Profilowanie ekspresji genów specyficzne dla typu komórki w wątrobie myszy

Tłumaczenie oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) umożliwia szybką i efektywną izolację mRNA translującego specyficznego dla typu komórki. Tutaj demonstrujemy metodę, która łączy hydrodynamiczne wstrzykiwanie żyły ogonowej w mysim modelu ponownego zasiedlania wątroby i TRAP w celu zbadania profilu ekspresji repopulujących hepatocytów.

Dzięki TRAP-seq możemy wyizolować RNA z określonych typów komórek, takich jak hepatocyty zasiedlające się w uszkodzonej wątrobie, aby przeanalizować zmiany ekspresji genów zachodzące w tych komórkach. Nie wymaga żadnych kroków w celu usunięcia niechcianych komórek z tkanki. RNA specyficzne dla typu komórki jest izolowane przez oczyszczanie powinowactwa z lizatów całego narządu.

Ta technika pomaga nam określić, jak określone komórki reagują na urazy, co może pomóc w identyfikacji nowych strategii lub leków do walki z chorobami wątroby. Można to wykorzystać do określenia, w jaki sposób komórki wątroby reagują na różne rodzaje urazów wątroby. Obecnie istnieje niewiele opcji leczenia ciężkich ostrych uszkodzeń wątroby, a ta metoda pomoże nam znaleźć nowe metody leczenia.

Ta metoda wywodzi się z mózgu. W wątrobie wyobrażaliśmy sobie, że można ją wykorzystać do badania dynamicznych zmian w różnych typach komórek, takich jak hepatocyty, komórki dróg żółciowych, komórki Kupffera i komórki śródbłonka, żeby wymienić tylko kilka. Procedurę zademonstruje Amber Wang, doktorantka i moja podopieczna.

Na początek ponownie zawiesić kulki magnetyczne przez delikatne pipetowanie. Zbieraj koraliki na stojaku magnetycznym przez ponad jedną minutę i usuń supernatant. Następnie wyjmij probówkę mikrowirówki ze stojaka magnetycznego i dodaj jeden mililitr PBS, a następnie pipetuj w górę iw dół, aby umyć kulki.

Umieść rurkę z powrotem na stojaku magnetycznym na dłużej niż jedną minutę, aby zebrać koraliki i usunąć PBS. Aby przygotować kulki pokryte białkiem L, dodaj 16 mikrolitrów biotynylowanego białka L do zawieszonych i umytych kulek magnetycznych i dodaj 1X PBS, aby uzyskać końcową objętość jednego mililitra, jeśli używasz 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki, lub 1,5 mililitra, jeśli używasz dwumililitrowej probówki do mikrowirówki. Inkubować kulki magnetyczne z biotynylowanym białkiem L przez 35 minut w temperaturze pokojowej na rotatorze probówkowym.

Następnie umieść probówkę na stojaku magnetycznym na dłużej niż jedną minutę i usuń supernatant, aby zebrać kulki pokryte białkiem L. Wyjmij probówkę do mikrowirówki ze stojaka magnetycznego i dodaj jeden mililitr PBS z 3% buforem BSA, a następnie delikatnie pipetuj co najmniej pięć razy, aby umyć kulki pokryte białkiem L. Ponownie umieść probówkę na stojaku magnetycznym na dłużej niż jedną minutę i usuń supernatant, aby zebrać powlekane kulki.

Powtórz mycie BSA kolejne cztery razy. Następnie dodaj 50 mikrogramów przeciwciał przeciwko przeciwciału GFP 19C8 i przeciwciału GFP 19F7 do kulek pokrytych białkiem L i inkubuj przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza na rotatorze probówkowym. Aby zebrać matrycę powinowactwa, umieść probówkę na stojaku magnetycznym na dłużej niż jedną minutę i usuń supernatant.

Zdejmij probówkę ze stojaka magnetycznego i dodaj jeden mililitr buforu o niskiej zawartości soli. Delikatnie pipetować w górę i w dół, aby umyć matrycę powinowactwa i powtórzyć płukanie buforem o niskiej zawartości soli kolejne dwa razy. Ponownie zawiesić kulki w 200 mikrolitrach buforu o niskiej zawartości soli, aby uzyskać 200 mikrolitrów matrycy powinowactwa.

Najpierw ustaw młynek do tkanek tak, aby rurki ze szkła PTFE można było umieścić na lodzie podczas homogenizacji. Wlej cztery mililitry buforu do lizy na zimno do szklanych rurek z PTFE. Połóż wątrobę na szalce Petriego.

Za pomocą noża wyizoluj od 200 do 500 miligramów kawałków wątroby i przenieś do rurek ze szkła PTFE. Umieść pozostałą tkankę wątroby we wstępnie schłodzonej probówce mikrowirówkowej i błyskawicznie zamroź w ciekłym azocie. Homogenizować próbki w homogenizatorze napędzanym silnikiem, zaczynając od 300 obr./min przez co najmniej pięć uderzeń w celu oddzielenia hepatocytów od struktury wątroby.

Za każdym razem opuszczaj szklaną rurkę. Zapobiegaj napowietrzaniu, które może spowodować denaturację białka, trzymając tłuczek poniżej roztworu. Następnie zwiększ prędkość do 900 obr./min, aby w pełni zhomogenizować tkanki wątroby przez co najmniej 12 pełnych ruchów.

Przenieś lizat do oznakowanych i wstępnie schłodzonych probówek, z których każda zawiera nie więcej niż jeden mililitr lizatu. Aby rozpocząć lizę jądrową, należy odwirować lizat wątroby w temperaturze 2 000 razy g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut, a następnie przenieść supernatant do nowej, wstępnie schłodzonej probówki wirówkowej na lodzie. Dodać 1/9 objętości sklaranty 10% NP-40 do probówki mikrowirówki na lodzie i wymieszać roztwór, delikatnie odwracając probówkę.

Szybko odwiruj probówki do mikrowirówek za pomocą miniwirówki i dodaj 1/9 objętości próbki z 10% DOC. Wymieszaj, delikatnie odwracając probówki do mikrowirówek i szybko odwiruj probówki do mikrowirówek i inkubuj na lodzie przez pięć minut. Odwirować lizat jądrowy w temperaturze 20 000 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut i przenieść supernatant do nowych, wstępnie schłodzonych probówek mikrowirówkowych na lodzie.

Z każdej probówki należy pobrać 1% całkowitej objętości supernatantu jako kontrolę przed immunoprecypitacją. Umieść kontrole przed immunoprecypitacją na rotatorze rurkowym w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Zachowaj szczególną ostrożność, aby delikatnie zawiesić matrycę powinowactwa przez pipetowanie, a następnie dodać 200 mikrolitrów do każdej próbki.

Inkubować lizaty w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, delikatnie mieszając na rotatorze rurowym. Aby wyizolować RNA, szybko odwiruj probówki zawierające lizaty w mini wirówce i zbierz kulki, umieszczając je na stojaku magnetycznym na co najmniej jedną minutę. Zebrać supernatant do dodatkowych probówek do mikrowirówek.

Dodać jeden mililitr świeżego buforu o wysokiej zawartości soli do każdej probówki, a następnie delikatnie pipetować co najmniej pięć razy bez wprowadzania bąbelków. Zbieraj kulki na stojaku magnetycznym na lodzie przez ponad jedną minutę i usuń supernatant. Powtórz kroki prania kolejne cztery razy.

Następnie wyjmij probówki do mikrowirówek ze stojaka magnetycznego i umieść w temperaturze pokojowej na pięć minut, aby się rozgrzały. Ponownie zawiesić kulki w 100 mikrolitrach buforu do lizy z 0,7 mikrolitra beta-merkaptoetanolu, aby uwolnić związany RNA z matrycy powinowactwa. Wiruj rurki przez co najmniej pięć sekund z najwyższą prędkością i szybko wiruj.

Następnie inkubuj probówki w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Umieść probówki na stojaku magnetycznym na co najmniej jedną minutę, a następnie zbierz supernatant i natychmiast przystąp do oczyszczania RNA zgodnie z protokołem oczyszczania RNA w zestawie. Aby osiągnąć maksymalną jakość wyizolowanego RNA, należy wykonać wszystkie opcjonalne kroki, w tym trawienie DNazy i wszystkie etapy elucji RNA, w tym zalecane wstępne podgrzanie buforu elucyjnego do 60 stopni Celsjusza.

W tym badaniu fuzja GFP-L10A i transgeny Fah były jednocześnie dostarczane w wektorze pułapki plazmidowej zawierającym transpozon do wątroby przez wstrzyknięcie hydrodynamiczne. Usunięcie nityzynonu wywołało toksyczne uszkodzenie wątroby. Barwienie immunofluorescencyjne potwierdziło koekspresję białka fuzyjnego FAH i GFP-L10A oraz rezasiedlenia hepatocytów po dwóch tygodniach ponownego zasiedlenia wątroby.

Próbka w stanie spoczynku dała najwyższą wydajność białka fuzyjnego, ponieważ wszystkie hepatocyty wykazują ekspresję GFP-L10A po wstrzyknięciu AAV8-TBG-Cre. I odwrotnie, prawie żadne RNA nie było wykrywalne w kontrolach typu dzikiego, które nie miały transgenu GFP-L10A, co wskazuje, że procedura TRAP jest wysoce specyficzna i ma niskie tło. Gdy TRAP zastosowano na tkance wątroby poddawanej repopulacji hepatocytami transdukowanymi GFP-L10A, uzyskano obfite RNA wysokiej jakości.

W przeciwieństwie do tego, za pomocą Bioanalyzera nie wykryto śladu RNA dla ujemnej próbki kontrolnej. Ekspresja Gsta1 była indukowana ponad dziesięciokrotnie w ponownym zasiedlaniu hepatocytów w porównaniu z hepatocytami w stanie spoczynku, podczas gdy nie wykryto wartości progowych cyklu z izolowanym przez TRAP RNA od myszy typu dzikiego z powodu braku wejściowego RNA. Podczas homogenizacji tkanki należy powoli przesuwać tłuczek, aby zapobiec napowietrzeniu.

Po wyizolowaniu RNA można przeprowadzić sekwencjonowanie wysokoprzepustowe lub qPCR w celu analizy ekspresji genów. Dzięki TRAP-seq mamy teraz metodę specyficznego izolowania RNA z ponownego zasiedlania hepatocytów i analizowania zmian w ekspresji genów podczas ponownego zasiedlania wątroby. To pozwala nam zidentyfikować geny, które są zmieniane podczas tego procesu i potencjalne cele terapeutyczne w leczeniu uszkodzenia wątroby.

Cykloheksymid i DTT, które są obecne w kilku, są toksyczne. Odpady powinny być zbierane i wyrzucane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.