Name: Mikroprzepływowy bioreaktor pikoliterowy do analizy mikrobiologicznej pojedynczych komórek: produkcja, konfiguracja systemu i obsługa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-06T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Poznaj mikroprzepływowy bioreaktor pikoliterowy do analizy pojedynczych komórek bakteryjnych Corynebacterium glutamicum i Escherichia coli. Ta metoda umożliwia badanie tempa wzrostu i heterogeniczności fenotypowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować technikowi Agnes Müller-Schröer za jej cenny wkład. Prace te zostały częściowo wykonane w Helmholtz Nanoelectronic Facility (HNF) w Forschungszentrum Jülich GmbH. Autorzy są wdzięczni za hojną pomoc i wsparcie.

1. Produkcja wafli
<ol>
	<li>Zaprojektuj urządzenie mikroprzepływowe zawierające wloty, wyloty, kanały główne i PLBR (rysunek 1A) za pomocą oprogramowania CAD.</li>
	<li>Konstrukcja przedstawiona w tym protokole (rysunek 2) składa się z dwóch wlotów wysiewu, generatora gradientu do mieszania dwóch różnych substratów, jednego wylotu i sześciu układów PLBR. Każda tablica zawiera 5 PLBR, co daje 30 równoległych PLBR wewnątrz jednego urządzenia mikroprzepływowego.</li>
	<li>Utwórz fotomaskę litograficzną zawierającą żądane układy chipów (rysunek 1B). Fotomaska została wyprodukowana we własnym zakresie metodą zapisu wiązką elektronów z rozdzielczością submikronową. Zastosowana maska składała się z warstwy chromu na szklanej płycie 5 w2. 
	Uwaga: wszystkie poniższe kroki należy wykonać w warunkach pomieszczenia czystego klasy 100 lub wyższej (schemat blokowy procesu pokazano na rysunkach 3A i 3B).</li>
	<li>Wyczyść 4-calową płytkę krzemową piranią (stosunek 10:1 kwasu siarkowego i nadtlenku wodoru) i kwasem fluorowodorowym przez kilka minut (Uwaga: niebezpieczne chemikalia). Płukać wodą dejonizowaną (DI) przez około 10 sekund.</li>
	<li>Odwadniać wafel przez 20 minut w temperaturze 200 °C.</li>
	<li>Przędzić 1 μm SU-8 2000.5 fotorezystu na płytce (1 warstwa) (4 ml rezystu, wirować 10 sekund z, v = 500 obr./min i a = 100 obr./min, wirować 30 sek. przy v = 1 000 obr./min i a = 300 obr./min).</li>
	<li>Umieść powlekaną płytkę na płycie grzejnej w temperaturze 95 °C, aby usunąć nadmiar rozpuszczalnika (1,5 minuty w 65 °C, 1,5 minuty w 95 °C i 1 minutę w 65 °C; najlepiej użyć dwóch płyt grzewczych).</li>
	<li>Włóż 1warstwę fotomaski (tutaj obszary pułapki reaktorów pikolitrowych) i wafel do wyrównywacza maski i wystawiaj płytkę na działanie 350-400 nm (kontakt z podciśnieniem, 64 mJ/cm², t = 3 sekundy, I = 7 mW/cm²).</li>
	<li>Przeprowadzić pieczenie po ekspozycji na płycie grzejnej w temperaturze 95 °C, aby zainicjować polimeryzację SU-8 (1 min w 65 °C, 1 min w 95 °C i 1 min w 65 °C). Uwaga: po tym kroku można zobaczyć struktury w warstwie SU-8.</li>
	<li>Umieścić wafel w kąpieli wywoływacza SU-8 na 1 minutę i przenieść go na kilka sekund do drugiego pojemnika ze świeżym wywoływaczem SU-8.</li>
	<li>Opłucz wafel w izopropanolu, aby usunąć wywoływacz SU-8 i wysusz wafel za pomocą przepływu azotu z przędzarki waflowej.</li>
	<li>Wafelek pieczemy na twardo przez 10 minut w temperaturze 150°C.</li>
	Na płytkę nanieść powłokę <li>fotorezystową 9 μm SU-8 2010 (2 warstwa) (dozować 4 ml rezystu, wirować 10 sekund z v = 500 obr./min, a = 100 obr./min i wirować 30 s z v = 4 000 obr./min, a = 300 obr./min).</li>
	<li>Umieścić wafel z SU-8 na płycie grzejnej w temperaturze 95 °C, aby usunąć nadmiar rozpuszczalnika (15 minut w 65 °C, 45-60 minut w 95 °C i 10 minut w 65 °C). Uwaga: należy zwrócić uwagę na zmarszczki i pęcherzyki. Jeśli płytka zostanie podgrzana do temperatury 95 °C, odparowany rozpuszczalnik może być zamknięty w maleńkich pęcherzykach gazu.</li>
	<li>Włóż fotomaskę o pożądanym układzie (tutaj główne kanały do dostarczania składników odżywczych) i wafel do nakładki maski i naświetl na 350-400 nm (twardy kontakt, 64 mJ/cm², t = 10 sek, I = 7 mW/cm²)</li>
	<li>Przeprowadzić pieczenie po ekspozycji na płycie grzejnej w temperaturze 95 °C, aby zakończyć polimeryzację SU-8 (5 min w 65 °C, 3:30 min w 95 °C, 3 min w 65 °C). Uwaga: po tym kroku można zobaczyć struktury w warstwie SU-8.</li>
	<li>Umieścić wafel w kąpieli wywoływacza SU-8 na 45 sekund, przenieść płytkę do drugiego pojemnika ze świeżym wywoływaczem SU-8 i wywoływać przez 60 sekund.</li>
	<li>Przepłukać wafel przez 20 sekund izopropanolem, aby usunąć wszelkie pozostałości wywoływacza SU-8 i wysuszyć wafel za pomocą sprężonego azotu.</li>
	<li>Na koniec upiecz wafelek na twardo w temperaturze 150 °C. W rezultacie uzyskuje się końcową płytkę (rysunek 1C), która zostanie wykorzystana jako forma wzorcowa do formowania PDMS.</li>
	<li>Wykonaj pomiary profilometryczne (Rysunek 3C), aby zweryfikować wysokość konstrukcji SU-8. Uwaga: niedokładności w wysokości struktury mogą skutkować nieefektywnym uwięzieniem komórek lub utratą komórek podczas hodowli.</li>
</ol>
2. Produkcja chipów z polidimetylosiloksanu
Uwaga: Wszystkie poniższe kroki powinny być idealnie wykonane w warunkach przepływu laminarnego, aby zapobiec zakłóceniu procedury produkcji przez cząsteczki pyłu (schemat blokowy procesu jest pokazany na rysunku 4).
<ol>
	<li>Przygotować mieszaninę bazy polidimetylosiloksanu (PDMS) i utwardzacza w stosunku 10:1. Dokładnie wymieszaj, aż uzyskasz jednorodny roztwór, który wygląda na nieprzezroczysty. Przygotuj tyle, ile jest to wymagane dla żądanej wysokości warstwy (tutaj 3 mm).</li>
	<li>Odgazowywać mieszaninę PDMS przez około 30 minut w lekkim podciśnieniu, aż wszystkie pęcherzyki znikną.</li>
	<li>Przygotować urządzenie formujące (lub szalkę Petriego) z odpowiednią płytką SU-8 i wlać do niej mieszaninę PDMS (rysunek 1D).</li>
	<li>Piecz PDMS przez 3 godziny w temperaturze 80 °C w piekarniku.</li>
	<li>Ostrożnie oderwij płytę PDMS od wafla. Pokrój płytę na pojedyncze wióry za pomocą czystego i ostrego skalpela.</li>
	<li>Umyj frytki w kąpieli n-pentanowej przez 90 minut, a następnie w dwóch kąpielach acetonowych (90 minut każda). Wysuszyć wióry przez noc, aby usunąć wszelkie pozostałości rozpuszczalnika. Uwaga: mycie PDMS należy wykonać pod wyciągiem. Uwaga: podczas mycia n-pentanem monomery i dimery są usuwane z utwardzonego PDMS, a rozmiar wióra może tymczasowo podwoić się podczas procedury prania.</li>
	<li>Przechowuj mikroprzepływowe chipy PDMS w zamkniętych pojemnikach do czasu końcowego eksperymentu.</li>
	<li>Tuż przed eksperymentem należy przebić otwory wlotowe i wylotowe w chipie PDMS za pomocą igły (lub dziurkacza) o nieco mniejszej średnicy niż złącza, które są używane do łączenia rurek z chipem PDMS.</li>
	<li>Ostrożnie wyczyść mikroprzepływowy chip PDMS izopropanolem i użyj taśmy klejącej, aby usunąć wszelkie cząsteczki kurzu, które mogą przykleić się do strukturalnej strony PDMS. Użyj taśmy klejącej kilka razy, aż na chipie nie będzie widać żadnych cząstek.</li>
	<li>Szkiełko podstawowe o grubości 170 μm należy czyścić kolejno acetonem i izopropanolem. Na koniec oczyść wodą dejonizowaną i osusz azotem pod ciśnieniem.</li>
	<li>Przed aktywacją plazmową należy rozgrzać myjkę plazmową i uruchomić plazmę na około 300 sek. Szkiełko proszkowane plazmowo i chip PDMS (moc 50 W, czas = 25 sekund, natężenie przepływu tlenu = 20 sccm).</li>
	<li>Wyrównaj PDMS i szklany chip przed klejeniem. Na koniec ostrożnie umieść chip PDMS na szklanym szkiełku (Rysunek 1E). PDMS i szkło połączą się w ciągu kilku sekund. Uwaga: nie należy wciskać pęsetą na górną część chipa PDMS podczas procesu łączenia. Może to prowadzić do tzw. zawalania się dachów kanałów i małych konstrukcji.</li>
	<li>W celu wzmocnienia wiązania, piecz ostatni wiór szklany PDMS przez 10 sekund w temperaturze 80 °C.</li>
</ol>
3. Przygotowanie kultury bakteryjnej
Uwaga: Wszystkie uprawy powinny być przygotowywane w sterylnym, filtrowanym podłożu, aby zapobiec gromadzeniu się niepożądanych cząstek, które mogą przeszkadzać podczas uprawy.
<ol>
	<li>Użyj płytki agarowej zawierającej pożądane organizmy (tutaj C. glutamicum ATCC 13032) i zaszczepij jedną kolonię w 20 ml świeżej pożywki BHI, inkubuj przez noc (≈ 8-14 godzin) w temperaturze 30 °C na wytrząsarce obrotowej (120 obr./min).</li>
	<li>Przenieść 10 μl kultury wstępnej do żądanego podłoża (tutaj CGXII21), które będzie używane podczas hodowli mikroprzepływowej i pozostawić komórkę na noc do wzrostu w temperaturze 30 °C na wytrząsarce obrotowej (120 obr./min).</li>
	<li>Przenieś żądaną ilość zawiesiny komórkowej (od 10 do 500 μl, w zależności od rozpoczęcia eksperymentu) do żądanej pożywki (tutaj CGXII21), która będzie używana podczas mikroprzepływowej hodowli komórek. Uwaga: najlepiej jest użyć komórek z wczesnej fazy logarytmicznej do wysiewu. Dla hodowli C. glutamicum najlepsza gęstość optyczna (OD600) do wysiewu wynosiła 0,5-2.</li>
	<li>Przenieść 1 ml kultury bakteryjnej do sterylnej probówki o pojemności 2 ml. Uwaga: należy to zrobić zaraz po zmontowaniu mikroprzepływowego chipa PDMS, aby zminimalizować czas transferu między kolbą wstrząsową a uprawą mikroprzepływową. Zazwyczaj czas transferu wynosi około 15 minut i powinien być jak najkrótszy, aby zapobiec wpływowi na metabolizm spowodowanemu ograniczeniem tlenu i zmianami temperatury.</li>
</ol>
4. Konfiguracja eksperymentalna
Uwaga: Wszystkie kroki są wykonywane za pomocą odwróconego mikroskopu.
<ol>
	<li>Uruchom inkubator mikroskopowy na 2 godziny przed eksperymentem, aby rozgrzać system. Uwaga: mikroskopia powinna być wyposażona w pełnowymiarowy inkubator do kontrolowania temperatury i, w razie potrzeby, przepływu gazu. Dodatkowa kontrola wilgotności nie jest konieczna, ponieważ system chipowy jest stale zasilany mediami.</li>
	<li>Otwórz system inkubatora, wybierz żądany cel i w razie potrzeby dodaj olejek immersyjny na obiektyw.</li>
	<li>Zamontuj chip wewnątrz uchwytu na wióry. W razie potrzeby przymocuj szklaną płytę taśmą klejącą, aby uniknąć ruchu wiórów podczas pracy stage.</li>
	<li>Wyśrodkuj próbkę na mikroskopie i skup się na matrycach PLBR.</li>
	<li>Podłącz wloty i wyloty za pomocą odpowiednich przewodów (Rysunek 1F). Podłącz rurkę do zbiornika na odpady. Reprezentatywny chip można zobaczyć na rysunku 4D.</li>
	<li>Włóż strzykawki do pomp i rozpocznij przepływ mediów. Użyć pożywki, buforu lub w razie potrzeby roztworu powlekającego i płukać kanały mikroprzepływowe przez około 1 godzinę. Uwaga: roztwór powlekający służy do powlekania ścianek kanałów, aby zapobiec niespecyficznemu przyleganiu komórek.</li>
	<li>W przypadku E. coli do pokrycia ścian kanału stosuje się 0,1% roztwór BSA. W przypadku C. glutamicum nie jest konieczne powlekanie. Po zakończeniu powlekania należy przepłukać wiór podłożem przed wysiewem komórek.</li>
	<li>Przed wysiewem i uprawą komórek sprawdź, czy nie ma wycieków i czy temperatura jest stała.</li>
</ol>
5. Wprowadzanie komórek bakteryjnych do urządzenia mikroprzepływowego
<ol>
	<li>Upewnij się, że żądane roztwory bakterii są dostępne w odpowiednich strzykawkach podłączonych do rurki.</li>
	<li>Odłącz bufor lub roztwór powlekający i podłącz zawiesinę ogniw do chipa. Aby zminimalizować objętość śmierci, niepożądane pęcherzyki powietrza i skrócić czas eksperymentu, należy wymienić całą igłę, a także rurkę, a nie tylko strzykawki.</li>
	<li>Wlej zawiesinę komórkową do kanałów z objętościowym natężeniem przepływu 200 nl/min, aż większość PLBR zostanie wypełniona żądaną ilością komórek (Figura 5A). Uwaga: optymalne wyniki siewu zależą od szczepu bakterii, OD600 i pożywki wstępnej hodowli. Parametry te muszą być dostosowane w celu zwiększenia skuteczności wychwytywania i czasu, aż wystarczająca liczba ogniw zostanie uwięziona w strukturach reaktora. W przypadku C. glutamamicum zazwyczaj stosuje się zawiesinę komórkową OD600 0,5-2; dla E. coli OD600 wynosił od 0,5-1.</li>
	<li>Jeśli napełniana jest tylko niewielka liczba PLBR, należy zwiększyć natężenie przepływu do 800-1 200 nl/min.</li>
	<li>Odłącz zawiesinę ogniw i podłącz pożywkę wzrostową do chipa (Rysunek 5B). Upewnij się, że podczas wymiany pożywki nie zostaną wprowadzone żadne pęcherzyki powietrza. Perfuzja ze świeżą pożywką wzrostową przy 100 nl/min.</li>
</ol>
6. Obrazowanie poklatkowe
<ol>
	<li>Wybierz określone PLBR do obrazowania poklatkowego. Zazwyczaj wybiera się PLBR, które zawierają pojedynczą komórkę macierzystą na początku eksperymentu. Liczba obszarów zainteresowania, które można zbadać w jednym eksperymencie, zależy od pożądanej liczby klatek na sekundę i konfiguracji mikroskopowej.</li>
	<li>Wybierz odpowiednią liczbę klatek na sekundę w zależności od liczby PLBR. Upewnij się, że mikroskop poradzi sobie z żądaną liczbą zwrotów z inwestycji w interwale poklatkowym.</li>
	<li>Wybierz odpowiednie zestawy filtrów (tutaj YFP). Automatycznie zamykaj migawkę podczas ruchu sceny i po każdym pomiarze poklatkowym, aby zapobiec wybielaniu chromoforu.</li>
	<li>Skonfiguruj sekwencję mikroskopii poklatkowej i rozpocznij eksperyment.</li>
	<li>Po przerośnięciu wszystkich PLBR eksperyment można zatrzymać, mikroprzepływowy chip PDMS można wyrzucić, a eksperyment można ocenić.</li>
</ol>
7. Analiza
Uwaga: Następujące kroki lub części procedury mogą być wykonywane ręcznie lub za pomocą programów do analizy obrazu, takich jak ImageJ, itp.
<ol>
	<li>Określ interesujące PLBR, w których hodowla spełnia wszystkie pożądane kryteria, np. liczbę komórek macierzystych, położenie komórek macierzystych itp.</li>
	<li>Aby określić tempo wzrostu jednej mikrokolonii, policz liczbę komórek w każdym przedziale czasowym.</li>
	<li>Oblicz maksymalną szybkość wzrostu, wykreślając czas w funkcji ln (liczba komórek). Nachylenie wykresu reprezentuje tempo wzrostu w [1/h] (patrz Rysunek 6).</li>
	<li>Analiza danych fluorescencyjnych jest silnie uzależniona od przeprowadzonego eksperymentu. W niniejszym raporcie wybrano przykład, aby zilustrować niejednorodność między koloniami i między komórkami między różnymi mikrokoloniami izogenicznymi (patrz rysunek 7).</li>
</ol>

<ol><li>Muzzey, D., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Time-Lapse+Fluorescence+Microscopy+in+Single+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Single Cells.</a> Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 25, 301-327 (2009).</li>
<li>Wei, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+virulence+proteins+as+tools+to+rewire+kinase+pathways+in+yeast+and+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bacterial virulence proteins as tools to rewire kinase pathways in yeast and immune cells.</a> Nature. 488, 384-388 (2012).</li>
<li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+topology+on+bacterial+social+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Influence of topology on bacterial social interaction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13910-13915 (1073).</li>
<li>Lee, P. J., Helman, N. C., Lim, W. A., Hung, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+system+for+dynamic+yeast+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">A microfluidic system for dynamic yeast cell imaging.</a> BioTechniques. 44, 91-95 (2008).</li>
<li>Kobel, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+single+stem+cells+in+microfluidic+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of single stem cells in microfluidic traps.</a> Lab Chip. 12, 2843-2849 (2012).</li>
<li>Carlo, D. D., Wu, L. Y., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+single+cell+culture+array%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Dynamic single cell culture array.</a> Lab Chip. 6, 1445-1449 (2006).</li>
<li>Locke, J. C. W., Young, J. W., Fontes, M., Jimenez, M. J. H., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+Pulse+Regulation+in+Bacterial+Stress+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stochastic Pulse Regulation in Bacterial Stress Response.</a> Science. 334, 366-369 (2011).</li>
<li>Boedicker, J. Q., Li, L., Kline, T. R., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+bacteria+and+determining+their+susceptibility+to+antibiotics+by+stochastic+confinement+in+nanoliter+droplets+using+plug-based+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Detecting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics by stochastic confinement in nanoliter droplets using plug-based microfluidics.</a> Lab Chip. 8, 1265-1272 (2008).</li>
<li>Fritzsch, F. S. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picoliter+nDEP+traps+enable+time-resolved+contactless+single+bacterial+cell+analysis+in+controlled+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Picoliter nDEP traps enable time-resolved contactless single bacterial cell analysis in controlled microenvironments.</a> Lab Chip. 13, 397-408 (2013).</li>
<li>Groisman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+chemostat+for+experiments+with+bacterial+and+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic chemostat for experiments with bacterial and yeast cells.</a> Nat. Methods. 2, 685-689 (2005).</li>
<li>Mather, W., Mondragon-Palomino, O., Danino, T., Hasty, J., Tsimring, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streaming+Instability+in+Growing+Cell+Populations%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Streaming Instability in Growing Cell Populations.</a> Phys. Rev. Lett. 104, (2010).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+growth+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Robust growth of Escherichia coli.</a> Curr. Biol. 20, 1099-1103 (2010).</li>
<li>Grunberger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+disposable+picolitre+bioreactor+for+cultivation+and+investigation+of+industrially+relevant+bacteria+on+the+single+cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A disposable picolitre bioreactor for cultivation and investigation of industrially relevant bacteria on the single cell level.</a> Lab Chip. 12, 2060-2068 (2012).</li>
<li>Walden, M., Elf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+transcriptional+interactions+in+single+cells+at+sufficient+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Studying transcriptional interactions in single cells at sufficient resolution.</a> Curr. Opin. Biotech. 22, 81-86 (2011).</li>
<li>Keymer, J. E., Galajda, P., Lambert, G., Liao, D., Austin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computation+of+mutual+fitness+by+competing+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Computation of mutual fitness by competing bacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20269-20273 (2008).</li>
<li>Keymer, J. E., Galajda, P., Muldoon, C., Park, S., Austin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+metapopulations+in+nanofabricated+landscapes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17290-17295 (2006).</li>
<li>Grunberger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+growth+rate+0.6%3A+Corynebacterium+glutamicum+cultivated+in+highly+diluted+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Beyond growth rate 0.6: Corynebacterium glutamicum cultivated in highly diluted environments.</a> Biotechnol. Bioeng. 110, 220-228 (2013).</li>
<li>Binder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+approach+to+identify+genomic+variants+of+bacterial+metabolite+producers+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">A high-throughput approach to identify genomic variants of bacterial metabolite producers at the single-cell level.</a> Genome Biol. 13, (2012).</li>
<li>Mustafi, N., Grunberger, A., Kohlheyer, D., Bott, M., Frunzke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+application+of+a+single-cell+biosensor+for+the+detection+of+L-methionine+and+branched-chain+amino+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Metab.+Eng%22%5BJournal%5D)">The development and application of a single-cell biosensor for the detection of L-methionine and branched-chain amino acids.</a> Metab. Eng. 14, 449-457 (2012).</li>
<li>Huber, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robo-Lector+-+a+novel+platform+for+automated+high-throughput+cultivations+in+microtiter+plates+with+high+information+content%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Robo-Lector - a novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content.</a> Microb. Cell Fact. 8, (2009).</li>
<li>Keilhauer, C., Eggeling, L., Sahm, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoleucine+synthesis+in+Corynebacterium+glutamicum%3A+molecular+analysis+of+the+ilvB-ilvN-ilvC+operon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Isoleucine synthesis in Corynebacterium glutamicum: molecular analysis of the ilvB-ilvN-ilvC operon.</a> J. Bacteriol. 175, 5595-5603 (1993).</li>
<li>Frunzke, J., Bramkamp, M., Schweitzer, J. E., Bott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+Heterogeneity+in+Corynebacterium+glutamicum+ATCC+13032+caused+by+prophage+CGP3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Population Heterogeneity in Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 caused by prophage CGP3.</a> J. Bacteriol. 190, 5111-5119 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisaliśmy wytwarzanie, konfigurację eksperymentalną i powiązane procedury operacyjne mikroprzepływowego urządzenia PDMS zawierającego kilka (PLBR) do analizy pojedynczych komórek bakterii.
Mikrofabrykacja z wykorzystaniem technik miękkiej litografii pozwala na szybkie dostosowanie wymiarów urządzenia do różnych rozmiarów i morfologii bakterii. Obecnie optymalizujemy bioreaktor pikolitrowy pod kątem hodowli różnych organizmów mikrobiologicznych i przepustowości uprawy. W celu zwiększenia wydajności odłowu, optymalizowana jest również geometria reaktora. Rysunek 8 przedstawia cztery nowe urządzenia PLBR, które są obecnie walidowane. Na wszystkich rysunkach kanał wysiewający został przeprojektowany pod względem szerokości i kształtu. W praktyce wydaje się, że ma to wpływ na liczbę uwięzionych komórek, ale wymaga dalszych badań. Znaczną poprawę w zakresie skuteczności odłowu osiągnięto również dzięki zastosowaniu dodatkowych kanałów przelewowych, co doprowadziło do zwiększenia przepływu konwekcyjnego przez reaktor i uwięzienia większej liczby komórek. Jednak jednocześnie zwiększa się ryzyko wypłukania komórek podczas hodowli.
Urządzenie stanowi ciekawą alternatywę dla upraw w makroskali, które są wykorzystywane od dziesięcioleci do badania procesów wzrostu i produkcji na poziomie pojedynczych komórek. Ma jednak kilka ważnych wymagań: do równoległego monitorowania kilku bioreaktorów pikolitrowych obowiązkowa jest w pełni zmotoryzowana konfiguracja mikroskopowa o wysokiej rozdzielczości z kompensacją dryfu ostrości. Ponadto potrzebny jest system inkubacji, aby utrzymać pożądaną temperaturę uprawy na stałym poziomie przez cały czas trwania pomiarów.
Osiągamy 95% wskaźnik sukcesu w produkcji urządzeń. Główne problemy są związane z nieefektywnym klejeniem PDMS ze szkłem, zawaleniem się dachu PDMS lub wyciekiem płynu (patrz Tabela 1 , aby zapoznać się z rozwiązywaniem najczęściej występujących problemów). Chociaż prace eksperymentalne są wykonywane częściowo w warunkach niesterylnych, rzadko obserwujemy zanieczyszczenie podczas eksperymentów, ze względu na zamknięty układ płynowy. Urządzenia mikroprzepływowe PDMS są optycznie przezroczyste, dlatego mogą być używane do obrazowania in vivo o wysokiej rozdzielczości. Chociaż PDMS wydaje się być idealny do tego zastosowania, ma wysokie powinowactwo do cząsteczek hydrofobowych, co sprawia, że stosowanie rozpuszczalników, które są szeroko stosowane w procesach biokatalitycznych całych komórek, jest ograniczone. Dostępne są jednak odpowiednie powłoki, które pozwalają dostosować protokół do tego rodzaju zastosowań.
Proponowany PLBR doskonale nadaje się do czasoprzestrzennej analizy zdarzeń komórkowych, a nawet subkomórkowych różnych rodzajów bakterii. Główną zaletą obecnego podejścia jest możliwość bezpośredniego ilościowego określenia wzrostu mikrokolonii w przeciwieństwie do metod konwencjonalnych. Ponadto PLBR pozwala na hodowlę w określonych i stałych warunkach. Ponieważ system ułatwia użycie niewielkich ilości odczynników lub materiałów, ma tę zaletę, że jest niedrogi, konfigurowalny i podatny na wysoką przepustowość. W tradycyjnych metodach przy analizie hodowli drobnoustrojów uwzględnia się średnie wartości dla całej populacji. Ponadto istniejące metody wymagają ręcznego pobierania próbek, co może prowadzić do degradacji próbek, a tym samym do błędów w pomiarze. PLBR oferuje nowe perspektywy rozwoju bioprocesów i analizy heterogeniczności populacji w mikrobiologii. PLBR jest obiecującym narzędziem do różnych zastosowań w rozwoju bioprocesów i może być stosowany w różnych dziedzinach badań, np. w analizie heterogeniczności między komórkami, analizie określonych klastrów komórkowych w obrębie linii komórkowych, badaniach przesiewowych szczepów produkcyjnych drobnoustrojów i badaniu fenotypów komórek w czasie rzeczywistym.

Mikroskopia poklatkowa to potężne narzędzie do badania żywych komórek in vivo1. Tymczasem dostępne na rynku, w pełni zautomatyzowane platformy mikroskopowe, w tym termicznie indukowana kompensacja dryfu ogniska, są powszechnie stosowane w badaniach biologicznych do badania zjawisk zależnych od czasu, począwszy od badań nad rakiem i komórkami neuronalnymi, poprzez inżynierię tkankową, aż po badania dynamiczne z pojedynczymi komórkami drożdży lub bakterii2-6.
Zazwyczaj stosuje się przezroczyste płytki dołkowe, podkładki agarowe lub po prostu szkiełka mikroskopowe, aby zapewnić środowisko hodowli komórkowej podczas obrazowania poklatkowego7. Mimo że te proste systemy nadają się do niektórych badań, mają bardzo ograniczoną kontrolę nad warunkami środowiskowymi i nie pozwalają na bardziej złożone perturbacje lub dobrze zdefiniowane i szybkie zmiany ośrodka. Jednorazowe chipy mikroprzepływowe produkowane w masowej produkcji zostały niedawno wprowadzone na rynek, ale są one w większości dostosowane do większych typów komórek eukariotycznych4. Chociaż wzrost można śledzić, dobrze zdefiniowane badania wzrostu dotyczące np. precyzyjnego wychwytywania komórek, wielkości kolonii, kierunku wzrostu i zdolności do usuwania komórek są ograniczone. Siedliska mikroprzepływowe i reaktory, w których komórki bakteryjne są hodowane w środowiskach 3D, zostały opracowane8-10, mają wady, gdy mamy do czynienia z badaniami ilościowymi na poziomie pojedynczej komórki. Chociaż można analizować ogólną heterogeniczność populacji, wielu parametrów komórek nie można dokładnie określić w rozdzielczości pojedynczej komórki, ponieważ wzrost nie jest ograniczony do monowarstw.
To ograniczenie spowodowało rozwój mikrosystemów umożliwiających hodowlę komórek w dobrze zdefiniowanych kanałach i siedliskach, z komórkami rosnącymi w płaskich monowarstwach z rozdzielczością pojedynczej komórki i szczególnie ścisłą kontrolą nad dostarczaniem pożywki i warunkami środowiskowymi6,11,12. Pokazano kilka przykładów systemów mikroprzepływowych do hodowli komórek bakteryjnych12-14. Bakterie zazwyczaj wykazują bardzo szybkie tempo wzrostu i wymagają struktur mikroprzepływowych w zakresie kilku mikrometrów i poniżej, zwłaszcza gdy do mikroskopii pożądane są monowarstwy komórek. Keymer i wsp. wykazano wzrost i rozprzestrzenianie się szczepów E. coli w mikrofabrykowanych krajobrazach15,16. Ponieważ interesowała ich dynamika populacji, nie prowadzili badań z rozdzielczością pojedynczych komórek.
Opracowaliśmy bioreaktor pikolitrowy (PLBR)13, który jest obecnie stosowany do badania różnych wskaźników wydajności biotechnologicznej, takich jak wzrost17 i analiza produktywności sprzężonej z fluorescencją na poziomie pojedynczej komórki18,19. Obecne urządzenie mikroprzepływowe umożliwia sterowanie reaktorem środowiskowym przy określonej objętości hodowli wynoszącej około jednego pikolitra i ciągłą obserwację pojedynczych komórek jednocześnie. W porównaniu z otwartymi jednowarstwowymi systemami skrzynkowymi11,14, w których jedna lub dwie strony są otwarte na kanał doprowadzający pożywkę, PLBR pozwala na kontrolowane odłowy i hodowlę. Konstrukcja pozwala na długotrwałą hodowlę bakterii bez ryzyka, że kilka sąsiadujących ze sobą kolonii utworzy jedną dużą populację. Ponadto system obejmuje obszary hodowli o wysokości 1 μm (w kolejności średnicy komórki), aby ograniczyć wzrost bakterii do monowarstw komórkowych. Natomiast kanały zasilające są 10 razy głębsze, aby zminimalizować opór hydrauliczny.
W porównaniu do zminiaturyzowanych systemów uprawy wsadowej20, obecny system pozwala na uprawę o stałych parametrach środowiskowych dzięki ciągłemu przepływowi pożywki. Co więcej, parametry środowiskowe, takie jak skład medium, temperatura, natężenie przepływu i wymiana gazowa, można łatwo kontrolować i zmieniać w ciągu kilku sekund. Pozwala to na szczegółowe badania odpowiedzi komórek na zmiany środowiskowe, dotyczące np. dostępności składników odżywczych czy bodźców stresowych. Zapotrzebowanie na zmniejszone objętości pożywek, a mianowicie w zakresie zaledwie kilku mikrolitrów, umożliwia naukowcom przeprowadzanie nowatorskich badań, np. zaburzeń komórek podczas obrazowania poklatkowego z supernatantem w eksperymentach na dużą skalę odkrywających odpowiedź komórki w tych specyficznych warunkach środowiskowych17. Bioreaktor pikoliterowy zapewnia naukowcom solidny system, który ściśle kontroluje warunki biofizyczne i jest obsługiwany przy użyciu precyzyjnych pomp strzykawkowych oraz zautomatyzowanej mikroskopii jasnego pola i mikroskopii fluorescencyjnej do obrazowania poklatkowego. W tym miejscu przedstawiamy kompletny protokół, w tym projekt urządzenia, produkcję i przykładowe zastosowania.

<table><tbody><tr><td>Płytka krzemowa o średnicy 100 mm, P/BOR < 100></td><td>Si-MAT, Materiały silikonowe, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photoresist SU-8 2000.5</td><td>Micro Resist Technology GmbH, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photoresist SU-8 2010</td><td>Micro Resist Technology GmbH, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Projektant SU-8 Pan DEV- 600</td><td>Micro Resist Technology GmbH, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw polidimetylosiloksanu (PDMS) Sylgard 184 Zestaw</td> <td>elastomerów silikonowychDow Corning; Farnell GmbH, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igły dozujące Precyzyjne końcówki&nbsp; 27 g; ID = 0,2 mm, OD = 0,42 mm</td><td>Nordson EFD Deutschland, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płytki szklane D263 T eco, 30 mm x 25 mm x 0,17 mm</td><td>Schott AG, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dziurkacz AKA 5130-B-90</td><td>Harris Uni-Core</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubing Tygon S-54-HL, ID = 0,25 mm, OD = 0,76 mm</td><td>Saint Gobain; VWR International GmbH, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki jednorazowe &ndash; Omnifix Spritzen BRAUN Omnifix 40 Duo, 1 ml</td><td>B. Braun Melsungen AG, Niemcy</td><td>552-183143</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki, 1 ml sterylne szklane strzykawki</td><td>INNOVATIVE LABOR SYSTEME GMBH (ILS), Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Chemicals</td></tr><tr><td>(NH4)2SO4</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&bull; 7H2O</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FeSO4&bull; 7H2O</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MnSO4&bull; H2O</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4&bull; 7H2O</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CuSO4</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NiCl2&bull; 6H2O</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotyna</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas prokatechowy</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jednowodny glukozy</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BHI</td><td>Becton, Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Komórki</td></tr><tr><td>Corynebacterium glutamicum ATTC 13032</td><td>DSMZ; Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli MG 1655</td><td>DSMZ; Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Wafer Cleaner SSEC 3300</td><td>Solid State Equipment LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spin Coater SPIN150 -NPP</td><td>SPS Europe B.V.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mask Aligner MA-6</td> Karl <td>Suess</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płyta grzejna HP30A - 2</td> Piec laboratoryjny <td>Torrey Pines</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Memmert UN 200</td> Myjka plazmowa <td>Memmert</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FEMTO</td><td>Diener Electronics, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompy strzykawkowe neMESYS</td><td>Cetoni GmbH, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne CB 162</td><td>Stuart</td><td>VWR 442-0304</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Nikon Eclipse Ti</td><td>Mikroskopia Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator mikroskopowy</td><td>Pecon GmbH, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka minispin plus " linia"</td><td>Eppendorf</td><td>9776501</td><td></td></tr><tr><td>Fotometr BioPhotometer plus&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>6132000008</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsaczka/inkubator do wytrząsania kolb 3031</td><td>GFL - Gesellschaft f&uuml; r Labortechnik mbH, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Profilometr, Dektak 150 Stylus Profiler</td><td>Veeco</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mikroprzepływowy bioreaktor pikoliterowy do analizy mikrobiologicznej pojedynczych komórek: produkcja, konfiguracja systemu i obsługa

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

W tym protokole szczegółowo opisano produkcję, eksperymentalną konfigurację i podstawowe działanie niedawno wprowadzonego mikroprzepływowego bioreaktora pikoliterowego (PLBR). PLBR może być wykorzystany do analizy pojedynczych bakterii i mikrokolonii w celu zbadania kwestii biotechnologicznych i mikrobiologicznych dotyczących np. wzrostu komórek, morfologii, reakcji na stres oraz produkcji metabolitów lub białek na poziomie pojedynczej komórki. Urządzenie charakteryzuje się ciągłym przepływem mediów, co zapewnia stałe warunki środowiskowe do badań perturbacji, ale dodatkowo umożliwia szybką zmianę medium, a także warunki oscylacyjne, aby naśladować dowolną pożądaną sytuację środowiskową. Aby wytworzyć urządzenia jednorazowego użytku, płytka krzemowa zawierająca struktury SU-8 o rozmiarach submikrometrowych posłużyła jako forma replikacyjna do szybkiego odlewania polidimetylosiloksanu. Chipy zostały pocięte, złożone, połączone i umieszczone w wysokiej rozdzielczości, w pełni zautomatyzowanym mikroskopie przystosowanym do obrazowania poklatkowego, które jest potężnym narzędziem do czasoprzestrzennej analizy komórek. W tym przypadku organizm platformy biotechnologicznej Corynebacterium glutamicum został zasiew do PLBR, a wzrost komórek i fluorescencja wewnątrzkomórkowa były śledzone przez kilka godzin, odkrywając zależną od czasu heterogeniczność populacji na poziomie pojedynczej komórki, co nie jest możliwe przy użyciu konwencjonalnych metod analizy, takich jak cytometria przepływowa. Oprócz wglądu w produkcję urządzeń, zademonstrowano przygotowanie hodowli wstępnej, ładowanie, wychwytywanie bakterii oraz hodowlę pojedynczych komórek i kolonii metodą PLBR. Urządzenia te dodadzą nowy wymiar w badaniach mikrobiologicznych do analizy zależnych od czasu zjawisk pojedynczych bakterii pod ścisłą kontrolą środowiska. Ze względu na prosty i stosunkowo krótki proces produkcji, technologia może być łatwo zaadaptowana w każdym laboratorium mikrofluidycznym i po prostu dostosowana do konkretnych potrzeb.

Wytwarzanie urządzenia
Mikrofluidyczny system PLBR jest wytwarzany poprzez połączenie jednej warstwy PDMS z cienkim szklanym chipem przystosowanym do mikroskopii o wysokiej rozdzielczości. Proces wytwarzania składa się z dwóch głównych etapów: po pierwsze, wykonania matrycy replikacyjnej (ryc. 1A, 1B i 1C), a po drugie, wykonania chipa (ryc. 1D, 1E i 1F). Zgodnie z protokołem, do stworzenia formy matrycowej wykorzystuje się standardowe techniki fotolitograficznego mikrofabrykowania. Laboratoria nieposiadające zaplecza typu clean room mogą nabyć komercyjnie dostępne, dostosowane matryce SU-8. Dzięki wielokrotnemu odlewnictwu z PDMS (ryc. 1A, 1B i 1C) można wyprodukować setki jednorazowych chipów. Odlewanie z PDMS oraz montaż chipa mogą być przeprowadzane w każdym laboratorium i nie wymagają zaplecza clean room, choć zaleca się stosowanie stanowisk z laminarnym przepływem powietrza.
Proces rozpoczyna się od zaprojektowania systemu chipu mikrofluidycznego. Do projektowania chipu mikrofluidycznego zazwyczaj wykorzystuje się oprogramowanie CAD (Rysunek 1A). Po etapie CAD za pomocą litografii wiązką elektronów (e-beam writer) generowana jest maska o rozdzielczości submikronowej (Rysunek 1B). W niniejszym badaniu stworzono maskę chromową o grubości 5 nm, która została wykorzystana do litografii wafla SU-8. Końcowy wafel krzemowo-SU-8 służy do formowania PDMS (Rysunek 1D). Po etapie wypalania płyta PDMS jest cięta na chipy, które są nieodwracalnie wiązane z szkiełkami przedmiotowymi (Rysunek 1E). Na koniec podłączane są rurki (Rysunek 1F).
Rycina 2 przedstawia szczegółową budowę układu mikroprzepływowego. Składa się on z dwóch wlotów do wysiewu, generatora gradientu do mieszania różnych podłoży lub mediów oraz jednego wylotu. Główne kanały mają wymiary 50 µm x 10 µm (S x W). Każde urządzenie składa się z sześciu macierzy PLBR, z których każda zawiera 5 PLBR. Daje to łącznie 30 zrównoleglonych reaktorów wewnątrz jednego urządzenia mikroprzepływowego.
Rysunek 3 przedstawia produkcję matrycy do replikacji. Zgodnie ze szczegółowym opisem w protokole, pierwsza warstwa SU-8 jest wytwarzana za pomocą litografii SU-8 (Rysunek 3A). Analogiczna procedura jest stosowana w przypadku drugiej warstwy (Rysunek 3B). Aby sprawdzić geometrię kanałów, zbadano wysokość PLBR oraz kanałów głównych przy użyciu profilometru. Na przykładzie pokazanym na Rysunku 3C zmierzono pierwszą warstwę (warstwę hodowlaną). Wykazuje ona tutaj stałą wysokość 1 200 nm, odpowiednią do hodowli C. glutamicum w pożywce BHI.
Rysunek 4 przedstawia procedurę formowania z PDMS, rozpoczynając od mieszania PDMS (Rysunek 4A), następnie proces formowania (Rysunek 4B) i kończąc na etapie wiązania (Rysunek 4C). Rysunek 4D przedstawia gotowy chip mikrofluidyczny zawierający szklaną płytkę o grubości 170 µm, chip z PDMS (o wysokości 3 mm) z wlotami i wylotami oraz stalowe igły połączone z rurkami. Po zakończeniu eksperymentu chip można wyrzucić i nie jest wymagane gruntowne czyszczenie. Ponadto jest on łatwy w montażu i obsłudze. Nie jest konieczna skomplikowana i trudna procedura napełniania.
Zasada działania urządzenia
Rysunek 5 przedstawia zasadę działania systemu reaktora. Komórki są wprowadzane do urządzenia mikroprzepływowego, a poszczególne komórki zostają uwięzione wewnątrz PLBR dzięki oddziaływaniom ze ścianami. Ze względu na różnicę w oporze hydrodynamicznym kanału i PLBR, wewnątrz PLBR występuje jedynie minimalny przepływ. Po zasiewie PLBR (Rysunek 5A), fazę wzrostu i obserwacji rozpoczyna się poprzez zmianę roztworu bakterii na pożywkę wzrostową (Rysunek 5B). Gdy PLBR zostaną całkowicie przerostem (Rysunek 5C), eksperyment jest zazwyczaj kończony, a obrazy time-lapse mogą zostać poddane analizie. W celu uzyskania szczegółowych informacji na temat mechanizmów uwięzienia i profilu przepływu wewnątrz PLBR, czytelnika odsyła się do pracy Grünberger et al.13 .
Analiza szybkości wzrostu
Obecny system można zastosować do badania różnych gatunków bakterii pod kątem różnych parametrów biologicznych, takich jak wzrost, morfologia lub sygnał fluorescencyjny. W pierwszym przykładzie C. glutamicum, organizm produkcyjny istotny przemysłowo, był hodowany w standardowych warunkach hodowli (T=30 °C, medium CGXII21). Rysunek 6A przedstawia krzywe wzrostu uzyskane z trzech izogenicznych mikrokolonii. Wzrost wykładniczy jest utrzymywany aż do wypełnienia PLBR, co wskazuje na brak ograniczeń w dostępie do składników odżywczych. Rysunek 6B prezentuje cztery obrazy z mikroskopii poklatkowej DIC rosnącej kolonii C. glutamicum.
Analiza fluorescencji
W przypadku mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych komórek badacze często wykorzystują specyficzne białka fluorescencyjne, na przykład GFP lub ich pochodne, aby powiązać konkretny interesujący fenotyp z mierzalnym wynikiem (sygnałem fluorescencyjnym). Aby zademonstrować przydatność PBLR do badań time-lapse opartych na fluorescencji, zbadaliśmy emisję fluorescencji szczepu C. glutamicum produkującego kodowane plazmidowo białko fuzyjne YFP-TetR pod kontrolą promotora Ptac (pEKEx2-yfp-tetR)18,22. W obecności niskich stężeń induktora (IPTG) wiadomo, że ekspresja z Ptac prowadzi do znacznej zmienności międzykomórkowej w izogenicznych populacjach bakteryjnych. Wykorzystując jedną prekulturę, śledzono wzrost i fluorescencję pojedynczych komórek w kilku izogenicznych mikrokoloniach. Jak widać na Rysunku 7, zaobserwowano heterogeniczność fenotypową pomiędzy różnymi mikrokoloniami oraz heterogeniczność na poziomie pojedynczych komórek w obrębie kolonii wywodzących się od jednej komórki macierzystej. Jedna kolonia (Rysunek 7B, PLBR 1) nie wykazywała niemal żadnej emisji fluorescencji, podczas gdy komórki PLBR 2 wykazywały niską emisję fluorescencji wynikającą z bazowej ekspresji yfp-tetR z promotora Ptac. W przypadku PLBR 3 emisja fluorescencji była znacznie silniejsza w porównaniu z innymi koloniami i zaobserwowano szeroki rozkład populacji. Przykład ten demonstruje przydatność PBLR do badań mikroskopii fluorescencyjnej time-lapse. W porównaniu z cytometrią przepływową, w której fluorescencję pojedynczych komórek można określić w jednym punkcie czasowym, obecny system pozwala na śledzenie komórek i badanie fluorescencji pojedynczych komórek w czasie rzeczywistym przez wiele pokoleń.
<img alt="Schemat procesu produkcji mikrochipów z etapami projektowania, maskowania, produkcji wafla, formowania, wiązania i montażu." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50560/50560fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50560/50560fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Przegląd procesu produkcji chipów PLBR. Wytwarzanie formy matki: rozpoczynając od (A) Projektowania, (B) Wytwarzania maski litograficznej oraz (C) Produkcji wafla. Produkcja chipów PDMS-szkło: rozpoczynając od (D) Formowania PDMS, a następnie (E) Wiązania szkła i PDMS oraz (F) Końcowego montażu chipa.
<img alt="Schematy chipa mikrofluidycznego z opisanymi kanałami przepływu, stosowanego w badaniach nad separacją i analizą komórek." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50560/50560fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50560/50560fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Konstrukcja chipa PLBR. (A) Rysunek CAD całego chipa mikrofluidycznego; (B) Powiększenie wybranych pozycji układu: Układ zawiera dwa wloty medium (a1), generator gradientu z kanałami mieszania (a2) oraz 6 równoległych macierzy PLBR (b1). b2 przedstawia pojedynczy PLBR, który jest osadzony w kanale płynnym o szerokości 100 µm. PLBR ma średnicę wewnętrzną 40 µm oraz kanały odżywcze o szerokości 2 µm. Wlot do zasiewu ma długość 40 µm. Kolor różowy reprezentuje pierwszą warstwę (obszar wychwytywania i hodowli), a kolor niebieski reprezentuje drugą warstwę (transport płynu).
<img alt="Schemat procesu mikrofabrykacji z etapami fotolitografii SU-8 oraz wynikami pomiarów wysokości." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50560/50560fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50560/50560fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Ilustracja procesu dwuwarstwowej fabrykacji wafla. (A) Fabrykacja pierwszej warstwy zawierającej struktury pułapkowe; (B) Fabrykacja drugiej warstwy zawierającej kanały płynowe, wloty i wyloty; (C) Reprezentatywne profile powierzchni pierwszej warstwy. W tym przypadku wysokość pierwszej warstwy wynosiła 1,200 nm i została ona wykorzystana do hodowli C. glutamicum w pożywce złożonej.
<img alt="Schemat procesu formowania PDMS; architektura chipa mikrofluidycznego z warstwami SU8, PDMS i szkła; wloty/wyloty." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50560/50560fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50560/50560fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Wytwarzanie urządzenia i reprezentatywny chip. Ilustracja procesu formowania PDMS: (A) mieszanie i odpowietrzanie PDMS; (B) formowanie PDMS; (C) uwalnianie z formy, wycinanie i bonding chipa. Finalny chip (Reprodukowano za zgodą Royal Society of Chemistry13): (D) fotografia chipa PDMS z 2 wlotami i 1 wylotem; (E) obraz CAD sześciu równoległych macierzy zawierających po 5 PLBR; (F) obraz SEM jednego PLBR.
<img alt="Wzrost bakterii w urządzeniu mikrofluidycznym; kanały przepływu laminarnego; układ PDMS; kanały przelewowe i zasilające." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50560/50560fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50560/50560fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Zasada działania systemu PLBR. (A) Faza zasiewania; (B) Faza wzrostu mikrokolonii bakteryjnych; (C) Faza przelewania. Powielono za zgodą Royal Society of Chemistry13. <a href="http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H">http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H</a>.
<img alt="Wykres wzrostu komórek z obrazami mikroskopowymi drobnoustrojów; równania analizy tempa wzrostu i wyniki." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50560/50560fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50560/50560fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6. Wyznaczanie tempa wzrostu mikrokolonii C. glutamicum WT. (A) Wykres wzrostu trzech hodowli PLBR i wynikające z nich krzywe wykładnicze (części reprodukowane za zgodą Royal Society of Chemistry)13. <a href="http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H">http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H</a>. (B) Obrazy time-lapse z rosnącej kolonii C. glutamicum.
<img alt="Schemat procesu hodowli mikrobowej z danymi fluorescencyjnymi; eksperyment przedstawia wzrost i analizę komórek." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50560/50560fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50560/50560fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7. Analiza heterogeniczności populacji oparta na PBLR. Przedstawiono szczep C. glutamicum wykazujący ekspresję fuzji yfp-tetR pod kontrolą promotora Ptac (pEKEx2-yfp-tetR) w obecności induktora IPTG. (A) Schemat procedury eksperymentalnej; (B) Trzy izogeniczne mikrokolonie wykazujące heterogeniczność międzykolonialną oraz heterogeniczność międzykomórkową; (C) Rozkład fluorescencji pojedynczych komórek w odpowiednich mikrokoloniach.
<img alt="Obraz mikroskopowy porównujący mikrostruktury z różnymi wlotami zasiewu do analizy materiałowej." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50560/50560fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50560/50560fig8.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 8"> 
Rysunek 8. Obrazy z powychowego mikroskopu elektronowego różnych PLBR.** Obrazy SEM przedstawiające wloty zasiewu w celu optymalizacji wydajności wychwytywania. (A) Większe wloty zasiewu (B) Mniejsze wloty zasiewu (C) Większe „otwarte” wloty zasiewu (D) Dwa wloty zasiewu.
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1276">
	<colgroup>
		<col span="4">
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td>Krok</td>
			<td>Problem</td>
			<td>Możliwa przyczyna</td>
			<td>Roztwór</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Produkcja wafli krzemowych</td>
			<td>Uwięzione pęcherzyki powietrza w SU-8 podczas wstępnego wypiekania</td>
			<td>Zbyt szybki wzrost temperatury</td>
			<td>Piec w temperaturze 95 °C i 65 °C kilka razy</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Produkcja wafli krzemowych</td>
			<td>Znikające i uszkodzone struktury z SU-8</td>
			<td>Nieoptymalna procedura wykonania; naprężenia mechaniczne w strukturach z SU-8</td>
			<td>Optymalizacja parametrów, takich jak czas wypiekania, czas ekspozycji</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Wytwarzanie wafli krzemowych</td>
			<td>Warstwy SU-8 zbyt cienkie, zbyt grube lub o nierównomiernej grubości</td>
			<td>Problem podczas nanoszenia warstwy metodą spin coatingu</td>
			<td>Sprawdź parametry urządzenia do nanoszenia warstw wirowych oraz uchwyt wafla</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bondowanie i montaż chipów </td>
			<td>Kollaps PLBR</td>
			<td>Parametry wiązania PDMS nie są optymalne </td>
			<td>Dostosuj moc, czas ekspozycji na plazmę oraz czas wygrzewania po procesie wiązania.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bondowanie i montaż układów scalonych</td>
			<td>Zanieczyszczenia strukturalne i cząstki w PLBRach</td>
			<td>Chip nie został odpowiednio oczyszczony</td>
			<td>Zastosuj taśmę klejącą do oczyszczenia powierzchni </td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Łączenie i montaż układów scalonych</td>
			<td>Niewystarczające wiązanie PDMS-szkło</td>
			<td>Nieoptymalne parametry wiązania lub niewystarczające oczyszczenie </td>
			<td>Sprawdź ustawienia plazmy tlenowej</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eksperyment mikrofluidyczny</td>
			<td>Wyciek płynu</td>
			<td>Otwór wlotowy/wylotowy nie został prawidłowo wykonany </td>
			<td>Optymalizacja procesu dziurkowania</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eksperyment mikroprzepływowy</td>
			<td>Wiele małych cząstek PDMS podczas napełniania</td>
			<td>Otwór nie został prawidłowo wykonany </td>
			<td>Optymalizacja procesu wybijania otworów</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Eksperyment mikrofluidyczny, aspekt biologiczny</td>
			<td>Brak wzrostu komórek</td>
			<td>Pozostałości rozpuszczalnika po procedurze czyszczenia</td>
			<td>Należy dokładniej przepłukać chip przed załadowaniem komórek lub pozwolić rozpuszczalnikowi odparować przed procesem wiązania.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eksperyment mikroprzepływowy, aspekt biologiczny</td>
			<td>Zmiana tempa wzrostu</td>
			<td>Różne przyczyny</td>
			<td>Sprawdzenie prekultury i temperatury</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eksperyment mikrofluidyczny, aspekt biologiczny</td>
			<td>Zmiany morfologii komórek podczas hodowli</td>
			<td>Ograniczenia składników odżywczych lub zmiana temperatury</td>
			<td>Sprawdź inkubator i przepływ</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eksperyment mikrofluidyczny, aspekty techniczne</td>
			<td>Dryft pozycji podczas mikroskopii pokadrowej (time-lapse)</td>
			<td>Wahania temperatury</td>
			<td>Sprawdź profil temperatury przed rozpoczęciem eksperymentów, aż do ustąpienia oscylacji</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eksperyment mikroprzepływowy, aspekty techniczne</td>
			<td>Utrata komórek podczas hodowli</td>
			<td>Nieco powyżej wysokości reaktora </td>
			<td>Optymalizacja wysokości reaktora</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eksperyment mikroprzepływowy, aspekty techniczne</td>
			<td>Brak pułapkowania</td>
			<td>Zbyt mała wysokość reaktora </td>
			<td>Optymalizacja wysokości reaktora</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Rozwiązywanie problemów. Tabela ta podsumowuje krytyczne aspekty, częste błędy i możliwe rozwiązania podczas pracy eksperymentalnej.

W tym protokole przedstawiono produkcję, konfigurację i podstawowe działanie mikroprzepływowego bioreaktora pikolitrowego (PLBR) do analizy pojedynczych komórek mikroorganizmów prokariotycznych. Mikroorganizmy istotne z przemysłowego punktu widzenia zostały przeanalizowane jako dowód zasadności, co pozwoliło na wgląd w tempo wzrostu, morfologię i niejednorodność fenotypową w określonych okresach czasu, co jest prawie niemożliwe przy użyciu konwencjonalnych metod.

Mikroprzepływowy bioreaktor pikoliterowy do analizy mikrobiologicznej pojedynczych komórek: produkcja, konfiguracja systemu i obsługa

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest analiza pojedynczych bakterii oraz ewoluujących izogenicznych mikrokolonii z pełną rozdzielczością przestrzenną i czasową w stałych warunkach środowiskowych przy użyciu mikrofluidycznego urządzenia do hodowli. Cel ten zostaje osiągnięty poprzez zaprojektowanie systemu hodowli mikrofluidycznej w oprogramowaniu CAD. Następnie z polidimetylosiloksanu wykonuje się jednorazowe urządzenia do hodowli mikrofluidycznej zawierające bioreaktory pikolitrowe o wysokości jednego mikrona, co ogranicza wzrost bakterii do jednej warstwy.Następnie do urządzenia mikrofluidycznego wprowadza się kulturę mikroorganizmów w celu inokulacji pojedynczych komórek macierzystych wewnątrz bioreaktorów. Komórki te są namnażane poprzez ciągłe wprowadzanie pożywki wzrostowej do systemu. Wyniki uzyskano dzięki zautomatyzowanej mikroskopii poklatkowej, obrazującej hodowlę przemysłowo istotnego szczepu Corynebacterium glutamicum, dane dotyczące wzrostu oraz heterogeniczność międzykomórkową.W konwencjonalnej biotechnologii większość analiz opiera się na danych uśrednionych. Nasze urządzenie mikrofluidyczne umożliwia analizę pojedynczych komórek poszczególnych bakterii z rozdzielczością przestrzenną i czasową. Jest to użyteczne narzędzie do szczegółowego badania heterogeniczności międzykomórkowej izogenicznych mikrokolonii.Stosujemy powszechną fotolitografię SU-8 oraz formowanie chipów z polidimetylosiloksanu w celu wytwarzania jednorazowych urządzeń mikroprzepływowych o rozdzielczości podmikronowej. Pomyślnie zademonstrowaliśmy naszą technologię z wykorzystaniem kilku mikroorganizmów biotechnologicznych, takich jak Escherichia coli i Corynebacterium glutamicum. W pierwszej kolejności należy zaprojektować urządzenie mikroprzepływowe przy użyciu oprogramowania CAD.Konstrukcja przedstawiona w niniejszym protokole składa się z dwóch wlotów do zasiewu, generatora gradientu do mieszania dwóch różnych substratów, jednego wylotu oraz sześciu macierzy, z których każda zawiera pięć bioreaktorów. W pomieszczeniu czystym przygotować czterocalowy wafelek krzemowy i nanieść metodą spin-coatingu warstwę 1 µm fotorezystu SU-8 2000.5 na wafelek, zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym. Umieścić pokryty wafelek na płycie grzejnej w temperaturze 95 °C w celu odparowania nadmiaru rozpuszczalnika, a następnie włożyć pierwszą warstwę maski fotolitograficznej, obejmującą obszary pułapkujące reaktorów pikolitrowych, oraz pokryty wafelek do urządzenia do wyrównywania masek.Następnie poddaj wafer naświetlaniu w trybie styku próżniowego światłem o długości fali od 350 do 400 nm przez trzy sekundy przy intensywności 7 mW/cm². Przeprowadź wygrzewanie poekspozycyjne na płaskiej płycie grzejnej w temperaturze 95 °C, aby zainicjować polimeryzację SU-8. Następnie umieść wafer w kąpieli z wywoływaczem do SU-8 na jedną minutę, a potem przenieś wafer do drugiego pojemnika ze świeżym wywoływaczem do SU-8 na kilka sekund.Opłucz wafelek w izopropanolu, aby usunąć wywoływacz SU-8, a następnie osusz go za pomocą strumienia azotu lub wirówki do wafli. Następnie poddaj wafelek wygrzewaniu (hard bake) przez 10 minut w temperaturze 150 °C. Kolejnie przygotuj drugą warstwę zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym, aby ukończyć formę matkę.Rozpocznij wytwarzanie chipa z PDMS, mieszając bazę i czynnik sieciujący w stosunku 10:1. Odpowietrz mieszaninę PDMS przez około 30 minut w desykatorze próżniowym, aż do całkowitego usunięcia pęcherzyków powietrza. Następnie umieść wafelek SU-8 w urządzeniu formującym i wlej na wafelek warstwę mieszaniny PDMS o grubości 3 mm.Następnie wypiekaj PDMS przez trzy godziny w temperaturze 80 °C w piekarniku. Po ostygnięciu ostrożnie oddziel blok PDMS od wafla i potnij go na pojedyncze płytki za pomocą czystego i ostrego skalpela. Przemyj płytki w kąpieli z n-pentanu przez 90 minut, a następnie w dwóch kolejnych kąpielach z acetonu, po 90 minut każda.Suszyć chipy przez noc, aby usunąć pozostałości rozpuszczalnika. Bezpośrednio przed eksperymentem wykonać otwory wlotowe i wylotowe w chipie z PDMS za pomocą igły lub dziurkacza o średnicy nieco mniejszej niż złączki stosowane do łączenia rurek z chipem z PDMS. Następnie starannie oczyścić mikrofluidyczny chip z PDMS izopropanolem i użyć taśmy klejącej, aby usunąć przylegające cząsteczki kurzu.Następnie należy oczyścić cienki szkiełko przedmiotowe o grubości 170 µm najpierw acetonem, potem izopropanolem, a następnie wodą dejonizowaną, i wysuszyć szkiełko strumieniem azotu. Po oczyszczeniu i osuszeniu, poddaj szkiełko oraz chip z PDMS utlenianiu plazmowemu przez 25 s przy mocy 50 W i przepływie tlenu 20 sccm. Następnie ostrożnie wyrównaj chip z PDMS i szkiełko przed nałożeniem PDMS na szkło, co spowoduje ich związanie w ciągu kilku sekund.Utrwal wiązanie, wypiekać układ przez 10 sekund w temperaturze 80 °C. Aby przygotować bakterie do eksperymentu z użyciem chipa, zaszczep pojedynczą kolonię wybranego szczepu bakterii, np. C.glutamicum, do 20 mL świeżego podłoża BHI i inkubować kulturę przez noc w temperaturze 30 °C na inkubatorze obrotowym przy 120 RPMs. Następnego ranka przenieść 10 µL kultury startowej do drugiej kultury zawierającej 20 mL odpowiedniego podłoża i pozostawić komórki do wzrostu przez noc w tych samych warunkach.Następnego dnia wstępnie podgrzej inkubator mikroskopu odwróconego do 30 °C. W zależności od konkretnej konfiguracji sprzętu może to potrwać do dwóch godzin. Podczas nagrzewania otwórz inkubator, wybierz odpowiedni obiektyw i przygotuj go, stosując wymagane medium montażowe.Następnie zamontuj chip w uchwycie i zabezpiecz go w miejscu. Wycentruj próbkę pod mikroskopem i ustaw ostrość na macierzach bioreaktorów pikolitrowych. Po ustawieniu ostrości na chipie, podłącz wloty i wyloty za pomocą odpowiednich przewodów, a następnie umieść przewody odpływowe w zbiorniku na odpady.Następnie należy napełnić strzykawkę świeżą pożywką, umieścić ją w pompie strzykawkowej i płukać kanały mikrofluidyczne przez jedną godzinę przy szybkości przepływu 200 nanoliters per minute, aby przygotować chip do pracy. Gdy komórki znajdują się jeszcze w wczesnej fazie wzrostu wykładniczego, należy przenieść jeden milliliter kultury bakteryjnej do sterylnej strzykawki, a następnie zastąpić strzykawkę i dreny zawierające pożywkę zawiesiną komórkową oraz nowymi drenami. Zawiesinę komórkową należy wprowadzać do kanałów z objętościową szybkością przepływu 200 nanoliters per minute, aż do czasu wypełnienia większości bioreaktorów pikolitrowych.Jeśli wypełniono tylko niewielką liczbę bioreaktorów, należy zwiększyć szybkość przepływu do 800–1200 nanolitrów na minutę. Po zasianiu pożądanej liczby komórek odłączyć zawiesinę komórkową, ponownie podłączyć pożywkę wzrostową do chipa i przeprowadzić perfuzję świeżą pożywką z szybkością 100 nanolitrów na minutę. Następnie należy przeskanować chip i wybrać konkretne bioreaktory do obrazowania time-lapse.Następnie skonfiguruj sekwencję mikroskopii time-lapse, aby obrazować bioreaktory od początku do końca i rozpocząć eksperyment. Gdy wszystkie bioreaktory pikolitrowe zostaną przerośnięte, przerwij eksperyment i odpowiednio zutylizuj chipy. Aby rozpocząć analizę, najpierw określ, które bioreaktory spełniają wszystkie pożądane kryteria eksperymentu, takie jak liczba i pozycja komórek macierzystych.Za pomocą programu do analizy, takiego jak ImageJ, określ szybkość wzrostu każdej mikrokolonii, zliczając liczbę komórek w każdym punkcie czasowym. Oblicz maksymalną szybkość wzrostu, sporządzając wykres zależności czasu od logarytmu liczby komórek. Przedstawiony tutaj system może być zastosowany do badania różnych gatunków bakterii pod kątem różnych parametrów biologicznych, takich jak wzrost, morfologia lub sygnał fluorescencyjny.W tym przykładzie szczep C.glutamicum był hodowany w standardowych warunkach hodowli, a przedstawione tutaj krzywe wzrostu uzyskano z trzech izogenicznych mikrokolonii. Bioreaktory pikolitrowe okazały się również przydatne do analizy produkcji białek przy użyciu fluorescencyjnej mikroskopii poklatkowej, co pokazano tutaj. Poprzez wystawienie komórek na niskie stężenie induktora białek IPTG, możliwe jest badanie zmienności poziomu białka między poszczególnymi komórkami na poziomie pojedynczej komórki w obrębie kolonii wywodzących się z jednej komórki macierzystej.Prezentowana technika może być zastosowana do monitorowania i analizy pojedynczych komórek bakteryjnych przy pełnej kontroli środowiska. Jest to niemal niemożliwe do osiągnięcia przy użyciu konwencjonalnych systemów hodowli w skali laboratoryjnej. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dokładną wiedzę na temat przygotowania mikroprzepływowych chipów hodowlanych do przeprowadzania porównywalnych analiz pojedynczych komórek.

microfluidic-picoliter-bioreactor-for-microbial-single-cell-analysis

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Mikrofluidyczny bioreaktor pikolitrowy do analizy pojedynczych komórek mikroorganizmów: Produkcja, konfiguracja systemu i działanie

Korzystając z bioreaktora pneumatycznego, demonstrujemy montaż, działanie i wydajność tego jednorazowego systemu bioreaktorów do wzrostu komórek ssaków.

Hodowla komórek ssaków przy użyciu systemu jednorazowego bioreaktora pneumatycznego

Ten protokół opisuje architekturę systemu do wykonywania automatycznych separacji cząstek o małej objętości (0,15–1,5 ml) za pomocą urządzenia mikroprzepływowego i omawia metody optymalizacji wydajności i działania urządzenia akustycznego.

Platforma mikroprzepływowa do precyzyjnego przetwarzania próbek o małej objętości i jej wykorzystanie do wymiarowania oddzielnych cząstek biologicznych za pomocą mikrourządzenia akustycznego

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i hodowli pojedynczych komórek za pomocą platformy mikroprzepływowej, który wykorzystuje nową koncepcję projektowania mikrostudzienek, aby umożliwić wysokowydajną izolację pojedynczych komórek i długoterminową hodowlę klonalną.

Platforma mikroprzepływowa do wysokowydajnej izolacji i hodowli pojedynczych komórek

Przedstawiamy metodę analizy mikroprzepływowej poszczególnych linii komórek bakteryjnych na przykładzie Bacillus subtilis. Metoda ta przezwycięża niedociągnięcia tradycyjnych metod analitycznych w mikrobiologii, umożliwiając obserwację setek generacji komórek w ściśle kontrolowanych i jednolitych warunkach wzrostu.

Jednokomórkowa analiza mikroprzepływowa Bacillus subtilis

Tutaj opisujemy użycie wysokoprzepustowego bioreaktora mikroprzepływowego połączonego z mikroskopem fluorescencyjnym do analizy wpływu naprężeń ścinających na biofilmy Pseudomonas aeruginosa wyrażające białka zielonej fluorescencji, w tym ustawienie instrumentu, określenie pokrycia biofilmu, tempa wzrostu i właściwości morfologicznych.

Analiza naprężeń ścinających w żywych komórkach u Pseudomonas aeruginosa przy użyciu zautomatyzowanego systemu mikroprzepływowego o wyższej przepustowości

Prezentujemy system mikroprzepływowy do wysokoprzepustowych badań nad złożonymi maszynami życia, który składa się z 1500 jednostek hodowlanych, szeregu ulepszonych pomp perystaltycznych i modułu mieszania na miejscu. Chip mikroprzepływowy pozwala na analizę wysoce złożonych i dynamicznych warunków mikrośrodowiskowych in vivo.

Generowanie dynamicznych warunków środowiskowych za pomocą wysokowydajnego urządzenia mikroprzepływowego

Ten artykuł przedstawia metodę budowy i obsługi taniego, wielokanałowego systemu hodowli komórek perfuzyjnych do pomiaru dynamiki wydzielania i szybkości wchłaniania substancji rozpuszczonych w procesach komórkowych. System może również wystawiać komórki na działanie dynamicznych profili bodźców.

Wielostrumieniowy bioreaktor perfuzyjny zintegrowany z frakcjonowaniem wylotowym w celu dynamicznej hodowli komórek

Obecny protokół opisuje platformę mikroprzepływową do badania rozwoju biofilmu w porowatych ośrodkach quasi-2D poprzez połączenie obrazowania mikroskopowego o wysokiej rozdzielczości z jednoczesnymi pomiarami różnicy ciśnień. Platforma określa ilościowo wpływ wielkości porów i natężenia przepływu płynu w porowatych ośrodkach na biozatkanie.

Platforma mikroprzepływowa do badania biozatykania w pożywkach porowatych

Ten protokół opisuje, jak używać Jednokomórkowego Systemu Mikrolitrowego Zarządzania Kulturami Kropelkowymi (komórka MISS) do przeprowadzania izolacji, hodowli i pobierania mikrobiologicznego monoklonu. Komórka MISS osiąga zintegrowany przepływ pracy oparty na technologii mikroprzepływowej kropelkowej, która zapewnia doskonałą monodyspersyjność kropel, wysoką hodowlę równoległą i wysokowydajne wykrywanie biomasy.

Zautomatyzowana i wysokowydajna mikrobiologiczna hodowla monoklonalna i zbiór z wykorzystaniem systemu omicznego do hodowli mikrolitrowych mikrolitrów

Ten protokół szczegółowo opisuje montaż układów mini-bioreaktorów, które mają być wykorzystane do hodowli złożonego przepływu złożonych zbiorowisk kałowych w warunkach beztlenowych. Omówiono również metody montażu, inokulacji i pobierania próbek z reaktorów do dalszej analizy.

Montaż bioreaktora do ciągłej hodowli złożonych zbiorowisk kałowych

Ten protokół przedstawia system mikrofluidyczny do badania mikrobiologiczne precipitacji minerałów tlenku manganu. Powstawanie biomineralu jest mierzone in situ za pomocą mikroskopii optycznej i analizy obrazu. To podejście może być dostosowane do badania precipitacji innych charakterystycznie zabarwionych biogenicznych minerałów w środowiskach porowatych.

Mikropłytka platforma do badania mikrobiologicznego wytrącania tlenków metali w mediach porowatych

Poznaj mikroprzepływowy bioreaktor pikoliterowy do analizy pojedynczych komórek bakteryjnych Corynebacterium glutamicum i Escherichia coli. Ta metoda umożliwia badanie tempa wzrostu i heterogeniczności fenotypowej.

Mikroprzepływowy bioreaktor pikoliterowy do analizy mikrobiologicznej pojedynczych komórek: produkcja, konfiguracja systemu i obsługa (Wideo) | JoVE Journal

Mikroprzepływowy bioreaktor pikoliterowy do analizy mikrobiologicznej pojedynczych komórek: produkcja, konfiguracja systemu i obsługa

Przeglądaj więcej filmów