Urządzenie mikroprzepływowe do badania wielu różnych szczepów
November 9th, 2012
Prezentujemy prostą metodę produkcji urządzeń mikroprzepływowych zdolnych do zastosowania podobnych warunków dynamicznych do wielu różnych szczepów, bez potrzeby stosowania czystego pomieszczenia lub miękkiej litografii.
Ogólnym celem poniższej metody jest zobrazowanie zachowania pojedynczych komórek z różnych szczepów drożdży w tych samych warunkach dynamicznych. Osiąga się to poprzez wytworzenie dwuwarstwowego urządzenia mikroprzepływowego lub dolna warstwa będzie zawierać każdy z różnych szczepów osobno, a górna warstwa zapewni dynamiczne warunki przepływu jako drugi krok. W studzienkach umieszcza się różne szczepy drożdży, a urządzenie zamyka się, tworząc pojedynczy kanał z wieloma oddzielonymi szczepami.
Następnie obrazujemy reakcje komórek na dynamiczne zmiany ośrodka Kontrolując natężenia przepływu w dwóch wejściach kanału Y, wyniki pokazują różne szczepy poddane tym samym warunkom dynamicznym i brak zanieczyszczenia krzyżowego między odwiertami. To urządzenie mikroprzepływowe ma kilka kluczowych zalet w porównaniu z innymi istniejącymi systemami. Umożliwia obrazowanie wielu różnych szczepów w tych samych warunkach dynamicznych.
Ponadto, co ważne, można go łatwo wyprodukować w dowolnym laboratorium bez konieczności stosowania specjalnego sprzętu. Metoda ta zrodziła się z dyskusji na temat tego, jak śledzić reakcje różnych izolatów z Dzikiego Wschodu na przepustki głodowe. Uruchom, narysuj lub wydrukuj żądany układ mikrokanałów w odpowiedniej skali.
Następnie przykryj szklany slajd warstwami taśmy klejącej Aby osiągnąć żądaną wysokość kanału, umieść projekt układu na płaskiej powierzchni i wyrównaj slajd do wzoru projektowego. Teraz ostrożnie odetnij taśmę na szklanym szkiełku zgodnie z układem. Usuń taśmę klejącą ze wszystkich obszarów szkiełka.
Zaakceptuj te w układzie mikrokanału. Umieść szkiełko w piekarniku grzewczym o temperaturze 65 stopni Celsjusza na trzy minuty. Następnie delikatnie wyczyść etanolem.
Wymieszaj bazę i składniki utwardzające PDMS zgodnie z zaleceniami producenta. Wlej około 30 mililitrów mieszaniny PDMS na szalkę Petriego na wysokość około 0,5 centymetra. W razie potrzeby odgazowuje PDMS w próżni.
Zanurz szklany szkiełko w PDMS wzorzystą taśmą klejącą skierowaną do góry. Umieszczenie wzoru za PDMS zapobiega tworzeniu się pęcherzyków powietrza między szkiełkiem a naczyniem Utwardzaj od dołu przez 48 godzin w temperaturze 65 stopni Celsjusza, upewniając się, że szalka jest pozioma za pomocą poziomicy w nowej 90-milimetrowej szalce Petriego. Wlej trzy mililitry mieszanki PDMS.
Ten krok można wykonać na koderze spinowym, jeśli jest dostępny. DGA i utwardzać, jak pokazano wcześniej. Teraz delikatnie wytnij warstwę przepływową urządzenia mikroprzepływowego do pożądanego rozmiaru za pomocą dziurkacza do biopsji.
Utwórz otwory dla wlotów i wylotów w warstwie przepływowej. Z drugiej szalki Petriego wytnij również warstwę studzienek o podobnej wielkości i umieść ją na grubej szklance. Przesuń palcem po układzie projektu.
Następnie wybij studzienki zgodnie z mikrokanałami w układzie za pomocą etanolu, wyczyść obie warstwy PDMS i szklaną szkiełko przykrywkowe i wysusz na powietrzu. Następnie potraktuj szkiełko nakrywkowe szkła i warstwę studzienek PDMS za pomocą standardowego wytrawiacza plazmowego do nieodwracalnego klejenia lub ręcznej obróbki koronowej do odwracalnego łączenia. Ostrożnie umieść warstwę studzienek na wierzchu szkiełka nakrywkowego, aby uzyskać przyczepność.
Delikatnie wycieraj wszelkie pęcherzyki powietrza. Przygotuj żądane podłoże w odpowiednich strzykawkach i podłącz do rurki tigon przegwintowanej przez pompę strzykawkową. Do obrazowania komórek.
Wykorzystaj mocne strony. Przejdź do żądanej fazy, dokładnie odwiruj kulturę i przenieś 300 mikrolitrów do mikroprobówek wirówkowych. Delikatnie umieść jeden mikrolitr con canna A w każdym dołku warstwy studzienek PDMS.
Wypłucz nadmiar conna A z każdej studzienki dwukrotnie, delikatnie pipetując wodę, podczas gdy con w A wysycha. Umyj szczepy dwukrotnie 300 mikrolitrami pożywki SC pozbawionej glukozy. Wypłukiwanie resztkowej glukozy ze ścian komórkowych pomaga w prawidłowym przyleganiu do konwalescencji.
Po wirowaniu komórki dokładnie pipetują około 0,5 mikrolitra zawiesiny komórek do poszczególnych studzienek. Delikatnie wypłucz pozostałe komórki bogatym podłożem. Kolejne dwa kroki należy wykonać szybko, aby zapobiec wysychaniu komórek.
Jako opcjonalną plazmę etapową, należy traktować wiór i studzienki, uważając, aby nie uderzyć bezpośrednio w studzienki. Następnie pod stereoskopem ostrożnie umieść chip na dołkach, zwracając szczególną uwagę na wyrównanie między nimi. Delikatnie dociśnij, aby przykleić dwie warstwy PDMS.
Powoli całkowicie napełnij urządzenie około 50 mikrolitrami bogatego podłoża, upewniając się, że wewnątrz kanału nie pozostały żadne pęcherzyki powietrza. Teraz podłącz urządzenie wkładające rurki do odpowiednich wlotów i rozpocznij przepływ mediów. Należy uważać, aby w rurkach nie tworzyły się pęcherzyki powietrza, ponieważ mogą one utknąć w urządzeniu i zniszczyć przepływ.
Przystąp do umieszczenia urządzenia pod mikroskopem i znajdź odpowiednie punkty obrazowania w każdym z nich. Dobrze utrzymuj komórki w bogatym, średnim przepływie przez godzinę lub dłużej, jeśli to konieczne. Aby umożliwić odzyskiwanie.
Rozpocznij eksperyment od ustawienia stałego przepływu. Pompuj A do 0,8 mililitra na godzinę i pompuj B do 0,2 mililitra na godzinę. Dla medium przepływa ponad 80% szerokości kanału.
Możemy dynamicznie zmieniać warunki w urządzeniu, zmieniając względne natężenia przepływu. Nowe warunki stabilizują się w ciągu kilku sekund wzdłuż całego kanału, aby zademonstrować separację między różnymi szczepami. Dwa rozróżnialne szczepy drożdży są obrazowane w naprzemiennych dołkach.
Należy pamiętać, że w tym eksperymencie nie ma wycieku komórek między studzienkami. Oba szczepy mają czynnik transkrypcyjny MSN two oznaczony YFP w celu przetestowania jednoczesnego wpływu dynamicznie zmieniających się warunków. Natężenia przepływu w dwóch kanałach wejściowych zostały zmienione tak, aby utworzyć krok bez pożywki glukozowej.
Spowodowało to lokalizację MSN 2 w jądrze. Co ważne, można analizować tor czasowy jądrowego MSN dwóch poziomów YFP w pojedynczych komórkach. Tak więc urządzenie mikroprzepływowe PDMS może być używane do stosowania jednoczesnych warunków dynamicznych do wielu odwiertów.
Podejmując się tej procedury, należy pamiętać, aby nie dopuścić do wyschnięcia ogniw podczas montażu urządzenia. Po opanowaniu technika ta może być łatwo wykonana bez potrzeby miękkiej litografii.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie przedstawia metodę obrazowania zachowania pojedynczych komórek drożdży z różnych szczepów w identycznych warunkach dynamicznych za pomocą urządzenia mikrofluidycznego. Urządzenie zostało zaprojektowane, aby zapobiec wzajemnemu zakażeniu, umożliwiając jednocześnie obserwację wielu szczepów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrofluidyka
- Mikroskopowe obrazowanie komórek
- Biologia drożdży
Tło
- Rozumienie zachowania komórek w warunkach dynamicznych jest kluczowe dla różnych badań biologicznych.
- Tradycyjne metody często wymagają czystych pomieszczeń i złożonych technik produkcyjnych.
- To badanie ma na celu uproszczenie procesu przy zachowaniu integralności eksperymentu.
- Urządzenia mikrofluidyczne oferują precyzyjną kontrolę warunków środowiskowych dla badań nad komórkami.
Cel badania
- Opracowanie urządzenia mikrofluidycznego, które umożliwia obrazowanie wielu szczepów drożdży jednocześnie.
- Zastosowanie dynamicznych warunków przepływu do różnych szczepów bez wzajemnego zakażenia.
- Zwiększenie zrozumienia reakcji komórek drożdży na zmiany środowiskowe.
Zastosowane metody
- Produkcja urządzenia mikrofluidycznego z dwóch warstw.
- Umieszczenie różnych szczepów drożdży w osobnych komórkach urządzenia.
- Zastosowanie dynamicznych warunków przepływu poprzez kontrolowane prędkości przepływu.
- Obrazowano reakcje komórek na zmiany w podłożu.
Główne wyniki
- Urządzenie skutecznie utrzymało separację między różnymi szczepami drożdży.
- Obrazy ujawniły różne reakcje szczepów drożdży na te same warunki dynamiczne.
- Metoda wykazała zalety nad istniejącymi systemami pod względem prostoty i skuteczności.
- Podczas eksperymentów nie zaobserwowano wzajemnego zakażenia między komórkami.
Wnioski
- To urządzenie mikrofluidyczne zapewnia nowatorskie podejście do badania wielu szczepów drożdży.
- Metoda pozwala na kontrolowane eksperymenty bez potrzeby złożonych konfiguracji.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować inne typy komórek i warunki eksperymentalne.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Comparative analysis of multiple cell strains under identical dynamic conditions is critical for early discovery and target validation in biopharma R&D. This microfluidic device enables simultaneous, contamination-free imaging of distinct yeast strains, supporting robust hypothesis testing and mechanistic de-risking. Its accessible fabrication and dynamic control streamline workflows at key inflection points in the discovery pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct comparison of cellular responses across multiple strains under controlled environmental shifts.
- Supports functional target validation by isolating strain-specific phenotypes in a shared dynamic context.
- Facilitates mechanistic de-risking by eliminating environmental variability as a confounder.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, contamination-free biological systems for downstream quantitative assays.
- Standardizes environmental exposure, enhancing reproducibility and assay reliability.
- Enables high-content imaging and multiplexed readouts for screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns experimental conditions for translational biomarker discovery when using disease-relevant yeast models.
- Maintains continuity from early discovery through preclinical validation by supporting consistent dynamic perturbations.
- Reduces risk of false positives by ensuring environmental uniformity across strains.
Pipeline & Workflow Integration
This device integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling parallel, quantitative analysis of multiple strains under synchronized dynamic conditions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by controlling environmental variables across strains.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible systems for compound or genetic screening.
- Analytics: Delivers quantitative, time-resolved imaging outputs for robust statistical comparison.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and mechanistic continuity when relevant to yeast-based disease models.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, easily manufactured platform adaptable to diverse strain panels and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in comparative studies.
- Operational Value: Simplifies device fabrication and standardizes experimental setup across labs.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by enabling direct, quantitative strain comparisons.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by clarifying strain-specific responses under uniform conditions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic assembly and quantitative cell imaging.
- Needs access to basic PDMS fabrication tools and standard microscopy infrastructure.
- Demands careful cross-team standardization of environmental flow parameters.
- Adaptable to other model systems with similar size and adherence properties.
- Practical limitations include throughput constraints and manual alignment steps.
