Name: Urządzenie mikroprzepływowe do badania wielu różnych szczepów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Poznaj metodę obrazowania pojedynczych komórek różnych szczepów drożdży w mikroprzepływowym urządzeniu dwuwarstwowym. Technika umożliwia jednoczesne badanie dynamicznych warunków bez zanieczyszczenia między próbkami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

YG otrzymuje wsparcie w ramach stypendium z IDB. IN jest stypendystą Alona oraz członkiem kadry naukowej w Edmond J‭. ‬Safra Center for Bioinformatics na Uniwersytecie w Tel Awiwie‭.‬ Badania te były finansowane z grantu ISF 1499/10.

1. Tworzenie matrycy z taśmy klejącej5
<ol>
	<li>Narysuj lub wydrukuj w odpowiedniej skali na papierze pożądany układ mikrokanałów. W naszym przypadku projekt składa się z dwóch kanałów w kształcie litery Y, z których każdy ma szerokość 3 mm (Rycina 2).</li>
	<li>Pokryj szkiełko przedmiotowe warstwami taśmy klejącej. Liczba warstw zdeterminuje wysokość kanału (około 60 μm na warstwę). Użyliśmy 3 warstw taśmy klejącej.</li>
	<li>Połóż projekt układu na płaskiej powierzchni. Dopasuj szkiełko do wzoru projektu. Ostrożnie wytnij skalpelem taśmę na szkiełku zgodnie z układem.</li>
	<li>Usuń taśmę klejącą ze wszystkich obszarów szkiełka przedmiotowego, z wyjątkiem tych znajdujących się w układzie mikrokanałów.</li>
	<li>Umieść szkiełko w piekarniku w temperaturze 65 °C na 2-3 min. Delikatnie oczyść etanolem.</li>
</ol>
2. Wytwarzanie mikroprzepływowego urządzenia z PDMS
<ol>
	<li>Wymieszaj bazę i utwardzacz PDMS zgodnie z zaleceniami producenta. Stosujemy stosunek bazy do utwardzacza 10:1. Wlej około 30 ml mieszaniny PDMS do szalki Petriego, aby uzyskać wysokość ~0,5 cm. W razie potrzeby odgazuj PDMS w próżni. Zanurz szkiełko w PDMS tak, aby wzorowana taśma Scotch była skierowana do góry. Umieszczenie wzoru przed wylaniem PDMS zapobiega powstawaniu pęcherzyków powietrza między szkiełkiem a dnem szalki. Utwardzaj przez 48 hr w temperaturze 65 °C, upewniając się za pomocą poziomicy, że szalka znajduje się w pozycji poziomej.</li>
	<li>Do nowej szalki Petriego o średnicy 90 mm wlej 3 ml mieszaniny PDMS, tak aby uzyskać warstwę o głębokości około 0,5 mm. (Jeśli dostępna jest wirówka do nakładania warstw, można jej użyć na tym etapie).</li>
	<li>Odgazuj i utwardź zgodnie z punktem 2.1.</li>
	<li>Ostrożnie wytnij skalpelem urządzenie mikroprzepływowe o pożądanej wielkości. Warstwa ta będzie określana jako „warstwa przepływu”.</li>
	<li>Wytnij podobnej wielkości fragment cienkiej warstwy PDMS z drugiej szalki Petriego. Będzie ona określana jako „warstwa studzienek”.</li>
	<li>Użyj odpowiednio dobranego wycinaka do biopsji (stosujemy średnicę wewnętrzną 1,2 mm), aby wyciąć otwory dla wlotów i wylotów w warstwie przepływu.</li>
	<li>Połóż warstwę studzienek na grubym szkiełku nad schematem projektu i wycinij studzienki, używając wycinaka do biopsji o średnicy wewnętrznej 2 mm, zgodnie z rozmieszczeniem mikrokanałów na schemacie.</li>
	<li>Oczyść obie warstwy PDMS oraz szkiełko podstawowe o wymiarach 24 mm x 60 mm etanolem. Pozostaw do wyschnięcia i zachowaj w czystości.</li>
	<li>Poddaj działaniu plazmy szkiełko podstawkowe oraz warstwę studzienek PDMS, używając standardowej trawaczki plazmowej (dla wiązania nieodwracalnego) lub ręcznego urządzenia do traktowania koronowego6 dla wiązania odwracalnego. Ostrożnie połóż warstwę studzienek na szkiełku, aby uzyskać adhezję (Rycina 3). Delikatnie usuń wszelkie pęcherzyki powietrza (jeśli to konieczne).</li>
</ol>
3. Eksperyment obrazowania komórek
<ol>
	<li>Upewnij się, że pożądane pożywki są przygotowane w odpowiednich strzykawkach podłączonych do elastycznych plastikowych rurek o średnicy wewnętrznej 0,02" (Tygon) w pompie strzykawkowej.</li>
	<li>Hoduj szczepy S. cerevisiae do pożądanej fazy w płynnym YPD. Dokładnie wymieszaj na vortexie i przenieś 300 μl każdego szczepu do probówki do mikrowirówki.</li>
	<li>Delikatnie nanieś 1 μl Konkanawaliny A (sigma) 2 mg/ml do każdego dołka. Dwukrotnie wypłucz nadmiar Konkanawaliny A z każdego dołka, delikatnie pipetując wodę.</li>
	<li>Podczas wysychania Konkanawaliny A dwukrotnie przemyj szczepy 300 μl pożywki SC pozbawionej glukozy. Wypłukanie resztkowej glukozy ze ścian komórkowych wspomaga prawidłową adhezję do Konkanawaliny A.</li>
	<li>Dokładnie wymieszaj komórki na vortexie. Pipetuj 0,75 μl lub mniej każdej zawiesiny komórkowej do oddzielnego dołka (Rysunek 3). Delikatnie wypłucz resztkowe komórki pożywką bogatą. Następne dwa kroki należy wykonać szybko, aby zapobiec wyschnięciu komórek.</li>
	<li>Dokładnie potraktuj plazmą chip i dołki, używając ręcznego urządzenia do potraktowania koronowego, uważając, aby nie uderzać bezpośrednio w dołki. Ostrożnie umieść chip na dołkach, zwracając szczególną uwagę na ich wyrównanie (ten krok można wykonać pod stereomikroskopem). Delikatnie dociśnij, aby skleić dwie warstwy PDMS. Powoli wypełnij urządzenie całkowicie około 50 μl pożywki bogatej, upewniając się, że w kanale nie pozostały pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>Podłącz urządzenie, wkładając rurki do odpowiednich wlotów, i rozpocznij przepływ pożywek. Dopilnuj, aby do urządzenia nie dostały się pęcherzyki powietrza, ponieważ mogą być trudne do usunięcia; można to osiągnąć, odłączając wlot lub wylot i delikatnie opukując urządzenie w miejscu, gdzie znajdują się pęcherzyki, uważając, aby nie stłuc szklanego kryszalku.</li>
	<li>Umieść pod mikroskopem i znajdź odpowiednie punkty obrazowania w każdym dołku.</li>
	<li>Utrzymuj komórki w przepływie pożywki bogatej przez 1 h lub dłużej, aby umożliwić regenerację, jeśli jest to konieczne.</li>
	<li>Rozpocznij eksperyment: stosujemy stały przepływ z każdej z dwóch pomp strzykawkowych, aby zapobiec cofaniu się pożywek, zmieniając względne szybkości przepływu według potrzeb. Ustawienie pompy A na 0,8 ml/hr i pompy B na 0,2 ml/hr skutkuje przepływem pożywki A nad 80% szerokości kanału (Rysunek 4). Można to dynamicznie zmieniać poprzez modyfikację obu szybkości przepływu. Nowe warunki stabilizują się w ciągu kilku sekund na całej długości kanału2.</li>
</ol>

<ol><li>Dertinger, S. K., Jiang, X., Li, Z., Murthy, V. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradients+of+substrate-bound+laminin+orient+axonal+specification+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Gradients of substrate-bound laminin orient axonal specification of neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 12542-12547 (2002).</li>
<li>Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+processing+by+the+HOG+MAP+kinase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Signal processing by the HOG MAP kinase pathway.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 7165-7170 (2008).</li>
<li>Paliwal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAPK-mediated+bimodal+gene+expression+and+adaptive+gradient+sensing+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MAPK-mediated bimodal gene expression and adaptive gradient sensing in yeast.</a> Nature. 446, 46-51 (2007).</li>
<li>Bennett, M. R., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+for+measuring+gene+network+dynamics+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices for measuring gene network dynamics in single cells.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 628-638 (2009).</li>
<li>Shrirao, A. B., Perez-Castillejos, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+Fabrication+of+Microfluidic+Devices+by+Replicating+Scotch-tape+Masters%5BTitle%5D)+AND+%22Chips+%26+Tips%22%5BJournal%5D)">Simple Fabrication of Microfluidic Devices by Replicating Scotch-tape Masters.</a> Chips & Tips. , (2010).</li>
<li>Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDMS+bonding+by+means+of+a+portable%2C+low-cost+corona+system%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system.</a> Lab Chip. 6, 1548-1549 (2006).</li>
<li>Gerber, D., Maerkl, S. J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+microfluidic+approach+to+generating+protein-interaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">An in vitro microfluidic approach to generating protein-interaction networks.</a> Nat. Methods. 6, 71-74 (2009).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

W niniejszej pracy przedstawiamy prostą metodę laboratoryjną wytwarzania urządzenia mikrofluidycznego, które umożliwia jednoczesne śledzenie kilku szczepów drożdży w warunkach dynamicznych. Obserwacja kilku szczepów w jednym kanale stanowi niezawodne narzędzie do porównywania dynamiki odpowiedzi pojedynczych komórek w wielu szczepach. Jedną z zalet naszego podejścia jest możliwość wykonania urządzenia za pomocą prostych technik, bez konieczności korzystania z pomieszczeń typu clean room. Co więcej, przeprowadziliśmy ten ...

Komórki nieustannie reagują na dynamicznie zmieniające się środowisko, modyfikując swój metabolizm, profil transkrypcyjny oraz funkcje komórkowe. Aby badać te zjawiska, konieczne są metody pozwalające na ilościowe określenie takich zmian. Jednym z odczytów takich odpowiedzi jest zmiana lokalizacji czynników transkrypcyjnych związanych ze stresem w odpowiedzi na stres żywieniowy.
Urządzenia mikroprzepływowe1 są wykorzystywane do dynamicznego manipulowania warunkami środowiskowymi komórek2-4. Oferują one szereg zalet w obrazowaniu żywych komórek: środowisko komórek może być precyzyjnie kontrolowane i dynamicznie zmieniane, komórki mogą być obrazowane w czasie rzeczywistym, w tym podczas manipulowania warunkami zewnętrznymi, a ponadto wymagane są minimalne objętości odczynników. Bardzo prostym projektem urządzenia mikroprzepływowego, pozwalającym na przełączanie się między dwoma stanami, jest urządzenie w kształcie litery Y2. Rutynowo stosujemy mikroprzepływowe urządzenia w kształcie litery Y, które umożliwiają wprowadzanie dynamicznych zmian w warunkach oddziaływania na komórki znajdujące się w kanale. Wykorzystujemy to urządzenie do śledzenia zmian lokalizacji znakowanych fluorescencyjnie czynników transkrypcyjnych związanych ze stresem w komórkach drożdży. Zmiany te obserwujemy w zmiennych warunkach odżywczych. Przykładowo, możemy podać impuls (lub serię impulsów) medium zawierającego glukozę w okresie przebywania w medium bez glukozy, z bardzo wysoką rozdzielczością czasową. Często w takich eksperymentach interesuje nas porównanie odpowiedzi różnych szczepów komórkowych (na przykład różnych mutantów lub różnych izolatów dzikich). Kanał w kształcie litery Y ogranicza się do jednego szczepu w każdym kanale – jeśli użytych zostanie więcej niż jeden szczep, nie ma prostego sposobu na ich rozróżnienie. Aby temu zaradzić, można zastosować różne kanały. Jeśli chcemy zastosować tę samą dynamikę warunków do wielu szczepów, chcielibyśmy połączyć koncepcję kanału Y z wieloma kanałami. Wdrażanie tego rozwiązania wiąże się z dwoma wyzwaniami: może być trudno zastosować te same warunki w tym samym czasie we wszystkich kanałach, a ponadto istnieje geometryczne ograniczenie liczby kanałów Y, które można zmieścić w jednym urządzeniu. Poszukiwaliśmy zatem sposobu na obserwację kilku szczepów w jednym kanale w warunkach dynamicznych.
Opisujemy tutaj dwuwarstwowe urządzenie mikrofluidyczne przeznaczone do obrazowania wielu szczepów w jednym kanale w tych samych warunkach dynamicznych. Warstwa dolna składa się z cienkiego PDMS z rzędem otworów. Warstwa ta jest przymocowana do szklanego szkiełka cover slip, tworząc wgłębienia, w których umieszczone zostaną różne szczepy, przytwierdzone do szkła za pomocą konkanawaliny A. Druga warstwa to mikrofluidyczne urządzenie w kształcie litery Y, wykonane metodą taśmy klejącej5. Po umieszczeniu szczepów we wgłębieniach druga warstwa jest szybko wyrównana i przytwierdzona do pierwszej, tworząc jeden kanał z kilkoma wgłębieniami zawierającymi różne szczepy. Końcowe urządzenie pozwala na śledzenie kilku szczepów w jednym kanale, gdzie wszystkie szczepy są poddane tym samym warunkom w dokładnie tym samym czasie. Cały proces projektowania i produkcji można przeprowadzić w warunkach laboratoryjnych, korzystając z prostych środków, bez użycia miękkiej litografii.

<table><tbody><tr><td>PDMS- SYLGARD 184</td><td>Dow Corning USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Susznik próżniowy</td><td>Nalgene</td><td>5310-0250</td><td></td></tr><tr><td>Wycinaki do biopsji</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>Harris Uni-Core 15076 (2 mm), 15074 (1.2 mm)</td><td></td></tr><tr><td>Pompy strzykawkowe</td><td>Chemyx</td><td>Fusion 200</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie do aktywacji koronowej</td><td>Electro-technic products</td><td>BD-20</td><td></td></tr><tr><td>Przewody Tygon</td><td>Tygon</td><td>S-54-HL</td><td></td></tr><tr><td>Konkanawalina-A</td><td>Sigma</td><td>C7275</td><td></td></tr><tr><td>Taśma klejąca Scotch</td><td>3M Scotch</td><td>Transparent Tape 1/2&quot;</td><td></td></tr></tbody></table>

urządzenie mikroprzepływowe do badania wielu odrębnych szczepów

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

Badanie odpowiedzi komórkowych na zmiany środowiskowe wiąże się z wieloma wyzwaniami eksperymentalnymi: komórki muszą być obrazowane w zmieniających się warunkach, często w sposób porównawczy. Płytki wielodołkowe są rutynowo wykorzystywane do porównywania wielu różnych szczepów lub linii komórkowych, jednak zapewniają ograniczoną kontrolę nad dynamiką środowiska. Z kolei urządzenia mikrofluidyczne pozwalają na precyzyjną dynamiczną kontrolę warunków otoczenia, lecz obrazowanie i rozróżnianie w nich więcej niż kilku szczepów jest trudne. W niniejszej pracy opisujemy metodę łatwego i szybkiego wytwarzania urządzenia mikrofluidycznego zdolnego do stosowania dynamicznie zmieniających się warunków dla wielu różnych szczepów drożdży w jednym kanale. Urządzenie jest projektowane i produkowane prostymi metodami, bez konieczności stosowania miękkiej litografii. Składa się ono z kanału przepływowego w kształcie litery Y, połączonego z drugą warstwą zawierającą mikrodółki. Szczepy są umieszczane w osobnych mikrodółkach i obrazowane w dokładnie tych samych warunkach dynamicznych. Demonstrujemy zastosowanie urządzenia do pomiaru odpowiedzi lokalizacji białek na impulsy zmian składników odżywczych w różnych szczepach drożdży.

Aby zademonstrować separację między różnymi szczepami, obrazowano dwa rozróżnialne szczepy drożdży w naprzemiennych studniach. Obrazowanie całych studni nie wykazuje wycieku komórek między nimi (Rycina 5a,b). Oba szczepy posiadają czynnik transkrypcyjny MSN2 znakowany YFP. Aby przetestować jednoczesny efekt dynamicznie zmieniających się warunków, zmieniono szybkości przepływu w dwóch kanałach wejściowych, tworząc skokowo podany pożywkę bez glukozy, co doprowadziło do lokalizacji Msn2-YFP w jądrze komórko...

Przedstawiamy prostą metodę wytwarzania urządzeń mikrofluidycznych zdolnych do stosowania podobnych warunków dynamicznych w odniesieniu do wielu odrębnych szczepów, bez konieczności korzystania z pomieszczeń typu clean room lub litografii miękkiej.

Urządzenie mikroprzepływowe do badania wielu odrębnych szczepów

Badanie reakcji komórek na zmiany środowiskowe wiąże się z wieloma wyzwaniami eksperymentalnymi: komórki muszą być obrazowane w zmiennych warunkach, często w...

Ogólnym celem poniższej metody jest obrazowanie zachowania pojedynczych komórek różnych szczepów drożdży w tych samych warunkach dynamicznych. Osiąga się to poprzez wykonanie dwuwarstwowego urządzenia mikrofluidycznego, w którym warstwa dolna zawiera poszczególne szczepy oddzielnie, a warstwa górna w drugim kroku zapewnia dynamiczne warunki przepływu. Różne szczepy drożdży umieszcza się w studzienkach, a następnie zamyka urządzenie, tworząc pojedynczy kanał z wieloma odseparowanymi szczepami.W następnym kroku obrazujemy reakcje komórek na dynamiczne zmiany w pożywce. Dzięki kontrolowaniu szybkości przepływu w dwóch wlotach kanału Y, wyniki ukazują różne szczepy poddane tym samym warunkom dynamicznym, bez zanieczyszczeń krzyżowych między studzienkami. To urządzenie mikrofluidyczne posiada kilka kluczowych zalet w porównaniu z innymi istniejącymi systemami. Pozwala ono na obrazowanie wielu odrębnych szczepów w tych samych warunkach dynamicznych.Co więcej, niezwykle istotne jest to, że można go łatwo wykonać w każdym laboratorium bez potrzeby posiadania specjalistycznego sprzętu. Metoda ta powstała w wyniku dyskusji nad sposobem monitorowania odpowiedzi różnych dzikich izolatów z Azji Wschodniej na przejścia głodowe. Na początek należy narysować lub wydrukować w odpowiedniej skali pożądany układ mikrokanałów.Następnie pokryj szkiełko przedmiotowe warstwami taśmy klejącej. Aby uzyskać pożądaną wysokość kanału, połóż projekt układu na płaskiej powierzchni i wyrównaj szkiełko względem wzoru projektu. Teraz ostrożnie wytnij taśmę na szkiełku przedmiotowym zgodnie z układem. Usuń taśmę klejącą ze wszystkich obszarów szkiełka przedmiotowego.Przyjmij te w układzie mikrokanału. Umieść szkiełko w piecu grzewczym w temperaturze 65 °C na trzy minuty. Następnie delikatnie oczyść etanolem.Zmieszać bazę i utwardzacz PDMS zgodnie z zaleceniami producenta. Wlać około 30 ml mieszaniny PDMS do szalki Petriego, aby uzyskać wysokość około 0,5 cm. W razie potrzeby odgazować PDMS w próżni.Zanurz szkiełko przedmiotowe w PDMS, tak aby wzór z taśmy klejącej był skierowany ku górze. Umieszczenie wzoru po nalaniu PDMS zapobiega tworzeniu się pęcherzyków powietrza między szkiełkiem a dnem naczynia. W nowej szalce Petriego o średnicy 90 mm wlej 3 mL mieszaniny PDMS. Utwardzaj przez 48 h w temperaturze 65 °C, upewniając się za pomocą poziomicy, że szalka znajduje się w pozycji poziomej.Ten krok można wykonać za pomocą kodera wirnikowego, jeśli jest dostępny. Przeprowadzić procesy DGA i utwardzanie zgodnie z wcześniejszymi instrukcjami. Następnie ostrożnie wyciąć warstwę przepływową urządzenia mikroprzepływowego do pożądanego rozmiaru, używając wycinaka do biopsji.Wykonaj otwory dla wlotów i wylotów w warstwie przepływowej. Wytnij również warstwę otworów o podobnej wielkości z drugiej szalki Petriego i umieść ją na grubym szkle. Nasuń na to projekt układu.Następnie należy wybić otwory w miejscach odpowiadających mikrokanałom na schemacie, używając etanolu, oczyścić obie warstwy PDMS oraz szklaną lamkę i wysuszyć je na powietrzu. W kolejnym kroku należy poddać szklaną lamkę oraz warstwę PDMS z otworami działaniu standardowej plazmy trawiącej w przypadku wiązania nieodwracalnego lub przenośnego urządzenia do traktowania koronowego w przypadku wiązania odwracalnego. Należy ostrożnie umieścić warstwę z otworami na szklanej lamce, aby uzyskać adhezję.Delikatnie usuń pęcherzyki powietrza. Przygotuj odpowiednie pożywki w odpowiednich strzykawkach i podłącz je do rurek typu tigon przeprowadzonych przez pompę strzykawkową. Do obrazowania komórek.Wykorzystać odpowiednie stężenia. Przejść do pożądanej fazy, dokładnie wymieszać kulturę w wirówce Vortex i przenieść 300 µL do probówek do mikrowirówki. Delikatnie nanieść 1 µL con canna A do każdej studni warstwy studni PDMS.Wypłucz nadmiar konkanawoliny A z każdej dołki dwukrotnie, delikatnie pipetując wodę, podczas gdy konkanawolina A wysycha. Przemyj szczepy dwukrotnie 300 µL pożywki SC pozbawionej glukozy. Usunięcie resztek glukozy ze ścian komórkowych sprzyja właściwej adhezji do konkanawoliny.Po wirowaniu w vortexie, należy dokładnie pipetować około 0,5 µL zawiesiny komórkowej do poszczególnych dołków. Pozostałe komórki należy delikatnie wypłukać pożywką bogatą. Kolejne dwa kroki muszą zostać wykonane szybko, aby zapobiec wysychaniu komórek.W ramach opcjonalnego kroku poddaj chip oraz studzienki obróbce plazmą, uważając, aby nie kierować strumienia bezpośrednio do wnętrza studzienek. Następnie, korzystając ze stereomikroskopu, ostrożnie nałóż chip na studzienki, zwracając szczególną uwagę na ich wzajemne wyrównanie. Delikatnie dociśnij, aby połączyć obie warstwy PDMS.Powoli wypełnij urządzenie całkowicie około 50 µL pożywki bogatej, upewniając się, że w kanale nie pozostały pęcherzyki powietrza. Następnie podłącz urządzenie, wkładając rurki do odpowiednich wlotów i uruchom przepływ pożywki. Dopilnuj, aby w rurkach nie powstały pęcherzyki powietrza, ponieważ mogą one utknąć w urządzeniu i zakłócić przepływ.Następnie należy umieścić urządzenie pod mikroskopem i znaleźć w każdym z nich odpowiednie punkty obrazowania. Komórki w dołkach należy utrzymywać w przepływie bogatej pożywki przez jedną godzinę lub dłużej, jeśli jest to konieczne, aby umożliwić ich regenerację.Rozpocznij eksperyment przy ustawieniu stałego przepływu. Ustaw pompę A na 0,8 ml/h, a pompę B na 0,2 ml/h. W przypadku medium przepływ powinien obejmować ponad 80% szerokości kanału.Możemy dynamicznie zmieniać warunki w urządzeniu poprzez zmianę względnych szybkości przepływu. Nowe warunki stabilizują się w ciągu kilku sekund wzdłuż całego kanału. Aby zademonstrować separację między różnymi szczepami, wykonano obrazowanie dwóch rozróżnialnych szczepów drożdży w naprzemiennych studzienkach.Należy zauważyć, że w tym eksperymencie nie dochodzi do przemieszczania się komórek między dołkami. Oba szczepy posiadają czynnik transkrypcyjny MSN2 znakowany YFP, aby zbadać jednoczesny efekt dynamicznie zmieniających się warunków. Prędkości przepływu w dwóch kanałach wlotowych zostały zmienione w celu utworzenia skoku medium bez glukozy.Doprowadziło to do lokalizacji MSN two w jądrze komórkowym. Co istotne, można analizować przebieg czasowy poziomów YFP w jądrowych MSN two w pojedynczych komórkach. Zatem mikrofluidyczne urządzenie PDMS może być wykorzystywane do stosowania jednoczesnych warunków dynamicznych w wielu dołkach.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby nie dopuścić do wyschnięcia komórek podczas montażu urządzenia. Po opanowaniu tej techniki można ją łatwo stosować bez konieczności wykorzystywania miękkiej litografii.

a-microfluidic-device-for-studying-multiple-distinct-strains

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Urządzenie mikrofluidyczne do badania wielu różnych szczepów

Opisujemy protokół wytwarzania urządzeń mikrofluidycznych, które umożliwiają wychwytywanie i hodowlę komórek. W tym podejściu wykorzystuje się ustrukturyzowane mikrostruktury, takie jak rowki wewnątrz kanałów mikrofluidycznych, aby stworzyć obszary o niskim naprężeniu ścinającym, w których komórki mogą zostać unieruchomione.

Urządzenie mikrofluidyczne z wzorami rowków do badania zachowania komórek

Niniejszy protokół opisuje opracowanie urządzenia mikroprzepływowego do badania chemotaksji bakteryjnej w stabilnych gradientach stężeń chemoefektorów.

Urządzenie mikroprzepływowe do ilościowego oznaczania chemotaksji bakteryjnej w stabilnych gradientach stężeń

Źródło: Cabeen, M. T. i in. Analiza mikrofluidyczna pojedynczych komórek Bacillus subtilis. J. Vis. Exp. (2018)Film pokazuje użycie urządzenia mikrofluidycznego do obserwacji wzrostu bakterii na poziomie pojedynczych komórek. Pokazuje, jak nieruchome komórki bakteryjne, zamknięte w mikroskalowych rowach, są nieustannie odżywiane i obrazowane pod mikroskopem fluorescencyjnym. System ten umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym podziału komórek i śledzenia linii genealogicznej na przestrzeni...

Śledzenie wzrostu bakterii z rozdzielczością pojedynczych komórek w układzie mikrofluidowym

W tym protokole przedstawiono produkcję, konfigurację i podstawowe działanie mikroprzepływowego bioreaktora pikolitrowego (PLBR) do analizy pojedynczych komórek mikroorganizmów prokariotycznych. Mikroorganizmy istotne z przemysłowego punktu widzenia zostały przeanalizowane jako dowód zasadności, co pozwoliło na wgląd w tempo wzrostu, morfologię i niejednorodność fenotypową w określonych okresach czasu, co jest prawie niemożliwe przy użyciu konwencjonalnych metod.

Mikroprzepływowy bioreaktor pikoliterowy do analizy mikrobiologicznej pojedynczych komórek: produkcja, konfiguracja systemu i obsługa

W tym artykule prezentujemy mikroprzepływowy chip do analizy pojedynczych komórek. Umożliwia ilościowe oznaczanie wewnątrzkomórkowych białek, enzymów, kofaktorów i drugich przekaźników za pomocą testów fluorescencyjnych lub testów immunologicznych.

Mikroprzepływowy chip do wszechstronnej analizy chemicznej pojedynczych komórek

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i hodowli pojedynczych komórek za pomocą platformy mikroprzepływowej, który wykorzystuje nową koncepcję projektowania mikrostudzienek, aby umożliwić wysokowydajną izolację pojedynczych komórek i długoterminową hodowlę klonalną.

Platforma mikroprzepływowa do wysokowydajnej izolacji i hodowli pojedynczych komórek

Przedstawiamy metodę analizy mikroprzepływowej poszczególnych linii komórek bakteryjnych na przykładzie Bacillus subtilis. Metoda ta przezwycięża niedociągnięcia tradycyjnych metod analitycznych w mikrobiologii, umożliwiając obserwację setek generacji komórek w ściśle kontrolowanych i jednolitych warunkach wzrostu.

Jednokomórkowa analiza mikroprzepływowa Bacillus subtilis

Ten raport opisuje metodę opartą na chipie mikroprzepływowym, która pozwala na przeprowadzenie eksperymentu z pojedynczą hodowlą komórkową, w którym można uzyskać wysokowydajne parowanie i mikroskopową analizę wielu pojedynczych komórek.

Ustanawianie kokultur opartych na pojedynczych komórkach w sposób deterministyczny za pomocą chipa mikroprzepływowego

Prezentujemy system mikroprzepływowy do wysokoprzepustowych badań nad złożonymi maszynami życia, który składa się z 1500 jednostek hodowlanych, szeregu ulepszonych pomp perystaltycznych i modułu mieszania na miejscu. Chip mikroprzepływowy pozwala na analizę wysoce złożonych i dynamicznych warunków mikrośrodowiskowych in vivo.

Generowanie dynamicznych warunków środowiskowych za pomocą wysokowydajnego urządzenia mikroprzepływowego

Ze względu na nieprzezroczystość gleby, interakcje między jej składowymi mikroorganizmami nie mogą być łatwo zobrazowane za pomocą rozdzielczości komórkowej. Zaprezentowano tu dwa narzędzia mikroprzepływowe, które dają nowe możliwości badania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych. Urządzenia są wszechstronne i proste w użyciu, umożliwiając wysoką kontrolę czasoprzestrzenną i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości na poziomie komórkowym.

Narzędzia mikroprzepływowe do badania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych na poziomie komórkowym

Przedstawiamy protokół urządzenia do ciągłej kultury mikrofluidalnej (MCCD), które umożliwia uprawę populacji bakteryjnych w stałych warunkach niskiego pożywienia (aż do setek nanomolarnych stężeń) lub czasowych fluktuacji składników odżywczych w skali minut.

Urządzenie mikrofluidyczne do ciągłej hodowli przeznaczone do badania Escherichia coli w warunkach niskich i wahających się stężeń składników odżywczych

Poznaj metodę obrazowania pojedynczych komórek różnych szczepów drożdży w mikroprzepływowym urządzeniu dwuwarstwowym. Technika umożliwia jednoczesne badanie dynamicznych warunków bez zanieczyszczenia między próbkami.

Urządzenie mikroprzepływowe do badania wielu odrębnych szczepów

Przeglądaj więcej filmów