Ocena uszkodzeń oksydacyjnych w pierwotnych komórkach powierzchni oka/komórkach macierzystych myszy w odpowiedzi na uszkodzenie ultrafioletem-C (UV-C)

Przeglądaj więcej filmów