Specyficzne tkankowo profilowanie ekspresji miRNA w wycinkach serca myszy przy użyciu hybrydyzacji in situ

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie mikroRNA, dostarczając narzędzi do wykrywania względnej lkalizacji zarówno cząsteczek białka, jak i mikroRNA. Główną zaletą tej techniki jest to, że można wykryć zarówno cząsteczki białka, jak i mikroRNA z tego samego wycinka tkanki. Protokół ten rozpoczyna się od ponownego nawodnienia tkanek zamontowanych na szkiełku.

Podgrzej szkiełka w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 10 minut w piecu do hybrydyzacji. Parafina powinna widocznie się topić. Następnie inkubować szkiełka w szklanym słoiku Coplin zawierającym dostępny w handlu środek czyszczący przez 10 minut.

Zrób to dwa razy. Następnie przenieś szkiełka z prania do mycia, aby ponownie nawodnić tkanki. Po uwodnieniu inkubuj tkanki w roztworze roboczym proteinazy K w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut.

Aby usunąć proteinazę K, umyj szkiełka w 1x PBS dwa razy. Teraz napraw tkanki. Najpierw wykonaj zbiorniki na szkiełkach za pomocą hydrofobowego pisaka, aby narysować wodoodporny okrąg wokół preparatów.

Następnie nałóż 500 mikrolitrów 4% roztworu PFA w barierę i inkubuj szkiełka w dygestorium. Aby usunąć utrwalacz, umyj szkiełka w słoiku Coplin zawierającym PBS przez pięć minut, dwa razy w temperaturze pokojowej. Następnie myj szkiełka w 0,13-molowym 1-metyloimidazolu przez 10 minut.

Zrób to w dygestoria w temperaturze pokojowej i wykonaj to pranie dwukrotnie. Dodać utrwalacz EDC i inkubować w temperaturze pokojowej w dygestorium przez godzinę. Spłucz szkiełka 50-milimolowym Tris.

Aby przygotować się do hybrydyzacji, najpierw zbuduj nawilżoną komorę. Załaduj dwa kawałki bibuły filtracyjnej lub bibułki na dno pudełka i zwilż bibułę mieszaniną jeden do jednego formamidu i 1x SSC. Następnie nałóż 200 mikrolitrów wstępnie podgrzanego roztworu hybrydyzacyjnego na każde szkiełko i inkubuj nawilżoną komorę szkiełek przez jedną do trzech godzin w temperaturze 50 stopni Celsjusza.

Po inkubacji zastąp roztwór hybrydyzacyjny 250 mikrolitrami roztworu sondy i przykryj szkiełka nakrywką bez RNaz. Staraj się unikać zatrzymywania pęcherzyków powietrza pod szkiełkiem nakrywkowym. Teraz ostrożnie uszczelnij komorę parafilmem i inkubuj szkiełka przez noc w temperaturze około 30 stopni Celsjusza poniżej temperatury topnienia RNA sondy.

Może być wymagana optymalizacja. Oprócz ustawienia odpowiedniej temperatury inkubacji, różne mikroRNA są wyrażane na różnych poziomach, więc może być również wymagana optymalizacja pod kątem stężenia sondy, aby uzyskać optymalny sygnał. Po hybrydyzacji wykonaj pranie rygorystyczne.

Najpierw był w 2x SSC w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez pięć minut lub do momentu, gdy pokrywa się poluzuje. Następnie wykonaj dwa prania w 2x SSC w temperaturze pokojowej, każde przez pięć minut. Następnie, kontynuując w temperaturze pokojowej, myj szkiełka przez pięć minut w 0,2x SSC, następnie pięć minut w PBST, a na koniec pięć minut w 1x PBS.

W tym momencie hybrydy RNA-RNA są stabilne, a warunki rygorystyczne dla RNA nie są już potrzebne. W celu wykrycia przeciwciał DIG najpierw popraw bariery hydrofobowe i nałóż 500 mikrolitrów roztworu blokującego na trzydzieści minut. Inkubować szkiełka w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze.

Następnie usuń roztwór blokujący i zastąp go 500 mikrolitrami roztworu przeciwciał DIG. Inkubować szkiełka w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze przez godzinę. Następnie, używając słoików Coplin, umyj szkiełka trzy razy w PBST przez pięć minut na mycie.

Następnie umyj szkiełka w roztworze do wstępnego barwienia przez pięć minut dwa razy. Następnie przenieś szkiełka do polipropylenowego słoika do kopertowania slajdów i dodaj 20 mililitrów roztworu podłoża AP. Teraz inkubuj szkiełka w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez sześć do 24 godzin, chroniąc przed światłem.

Przy pierwszym użyciu podłoża AP ważne jest, aby śledzić reakcję. W odstępach dwugodzinnych sprawdzaj rozwój koloru na szkiełkach za pomocą mikroskopu, aż do ustalenia optymalnego czasu inkubacji. Aby usunąć nadmiar substratu AP, umyj szkiełka dwukrotnie w roztworze KTBT przez pięć minut na pranie, a następnie jedno pranie w PBS przez pięć minut.

Aby wykryć przeciwciało cTNT, najpierw zablokuj tkanki na godzinę. Następnie nanieść 200 mikrolitrów roztworu przeciwciała cTNT i inkubować szkiełka przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza w wilgotnej komorze. Następnego dnia umyj szkiełka w słoiku Coplin zawierającym PBS przez pięć minut.

Zrób to trzy razy. Następnie nanieść 250 mikrolitrów roztworu przeciwciała anty-króliczego 568 i inkubować szkiełka przez godzinę w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze. Aby wypłukać nadmiar przeciwciał drugorzędowych, należy użyć trzech pięciominutowych płukań w PBS.

Następnie, w razie potrzeby, nałóż 250 mikrolitrów roztworu roboczego DAPI i inkubuj szkiełka przez jedną minutę, chroniąc przed światłem. Aby usunąć nadmiar plamy DAPI, użyj dwóch pięciominutowych prań PBS, a po praniu zamontuj szkiełka. Hybrydyzacja in-situ mikroRNA została zoptymalizowana na odcinkach serca myszy przy użyciu zaszyfrowanego mikroRNA do kontroli negatywnej i snRNA U6 jako kontroli pozytywnej.

Specyficzną dla kardiomiocytów ekspresję mikroRNA-182 oceniano w skrawkach serca myszy kontrolnych i myszy z nadekspresją PlGF. Myszy były nosicielami transgenu PlGF pod promotorem alfa-MHC i rozwinęły przerost serca, wtórny do zwiększonej angiogenezy, w ciągu sześciu tygodni od aktywacji transgenu. Protokół barwienia ujawnił zwiększoną ekspresję mikroRNA-182 w sercach myszy PlGF.

Następnie, aby określić, które typy komórek wyrażają mikroRNA-182, te same sekcje zostały wybarwione immunologicznie pod kątem cTNT. Zastosowano również barwienie DAPI. Zarówno w kontrolnych, jak i mysich odcinkach serca PlGF mikroRNA-182 znaleziono w przedziale jądrowym komórek kardiomiocytów cTNT-dodatnich.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić hybrydyzację mikroRNAzy, a następnie barwienie immunologiczne białek. Próbując tej procedury, bardzo ważne jest, aby pamiętać o utrzymaniu warunków wolnych od RNAzy przez cały pierwszy dzień, podczas wszystkich etapów prowadzących do hybrydyzacji prop. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak Western blot w PCR w czasie rzeczywistym, aby odpowiedzieć na pytania, takie jak, jakie są względne poziomy ekspresji tego konkretnego mikroRNA w różnych tkankach lub tego konkretnego białka w tym samym odcinku tkanki.

Nie zapominaj, że praca z utrwalaczami, takimi jak PFA i ADC, może być bardzo niebezpieczna. Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, w tym noszenie rękawiczek i fartuchów laboratoryjnych, a także używanie wyciągów.