Ocena uszkodzeń oksydacyjnych w pierwotnych komórkach powierzchni oka/komórkach macierzystych myszy w odpowiedzi na uszkodzenie ultrafioletem-C (UV-C)

Witam wszystkich, nazywam się Dr.Bipasha Bose. Pracuję jako profesor nadzwyczajny i kierownik w Centrum Komórek Macierzystych i Medycyny Regeneracyjnej, Yenepoya Research Center, Yenepoya University, Mangalore, Indie. Teraz pokażemy, jak wykryć obecność ROS, czyli reaktywnych form tlenu "w żywych kulturach z powierzchni oczu myszy, które zostały wystawione na działanie różnych dawek promieniowania ultrafioletowego C.

Zaletą tej techniki jest to, że tutaj możemy jednocześnie wykrywać obecność reaktywnych form tlenu, żywych i martwych komórek, bez konieczności posiadania komórek Vester. Zasada tej techniki polega zasadniczo na przepuszczalności żywych komórek barwnika DCFDA. DCFDA jest bezbarwnym barwnikiem przenikanym przez żywą komórkę, który podczas stresu oksydacyjnego jest oddziaływany przez oksydazy wewnątrzkomórkowe i przekształcany w fluorescencyjny DCF na zielono.

W związku z tym zielony kwiatostan umożliwia nam wykrycie obecności reaktywnych form tlenu w żywych komórkach. Z drugiej strony, jodek propidyny jest barwnikiem przepuszczalnym wyłącznie dla martwych komórek, który fluoryzuje na czerwono. Jest to dwuniciowy barwnik interkalacyjny rDNA.

Jednak barwnik Hoechst przenika zarówno do żywych, jak i martwych komórek. Jest to plama jądrowa w kolorze niebieskim. Jest to więc bardzo prosta metoda, w której możemy wykryć obecność reaktywnych form tlenu w długoterminowych hodowlach w sposób zależny od czasu wraz z oceną martwych komórek.

Punkt płytki dwa miliony komórek na 35 milimetrowych szalkach hodowlanych. Komórki, które stosujemy, to komórki z powierzchni oka myszy. Usuń maksymalną objętość pożywki z każdej z naczyń do hodowli komórkowych.

Pozostaw około 500 mikrolitrów pożywki do hodowli komórkowych w bliskim kontakcie z komórkami. Minimalna ilość podłoża zapobiegnie wysuszeniu komórek. Jednak celem minimalnej ilości mediów jest umożliwienie maksymalnej penetracji ekspozycji na promieniowanie UVC.

Weź komórki pod źródło UV, może to być środek sieciujący UV lub dowolne inne źródło ultrafioletu C. Wystaw komórki na działanie różnych dawek promieniowania UVC, takich jak jeden, 10, 100, 1 000 i 10 000 dżuli na metr kwadratowy. Gdy ogniwa zostaną wystawione na działanie promieniowania ultrafioletowego C, pokrywki powinny być w pozycji otwartej.

Pozwoli to na maksymalną penetrację ultrafioletu-C do komórek, a tym samym pokaże optymalną odpowiedź komórek na dawkę i odpowiedź na promieniowanie ultrafioletowo-C. Przynieś komórki do okapu z laminarnym przepływem powietrza i uzupełnij każde z naczyń dwoma mililitrami kompletnego podłoża. Ta kompletna pożywka zawiera 20% płodowej surowicy bydlęcej w DMEM, uzupełnioną suplementami, takimi jak 1% minimum aminokwasów endogennych, a także 1% antybiotyku, czyli penicyliny i streptomycyny.

Następnie, po uzupełnieniu maksymalną objętością, czyli dwoma mililitrami kompletnej pożywki, należy umieścić płytki z powrotem w inkubatorze i inkubować przez okres trzech godzin, aby zobaczyć wczesne efekty promieniowania ultrafioletowego C. Przygotuj pożywkę do barwienia żywych komórek w ciągu ostatnich 15 minut trzech godzin po inkubacji komórek UVC. Środek barwiący przygotowuje się w 10% FBS zawierającym DMEM wstępnie podgrzany do 37 stopni.

Aby zrobić 10 mililitrów pożywki barwiącej, najpierw dodaj pięć mikrolitrów DCFDA z zapasu 10 milimolowców, aby uzyskać końcowe stężenie pięciu mikromolowych. Dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół. Po drugie, dodać pięć mikrolitrów roztworu Hoechsta z zapasu 10 miligramów na ml, aby uzyskać końcowe stężenie pięciu mikrogramów na ml.

Teraz dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół. Na koniec dodaj 200 mikrolitrów jodku propidyny z zapasu jednego miligrama na ml, aby uzyskać końcowe stężenie 20 mikrogramów na ml. Dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół.

Teraz roztwór barwiący jest gotowy do użycia. Po trzech godzinach inkubacji po ekspozycji na promieniowanie UVC wyjmij płytki z inkubatora CO2. Odessać pożywkę z każdej z naczyń, które zostały wystawione na działanie różnych dawek UVC, takich jak jeden, 10, 100, 1 000 i 10 000 dżuli na metr kwadratowy.

Teraz delikatnie dodaj dwa mililitry świeżo przygotowanej pożywki do barwienia żywych komórek do każdej z naczyń od boków naczyń. Ponownie umieścić płytki w inkubatorze CO2 i inkubować przez 15 minut w celu barwienia żywych komórek. Po 15 minutach inkubacji w pożywce do barwienia żywych komórek należy usunąć pożywkę barwiącą z każdej z naczyń zawierających komórki wystawione na działanie różnych dawek promieniowania ultrafioletowego C.

Uzupełnij komórki dwoma mililitrami kompletnego podłoża. Teraz komórki są gotowe do przeglądania. Teraz umieść komórki kontrolne pod jasnym polem kamery fluorescencyjnej.

Komórki wyglądają pozornie normalnie, ponieważ są komórkami kontrolnymi. Pod niebieskim polem możemy zobaczyć fluoryzujące komórki całkowite. Pod zielonym polem pokazuje generację ROS.

Ponieważ są to komórki kontrolne, nie jest generowany ROS. Pod czerwonym polem widoczne są martwe komórki barwione jodkiem propidyny. Następnie utrzymuj promieniowanie UV naświetlone 100 dżuli na metr kwadratowy pod jasnym polem.

Pod niebieskim polem, a także możemy zobaczyć całkowitą liczbę komórek pod niebieskim polem. Jednak gdy wystawiamy się na działanie pola zielonego, widoczne są komórki dodatnie DCFDA, a także martwe komórki PI dodatnie. Na koniec umieść maksymalną dawkę UV, czyli 10 000 dżuli na metr kwadratowy naświetlonych komórek, pod jasnym polem.

Widzimy nieprawidłową morfologię komórek. Jednak pod niebieskim polem możemy zobaczyć całkowitą liczbę niebieskich komórek. Pod zielonym polem widoczne są zielone fluorescencyjne komórki dodatnie DCFDA, wskazujące na generację ROS.

Kiedy komórki są wystawione na działanie czerwonego pola, wszystkie komórki fluoryzują na czerwono, co wskazuje na dużą liczbę śmierci komórek, gdy komórki są traktowane dawką 10 000 dżuli na metr kwadratowy promieniowania UV. Teraz ułóż obrazy uchwycone w różnych kanałach w jeden złożony panel obrazu odpowiadający dawkom ultrafioletu-C i nienaświetlonym kontrolom. Obrazy są ułożone w jednym panelu w grupie.

Po pierwsze, jasne pole. Po drugie, niebieska plama jądrowa Hoechsta. Po trzecie, barwienie jodkiem propidyny, jak w przypadku martwych jąder.

Po czwarte, DCFDA dla komórek dodatnich ROS. I po piąte, scalony obraz. Kiedy spojrzymy na pierwszy i drugi rząd obrazów, czyli nienaświetloną kontrolę i komórki wystawione na działanie dawki UVC jeden dżul na metr kwadratowy, zaobserwowaliśmy, że nie było ani komórek PI, ani ROS dodatnich, które się zaświeciły, co wskazuje na całkowity brak ROS i śmierci komórek w nienaświetlonych kontrolach i tak niską dawkę UVC wynoszącą jeden dżul na metr kwadratowy.

Przejdźmy teraz do trzeciego rzędu złożonych obrazów komórek, które zostały wystawione na działanie 100 dżuli na metr kwadratowy. Bardzo niski odsetek komórek, około 10%, był dodatni zarówno dla PI, jak i DCFDA w tej dawce, co wskazuje na niską ilość wytwarzania ROS i śmierć komórki. Teraz przechodzimy do kolejnej, wyższej dawki ekspozycji na promieniowanie UVC, czyli 1000 dżuli na metr kwadratowy, jak wskazano w czwartym rzędzie złożonego obrazu.

W tym przypadku około 70% komórek było dodatnich dla PI i DCFDA. Na koniec przechodzimy do najwyższej dawki ekspozycji na promieniowanie UVC, czyli 10 000 dżuli na metr kwadratowy, jak przedstawiono w piątym rzędzie obrazu kompozytowego. Okazało się, że prawie 100% komórek było dodatnich zarówno dla PI, jak i DCFDA, co wskazuje na 100% śmierć komórki i wytwarzanie ROS przy tej konkretnej dawce UVC.

Prześlij obrazy do oprogramowania do obrazowania. Najpierw otwórz niebieski obraz wskazujący jądra barwione Hoeschtem, czyli całkowitą liczbę komórek. Otwórz narzędzie do liczenia i klikaj każdą z komórek pojedynczo, aby uzyskać liczbę.

Teraz otwórz obraz przechwycony pod czerwonym kanałem wskazującym martwe komórki PI dodatnie. Otwórz narzędzie do liczenia i kliknij każdy z czerwonych punktów wskazujących liczbę martwych komórek PI dodatnich. Po zakończeniu zliczania martwych komórek kliknij przechwycone komórki z zielonym kanałem i otwórz narzędzie do liczenia, a następnie kliknij każde z zielonych miejsc wskazujących komórki pokazujące generację ROS.

Zakończ liczenie zielonych komórek przechwyconych pod zielonym kanałem, a następnie za pomocą wzoru policz procent śmierci komórki przez uszkodzenie UVC i procent produkcji ROS przez uszkodzenie UVC. Oblicza się to za pomocą prostego wzoru liczba komórek PI dodatnich, czyli komórek fluoryzujących na czerwono, podzielona przez liczbę komórek dodatnich Hoechsta pomnożoną przez 100. Procent produkcji ROS przez uszkodzenia UV oblicza się za pomocą wzoru, liczba komórek dodatnich DCFDA lub komórek fluoryzujących na zielono, podzielona przez liczbę komórek dodatnich Hoechst pomnożona przez 100.

Gdy masz już obie wartości procentowe, czyli procent śmierci komórki i procent produkcji ROS, użyj tych wartości do wykreślenia wykresu słupkowego. Oś X wskazuje dawkę promieniowania UV, podczas gdy oś y wskazuje procent komórek. Zielone paski wskazują procent generacji ROS, podczas gdy czerwony pasek wskazuje procent śmierci komórki.

Po analizie oczywiste jest, że przy dawce UVC 100 dżuli występuje 10% komórek generujących ROS, a także 10% śmierć komórki. Podczas gdy przy dawce UVC 10 podniesionej do trzech dżuli na metr kwadratowy, 70% komórek wykazywało wytwarzanie ROS, a także śmierć komórki. Podczas gdy przy najwyższej dawce UVC, czyli 10 podniesionej do czterech dżuli na metr kwadratowy, około 100% komórek wykazywało śmierć komórkową, a także produkcję ROS.

W związku z tym można wywnioskować, że istnieje silna dodatnia korelacja między wytwarzaniem ROS a śmiercią komórki. Podsumowując, technika ta jest bardzo przydatna do jednoczesnej oceny reaktywnych form tlenu, żywych i martwych komórek w żywych, normalnych kulturach zdarzeń. Technika ta jest również przydatna do ograniczonej oceny reaktywnych form tlenu, żywych i martwych komórek, w długotrwałych hodowlach, które były wystawione na działanie różnych czynników uszkadzających komórki, takich jak promieniowanie ultrafioletowe lub czynniki chemiczne.

Technika ta może również pomóc badaczowi w określeniu optymalnego czasu na pobranie komórek, takiego jak 50% ROS, 75% ROS, i tak dalej, tak i tak dalej, jak może to mieć miejsce w przypadku wielu dalszych zastosowań, takich jak QR do PCR i Western blotting.