Ekspresja genów w pojedynczej komórce za pomocą multipleksu RT-qPCR w celu scharakteryzowania heterogeniczności rzadkich populacji limfoidalnych

Ten protokół opisuje, jak ocenić ekspresję dużej liczby genów na poziomie klonalnym. Jednokomórkowy RT-qPCR daje wysoce wiarygodne wyniki z dużą czułością dla setek próbek i genów.

Ogólnym celem tego eksperymentu jest obserwacja ekspresji wielu genów w pojedynczych komórkach. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii, takie jak niejednorodność sygnatur molekularnych w populacji komórek lub rzadka sygnatura molekularna. Główną zaletą tej techniki jest to, że specyficzne sygnatury molekularne z co najmniej 48 różnymi genami mogą być oceniane w wielu komórkach w tym samym czasie.

Rozpocznij tę procedurę od przygotowania mieszanki przed amplifikacją dla 48 reakcji w 1,5 mililitrowej tubie. Dodać do probówki 240 mikrolitrów specyficznego buforu retrotranskrypcyjnego, 62,4 mikrolitrów buforu o niskiej zawartości EDTA TE i 9,6 mikrolitrów polimerazy DNA Taq. Za pomocą pipety elektronicznej rozprowadź 6,5 mikrolitra mieszanki przed amplifikacją do każdego z 48 dołków w 96-dołkowej, jednokomórkowej płytce.

Następnie przygotuj 0,2-krotną mieszankę testową w 1,5-mililitrowej probówce. Dodaj do probówki 1,4 mikrolitra każdego podkładu. Dostosuj końcową objętość do 140 mikrolitrów z niskim buforem EDTA TE.

Za pomocą pipety elektronicznej rozprowadź 2,5 mikrolitra mieszanki testowej 0,2x do 48 dołków w 96-dołkowej, jednokomórkowej płytce sortującej, zawierającej mieszaninę przed amplifikacją. Uszczelnij płytkę folią osłonową. Obracaj płytkę i obracaj ją 280 razy g przez jedną minutę.

Pojedyncze wrodzone komórki limfoidalne wątroby (ILC) zostaną posortowane przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją. Rozpocznij tę procedurę od użycia pustej płytki 96-dołkowej jako testu. Umieść płytkę testową na uchwycie płytki tak, aby jedna studzienka znajdowała się po lewej stronie i w kierunku eksperymentatora.

Wyreguluj uchwyt płytki, aby uzyskać kroplę w środku dołka z koralikami weryfikacyjnymi. Po prawidłowym wyregulowaniu umieścić 96-dołkową, jednokomórkową płytkę sortującą zawierającą mieszaninę testową i wstępne amplifikację na uchwycie płytki. Narysuj układ tablic i posortuj po jednej komórce na studzienkę w populacji bramkowanej.

Prawidłowe ustawienie każdej komórki na 96-dołkowej, jednokomórkowej płytce sortującej jest niezbędne, a układ płytki powinien być przechowywany w oprogramowaniu arkusza kalkulacyjnego. Pozostaw jedną studzienkę zawierającą 0,2-krotną mieszankę testową i mieszankę przed amplifikacją bez komórek, jako kontrolę bez wprowadzania danych. Opcjonalnie pozostaw dwa rzędy po sześć studzienek do rozcieńczenia cDNA jako kontrolę wydajności startera.

Natychmiast po sortowaniu pojedynczych komórek należy odwirować i odwirować 96-dołkową, jednokomórkową płytkę sortującą. Umieść płytkę w termocyklerze. Wykonaj odwrotną transkrypcję i wstępną amplifikację zgodnie ze wskazaniami.

Aby uzyskać wystarczającą ilość materiału, wymagana jest wstępna amplifikacja określonych genów docelowych na posortowanych pojedynczych komórkach. Rozcieńczyć wstępnie amplifikowane próbki, dodając 36 mikrolitrów buforu o niskiej zawartości EDTA TE do każdej studzienki. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować 191 mikrolitrów Master Mix, pipetując 175 mikrolitrów qPCR Master Mix i 17,5 mikrolitrów odczynnika ładującego próbkę do 1,5 mililitrowej probówki.

Na nowej 96-dołkowej płytce rozprowadź 3,6 mikrolitra Master Mix do każdego z 48 dołków. To jest 96-dołkowa płytka na próbkę. Przenieś 2,9 mikrolitra wstępnie amplifikowanego cDNA z 96-dołkowej, jednokomórkowej płytki sortującej na nową 96-dołkową płytkę do próbki, zachowując tę samą pozycję dla każdej próbki między dwiema płytkami.

Przygotuj 96-dołkową płytkę testową, rozprowadzając trzy mikrolitry odczynnika ładującego test do każdej z 48 dołków na nowej 96-dołkowej płytce. Dodaj trzy mikrolitry starterów do każdej studzienki. Zasadnicze znaczenie ma prawidłowe umieszczenie każdego startera na 96-dołkowej płytce testowej.

Zachowaj układ płyty w oprogramowaniu do arkuszy kalkulacyjnych. Aby rozpocząć tę procedurę, umieść zintegrowany obwód mikroprzepływowy (IFC) na stole i sprawdź zawory za pomocą strzykawki. Zdjąć nasadkę strzykawki, umieścić ją prostopadle do jednego zaworu i mocno docisnąć.

O-ring powinien się poruszać. Napełnij chip płynem z przewodu sterującego. Po powtórzeniu poprzednich kroków z drugim zaworem usuń czarną folię z dolnej części chipa.

Załaduj chip do kontrolera IFC. Na ekranie kontrolera IFC wybierz pozycję prime, a następnie uruchom. Następnie wysuń chip i ponownie zamknij czarną folię na spodzie chipa.

Za pomocą pipety ośmiokanałowej przenieś pięć mikrolitrów z 96-dołkowej płytki testowej na jedną lub lewą stronę chipa. Zmień końcówki dla każdej studzienki chipa. Unikaj tworzenia bąbelków, a jeśli pojawią się bąbelki, użyj końcówek o pojemności 10 mikrolitrów, aby je usunąć.

Wypełnij lewą stronę chipa zgodnie ze wskazaniami. W ten sam sposób napełnij prawą stronę chipa pięcioma mikrolitrami z 96-dołkowej płytki na próbkę. Aby ten eksperyment zakończył się sukcesem, konieczne jest, aby układ IFC był prawidłowo wypełniony w celu prawidłowego załadowania do kontrolera IFC.

Usuń niebieską folię z dolnej części chipa i załaduj chip do kontrolera IFC. Na ekranie kontrolera IFC wybierz opcję Załaduj mieszanie, a następnie uruchom. Po zakończeniu wysuń chip i ponownie zamknij niebieską folię na spodzie chipa.

Aby uruchomić chip, najpierw wybierz oprogramowanie do zbierania danych na komputerze mikroprzepływowym qPCR. Po uruchomieniu wybierz nowy przebieg. Wybierz opcję wysuń i załaduj chip.

Po skonfigurowaniu oprogramowania zgodnie z opisem w protokole tekstowym wybierz opcję uruchom uruchom. Reakcja potrwa około 90 minut. Aby rozpocząć analizę danych, otwórz oprogramowanie do analizy PCR w czasie rzeczywistym, wybierz plik i otwórz, znajdź folder eksperymentu i wybierz chip run dot b m jeden plik.

Kliknij widok analizy, tabelę wyników i widok mapy cieplnej. Pola oznaczone znakiem x znajdują się poniżej progowego poziomu detekcji i/lub mają złe krzywe wzmocnienia. Nazwij przykłady.

Przejdź do konfiguracji próbki i wybierz nowy program SBS 96. Kliknij mapowanie i wybierz układ próbki zgodnie z układem 96-dołkowej płytki próbki. Skopiuj i wklej przykładowy projekt układu z oprogramowania do obsługi arkuszy kalkulacyjnych.

Zdefiniuj wklejony układ jako nazwę próbki. Użyj tej samej procedury, aby nazwać testy. Wprowadź nazwy starterów w ustawieniach detektora i zdefiniuj wklejony układ jako nazwę detektora.

Kliknij widok analizy i przeanalizuj. Wybierz plik, wyeksportuj go i zapisz jako wyniki mapy skupień. Za pomocą cytometrii przepływowej populacje ILC w wątrobie posortowano na podstawie szeroko wyrażonych markerów ILC i zdefiniowano trzy odrębne populacje.

Prawidłowo załadowany pojedynczy komórkowy chip ekspresji genów z multipleksem powinien pojawić się z prostymi liniami i rzędami, z każdą komorą reakcyjną wypełnioną i w tym samym wymiarze. Nieprawidłowo załadowany chip będzie miał puste linie i rzędy komór reakcyjnych, a także linie gięcia. Ten rysunek amidytu fluoresceiny prawidłowo załadowanego chipa pokazuje różnice w jasności komory reakcyjnej pojawiające się po kilku cyklach.

Komory reakcyjne z sygnałem wzmacniającym wydają się jaśniejsze niż komory reakcyjne bez sygnałów wzmocnienia lub z niskimi sygnałami. Po odpowiednim sortowaniu, wstępnej amplifikacji i ładowaniu komórek, populacja ILC wydawała się niejednorodna pod względem ekspresji genów w wątrobie dorosłych myszy typu dzikiego. Po lewej stronie znajduje się mapa cieplna bez modyfikacji.

Po prawej stronie znajduje się zmodyfikowana mapa cieplna uzyskana po zdefiniowaniu próbki i nazwy testu. Korzystając z oprogramowania online, zidentyfikowano specyficzne dla komórki sygnatury ekspresji genów i zależności populacji komórek. Każda linia reprezentuje gen, a każdy wiersz reprezentuje tę samą komórkę, a trzy populacje komórek są reprezentowane na niebiesko, czerwono i zielono.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dziewięciu godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby uważnie śledzić orientację płytki pod kątem rozkładu komórek i starterów. Po jej opracowaniu technika ta utorowała naukowcom drogę do zbadania rzadkich i specyficznych sygnatur molekularnych w populacjach komórek.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ocenić ekspresję wielu genów w wielu pojedynczych komórkach w tym samym czasie, po prawidłowym sortowaniu komórek, wstępnej amplifikacji i załadowaniu.