Mikroprzepływowy bioreaktor pikoliterowy do analizy mikrobiologicznej pojedynczych komórek: produkcja, konfiguracja systemu i obsługa

Ogólnym celem tej procedury jest analiza pojedynczych bakterii i ewoluujących mikrokolonii izogenicznych z pełną rozdzielczością przestrzenną i czasową w stałych warunkach środowiskowych przy użyciu urządzenia do hodowli mikroprzepływowej. Osiąga się to poprzez zaprojektowanie najpierw systemu uprawy mikroprzepływowej za pomocą oprogramowania CAD. Następnie z polidimetylosiloksanu wytwarzane są jednorazowe urządzenia do uprawy mikroprzepływowej, które zawierają bioreaktory pikolitrowe, o wielkości jednego mikrona i wysokości, aby ograniczyć rozwój bakterii do jednej warstwy.

Hodowla drobnoustrojów jest następnie wprowadzana do urządzenia mikroprzepływowego w celu zaszczepienia pojedynczych komórek macierzystych w bioreaktorach. Komórki te są namnażane przez ciągłą infuzję pożywki wzrostowej przez system. Wyniki uzyskano za pomocą zautomatyzowanej mikroskopii poklatkowej pokazującej hodowlę istotnego przemysłowo szczepu Corynebacterium glutamicum, dane dotyczące wzrostu i niejednorodność komórka-komórka.

W konwencjonalnej biotechnologii większość analiz opiera się na uśrednionych danych. Nasze urządzenie mikroprzepływowe umożliwia analizę pojedynczych komórek pojedynczych bakterii z rozdzielczością przestrzenną i czasową. Jest to przydatne narzędzie do bliższego przyjrzenia się heterogeniczności mikrokolonii izogenicznych między komórkami.

Stosujemy powszechną fotolitografię SU-8 i formowanie chipów z polidimetylosiloksanu do produkcji jednorazowych urządzeń mikroprzepływowych o rozdzielczości sub mikromediów. Z powodzeniem zademonstrowaliśmy naszą technologię na kilku mikroorganizmach biotechnicznych, takich jak Escherichia coli i Corynebacterium glutamicum. Aby rozpocząć, zaprojektuj urządzenie mikroprzepływowe za pomocą oprogramowania CAD.

Projekt przedstawiony w tym protokole składa się z dwóch wlotów wysiewających, generatora gradientu do mieszania dwóch różnych substratów, jednego wylotu i sześciu układów składających się z pięciu bioreaktorów każdy. W czystym pomieszczeniu przygotuj czterocalową płytkę krzemową i zakoduj jeden mikron fotorezystu SU-8 2000.5 na płytce zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Umieść powlekaną płytkę na gorącej płycie w temperaturze 95 stopni Celsjusza, aby usunąć nadmiar rozpuszczalnika, a następnie włóż pierwszą warstwę maski fotograficznej składającej się z obszarów pułapkowania reaktorów pikolitrowych i powlekanej płytki do wyrównywacza maski.

Następnie wystaw wafel w trybie kontaktu próżniowego na działanie światła o długości od 350 do 400 nanometrów przez trzy sekundy z intensywnością siedmiu miliwatów na centymetr kwadratowy. Wykonaj pieczenie poekspozycyjne na równej płycie grzejnej w temperaturze 95 stopni Celsjusza, aby zainicjować polimeryzację SU-8. Następnie umieść wafel w kąpieli wywoływacza SU-8 na jedną minutę, a następnie przenieś wafel do drugiego pojemnika ze świeżym wywoływaczem SU-8 na kilka sekund.

Opłucz wafel w izopropanolu w celu usunięcia wywoływacza SU-8 i wysuszenia płytki za pomocą przepływu azotu lub wirówki waflowej. Następnie wypiekamy wafelek na twardo przez 10 minut w temperaturze 150 stopni Celsjusza. Następnie wyprodukuj drugą warstwę zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym, aby ukończyć formę wzorcową.

Rozpocznij wytwarzanie chipów PDMS od zmieszania zasady i czynnika nośnego w stosunku 10 do jednego. Mieszaninę PDMS należy odgazowywać przez około 30 minut w eksykatorze próżniowym, aż wszystkie pęcherzyki znikną. Następnie umieść wafel SU-8 w urządzeniu do formowania i wlej trzymilimetrową warstwę mieszaniny PDMS na wafel.

Następnie piecz PDMS przez trzy godziny w temperaturze 80 stopni Celsjusza w piekarniku. Po schłodzeniu ostrożnie oderwij płytę PDMS od wafla i pokrój płytę na pojedyncze wióry za pomocą czystego i ostrego skalpela. Umyj frytki w kąpieli n-pentanowej przez 90 minut, a następnie w dwóch kąpielach myjących acetonem przez 90 minut każda.

Wysuszyć wióry przez noc, aby usunąć wszelkie pozostałości rozpuszczalnika. Tuż przed eksperymentem należy przebić otwory wlotowe i wylotowe w chipie PDMS za pomocą igły lub dziurkacza o nieco mniejszej średnicy niż złącza, które są używane do łączenia rurki z chipem PDMS. Następnie dokładnie wyczyść mikroprzepływowy chip PDMS izopropanolem i użyj taśmy klejącej, aby usunąć wszelkie przywierające cząsteczki kurzu.

Wyczyść również szkiełko o grubości 170 mikronów najpierw acetonem, następnie izopropanolem, a następnie wodą dejonizowaną i osusz szkiełko strumieniem azotu. Po oczyszczeniu i wyschnięciu plazma utlenia szkiełko podstawowe i chip PDMS przez 25 sekund przy użyciu mocy 50 watów i natężenia przepływu tlenu 20 sccm. Następnie ostrożnie wyrównaj PDMS i szklany chip przed umieszczeniem PDMS na szkle, co spowoduje jego związanie w ciągu kilku sekund.

Zabezpiecz wiązanie, piecząc nastawę przez 10 sekund w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Aby przygotować bakterie do eksperymentu z chipem, zaszczepij pojedynczą kolonię pożądanego szczepu bakteryjnego, takiego jak C.glutamicum, w 20 mililitrach świeżej pożywki BHI i inkubuj kulturę przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza na wytrząsarce obrotowej z prędkością 120 obr./min. Następnego ranka przenieś 10 mikrolitrów kultury starterowej do drugiej kultury zawierającej 20 mililitrów pożądanej pożywki i pozwól komórkom rosnąć przez noc w tych samych warunkach.

Następnego dnia rozgrzej inkubator odwróconego mikroskopu do 30 stopni Celsjusza. Może to potrwać do dwóch godzin, w zależności od indywidualnej konfiguracji. Podczas nagrzewania się zestawu otwórz inkubator i wybierz żądany obiektyw, a następnie przygotuj go z dowolnym wymaganym medium montażowym.

Następnie zamontuj chip w uchwycie na wióry i zabezpiecz go na miejscu. Wyśrodkuj próbkę na mikroskopie i skup się na matrycach bioreaktorów pikolitrów. Mając ostrość na chipie, połącz wloty i wyloty odpowiednimi rurkami, a następnie umieść rurkę wylotową w zbiorniku na odpady.

Następnie napełnij strzykawkę świeżą pożywką, umieść ją w pompie strzykawkowej i płucz kanały mikroprzepływowe przez godzinę z natężeniem przepływu 200 nanolitrów na minutę, aby zalać chip. Podczas gdy komórki są jeszcze we wczesnej fazie wzrostu wykładniczego, przenieś jeden mililitr kultury bakteryjnej do sterylnej strzykawki i zastąp strzykawkę i rurkę zawierającą pożywkę zawiesiną komórkową i świeżą rurką. Wlej zawiesinę komórkową do kanałów z objętościowym natężeniem przepływu 200 nanolitrów na minutę, aż większość bioreaktorów pikolitrowych zostanie napełniona.

Jeśli napełniona jest tylko niewielka liczba bioreaktorów, zwiększ natężenie przepływu do 800 do 1200 nanolitrów na minutę. Po wysianiu żądanej ilości komórek odłącz zawiesinę komórek, ponownie podłącz pożywkę wzrostową do chipa i perfuzuj ze świeżymi pożywkami z prędkością 100 nanolitrów na minutę. Następnie zeskanuj chip i wybierz określone bioreaktory do obrazowania poklatkowego.

Następnie skonfiguruj sekwencję mikroskopii poklatkowej, aby zobrazować bioreaktory od początku do końca i rozpocząć eksperyment. Gdy wszystkie bioreaktory pikolitrowe są przerośnięte, przerwij eksperyment i odpowiednio wyrzuć chipy. Aby rozpocząć analizę, najpierw określ, które bioreaktory spełniają wszystkie pożądane kryteria eksperymentu, takie jak liczba i położenie komórek macierzystych.

Korzystając z programu analitycznego, takiego jak obraz J, określ tempo wzrostu każdej mikrokolonii, zliczając liczbę komórek w każdym punkcie czasowym. Oblicz maksymalną szybkość wzrostu, wykreślając czas w funkcji logarytmu liczby komórki. Prezentowany system może być stosowany do badania różnych gatunków bakterii pod kątem różnych parametrów biologicznych, takich jak wzrost, morfologia czy sygnał fluorescencyjny.

W tym przykładzie C.glutamicum był hodowany w standardowych warunkach uprawy, a uzyskane krzywe wzrostu pochodzące z trzech mikrokolonii izogenicznych są pokazane tutaj. Bioreaktory pikolitrowe okazały się również przydatne w dostępie do produkcji białek dzięki zastosowaniu poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej, jak pokazano tutaj. Wystawiając komórki na działanie niskiego stężenia induktora białka IPTG, można badać zmiany białka między komórkami na poziomie pojedynczych komórek w koloniach, zaczynając od pojedynczej komórki macierzystej.

Zademonstrowana technika może być stosowana do monitorowania i analizy pojedynczych komórek bakteryjnych przy doskonałej kontroli środowiska. Jest to prawie niemożliwe przy użyciu konwencjonalnych systemów uprawy na skali stołowej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować mikroprzepływowe chipsy hodowlane, aby przeprowadzić porównywalną analizę pojedynczych komórek.