Izolacja i charakterystyka pierwotnych sinusoidalnych komórek śródbłonka wątroby myszy

Tutaj przedstawiamy i demonstrujemy protokół izolacji pierwotnych komórek śródbłonka sinusoidalnego wątroby myszy (LSEC). Protokół opiera się na perfuzji kolagenazy wątrobowej, oczyszczaniu komórek niemiąższowych przez wirowanie z niską prędkością oraz selekcji kulek magnetycznych CD146. Zajmujemy się również fenotypowaniem i charakteryzacją tych izolowanych LSEC za pomocą cytometrii przepływowej i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Tutaj demonstrujemy nasz protokół pierwotnej izolacji sinusoidalnych komórek wątroby myszy lub izolacji LSEC. Protokół składa się z perfuzji kolagenazy wątrobowej i ultrawirowania z niską prędkością w celu oczyszczenia komórek niemiąższowych i selekcji kulek magnetycznych CD146. Nasza metoda izolacji LSEC jest bardzo skuteczna i ma zastosowanie do zdrowej i chorej wątroby myszy.

Izolowane LSEC wykazują wysoką czystość oraz zachowują strukturę i funkcję. LSEC izolowane przy użyciu tego protokołu są optymalne do badań funkcjonalnych i molekularnych oraz generowania danych multiomicznych. Protokół ten będzie pomocny w badaniu komunikacji międzykomórkowej w wątrobie.

Zacznij od pokrycia 10-centymetrowych naczyń hodowlanych trzema mililitrami roztworu kolagenu. Następnie inkubuj naczynia w temperaturze pokojowej przez godzinę. Po godzinie usuń nadmiar płynu z powlekanej powierzchni.

Umyj naczynia PBS trzy razy i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Ustaw podgrzewany i nawilżony aparat do perfuzji recyrkulacyjnej. Płucz system perfuzyjny za pomocą 10% wybielacza przez pięć minut.

Następnie ponownie przepłucz system sterylną wodą przez kolejne 10 minut. Odcedź płyn do płukania tak bardzo, jak to możliwe, przed perfuzją roztworem kolagenazy. Przelej roztwór kolagenazy przez system perfuzyjny, aby podgrzać go do 37 stopni Celsjusza.

Ustaw prędkość pompy na prędkość pierwszą na pokrętle regulacji prędkości. Utrzymuj prędkość na tym samym poziomie przez całą procedurę. Zważ mysz do zabiegu.

Następnie przymocuj go do powierzchni operacyjnej. Spryskaj brzuch myszy 70% etanolem. Za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj nacięcie o długości około pięciu centymetrów, zaczynając od dolnej części brzucha aż do wyrostka mieczykowatego.

Następnie wykonaj dwa boczne nacięcia za pomocą małych nożyczek do tęczówki po każdej stronie brzucha, aby całkowicie odsłonić narządy jamy brzusznej. Umieść osłonę cewnika dożylnego pod grzbietem zwierzęcia, aby podnieść i wypoziomować brzuch. Używając zwykłych, zakrzywionych kleszczy opatrunkowych, delikatnie pociągnij jelita i żołądek na lewo od zwierzęcia.

Następnie umieść szew chirurgiczny 5-0 pod żyłą główną dolną lub IVC, tuż pod odsłoniętą lewą nerką. Zawiąż luźny zaczep w szwie. Następnie umieść kolejny szew chirurgiczny 5-0 wokół żyły wrotnej wątroby.

Umieść szew tuż nad punktem rozgałęzienia żyły śledziony żyły wrotnej wątroby. Ponownie zawiąż luźny zaczep w szwie. Używając szwu żyły wrotnej jako naprężenia, wprowadź cewnik dożylny o rozmiarze 20 w żyle wznów wątroby jeden centymetr poniżej miejsca, w którym rozgałęzia się na prawą i lewą żyłę wrotną wątroby.

Następnie wsuń cewnik w górę żyły, ale utrzymuj go poniżej obszaru rozgałęzienia. Pozwól, aby krew przepływała w dół cewnika, aż zacznie kapać. Zabezpiecz cewnik dożylny szwem do żyły wrotnej.

Użyj przewodu dożylnego, aby podłączyć butelkę dożylną z buforem A do cewnika. Następnie należy przepłukać wątrobę tym roztworem, unikając przedostawania się powietrza do systemu. Zawiąż szew wokół IVC poniżej nerki.

Następnie przeciąć IVC poniżej szwu, aby zwierzę mogło się wykrwawić. Po perfuzji odetnij żołądek, jelita, śledzionę i inne wnętrzności przyczepione do wątroby. Następnie odetnij przeponę i główne naczynia z jamy klatki piersiowej.

Usuń wątrobę ze zwierzęcia i umieść ją na tacy perfuzyjnej. Ostrożnie wyjmij linię dożylną i podłącz roztwór kolagenazy do komory recyrkulacyjnej. Pozwól wątrobie ulegać perfuzji, aż kapsułka stanie się wymodelowana i stanie się papkowata.

Powinno to zwykle zająć od 10 do 15 minut. Po strawieniu wyjmij wątrobę z komory i umieść ją na 10-centymetrowej szalce Petriego z około 20 mililitrami DMEM bez surowicy. Delikatnie rozerwij wątrobę kilkoma końcówkami pipet i wyrzuć drzewo żółciowe.

Następnie przefiltruj zawiesinę wątroby przez sitko komórkowe o średnicy 70 mikrometrów do 50-mililitrowej stożkowej probówki. Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 50 razy G przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Następnie należy pobrać supernatant zawierający niemiąższowe komórki wątroby.

Odwirować supernatant w temperaturze 300 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie zbierz osad komórkowy i zawieś go ponownie w jednym mililitrze buforu izolacyjnego. Określ numer komórki za pomocą automatycznego licznika komórek, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.

Następnie odwiruj zawiesinę komórek. Całkowicie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad za pomocą 90 mikrolitrów buforu izolacyjnego na 10 milionów komórek. Dodaj 10 mikrolitrów mikrokulek CD146 na 10 milionów komórek.

Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby umyć komórki, dodaj od jednego do dwóch mililitrów buforu izolacyjnego na 10 milionów komórek. Odwirować roztwór o stężeniu 300 razy G przez 10 minut.

Następnie należy całkowicie odessać supernatant i ponownie zawiesić do miliarda komórek w 500 mikrolitrach bufora izolacyjnego. Następnie należy przygotować kolumnę separacyjną, przepłukując ją trzema mililitrami buforu izolacyjnego. Nałóż zawiesinę komórek na kolumnę wypełnioną 70-mikrometrowymi filtrami do wstępnej separacji.

Przemyć kolumnę trzema mililitrami buforu izolacyjnego trzy razy. Następnie wyjmij kolumnę z separatora i umieść ją na 15-mililitrowej probówce wirówkowej. Odpipetować pięć mililitrów buforu izolacyjnego na kolumnę.

Aby odzyskać komórki oznaczone kulkami magnetycznymi, należy mocno wcisnąć tłok do kolumny, aby wypłukać komórki. Na koniec odwiruj komórki w temperaturze 300 razy G przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza. Izolowane LSEC markery czystości i powierzchni oceniano za pomocą cytometrii przepływowej.

Analiza danych i strategia bramkowania dla bramkowanych LSEC i singletów są oparte na danych dotyczących rozproszenia do przodu i rozproszenia bocznego. Wyizolowane LSEC wybarwiono barwnikiem żywotności i kombinacją przeciwciał CD45, CD146 i Stabilin-2. Żywotne LSEC bramkowano na populacji CD45 ujemnej i analizowano pod kątem ekspresji CD146 i stabiliny-2.

Na podstawie tych danych potwierdzono, że wyizolowane LSEC miały ponad 94% żywotności i ponad 90% czystości. Specyficzny dla LSEC fenotyp wyizolowanych komórek został następnie potwierdzony za pomocą mikroskopii świetlnej i skaningowej mikroskopii elektronowej. Wyizolowane LSEC hodowano w kompletnej pożywce wzrostowej przez sześć godzin i badano za pomocą mikroskopii świetlnej.

Białe strzałki na obrazie SEM wskazują okna LSEC, które są charakterystyczną cechą morfologiczną LSEC. Kluczowymi krokami zapewniającymi całkowitą perfuzję tkanki wątroby są prawidłowe ułożenie taśmy cewnika, unikanie wprowadzania powietrza do cewnika oraz optymalny czas trawienia kolagenazy. Wysokiej jakości LSEC uzyskany przy użyciu naszego protokołu ułatwi identyfikację molekularnego mechanizmu funkcji LSEC i poprawi nasze zrozumienie ich roli w komunikacji międzykomórkowej w wątrobie, w zdrowiu i chorobie.