Name: Profilowanie ekspresji genów specyficzne dla typu komórki w wątrobie myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Poznaj metodę TRAP-seq do izolacji RNA z hepatocytów odnawiających się w wątrobie myszy. Technika umożliwia analizę zmian ekspresji genów podczas repopulacji wątroby i identyfikację potencjalnych celów terapeutycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez następujące granty: F31-DK113666 (AWW), K01-DK102868 (AMZ), K08-DK106478 (KJW) i P30-DK050306 (grant pilotażowy dla KJW).

<ol><li>Taub, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+regeneration%3A+from+myth+to+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Liver regeneration: from myth to mechanism.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).</li>
<li>Lee, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Etiologies+of+acute+liver+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Liver+Disease%22%5BJournal%5D)">Etiologies of acute liver failure.</a> Seminars in Liver Disease. 28 (2), 142-152 (2008).</li>
<li>Sanyal, A. J., Yoon, S. K., Lencioni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+etiology+of+hepatocellular+carcinoma+and+consequences+for+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22The+Oncologist%22%5BJournal%5D)">The etiology of hepatocellular carcinoma and consequences for treatment.</a> The Oncologist. 15 Suppl 4, 14-22 (2010).</li>
<li>Jadlowiec, C. C., Taner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+transplantation%3A+Current+status+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Liver transplantation: Current status and challenges.</a> World Journal of Gastroenterology. 22 (18), 4438-4445 (2016).</li>
<li>Michalopoulos, G. K., DeFrances, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Liver regeneration.</a> Science. 276 (5309), 60-66 (1997).</li>
<li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+regeneration+after+partial+hepatectomy%3A+critical+analysis+of+mechanistic+dilemmas%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Liver regeneration after partial hepatectomy: critical analysis of mechanistic dilemmas.</a> The American Journal of Pathology. 176 (1), 2-13 (2010).</li>
<li>Grompe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+fumarylacetoacetate+hydrolase+is+responsible+for+the+neonatal+hepatic+dysfunction+phenotype+of+lethal+albino+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Loss of fumarylacetoacetate hydrolase is responsible for the neonatal hepatic dysfunction phenotype of lethal albino mice.</a> Genes & Development. 7 (12A), 2298-2307 (1993).</li>
<li>Wangensteen, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+facile+method+for+somatic%2C+lifelong+manipulation+of+multiple+genes+in+the+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">A facile method for somatic, lifelong manipulation of multiple genes in the mouse liver.</a> Hepatology. 47 (5), 1714-1724 (2008).</li>
<li>Wang, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRAP-seq+identifies+cystine%2Fglutamate+antiporter+as+a+driver+of+recovery+from+liver+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">TRAP-seq identifies cystine/glutamate antiporter as a driver of recovery from liver injury.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2297-2309 (2018).</li>
<li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+%28TRAP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).</li>
<li>Agilent Technologies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Agilent+RNA+6000+Pico%3A+User+Manual%22">Agilent RNA 6000 Pico: User Manual</a>. , Retrieved from https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90046_RNA600Pico_KG_EN.pdf (2016).</li>
<li>NEBNext. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22NEBNext+Ultra+RNA+Library+Prep+Kit+for+Illumina%3A+User+Manual%22">NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina: User Manual</a>. , Retrieved from https://international.neb.com/-/media/nebus/files/manuals/manuale7530.pdf (2018).</li>
<li>NanoDrop. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%222000%2F2000c+Spectrophotomerter%3A+User+Manual%22">2000/2000c Spectrophotomerter: User Manual</a>. , Retrieved from https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CAD/manuals/NanoDrop-2000-User-Manual-EN.pdf (2009).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+translational+profiling+in+acute+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Cell-specific translational profiling in acute kidney injury.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1242-1254 (2014).</li>
<li>Lu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+glutathione+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Regulation of glutathione synthesis.</a> Molecular Aspects of Medicine. 30 (1-2), 42-59 (2009).</li>
<li>Wang, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+chromatin+architecture+of+the+regenerating+liver%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">The dynamic chromatin architecture of the regenerating liver.</a> bioRxiv. , (2019).</li>
<li>Zahm, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-content+in+vivo+screen+to+identify+microRNA+epistasis+in+the+repopulating+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">A high-content in vivo screen to identify microRNA epistasis in the repopulating mouse liver.</a> bioRxiv. , (2019).</li>
<li>Stork, C., Zheng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Profiling+of+RNA-Protein+Interactions+Using+CLIP-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Profiling of RNA-Protein Interactions Using CLIP-Seq.</a> Methods in Molecular Biology. 1421, 137-151 (2016).</li>
<li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+antioxidant+pathway+activity+and+reserve+determine+toxicity+and+specificity+of+the+biliary+toxin+biliatresone+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Glutathione antioxidant pathway activity and reserve determine toxicity and specificity of the biliary toxin biliatresone in zebrafish.</a> Hepatology. 64 (3), 894-907 (2016).</li>
<li>Halpern, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+spatial+reconstruction+reveals+global+division+of+labour+in+the+mammalian+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell spatial reconstruction reveals global division of labour in the mammalian liver.</a> Nature. 542 (7641), 352-356 (2017).</li>
<li>Camp, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+communication+regulates+human+liver+bud+development+from+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multilineage communication regulates human liver bud development from pluripotency.</a> Nature. 546 (7659), 533-538 (2017).</li>
<li>Wang, Y. J., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+RNA-Seq+of+the+Pancreatic+Islets--a+Promise+Not+yet+Fulfilled%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Single-Cell RNA-Seq of the Pancreatic Islets--a Promise Not yet Fulfilled?</a> Cell Metabolism. 29 (3), 539-544 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

TRAP-seq jest techniką specyficznej dla typu komórki izolacji translacji mRNA za pomocą rybosomów znakowanych epitopami i stanowi alternatywę dla podejść FACS, ponieważ omija ograniczenia, takie jak wymagania czasowe FACS9. Zamiast tego TRAP umożliwia szybką i wydajną izolację RNA bezpośrednio z tkanek masowych, pomagając uniknąć jakichkolwiek zmian w ekspresji genów. TRAP-seq szczególnie dobrze nadaje się do stosowania w odbudowie wątroby myszy Fah-/- , ponieważ ekspansja hepa...

Jako główny organ metaboliczny u kręgowców, wątroba jest odpowiedzialna za homeostazę glukozy, syntezę białek w surowicy, wydzielanie kwasów żółciowych oraz metabolizm ksenobiotyków i detoksykację. Wątroba posiada niezwykłą zdolność do regeneracji uszkodzonego miąższu po ekspozycji na toksyny, aby zapobiec natychmiastowej niewydolności wątroby1. Jednak niepowodzenie regeneracji może wystąpić w przypadku nadmiernego spożycia paracetamolu lub alkoholu, co może prowadzić do ostrej niewydolności wątroby2. Ponadto przewlekłe uszkodzenie wątroby spowodowane wirusowym zapaleniem wątroby, stłuszczeniem wątroby i stłuszczeniowym zapaleniem wątroby może powodować zwłóknienie wątroby, marskość wątroby i raka wątrobowokomórkowego3. Jedynym dostępnym sposobem leczenia schyłkowej niewydolności wątroby jest przeszczep, ale jest on ograniczony przez niedobór narządów, co uniemożliwia skuteczne leczenie u wszystkich pacjentów4. Lepsze zrozumienie procesu rekonwalescencji po toksycznym uszkodzeniu wątroby ma zatem kluczowe znaczenie dla opracowania metod leczenia stymulujących regenerację wystarczającą do przywrócenia funkcji chorego narządu.
Najszerzej stosowanym systemem modelowym do badania regeneracji wątroby jest częściowa hepatektomia u gryzoni, w której duża część wątroby jest wycinana w celu stymulowania szybkiej ekspansji hepatocytów5. Jednak częściowa hepatektomia nie podsumowuje ekspansji hepatocytów po toksycznym uszkodzeniu wątroby z powodu braku nacieku komórek odpornościowych i martwicy komórek hepatocytów, często obserwowanej w przypadku ostrego uszkodzenia wątroby u ludzi6. Bardziej odpowiednim systemem do modelowania tej formy odnowy narządów jest mysz Fah-/-, która nie ma funkcjonalnej hydrolazy fumaryloacetooctanu (FAH) niezbędnej do prawidłowego metabolizmu tyrozyny i rozwija poważne uszkodzenie wątroby prowadzące do śmierci7. Myszy te mogą być utrzymywane w zdrowym stanie przez czas nieokreślony poprzez leczenie lekiem nityzynonem w wodzie pitnej. Alternatywnie, ekspresję FAH można przywrócić przez dostarczenie transgenu do podzbioru hepatocytów, które rozszerzą się, aby ponownie zasiedlić wątrobę po usunięciu nityzynonu8.
Aby profilować zmiany ekspresji genów w ponownym zasiedlaniu hepatocytów, potrzebne jest narzędzie do specyficznego izolowania replikujących się hepatocytów u myszy Fah-/- bez zanieczyszczenia sąsiednimi uszkodzonymi hepatocytami i innymi typami komórek. Niestety, sortowanie komórek wspomagane fluorescencją (FACS) hepatocytów jest trudne, ponieważ (1) kruchość ponownego zasiedlenia hepatocytów prowadzi do słabej regeneracji po perfuzji wątroby, (2) replikujące się hepatocyty mają bardzo zmienną wielkość, co utrudnia izolację czystej populacji przez FACS, oraz (3) czas procedury od perfuzji wątroby do izolacji RNA jest dłuższy niż 2 godziny, W związku z tym profile ekspresji genów mogą ulegać znacznym sztucznym zmianom przed pobraniem próbek9.
Alternatywnie, ekspresja rybosomów oznaczonych epitopami, szczególnie w ponownym zasiedleniu hepatocytów, pozwala na szybką izolację aktywnie translującego mRNA związanego przez rybosomy za pomocą oczyszczania powinowactwa natychmiast po pobraniu organów, za pomocą dużych lizatów tkanki wątroby. W tym miejscu opisujemy protokół przeprowadzania oczyszczania powinowactwa translacyjnego rybosomów (TRAP)10, a następnie sekwencjonowania RNA o wysokiej przepustowości (TRAP-seq), w celu specyficznej izolacji i profilowania mRNA w ponownym zasiedlaniu hepatocytów w klasie Fah-/- mouse9. Koekspresja białka rybosomalnego znakowanego białkiem zielonej fluorescencji (GFP:RPL10A) z FAH umożliwia oczyszczanie powinowactwa translacyjnego mRNA związanego przez polisomy zawierające GFP:RPL10A. Ta metoda pozwala uniknąć wszelkich etapów dysocjacji komórek, takich jak perfuzja wątroby w celu wyizolowania delikatnych, ponownie zasiedlających hepatocytów. Zamiast tego wykorzystuje lizę tkanki całego narządu i przeciwciał do szybkiej ekstrakcji RNA specyficznie z komórek docelowych. Wreszcie, izolacja obfitego, wysokiej jakości mRNA za pomocą TRAP-seq umożliwia dalsze zastosowania, takie jak analiza sekwencjonowania, w celu profilowania dynamicznych zmian ekspresji genów podczas procesu ponownego zasiedlenia.

<table><tbody><tr><td>10 ml Młynek do tkanek, Potter-Elv, powlekany</td><td>DWK Life Sciences (Wheaton)</td><td>358007</td><td></td></tr><tr><td>Absolutnie RNA Miniprep Kit</td><td>Agilent</td><td>400800</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała anty-GFP</td><td>Memorial Sloan-Kettering Przeciwciała i Rdzeń zasobów biologicznych</td><td>GFP Ab #19C8 i GFP Ab #19F7</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej, wolna od IgG, bez proteazy</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>001-000-162</td><td></td></tr><tr><td>cKompletny, Mini, wolny od EDTA inhibitor proteazy Koktajl</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Cykloheksymid</td><td>Millipore Sigma</td><td>C7698</td><td></td></tr><tr><td>Kwas dezoksycholowy, DOC</td><td>Millipore Sigma</td><td>D2510</td><td></td></tr><tr><td>D-Glukoza, Dekstroza</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16</td><td></td></tr><tr><td>DL-Ditiothreitol</td><td>Millipore Sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>65602</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Petri Szalki z przezroczystą pokrywką</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (10x), wapń, magnez, bez czerwieni fenolowej</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14065-056</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, 1 M roztwór, pH 7,3, Klasa biologii molekularnej, Ultrapure, Thermo Scientific</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AAJ16924AE</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu, MgCl2&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000c Spektrofotometr</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>VV-83061-00</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Poly(A) mRNA Moduł izolacji magnetycznej</td><td>New England BioLabs</td><td>E7490S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra Zestaw do przygotowania biblioteki RNA dla Illumina</td><td>New England BioLabs</td><td>E7530S</td><td></td></tr><tr><td>Glikol nonylofenylowo-polietylenowy, NP-40. IGEPAL CA-630</td><td>Millipore Sigma</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>Woda bez nukleaz, bez poddanych działaniu DEPC</td> Mieszadło górne <td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td></td><td>DWK Life Sciences (Wheaton)</td><td>903475</td><td></td></tr><tr><td>Bufor PBS (10x), pH 7,4</td><td>Ambion</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>Białko rekombinowane Pierce L, biotynylowane</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>29997</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu, KCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Pico Kit & Odczynniki</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap RNaza Roztwór do dekontaminacji</td><td>Invitrogen</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>RNasin Inhibitory rybonukleazy</td><td>Promega</td><td>N2515</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu, NaN3</td><td>Millipore Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu, NaHCO3</td><td>Millipore Sigma</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>SUPERaza&middot; W inhibitorze RNazy</td><td>Invitrogen</td><td>AM2694</td><td></td></tr></tbody></table>

profilowanie ekspresji genów specyficzne dla typu komórki w wątrobie myszy

Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

Ponowne zasiedlenie wątroby po urazie jest kluczową cechą ssaków, która zapobiega natychmiastowej niewydolności narządów i śmierci po ekspozycji na toksyny środowiskowe. Głębsze zrozumienie zmian w ekspresji genów, które zachodzą podczas ponownego zasiedlenia, może pomóc w identyfikacji celów terapeutycznych promujących przywrócenie funkcji wątroby w przypadku urazów. Niemniej jednak metody izolowania specyficznie zasiedlających hepatocytów są hamowane przez brak markerów komórkowych, ograniczoną liczbę komórek i kruchość tych komórek. Opracowanie technologii oczyszczania powinowactwa translacyjnego rybosomów (TRAP) w połączeniu z mysim modelem Fah-/- w celu rekapitulacji populacji w warunkach uszkodzenia wątroby umożliwia profilowanie ekspresji genów w repopulujących hepatocytach. Dzięki TRAP mRNA translujące specyficzne dla typu komórki jest szybko i skutecznie izolowane. Opracowaliśmy metodę, która wykorzystuje TRAP z opartą na powinowactwie izolacją translującego mRNA z hepatocytów, które selektywnie eksprymują białko rybosomalne (RP) znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP), GFP: RPL10A. TRAP pozwala uniknąć długiego okresu wymaganego do sortowania komórek aktywowanego fluorescencją, które może zmienić profil ekspresji genów. Ponadto, ponieważ tylko repopulujące hepatocyty wykazują ekspresję białka fuzyjnego GFP:RPL10A, wyizolowane mRNA jest pozbawione zanieczyszczeń pochodzących z otaczających uszkodzonych hepatocytów i innych typów komórek w wątrobie. Oczyszczone z powinowactwa mRNA jest wysokiej jakości i umożliwia dalszą analizę ekspresji genów opartą na PCR lub sekwencjonowaniu o wysokiej przepustowości.

Aby przeprowadzić profilowanie ekspresji genów w repopulujących hepatocytach myszy Fah-/-, fuzję Gfp:Rpl10a oraz transgeny Fah dostarcza się wspólnie do wątroby za pomocą plazmidu zawierającego transposon8 (wektor TRAP) poprzez wtryskiwanie hydrodynamiczne (Rysunek 1A). Odstawienie nitizononu indukuje toksyczne uszkodzenie wątroby, co stwarza presję selekcyjną dla hepatocytów stabi...

Tłumaczenie oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) umożliwia szybką i efektywną izolację mRNA translującego specyficznego dla typu komórki. Tutaj demonstrujemy metodę, która łączy hydrodynamiczne wstrzykiwanie żyły ogonowej w mysim modelu ponownego zasiedlania wątroby i TRAP w celu zbadania profilu ekspresji repopulujących hepatocytów.

Profilowanie ekspresji genów specyficzne dla typu komórki w wątrobie myszy

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A ...

Dzięki TRAP-seq możemy wyizolować RNA z określonych typów komórek, takich jak hepatocyty zasiedlające się w uszkodzonej wątrobie, aby przeanalizować zmiany ekspresji genów zachodzące w tych komórkach. Nie wymaga żadnych kroków w celu usunięcia niechcianych komórek z tkanki. RNA specyficzne dla typu komórki jest izolowane przez oczyszczanie powinowactwa z lizatów całego narządu.Ta technika pomaga nam określić, jak określone komórki reagują na urazy, co może pomóc w identyfikacji nowych strategii lub leków do walki z chorobami wątroby. Można to wykorzystać do określenia, w jaki sposób komórki wątroby reagują na różne rodzaje urazów wątroby. Obecnie istnieje niewiele opcji leczenia ciężkich ostrych uszkodzeń wątroby, a ta metoda pomoże nam znaleźć nowe metody leczenia.Ta metoda wywodzi się z mózgu. W wątrobie wyobrażaliśmy sobie, że można ją wykorzystać do badania dynamicznych zmian w różnych typach komórek, takich jak hepatocyty, komórki dróg żółciowych, komórki Kupffera i komórki śródbłonka, żeby wymienić tylko kilka. Procedurę zademonstruje Amber Wang, doktorantka i moja podopieczna.Na początek ponownie zawiesić kulki magnetyczne przez delikatne pipetowanie. Zbieraj koraliki na stojaku magnetycznym przez ponad jedną minutę i usuń supernatant. Następnie wyjmij probówkę mikrowirówki ze stojaka magnetycznego i dodaj jeden mililitr PBS, a następnie pipetuj w górę iw dół, aby umyć kulki.Umieść rurkę z powrotem na stojaku magnetycznym na dłużej niż jedną minutę, aby zebrać koraliki i usunąć PBS. Aby przygotować kulki pokryte białkiem L, dodaj 16 mikrolitrów biotynylowanego białka L do zawieszonych i umytych kulek magnetycznych i dodaj 1X PBS, aby uzyskać końcową objętość jednego mililitra, jeśli używasz 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki, lub 1,5 mililitra, jeśli używasz dwumililitrowej probówki do mikrowirówki. Inkubować kulki magnetyczne z biotynylowanym białkiem L przez 35 minut w temperaturze pokojowej na rotatorze probówkowym.Następnie umieść probówkę na stojaku magnetycznym na dłużej niż jedną minutę i usuń supernatant, aby zebrać kulki pokryte białkiem L. Wyjmij probówkę do mikrowirówki ze stojaka magnetycznego i dodaj jeden mililitr PBS z 3% buforem BSA, a następnie delikatnie pipetuj co najmniej pięć razy, aby umyć kulki pokryte białkiem L. Ponownie umieść probówkę na stojaku magnetycznym na dłużej niż jedną minutę i usuń supernatant, aby zebrać powlekane kulki.Powtórz mycie BSA kolejne cztery razy. Następnie dodaj 50 mikrogramów przeciwciał przeciwko przeciwciału GFP 19C8 i przeciwciału GFP 19F7 do kulek pokrytych białkiem L i inkubuj przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza na rotatorze probówkowym. Aby zebrać matrycę powinowactwa, umieść probówkę na stojaku magnetycznym na dłużej niż jedną minutę i usuń supernatant.Zdejmij probówkę ze stojaka magnetycznego i dodaj jeden mililitr buforu o niskiej zawartości soli. Delikatnie pipetować w górę i w dół, aby umyć matrycę powinowactwa i powtórzyć płukanie buforem o niskiej zawartości soli kolejne dwa razy. Ponownie zawiesić kulki w 200 mikrolitrach buforu o niskiej zawartości soli, aby uzyskać 200 mikrolitrów matrycy powinowactwa.Najpierw ustaw młynek do tkanek tak, aby rurki ze szkła PTFE można było umieścić na lodzie podczas homogenizacji. Wlej cztery mililitry buforu do lizy na zimno do szklanych rurek z PTFE. Połóż wątrobę na szalce Petriego.Za pomocą noża wyizoluj od 200 do 500 miligramów kawałków wątroby i przenieś do rurek ze szkła PTFE. Umieść pozostałą tkankę wątroby we wstępnie schłodzonej probówce mikrowirówkowej i błyskawicznie zamroź w ciekłym azocie. Homogenizować próbki w homogenizatorze napędzanym silnikiem, zaczynając od 300 obr./min przez co najmniej pięć uderzeń w celu oddzielenia hepatocytów od struktury wątroby.Za każdym razem opuszczaj szklaną rurkę. Zapobiegaj napowietrzaniu, które może spowodować denaturację białka, trzymając tłuczek poniżej roztworu. Następnie zwiększ prędkość do 900 obr./min, aby w pełni zhomogenizować tkanki wątroby przez co najmniej 12 pełnych ruchów.Przenieś lizat do oznakowanych i wstępnie schłodzonych probówek, z których każda zawiera nie więcej niż jeden mililitr lizatu. Aby rozpocząć lizę jądrową, należy odwirować lizat wątroby w temperaturze 2 000 razy g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut, a następnie przenieść supernatant do nowej, wstępnie schłodzonej probówki wirówkowej na lodzie. Dodać 1/9 objętości sklaranty 10% NP-40 do probówki mikrowirówki na lodzie i wymieszać roztwór, delikatnie odwracając probówkę.Szybko odwiruj probówki do mikrowirówek za pomocą miniwirówki i dodaj 1/9 objętości próbki z 10% DOC. Wymieszaj, delikatnie odwracając probówki do mikrowirówek i szybko odwiruj probówki do mikrowirówek i inkubuj na lodzie przez pięć minut. Odwirować lizat jądrowy w temperaturze 20 000 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut i przenieść supernatant do nowych, wstępnie schłodzonych probówek mikrowirówkowych na lodzie.Z każdej probówki należy pobrać 1% całkowitej objętości supernatantu jako kontrolę przed immunoprecypitacją. Umieść kontrole przed immunoprecypitacją na rotatorze rurkowym w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Zachowaj szczególną ostrożność, aby delikatnie zawiesić matrycę powinowactwa przez pipetowanie, a następnie dodać 200 mikrolitrów do każdej próbki.Inkubować lizaty w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, delikatnie mieszając na rotatorze rurowym. Aby wyizolować RNA, szybko odwiruj probówki zawierające lizaty w mini wirówce i zbierz kulki, umieszczając je na stojaku magnetycznym na co najmniej jedną minutę. Zebrać supernatant do dodatkowych probówek do mikrowirówek.Dodać jeden mililitr świeżego buforu o wysokiej zawartości soli do każdej probówki, a następnie delikatnie pipetować co najmniej pięć razy bez wprowadzania bąbelków. Zbieraj kulki na stojaku magnetycznym na lodzie przez ponad jedną minutę i usuń supernatant. Powtórz kroki prania kolejne cztery razy.Następnie wyjmij probówki do mikrowirówek ze stojaka magnetycznego i umieść w temperaturze pokojowej na pięć minut, aby się rozgrzały. Ponownie zawiesić kulki w 100 mikrolitrach buforu do lizy z 0,7 mikrolitra beta-merkaptoetanolu, aby uwolnić związany RNA z matrycy powinowactwa. Wiruj rurki przez co najmniej pięć sekund z najwyższą prędkością i szybko wiruj.Następnie inkubuj probówki w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Umieść probówki na stojaku magnetycznym na co najmniej jedną minutę, a następnie zbierz supernatant i natychmiast przystąp do oczyszczania RNA zgodnie z protokołem oczyszczania RNA w zestawie. Aby osiągnąć maksymalną jakość wyizolowanego RNA, należy wykonać wszystkie opcjonalne kroki, w tym trawienie DNazy i wszystkie etapy elucji RNA, w tym zalecane wstępne podgrzanie buforu elucyjnego do 60 stopni Celsjusza.W tym badaniu fuzja GFP-L10A i transgeny Fah były jednocześnie dostarczane w wektorze pułapki plazmidowej zawierającym transpozon do wątroby przez wstrzyknięcie hydrodynamiczne. Usunięcie nityzynonu wywołało toksyczne uszkodzenie wątroby. Barwienie immunofluorescencyjne potwierdziło koekspresję białka fuzyjnego FAH i GFP-L10A oraz rezasiedlenia hepatocytów po dwóch tygodniach ponownego zasiedlenia wątroby.Próbka w stanie spoczynku dała najwyższą wydajność białka fuzyjnego, ponieważ wszystkie hepatocyty wykazują ekspresję GFP-L10A po wstrzyknięciu AAV8-TBG-Cre. I odwrotnie, prawie żadne RNA nie było wykrywalne w kontrolach typu dzikiego, które nie miały transgenu GFP-L10A, co wskazuje, że procedura TRAP jest wysoce specyficzna i ma niskie tło. Gdy TRAP zastosowano na tkance wątroby poddawanej repopulacji hepatocytami transdukowanymi GFP-L10A, uzyskano obfite RNA wysokiej jakości.W przeciwieństwie do tego, za pomocą Bioanalyzera nie wykryto śladu RNA dla ujemnej próbki kontrolnej. Ekspresja Gsta1 była indukowana ponad dziesięciokrotnie w ponownym zasiedlaniu hepatocytów w porównaniu z hepatocytami w stanie spoczynku, podczas gdy nie wykryto wartości progowych cyklu z izolowanym przez TRAP RNA od myszy typu dzikiego z powodu braku wejściowego RNA. Podczas homogenizacji tkanki należy powoli przesuwać tłuczek, aby zapobiec napowietrzeniu.Po wyizolowaniu RNA można przeprowadzić sekwencjonowanie wysokoprzepustowe lub qPCR w celu analizy ekspresji genów. Dzięki TRAP-seq mamy teraz metodę specyficznego izolowania RNA z ponownego zasiedlania hepatocytów i analizowania zmian w ekspresji genów podczas ponownego zasiedlania wątroby. To pozwala nam zidentyfikować geny, które są zmieniane podczas tego procesu i potencjalne cele terapeutyczne w leczeniu uszkodzenia wątroby.Cykloheksymid i DTT, które są obecne w kilku, są toksyczne. Odpady powinny być zbierane i wyrzucane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.

cell-type-specific-gene-expression-profiling-in-the-mouse-liver

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Profilowanie ekspresji pojedynczych komórek umożliwia szczegółową analizę ekspresji genów w poszczególnych komórkach. Opisujemy metody izolacji kardiomiocytów oraz przygotowania otrzymanych lizatów do analizy całego transkryptomu za pomocą mikromacierzy lub qPCR specyficznych celów.

Profilowanie transkrypcyjne pojedynczych komórek kardiomiocytów dorosłej myszy

Transfekcja in vivo nagiego DNA poprzez hydrodynamiczne dostarczanie genów wprowadza geny do tkanki zwierzęcia z minimalną reakcją zapalną. Generowane są wystarczające ilości produktu genowego, aby można było analizować funkcję i regulację genów, a także strukturę i funkcję białek.

Przejściowa ekspresja białek przez hydrodynamiczne dostarczanie genów u myszy

Prezentujemy system hodowli erytroblastów wątroby in in vitro u myszy płodowej, który analizuje wczesne i późne stadia końcowej erytropoezy. System ten ułatwia analizę funkcjonalną określonych genów na różnych etapach rozwoju.

System hodowli wątroby płodu myszy do analizy funkcji genów docelowych we wczesnych i późnych stadiach erytropoezy terminalnej

Ten protokół opisuje, jak ocenić ekspresję dużej liczby genów na poziomie klonalnym. Jednokomórkowy RT-qPCR daje wysoce wiarygodne wyniki z dużą czułością dla setek próbek i genów.

Ekspresja genów w pojedynczej komórce za pomocą multipleksu RT-qPCR w celu scharakteryzowania heterogeniczności rzadkich populacji limfoidalnych

Tutaj zaprezentowaliśmy metodę sekwencjonowania mRNA z multipleksowaną pojedynczą komórką do profilowania ekspresji genów w tkankach embrionalnych myszy. Metoda sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki oparta na kropelkach (scRNA-Seq) w połączeniu ze strategiami multipleksowania może profilować pojedyncze komórki z wielu próbek jednocześnie, co znacznie obniża koszty odczynników i minimalizuje eksperymentalne efekty wsadowe.

Multipleksowana analiza sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki komórek embrionalnych myszy

Ten protokół zapewnia prostą i niezawodną metodę produkcji żywotnych, precyzyjnie wyciętych plastrów wątroby od myszy. Próbki tkanek ex vivo mogą być utrzymywane w laboratoryjnych warunkach hodowli tkankowej przez wiele dni, zapewniając elastyczny model do badania patobiologii wątroby.

Precyzyjnie wycięte plastry wątroby jako model biologii wątroby ex vivo

Tutaj przedstawiamy i demonstrujemy protokół izolacji pierwotnych komórek śródbłonka sinusoidalnego wątroby myszy (LSEC). Protokół opiera się na perfuzji kolagenazy wątrobowej, oczyszczaniu komórek niemiąższowych przez wirowanie z niską prędkością oraz selekcji kulek magnetycznych CD146. Zajmujemy się również fenotypowaniem i charakteryzacją tych izolowanych LSEC za pomocą cytometrii przepływowej i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Izolacja i charakterystyka pierwotnych sinusoidalnych komórek śródbłonka wątroby myszy

Protokół ten opisuje metodę izolowania RNA z określonych histologicznych obszarów tkanki wątroby myszy z unieruchomioną o Optymalnej Temperaturze Cięcia z zastosowaniem złożonego tkanki wątroby za pomocą mikrosekcji laserowej, umożliwiającej ukierunkowaną analizę ekspresji genów w dalszej fazie.

Mikroskop laserowego przechwytywania tkanki wątroby myszy utrwalonej paraformaldehydem do analizy RNA

Niniejsza procedura opisuje sposób tworzenia pierwotnych kultur komórek krwiotwórczych z szpiku kostnego myszy, po których następuje transfekcja przy użyciu systemu elektroporacji Gene Pulser MXCell.

Przygotowanie pierwotnych kultur komórek hematopoetycznych z szpiku kostnego myszy do elektroporacji

W niniejszej pracy przedstawiamy dwie techniki manipulowania ekspresją genów w komórkach zwojowych siatkówki (RGCs) myszy za pomocą elektroporacji in utero oraz ex vivo. Techniki te pozwalają badać, w jaki sposób zmiany w ekspresji genów wpływają na rozwój RGCs, prowadzenie aksonów oraz właściwości funkcjonalne.

Elektroporacja in utero oraz ex vivo w celu ekspresji genów w komórkach zwojowych siatkówki myszy

Poznaj metodę TRAP-seq do izolacji RNA z hepatocytów odnawiających się w wątrobie myszy. Technika umożliwia analizę zmian ekspresji genów podczas repopulacji wątroby i identyfikację potencjalnych celów terapeutycznych.

Profilowanie ekspresji genów specyficzne dla typu komórki w wątrobie myszy

Przeglądaj więcej filmów