Mikroprzepływowy bioreaktor pikoliterowy do analizy mikrobiologicznej pojedynczych komórek: produkcja, konfiguracja systemu i obsługa

Ogólnym celem niniejszej procedury jest analiza pojedynczych bakterii oraz ewoluujących izogenicznych mikrokolonii z pełną rozdzielczością przestrzenną i czasową w stałych warunkach środowiskowych przy użyciu mikrofluidycznego urządzenia do hodowli. Cel ten zostaje osiągnięty poprzez zaprojektowanie systemu hodowli mikrofluidycznej w oprogramowaniu CAD. Następnie z polidimetylosiloksanu wykonuje się jednorazowe urządzenia do hodowli mikrofluidycznej zawierające bioreaktory pikolitrowe o wysokości jednego mikrona, co ogranicza wzrost bakterii do jednej warstwy.

Następnie do urządzenia mikrofluidycznego wprowadza się kulturę mikroorganizmów w celu inokulacji pojedynczych komórek macierzystych wewnątrz bioreaktorów. Komórki te są namnażane poprzez ciągłe wprowadzanie pożywki wzrostowej do systemu. Wyniki uzyskano dzięki zautomatyzowanej mikroskopii poklatkowej, obrazującej hodowlę przemysłowo istotnego szczepu Corynebacterium glutamicum, dane dotyczące wzrostu oraz heterogeniczność międzykomórkową.

W konwencjonalnej biotechnologii większość analiz opiera się na danych uśrednionych. Nasze urządzenie mikrofluidyczne umożliwia analizę pojedynczych komórek poszczególnych bakterii z rozdzielczością przestrzenną i czasową. Jest to użyteczne narzędzie do szczegółowego badania heterogeniczności międzykomórkowej izogenicznych mikrokolonii.

Stosujemy powszechną fotolitografię SU-8 oraz formowanie chipów z polidimetylosiloksanu w celu wytwarzania jednorazowych urządzeń mikroprzepływowych o rozdzielczości podmikronowej. Pomyślnie zademonstrowaliśmy naszą technologię z wykorzystaniem kilku mikroorganizmów biotechnologicznych, takich jak Escherichia coli i Corynebacterium glutamicum. W pierwszej kolejności należy zaprojektować urządzenie mikroprzepływowe przy użyciu oprogramowania CAD.

Konstrukcja przedstawiona w niniejszym protokole składa się z dwóch wlotów do zasiewu, generatora gradientu do mieszania dwóch różnych substratów, jednego wylotu oraz sześciu macierzy, z których każda zawiera pięć bioreaktorów. W pomieszczeniu czystym przygotować czterocalowy wafelek krzemowy i nanieść metodą spin-coatingu warstwę 1 µm fotorezystu SU-8 2000.5 na wafelek, zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym. Umieścić pokryty wafelek na płycie grzejnej w temperaturze 95 °C w celu odparowania nadmiaru rozpuszczalnika, a następnie włożyć pierwszą warstwę maski fotolitograficznej, obejmującą obszary pułapkujące reaktorów pikolitrowych, oraz pokryty wafelek do urządzenia do wyrównywania masek.

Następnie poddaj wafer naświetlaniu w trybie styku próżniowego światłem o długości fali od 350 do 400 nm przez trzy sekundy przy intensywności 7 mW/cm². Przeprowadź wygrzewanie poekspozycyjne na płaskiej płycie grzejnej w temperaturze 95 °C, aby zainicjować polimeryzację SU-8. Następnie umieść wafer w kąpieli z wywoływaczem do SU-8 na jedną minutę, a potem przenieś wafer do drugiego pojemnika ze świeżym wywoływaczem do SU-8 na kilka sekund.

Opłucz wafelek w izopropanolu, aby usunąć wywoływacz SU-8, a następnie osusz go za pomocą strumienia azotu lub wirówki do wafli. Następnie poddaj wafelek wygrzewaniu (hard bake) przez 10 minut w temperaturze 150 °C. Kolejnie przygotuj drugą warstwę zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym, aby ukończyć formę matkę.

Rozpocznij wytwarzanie chipa z PDMS, mieszając bazę i czynnik sieciujący w stosunku 10:1. Odpowietrz mieszaninę PDMS przez około 30 minut w desykatorze próżniowym, aż do całkowitego usunięcia pęcherzyków powietrza. Następnie umieść wafelek SU-8 w urządzeniu formującym i wlej na wafelek warstwę mieszaniny PDMS o grubości 3 mm.

Następnie wypiekaj PDMS przez trzy godziny w temperaturze 80 °C w piekarniku. Po ostygnięciu ostrożnie oddziel blok PDMS od wafla i potnij go na pojedyncze płytki za pomocą czystego i ostrego skalpela. Przemyj płytki w kąpieli z n-pentanu przez 90 minut, a następnie w dwóch kolejnych kąpielach z acetonu, po 90 minut każda.

Suszyć chipy przez noc, aby usunąć pozostałości rozpuszczalnika. Bezpośrednio przed eksperymentem wykonać otwory wlotowe i wylotowe w chipie z PDMS za pomocą igły lub dziurkacza o średnicy nieco mniejszej niż złączki stosowane do łączenia rurek z chipem z PDMS. Następnie starannie oczyścić mikrofluidyczny chip z PDMS izopropanolem i użyć taśmy klejącej, aby usunąć przylegające cząsteczki kurzu.

Następnie należy oczyścić cienki szkiełko przedmiotowe o grubości 170 µm najpierw acetonem, potem izopropanolem, a następnie wodą dejonizowaną, i wysuszyć szkiełko strumieniem azotu. Po oczyszczeniu i osuszeniu, poddaj szkiełko oraz chip z PDMS utlenianiu plazmowemu przez 25 s przy mocy 50 W i przepływie tlenu 20 sccm. Następnie ostrożnie wyrównaj chip z PDMS i szkiełko przed nałożeniem PDMS na szkło, co spowoduje ich związanie w ciągu kilku sekund.

Utrwal wiązanie, wypiekać układ przez 10 sekund w temperaturze 80 °C. Aby przygotować bakterie do eksperymentu z użyciem chipa, zaszczep pojedynczą kolonię wybranego szczepu bakterii, np. C.glutamicum, do 20 mL świeżego podłoża BHI i inkubować kulturę przez noc w temperaturze 30 °C na inkubatorze obrotowym przy 120 RPMs. Następnego ranka przenieść 10 µL kultury startowej do drugiej kultury zawierającej 20 mL odpowiedniego podłoża i pozostawić komórki do wzrostu przez noc w tych samych warunkach.

Następnego dnia wstępnie podgrzej inkubator mikroskopu odwróconego do 30 °C. W zależności od konkretnej konfiguracji sprzętu może to potrwać do dwóch godzin. Podczas nagrzewania otwórz inkubator, wybierz odpowiedni obiektyw i przygotuj go, stosując wymagane medium montażowe.

Następnie zamontuj chip w uchwycie i zabezpiecz go w miejscu. Wycentruj próbkę pod mikroskopem i ustaw ostrość na macierzach bioreaktorów pikolitrowych. Po ustawieniu ostrości na chipie, podłącz wloty i wyloty za pomocą odpowiednich przewodów, a następnie umieść przewody odpływowe w zbiorniku na odpady.

Następnie należy napełnić strzykawkę świeżą pożywką, umieścić ją w pompie strzykawkowej i płukać kanały mikrofluidyczne przez jedną godzinę przy szybkości przepływu 200 nanoliters per minute, aby przygotować chip do pracy. Gdy komórki znajdują się jeszcze w wczesnej fazie wzrostu wykładniczego, należy przenieść jeden milliliter kultury bakteryjnej do sterylnej strzykawki, a następnie zastąpić strzykawkę i dreny zawierające pożywkę zawiesiną komórkową oraz nowymi drenami. Zawiesinę komórkową należy wprowadzać do kanałów z objętościową szybkością przepływu 200 nanoliters per minute, aż do czasu wypełnienia większości bioreaktorów pikolitrowych.

Jeśli wypełniono tylko niewielką liczbę bioreaktorów, należy zwiększyć szybkość przepływu do 800–1200 nanolitrów na minutę. Po zasianiu pożądanej liczby komórek odłączyć zawiesinę komórkową, ponownie podłączyć pożywkę wzrostową do chipa i przeprowadzić perfuzję świeżą pożywką z szybkością 100 nanolitrów na minutę. Następnie należy przeskanować chip i wybrać konkretne bioreaktory do obrazowania time-lapse.

Następnie skonfiguruj sekwencję mikroskopii time-lapse, aby obrazować bioreaktory od początku do końca i rozpocząć eksperyment. Gdy wszystkie bioreaktory pikolitrowe zostaną przerośnięte, przerwij eksperyment i odpowiednio zutylizuj chipy. Aby rozpocząć analizę, najpierw określ, które bioreaktory spełniają wszystkie pożądane kryteria eksperymentu, takie jak liczba i pozycja komórek macierzystych.

Za pomocą programu do analizy, takiego jak ImageJ, określ szybkość wzrostu każdej mikrokolonii, zliczając liczbę komórek w każdym punkcie czasowym. Oblicz maksymalną szybkość wzrostu, sporządzając wykres zależności czasu od logarytmu liczby komórek. Przedstawiony tutaj system może być zastosowany do badania różnych gatunków bakterii pod kątem różnych parametrów biologicznych, takich jak wzrost, morfologia lub sygnał fluorescencyjny.

W tym przykładzie szczep C.glutamicum był hodowany w standardowych warunkach hodowli, a przedstawione tutaj krzywe wzrostu uzyskano z trzech izogenicznych mikrokolonii. Bioreaktory pikolitrowe okazały się również przydatne do analizy produkcji białek przy użyciu fluorescencyjnej mikroskopii poklatkowej, co pokazano tutaj. Poprzez wystawienie komórek na niskie stężenie induktora białek IPTG, możliwe jest badanie zmienności poziomu białka między poszczególnymi komórkami na poziomie pojedynczej komórki w obrębie kolonii wywodzących się z jednej komórki macierzystej.

Prezentowana technika może być zastosowana do monitorowania i analizy pojedynczych komórek bakteryjnych przy pełnej kontroli środowiska. Jest to niemal niemożliwe do osiągnięcia przy użyciu konwencjonalnych systemów hodowli w skali laboratoryjnej. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dokładną wiedzę na temat przygotowania mikroprzepływowych chipów hodowlanych do przeprowadzania porównywalnych analiz pojedynczych komórek.