Name: Izolacja i charakterystyka pierwotnych sinusoidalnych komórek śródbłonka wątroby myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Poznaj metodę izolacji pierwotnych komórek śródbłonka sinusoidalnego wątroby myszy przy użyciu perfuzji kolagenazowej i selekcji magnetycznej. Protokół zapewnia ponad 90% czystość i ponad 94% żywotność komórek LSEC.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases of the NIH (1RO1DK122948 do SHI) oraz NIH Silvio O. Conte Digestive Diseases Research Core Centers P30 (DK084567). Wsparcia dla KF udzieliły również zagraniczne stypendia badawcze Japońskiego Towarzystwa Promocji Nauki (JSPS). Chcielibyśmy również podziękować dr Gregory'emu J. Goresowi i Stevenowi Bronkowi za ich oryginalny projekt i optymalizację aparatu do perfuzji kolagenazy.

Protokoły dla zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzeniem przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Kliniki Mayo. Ośmiotygodniowe samce myszy C57BL/6J zakupiono w Jackson Laboratory. Myszy trzymano w obiekcie o kontrolowanej temperaturze 12:12 godzin cyklu światło-ciemność z bezpłatnym dostępem do diety.
1. Przygotowanie naczynia lub talerza do hodowli pokrytej kolagenem
<ol>
	<li>Aby uzyskać 50 ml kwasu octowego o stężeniu 0,02 mol/l, dodaj 0,6 ml lodowatego kwasu octowego do 49,4 ml H2O.</li>
	<li>Przygotuj 50 μg/ml kolagenu typu I w 0,02 mol/l kwasu octowego. Rozcieńczenie zależy od stężenia partii.</li>
	<li>Pokryj 10 cm szalki hodowlane 3 ml roztworu kolagenu. Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 1 godz. 
	UWAGA: W przypadku używania innego naczynia lub talerza do hodowli, objętość roztworu powlekającego należy dostosować w zależności od obszaru hodowli, zwykle stosuje się 6-10 μg/cm2.</li>
	<li>Usuń nadmiar płynu z powlekanej powierzchni i przemyj 3 razy solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Pozostaw naczynia do wyschnięcia na powietrzu.</li>
	<li>Jeśli roztwór kolagenu nie jest sterylny, wysterylizuj naczynia pokryte kolagenem przez wystawienie na działanie światła ultrafioletowego (UV) przez 10 minut w sterylnym kapturze do hodowli tkanek.</li>
</ol>
2. Konfiguracja sprzętu
<ol>
	<li>Ustaw podgrzewany i nawilżony aparat do perfuzji recyrkulacyjnej, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 1B.</li>
	<li>Płucz system perfuzyjny za pomocą 10% wybielacza przez 5 minut, a następnie sterylną wodą przez kolejne 10 minut.</li>
	<li>Odcedź płyn do płukania tak bardzo, jak to możliwe, przed perfuzją roztworu kolagenazy.</li>
	<li>Przepuścić roztwór kolagenazy przez system perfuzyjny (jak pokazano na rysunku <silna klasa="xfig">Rysunek 1B), aby go podgrzać w temperaturze 37 °C. Ustawić szybkość pompowania na prędkość 1, jak pokazano na pokrętle regulacji prędkości (równą 40 ml/min).</li>
	<li>Utrzymuj tę prędkość na tym samym poziomie przez cały czas trwania procedury. Roztwór kolagenazy należy ponownie wykorzystać w obiegu zamkniętym w ciągu dnia izolacji LSEC. 
	UWAGA: Prędkość pompy jest ustalona na 1, aby uniknąć nacisku mechanicznego, który mógłby zaburzyć stan biologiczny LSEC.</li>
</ol>
3. Zabieg chirurgiczny
<ol>
	<li>Zważ mysz.</li>
	<li>Wstrzyknąć dootrzewnowo (IP) 90 mg/kg masy ciała ketaminy i 10 mg/kg masy ciała ksylazyny.</li>
	<li>Gdy mysz przestanie reagować na bolesne bodźce, przymocuj mysz do powierzchni chirurgicznej, jak pokazano na rysunku <silna klasa="xfig">Rysunek 1B.</li>
	<li>Spryskaj brzuch myszy 70% etanolem. Za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj nacięcie o długości ~5 cm, zaczynając od dolnej części brzucha aż do wyrostka mieczykowatego.</li>
	<li>Następnie wykonaj dwa boczne nacięcia za pomocą małych nożyczek do tęczówki po każdej stronie brzucha, aby w pełni odsłonić narządy jamy brzusznej.</li>
	<li>Umieść osłonę cewnika dożylnego (IV) pod grzbietem zwierzęcia, aby podnieść i wyrównać brzuch.</li>
	<li>Używając zwykłych, zakrzywionych kleszczy opatrunkowych, delikatnie pociągnij jelita i żołądek na lewo od zwierzęcia.</li>
	<li>Umieść szew chirurgiczny 5-0 pod żyłą główną dolną (IVC) tuż pod odsłoniętą lewą nerką. Zawiąż luźny zaczep w szwie.</li>
	<li>Umieść kolejny szew chirurgiczny 5-0 wokół żyły wrotnej wątroby (PV) tuż nad punktem rozgałęzienia żyły śledziony od PV wątroby. Zawiąż luźny zaczep w szwie.</li>
	<li>Używając szwu PV jako naciągu, wprowadź cewnik dożylny 20 G do PV wątroby 1 cm poniżej miejsca, w którym rozgałęzia się na prawą i lewą PV wątroby.</li>
	<li>Wsuń cewnik w górę żyły, ale utrzymuj go poniżej obszaru rozgałęzienia. Pozwól, aby krew przepływała w dół cewnika, aż zacznie kapać.</li>
	<li>Z częścią buforu A (Tabela 1) w butelce dożylnej (IV) umieszczonej nad obszarem operacyjnym, użyj przewodu dożylnego i podłącz go do cewnika. Przepłukać wątrobę tym roztworem, unikając przedostawania się powietrza do systemu.</li>
	<li>Zawiąż szew wokół żyły głównej dolnej poniżej nerki. Umożliwi to wątrobie retro perfuzję.</li>
	<li>Przeciąć IVC poniżej szwu, aby zwierzę mogło się wykrwawić. 
	UWAGA: Ten krok należy wykonać szybko, aby uniknąć przekrwienia wątroby.</li>
	<li>Zabezpiecz cewnik dożylny za pomocą szwu PV.</li>
	<li>Po zmieszaniu odetnij żołądek, jelita, śledzionę i inne wnętrzności przyczepione do wątroby.</li>
	<li>Odetnij przeponę i główne naczynia z jamy klatki piersiowej. Usuń wątrobę ze zwierzęcia i umieść ją na tacy perfuzyjnej.</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij przewód dożylny i podłącz roztwór kolagenazy do komory recyrkulacyjnej. 
	UWAGA: Kroki 3.16-3.18 należy wykonać w ciągu 5 minut, aby wątroba nie była zbyt długo perfuzjowana buforem A. Bądź bardzo ostrożny, aby nie dopuścić do przedostania się pęcherzyków powietrza do wątroby.</li>
	<li>Pozwól wątrobie ulegać perfuzji, aż kapsułka stanie się cętkowana i stanie się papkowata (10-15 minut lub dłużej, okres różni się w zależności od różnych partii kolagenazy).</li>
	<li>Podczas gdy wątroba jest w perfuzji, upewnij się, że zwierzę nie żyje, zanim wyrzucisz je do worka do sekcji zwłok.</li>
	<li>Po strawieniu wyjmij wątrobę z komory i umieść ją na 10-centymetrowej szalce Petriego z około 20 ml bezsurowicy Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM).</li>
	<li>Delikatnie rozerwij wątrobę kilkoma końcówkami pipet i wyrzuć drzewo żółciowe.</li>
	<li>Przefiltrować zawiesinę wątroby przez sitko o wielkości 70 μm do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórkową o sile 50 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Zebrać supernatant zawierający niemiąższowe komórki wątroby. 
	UWAGA: Hepatocyty są wytrącane w osadzie, który można dalej oczyszczać za pomocą wirowania gradientowego, jak opisano wcześniej15.</li>
</ol>
4. Separacja niemiąższowych komórek wątroby i oczyszczanie LSEC
UWAGA: Oczyść LSEC CD146+ za pomocą kulek immunomagnetycznych, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
<ol>
	<li>Odwirować supernatant przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zebrać osad komórek i ponownie zawiesić w 1 ml buforu izolacyjnego (Tabela 1), określić liczbę komórek za pomocą automatycznego licznika komórek zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórek o sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, całkowicie odessać supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad z 90 μl buforu izolacyjnego na 107 wszystkich komórek.</li>
	<li>Dodaj 10 μl kulek magnetycznych CD146 na 107 komórek. Dobrze wymieszać i inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Aby przemyć komórki, dodać 1-2 ml buforu izolacyjnego na 107 komórek, odwirować przy 300 x g przez 10 minut, a następnie całkowicie odessać supernatant.</li>
	<li>Zawiesić do 109 komórek w 500 μl buforu izolacyjnego (Tabela 1). 
	UWAGA: W przypadku większej liczby komórek należy odpowiednio przeskalować wolumin buforu w górę.</li>
	<li>Przygotować kolumnę separacyjną, przepłukać ją 3 ml buforu izolacyjnego.</li>
	<li>Nałóż zawiesinę komórek na kolumnę umieszczoną w stosie filtrów do wstępnej separacji 70 μm.</li>
	<li>Przemyć kolumnę 3 ml buforu izolacyjnego 3 razy. 
	UWAGA: Podczas mycia kolumny należy dodać bufor izolacyjny, gdy tylko zbiornik kolumny będzie pusty.</li>
	<li>Wyjąć kolumnę z separatora i umieścić ją w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Odpipetować 5 ml buforu izolacyjnego na kolumnę.</li>
	<li>Aby odzyskać komórki oznaczone kulkami magnetycznymi, mocno wciśnij tłok do kolumny, aby wypłukać komórki.</li>
	<li>Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. LSEC są gotowe do badania mikroskopowego i dalszej analizy.</li>
</ol>
5. Immunofenotypowanie LSEC i ocena czystości za pomocą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Określ liczbę komórek izolowanych LSEC za pomocą automatycznego licznika komórek, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Odwirować komórki przy sile 300 x g przez 5 minut, całkowicie odessać supernatant.</li>
	<li>Pobrać 1 x 106 komórek/probówkę i ponownie zawiesić z 90 μl buforu barwiącego (Tabela 1).</li>
	<li>Dodać 10 μl/probówkę mysiego bloku FcR i 1 μl barwnika żywotności, inkubować w temperaturze 4 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Wybarwić komórki kombinacją przeciwciał CD45, CD146 i stabiliny-2 rozcieńczonych w stosunku 1:50 buforem barwiącym. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 20 minut.</li>
	<li>Przemyć komórki 5 ml buforu barwiącego i odwirować przy 300 x g przez 10 minut, a następnie całkowicie odessać supernatant.</li>
	<li>Zawiesić komórki za pomocą 300 μl buforu barwiącego i przepuścić przez cytometr przepływowy.</li>
</ol>
6. Kultura i egzaminy LSEC
<ol>
	<li>Wysiew 1 x 106 komórek / studzienka na 6-dołkowej płytce i hoduj ją z pożywką do wzrostu komórek śródbłonka składającą się z 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% suplementu wzrostu komórek śródbłonka i 1% roztworu prymocyny.</li>
	<li>Zbadaj wyizolowane LSEC za pomocą mikroskopii świetlnej. Uzyskuj obrazy w jasnym polu z 10-krotnym powiększeniem.</li>
</ol>
7. Morfologia LSEC i badanie okien za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej
<ol>
	<li>Wstępnie pokryj wkładki hodowli komórkowej (wielkość porów 3 μm) roztworem kolagenu.</li>
	<li>Hodowla izolowanych LSEC (120 000 komórek) na wkładce z podłożem wzrostu komórek śródbłonka na 24-dołkowej płytce w ciepłej i wilgotnej atmosferze o temperaturze 37 °C. Pozwól komórkom się uspokoić i przylegać przez 2 godziny.</li>
	<li>W celu utrwalenia komórek dodać równoważną objętość wstępnie podgrzanego w temperaturze 37 °C utrwalacza Trumpa do pożywki do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Po inkubacji przez 10 minut zastąp 50% rozcieńczony utrwalacz Trumpa nierozcieńczonym utrwalaczem Trumpa.</li>
	<li>Utrwal komórki w utrwalaczu Trump przez 2 godziny, a następnie inkubuj przez 1 godzinę w 1% tetratlenkach osmu.</li>
	<li>Kontynuuj odwadnianie próbek, suszenie w urządzeniu do suszenia w punkcie krytycznym, montaż, napylanie i badanie za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego.</li>
</ol>

<ol><li>Morin, O., Goulet, F., Normand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+sinusoidal+endothelial+cells%3A+isolation%2C+purification%2C+characterization+and+interaction+with+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Revisiones+Sobre+Biologia+Celular%3A+RBC%22%5BJournal%5D)">Liver sinusoidal endothelial cells: isolation, purification, characterization and interaction with hepatocytes.</a> Revisiones Sobre Biologia Celular: RBC. 15, 1-85 (1988).</li>
<li>Ibrahim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sinusoidal+endotheliopathy+in+nonalcoholic+steatohepatitis%3A+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Sinusoidal endotheliopathy in nonalcoholic steatohepatitis: therapeutic implications.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 321 (1), 67-74 (2021).</li>
<li>Poisson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+sinusoidal+endothelial+cells%3A+Physiology+and+role+in+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases.</a> Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).</li>
<li>Marrone, G., Shah, V. H., Gracia-Sancho, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sinusoidal+communication+in+liver+fibrosis+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Sinusoidal communication in liver fibrosis and regeneration.</a> Journal of Hepatology. 65 (3), 608-617 (2016).</li>
<li>Shetty, S., Lalor, P. F., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+sinusoidal+endothelial+cells+-+gatekeepers+of+hepatic+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Liver sinusoidal endothelial cells - gatekeepers of hepatic immunity.</a> Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 15 (9), 555-567 (2018).</li>
<li>Smedsrød, B., Pertoft, H., Gustafson, S., Laurent, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scavenger+functions+of+the+liver+endothelial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Scavenger functions of the liver endothelial cell.</a> Biochemical Journal. 266 (2), 313-327 (1990).</li>
<li>DeLeve, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+sinusoidal+endothelial+cells+in+hepatic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Liver sinusoidal endothelial cells in hepatic fibrosis.</a> Hepatology. 61 (5), 1740-1746 (2015).</li>
<li>Dar, W. A., Sullivan, E., Bynon, J. S., Eltzschig, H., Ju, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischaemia+reperfusion+injury+in+liver+transplantation%3A+Cellular+and+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+International%22%5BJournal%5D)">Ischaemia reperfusion injury in liver transplantation: Cellular and molecular mechanisms.</a> Liver International. 39 (5), 788-801 (2019).</li>
<li>Furuta, K., Guo, Q., Hirsova, P., Ibrahim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+Roles+of+Liver+Sinusoidal+Endothelial+Cells+in+Nonalcoholic+Steatohepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Biology%22%5BJournal%5D)">Emerging Roles of Liver Sinusoidal Endothelial Cells in Nonalcoholic Steatohepatitis.</a> Biology. 9 (11), Basel. 395(2020).</li>
<li>Wu, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+differences+between+human+liver+cancer+endothelial+cells+and+liver+sinusoidal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Research%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional differences between human liver cancer endothelial cells and liver sinusoidal endothelial cells.</a> Journal of Vascular Research. 45 (1), 78-86 (2008).</li>
<li>Meyer, J., Gonelle-Gispert, C., Morel, P., Bühler, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+isolation+and+purification+of+murine+liver+sinusoidal+endothelial+cells%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Methods for isolation and purification of murine liver sinusoidal endothelial cells: A systematic review.</a> PLoS One. 11 (3), 0151945(2016).</li>
<li>Meyer, J., Lacotte, S., Morel, P., Gonelle-Gispert, C., Buhler, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+for+mouse+liver+sinusoidal+endothelial+cell+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">An optimized method for mouse liver sinusoidal endothelial cell isolation.</a> Experimental Cell Research. 349 (2), 291-301 (2016).</li>
<li>Furuta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-induced+endothelial+vascular+cell+adhesion+molecule+1+promotes+nonalcoholic+steatohepatitis+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Lipid-induced endothelial vascular cell adhesion molecule 1 promotes nonalcoholic steatohepatitis pathogenesis.</a> Journal of Clinical Investigation. 131 (6), (2021).</li>
<li>Guo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+%CE%B2%281%29-enriched+extracellular+vesicles+mediate+monocyte+adhesion+and+promote+liver+inflammation+in+murine+NASH%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Integrin β(1)-enriched extracellular vesicles mediate monocyte adhesion and promote liver inflammation in murine NASH.</a> Journal of Hepatology. 71 (1), 1193-1205 (2019).</li>
<li>Hirsova, P., Ibrahim, S. H., Bronk, S. F., Yagita, H., Gores, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vismodegib+suppresses+TRAIL-mediated+liver+injury+in+a+mouse+model+of+nonalcoholic+steatohepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Vismodegib suppresses TRAIL-mediated liver injury in a mouse model of nonalcoholic steatohepatitis.</a> PLoS One. 8 (7), 70599(2013).</li>
<li>Schrage, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+CD146+is+widely+expressed+on+endothelial+cells+and+is+recognized+by+the+monoclonal+antibody+ME-9F1%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1.</a> Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).</li>
<li>Olsavszky, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+transcriptomic+network+of+multi-ligand+scavenger+receptor+Stabilin-1-+and+Stabilin-2-deficient+liver+sinusoidal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Exploring the transcriptomic network of multi-ligand scavenger receptor Stabilin-1- and Stabilin-2-deficient liver sinusoidal endothelial cells.</a> Gene. 768, 145284(2021).</li>
<li>DeLeve, L. D., Maretti-Mira, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+sinusoidal+endothelial+cell%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Liver+Disease%22%5BJournal%5D)">Liver sinusoidal endothelial cell: An update.</a> Seminars in Liver Disease. 37 (4), 377-387 (2017).</li>
<li>DeLeve, L. D., Wang, X., Hu, L., McCuskey, M. K., McCuskey, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+liver+sinusoidal+endothelial+cell+phenotype+is+maintained+by+paracrine+and+autocrine+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rat liver sinusoidal endothelial cell phenotype is maintained by paracrine and autocrine regulation.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 287 (4), 757-763 (2004).</li>
<li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+hepatocytes+and+sinusoidal+endothelial+cells+from+mouse+liver+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993(2018).</li>
<li>Ishiguro, K., Yan, I. K., Patel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+tissue+extracellular+vesicles+from+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation of tissue extracellular vesicles from the liver.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e58649(2019).</li>
<li>Topp, S. A., Upadhya, G. A., Strasberg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+preservation+of+isolated+sinusoidal+endothelial+cells+in+MMP+9+knockout+mice%3A+effect+on+morphology+and+platelet+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Cold preservation of isolated sinusoidal endothelial cells in MMP 9 knockout mice: effect on morphology and platelet adhesion.</a> Liver Transplantation. 10 (8), 1041-1048 (2004).</li>
<li>Katz, S. C., Pillarisetty, V. G., Bleier, J. I., Shah, A. B., DeMatteo, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+sinusoidal+endothelial+cells+are+insufficient+to+activate+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Liver sinusoidal endothelial cells are insufficient to activate T cells.</a> Journal of Immunology. 173 (1), 230-235 (2004).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation+method+for+isolation+of+single-cell+types+from+mouse+liver+for+proteomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Sample preparation method for isolation of single-cell types from mouse liver for proteomic studies.</a> Proteomics. 11 (17), 3556-3564 (2011).</li>
<li>Do, H., Healey, J. F., Waller, E. K., Lollar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+factor+VIII+by+murine+liver+sinusoidal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Expression of factor VIII by murine liver sinusoidal endothelial cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (28), 19587-19592 (1999).</li>
<li>Schrage, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+T+cell+transmigration+across+the+murine+liver+sinusoidal+endothelium+is+mediated+by+transcytosis+and+surface+presentation+of+chemokines%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Enhanced T cell transmigration across the murine liver sinusoidal endothelium is mediated by transcytosis and surface presentation of chemokines.</a> Hepatology. 48 (4), 1262-1272 (2008).</li>
<li>Chou, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophosphatidic+acid+alters+the+expression+profiles+of+angiogenic+factors%2C+cytokines%2C+and+chemokines+in+mouse+liver+sinusoidal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Lysophosphatidic acid alters the expression profiles of angiogenic factors, cytokines, and chemokines in mouse liver sinusoidal endothelial cells.</a> PLoS One. 10 (3), 0122060(2015).</li>
<li>Deleve, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dacarbazine+toxicity+in+murine+liver+cells%3A+a+model+of+hepatic+endothelial+injury+and+glutathione+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Dacarbazine toxicity in murine liver cells: a model of hepatic endothelial injury and glutathione defense.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 268 (3), 1261-1270 (1994).</li>
<li>Smedsrød, B., Pertoft, H., Eggertsen, G., Sundström, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+morphological+characterization+of+cultures+of+Kupffer+cells+and+liver+endothelial+cells+prepared+by+means+of+density+separation+in+Percoll%2C+and+selective+substrate+adherence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Functional and morphological characterization of cultures of Kupffer cells and liver endothelial cells prepared by means of density separation in Percoll, and selective substrate adherence.</a> Cell and Tissue Research. 241 (3), 639-649 (1985).</li>
<li>Despoix, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+CD146%2FMCAM+is+a+marker+of+natural+killer+cell+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mouse CD146/MCAM is a marker of natural killer cell maturation.</a> European Journal of Immunology. 38 (10), 2855-2864 (2008).</li>
<li>Strauss, O., Phillips, A., Ruggiero, K., Bartlett, A., Dunbar, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+identifies+distinct+subsets+of+endothelial+cells+in+the+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence identifies distinct subsets of endothelial cells in the human liver.</a> Scientific Reports. 7, 44356(2017).</li>
<li>Halpern, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired-cell+sequencing+enables+spatial+gene+expression+mapping+of+liver+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Paired-cell sequencing enables spatial gene expression mapping of liver endothelial cells.</a> Nature Biotechnology. 36 (10), 962-970 (2018).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy nie mają żadnych konfliktów do ujawnienia.

W niniejszym manuskrypcie opisujemy protokół izolacji LSEC z wątroby myszy składający się z dwuetapowej perfuzji kolagenazy i późniejszego sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS). Protokół ten składa się z następujących trzech etapów: (1) Perfuzja przez PV z buforem wolnym od wapnia, a następnie buforem zawierającym kolagenazę w celu uzyskania dyspersji komórek wątroby; (2) Wykluczenie hepatocytów z wirowaniem z niską prędkością; oraz (3) pozytywna selekcja LSEC oparta na MAC z komórek niemiąższowych (NPC) pr...

Sinusoidalne komórki śródbłonka wątroby (LSECs) wyściełają ściany sinusoidalne wątroby i są najliczniejszymi komórkami niemiąższowymi w wątrobie 1. LSEC odróżniają się od innych komórek śródbłonka naczyń włosowatych w innych częściach ciała obecnością okien i brakiem klasycznej błony podstawnej lub membrany2,3. W związku z tym LSEC posiadają charakterystyczne cechy fenotypowe i strukturalne, które zwiększają ich przepuszczalność i zdolność endocytarną do eliminowania różnych krążących makrocząsteczek, w tym lipidów i lipoprotein. LSEC odgrywają kluczową rolę w wzajemnym oddziaływaniu między komórkami miąższowymi i niemiąższowymi, takimi jak komórki gwiaździste i komórki odpornościowe. LSEC odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu homeostazy wątroby poprzez utrzymywanie komórek gwiaździstych i komórek Kupffera w stanie spoczynku4. LSEC modulują skład populacji komórek odpornościowych wątroby, pośrednicząc w adhezji i migracji przezśródbłonkowej krążących leukocytów5,6. Podczas ostrego i przewlekłego uszkodzenia wątroby7, w tym uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego (IRI)8, niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby (NASH)9 i raka wątrobowokomórkowego (HCC), LSEC ulegają zmianom fenotypowym znanym jako kapilaryzacja charakteryzująca się defenestracją i tworzeniem błony podstawnej10. Te zmiany fenotypowe w LSEC są związane z dysfunkcją LSEC i nabywaniem właściwości prozakrzepowych, prozapalnych i profibrogennych.
Opracowano kilka metod izolacji LSEC z wątroby myszy11. Niektóre techniki polegają na oddzieleniu komórek niemiąższowych i miąższowych, a następnie wirowaniu w gradiencie gęstości w celu oczyszczenia LSEC z frakcji niemiąższowych. Ograniczeniem tej metody jest obecność zanieczyszczających makrofagów w końcowych etapach izolacji LSEC, co może mieć wpływ na czystość izolowanych LSECs12. Protokół ten opiera się na perfuzji kolagenazy w wątrobie myszy i kulkach magnetycznych CD146 + pozytywnej selekcji komórek niemiąższowych w celu oczyszczenia LSEC. LSEC wyizolowane tą metodą wykazują wysoką czystość oraz zachowaną morfologię i żywotność. Te LSEC są optymalne do badań funkcjonalnych, w tym testów przepuszczalności i adhezji, a także do dalszych badań dla interesujących ścieżek. Co więcej, wraz z rosnącym zainteresowaniem generowaniem dużych zbiorów danych zarówno w badaniach klinicznych, jak i odkryciach, te wysokiej jakości LSEC wyizolowane zarówno ze zdrowych, jak i chorych wątrob z niealkoholowym stłuszczeniowym zapaleniem wątroby (NASH) lub innymi schorzeniami mogą być łączone lub używane indywidualnie, umożliwiając generowanie danych multiomicznych i porównywanie zdrowia i choroby13,14. Ponadto wyizolowane LSEC można wykorzystać do opracowania dwuwymiarowych i trójwymiarowych modeli in vitro, takich jak organoidy, w celu rozszyfrowania aktywowanego szlaku sygnałowego w LSEC i ich komunikacji międzykomórkowej z innymi komórkami wątroby pod wpływem różnych szkodliwych bodźców i w odpowiedzi na różne interwencje terapeutyczne.

<table><tbody><tr><td>2,0-calowy cewnik dożylny (IV) 20 G</td><td>Terumo, SOmerset, NJ, USA</td><td>SR-OX2051CA</td><td></td></tr><tr><td>2&ndash; 3-calowa taca perfuionowa z otworem w środku</td><td></td><td></td><td>dostosowana; wyprodukowano we własnym zakresie</td></tr><tr><td>405/520 barwnik żywotności</td><td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Niemcy</td><td>130-110-205</td><td></td></tr><tr><td>4-calowe regularne zakrzywione kleszcze opatrunkowe</td><td>Fisher Brand</td><td>FS16-100-110</td><td></td></tr><tr><td>5-0 Jedwabny szew Perma-Hand</td><td>Ethicon, Raritan, NJ, USA</td><td>A182H</td><td></td></tr><tr><td>Anti-stabilin-2 (mysz) mAb-Alexa Fluor&Atilde; 488</td><td>MBL International, Woburn, MA, Stany Zjednoczone</td><td>D317-A48</td><td></td></tr><tr><td>Kolba BSA</td><td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Niemcy</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD146 (LSEC)-PE, anty-myszy</td><td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Niemcy</td><td>130-118-407</td><td></td></tr><tr><td>CD146 (LSEC) MicroBeads, mysz</td><td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Niemcy</td><td>130-092-007</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45-Viogreen, anty-myszy</td><td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Niemcy</td><td>130-110-803</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen typu I</td><td>Corning, Corning, NY, USA</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza II</td><td>Gibco, Waltham, MA, USA</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka</td><td>ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA</td><td>211-500</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik blokujący FcR, mysz</td><td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Niemcy</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie FlowJo, wersja 10.6</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hardened Fine Nożyczki</td><td>FST, Foster city, CA, USA</td><td>14091-11</td><td></td></tr><tr><td>Podgrzewane (37 & deg; C) i nawilżony aparat perfuzyjny z recyrkulacją wyposażony w wtrysk tlenu z szybkością 10 psi.</td><td></td><td></td><td>dostosowane; wyprodukowany we własnym zakresie</td></tr><tr><td>skaningowy mikroskop elektronowy Hitachi S 4700</td><td>Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA</td><td>SEM096</td><td></td></tr><tr><td>LS kolumny</td><td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Niemcy</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Filtry wstępnej separacji MACS (70 &mu; m)</td> <td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Niemcy</td><td>130-095-823</td><td></td></tr><tr><td>Bufor płuczący MACS</td><td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Niemcy</td><td>130-091-222</td><td></td></tr><tr><td>Inteligentny filtr siatkowy MACS (70 &mu; m)</td> <td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Niemcy</td><td>130-098-462</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy MACSQunt</td><td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wkładka do hodowli komórek milikomórkowych</td><td>Millipore Sigma, Burlington, MA, USA</td><td>PITP01250</td><td></td></tr><tr><td>Licznik komórek Nexcelom</td><td>Bioscience, Lawrence, MA, USA</td><td>Celometr Auto T4 Plus</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare, Chicago, IL, USA</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne</td><td>F.S.T, Foster city, CA, USA</td><td>14001-12</td><td></td></tr><tr><td>Bardzo małe zakrzywione kleszcze opatrunkowe</td><td>F.S.T, Foster city, CA, USA</td><td>11063-07</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i charakterystyka pierwotnych sinusoidalnych komórek śródbłonka wątroby myszy

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Sinusoidalne komórki śródbłonka wątroby (LSEC) to wyspecjalizowane komórki śródbłonka znajdujące się na granicy między krążeniem a miąższem wątroby. LSEC mają wyraźną morfologię charakteryzującą się obecnością okien i brakiem błony podstawnej. LSEC odgrywają istotną rolę w wielu zaburzeniach patologicznych w wątrobie, w tym w rozregulowaniu metabolizmu, zapaleniu, zwłóknieniu, angiogenezie i kancerogenezie. Jednak niewiele opublikowano na temat izolacji i charakterystyki LSEC. W tym miejscu protokół ten omawia izolację LSEC zarówno od zdrowych, jak i niealkoholowych myszy z stłuszczeniową chorobą wątroby (NAFLD). Protokół opiera się na perfuzji kolagenazy w wątrobie myszy i pozytywnej selekcji kulek magnetycznych komórek niemiąższowych w celu oczyszczenia LSEC. W badaniu tym scharakteryzowano LSEC przy użyciu specyficznych markerów za pomocą cytometrii przepływowej i zidentyfikowano charakterystyczne cechy fenotypowe za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej. LSEC wyizolowane zgodnie z tym protokołem mogą być wykorzystywane do badań funkcjonalnych, w tym testów adhezji i przepuszczalności, a także do dalszych badań dla określonej ścieżki będącej przedmiotem zainteresowania. Ponadto te LSEC mogą być łączone lub używane indywidualnie, co pozwala między innymi na generowanie danych multiomicznych, w tym masowego lub pojedynczego komórkowego RNA, proteomiki lub fosfo-proteomiki oraz oznaczania chromatyny dostępnej dla transposazy przy użyciu sekwencjonowania (ATAC-seq). Protokół ten będzie przydatny dla badaczy badających komunikację LSEC z innymi komórkami wątroby w zdrowiu i chorobie oraz pozwoli na dogłębne zrozumienie roli LSEC w patogennych mechanizmach ostrego i przewlekłego uszkodzenia wątroby.

Schematy eksperymentalne i konfiguracja sprzętu: 
W niniejszym protokole wątrobę myszy poddano trawieniu z wykorzystaniem zamkniętego obiegu perfuzyjnego, a następnie komórki nieparenchymalne i hepatocyty oddzielono poprzez wirowanie z niską prędkością przy 50 x g przez 2 min. Pierwotne LSEC wyizolowano z frakcji nieparenchymalnej przy użyciu selekcji koralikami magnetycznymi CD146. Schematy eksperymentalne przedstawiono na Ryc. 1A. Kaniulę umieszczono w żyle wro...

Tutaj przedstawiamy i demonstrujemy protokół izolacji pierwotnych komórek śródbłonka sinusoidalnego wątroby myszy (LSEC). Protokół opiera się na perfuzji kolagenazy wątrobowej, oczyszczaniu komórek niemiąższowych przez wirowanie z niską prędkością oraz selekcji kulek magnetycznych CD146. Zajmujemy się również fenotypowaniem i charakteryzacją tych izolowanych LSEC za pomocą cytometrii przepływowej i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Izolacja i charakterystyka pierwotnych sinusoidalnych komórek śródbłonka wątroby myszy

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Tutaj demonstrujemy nasz protokół pierwotnej izolacji sinusoidalnych komórek wątroby myszy lub izolacji LSEC. Protokół składa się z perfuzji kolagenazy wątrobowej i ultrawirowania z niską prędkością w celu oczyszczenia komórek niemiąższowych i selekcji kulek magnetycznych CD146. Nasza metoda izolacji LSEC jest bardzo skuteczna i ma zastosowanie do zdrowej i chorej wątroby myszy.Izolowane LSEC wykazują wysoką czystość oraz zachowują strukturę i funkcję. LSEC izolowane przy użyciu tego protokołu są optymalne do badań funkcjonalnych i molekularnych oraz generowania danych multiomicznych. Protokół ten będzie pomocny w badaniu komunikacji międzykomórkowej w wątrobie.Zacznij od pokrycia 10-centymetrowych naczyń hodowlanych trzema mililitrami roztworu kolagenu. Następnie inkubuj naczynia w temperaturze pokojowej przez godzinę. Po godzinie usuń nadmiar płynu z powlekanej powierzchni.Umyj naczynia PBS trzy razy i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Ustaw podgrzewany i nawilżony aparat do perfuzji recyrkulacyjnej. Płucz system perfuzyjny za pomocą 10% wybielacza przez pięć minut.Następnie ponownie przepłucz system sterylną wodą przez kolejne 10 minut. Odcedź płyn do płukania tak bardzo, jak to możliwe, przed perfuzją roztworem kolagenazy. Przelej roztwór kolagenazy przez system perfuzyjny, aby podgrzać go do 37 stopni Celsjusza.Ustaw prędkość pompy na prędkość pierwszą na pokrętle regulacji prędkości. Utrzymuj prędkość na tym samym poziomie przez całą procedurę. Zważ mysz do zabiegu.Następnie przymocuj go do powierzchni operacyjnej. Spryskaj brzuch myszy 70% etanolem. Za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj nacięcie o długości około pięciu centymetrów, zaczynając od dolnej części brzucha aż do wyrostka mieczykowatego.Następnie wykonaj dwa boczne nacięcia za pomocą małych nożyczek do tęczówki po każdej stronie brzucha, aby całkowicie odsłonić narządy jamy brzusznej. Umieść osłonę cewnika dożylnego pod grzbietem zwierzęcia, aby podnieść i wypoziomować brzuch. Używając zwykłych, zakrzywionych kleszczy opatrunkowych, delikatnie pociągnij jelita i żołądek na lewo od zwierzęcia.Następnie umieść szew chirurgiczny 5-0 pod żyłą główną dolną lub IVC, tuż pod odsłoniętą lewą nerką. Zawiąż luźny zaczep w szwie. Następnie umieść kolejny szew chirurgiczny 5-0 wokół żyły wrotnej wątroby.Umieść szew tuż nad punktem rozgałęzienia żyły śledziony żyły wrotnej wątroby. Ponownie zawiąż luźny zaczep w szwie. Używając szwu żyły wrotnej jako naprężenia, wprowadź cewnik dożylny o rozmiarze 20 w żyle wznów wątroby jeden centymetr poniżej miejsca, w którym rozgałęzia się na prawą i lewą żyłę wrotną wątroby.Następnie wsuń cewnik w górę żyły, ale utrzymuj go poniżej obszaru rozgałęzienia. Pozwól, aby krew przepływała w dół cewnika, aż zacznie kapać. Zabezpiecz cewnik dożylny szwem do żyły wrotnej.Użyj przewodu dożylnego, aby podłączyć butelkę dożylną z buforem A do cewnika. Następnie należy przepłukać wątrobę tym roztworem, unikając przedostawania się powietrza do systemu. Zawiąż szew wokół IVC poniżej nerki.Następnie przeciąć IVC poniżej szwu, aby zwierzę mogło się wykrwawić. Po perfuzji odetnij żołądek, jelita, śledzionę i inne wnętrzności przyczepione do wątroby. Następnie odetnij przeponę i główne naczynia z jamy klatki piersiowej.Usuń wątrobę ze zwierzęcia i umieść ją na tacy perfuzyjnej. Ostrożnie wyjmij linię dożylną i podłącz roztwór kolagenazy do komory recyrkulacyjnej. Pozwól wątrobie ulegać perfuzji, aż kapsułka stanie się wymodelowana i stanie się papkowata.Powinno to zwykle zająć od 10 do 15 minut. Po strawieniu wyjmij wątrobę z komory i umieść ją na 10-centymetrowej szalce Petriego z około 20 mililitrami DMEM bez surowicy. Delikatnie rozerwij wątrobę kilkoma końcówkami pipet i wyrzuć drzewo żółciowe.Następnie przefiltruj zawiesinę wątroby przez sitko komórkowe o średnicy 70 mikrometrów do 50-mililitrowej stożkowej probówki. Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 50 razy G przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Następnie należy pobrać supernatant zawierający niemiąższowe komórki wątroby.Odwirować supernatant w temperaturze 300 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie zbierz osad komórkowy i zawieś go ponownie w jednym mililitrze buforu izolacyjnego. Określ numer komórki za pomocą automatycznego licznika komórek, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.Następnie odwiruj zawiesinę komórek. Całkowicie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad za pomocą 90 mikrolitrów buforu izolacyjnego na 10 milionów komórek. Dodaj 10 mikrolitrów mikrokulek CD146 na 10 milionów komórek.Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby umyć komórki, dodaj od jednego do dwóch mililitrów buforu izolacyjnego na 10 milionów komórek. Odwirować roztwór o stężeniu 300 razy G przez 10 minut.Następnie należy całkowicie odessać supernatant i ponownie zawiesić do miliarda komórek w 500 mikrolitrach bufora izolacyjnego. Następnie należy przygotować kolumnę separacyjną, przepłukując ją trzema mililitrami buforu izolacyjnego. Nałóż zawiesinę komórek na kolumnę wypełnioną 70-mikrometrowymi filtrami do wstępnej separacji.Przemyć kolumnę trzema mililitrami buforu izolacyjnego trzy razy. Następnie wyjmij kolumnę z separatora i umieść ją na 15-mililitrowej probówce wirówkowej. Odpipetować pięć mililitrów buforu izolacyjnego na kolumnę.Aby odzyskać komórki oznaczone kulkami magnetycznymi, należy mocno wcisnąć tłok do kolumny, aby wypłukać komórki. Na koniec odwiruj komórki w temperaturze 300 razy G przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza. Izolowane LSEC markery czystości i powierzchni oceniano za pomocą cytometrii przepływowej.Analiza danych i strategia bramkowania dla bramkowanych LSEC i singletów są oparte na danych dotyczących rozproszenia do przodu i rozproszenia bocznego. Wyizolowane LSEC wybarwiono barwnikiem żywotności i kombinacją przeciwciał CD45, CD146 i Stabilin-2. Żywotne LSEC bramkowano na populacji CD45 ujemnej i analizowano pod kątem ekspresji CD146 i stabiliny-2.Na podstawie tych danych potwierdzono, że wyizolowane LSEC miały ponad 94% żywotności i ponad 90% czystości. Specyficzny dla LSEC fenotyp wyizolowanych komórek został następnie potwierdzony za pomocą mikroskopii świetlnej i skaningowej mikroskopii elektronowej. Wyizolowane LSEC hodowano w kompletnej pożywce wzrostowej przez sześć godzin i badano za pomocą mikroskopii świetlnej.Białe strzałki na obrazie SEM wskazują okna LSEC, które są charakterystyczną cechą morfologiczną LSEC. Kluczowymi krokami zapewniającymi całkowitą perfuzję tkanki wątroby są prawidłowe ułożenie taśmy cewnika, unikanie wprowadzania powietrza do cewnika oraz optymalny czas trawienia kolagenazy. Wysokiej jakości LSEC uzyskany przy użyciu naszego protokołu ułatwi identyfikację molekularnego mechanizmu funkcji LSEC i poprawi nasze zrozumienie ich roli w komunikacji międzykomórkowej w wątrobie, w zdrowiu i chorobie.

isolation-characterization-mouse-primary-liver-sinusoidal-endothelial

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Komórki śródbłonka mikronaczyniowego mózgu (BMEC) są połączone specyficznymi białkami połączeniowymi, tworząc wysoce regulowaną barierę oddzielającą krew od ośrodkowego układu nerwowego (OUN), tak zwaną barierę krew-mózg (BBB). Izolacja pierwotnych mysich komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu, jak omówiono w tym protokole, umożliwia szczegółowe badania in vitro bariery krew-mózg.

Izolacja pierwotnych mysich komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu

Komórki śródbłonka naczyniowego odgrywają znaczącą rolę w wielu ważnych zaburzeniach sercowo-naczyniowych. W tym artykule opisano prostą metodę izolowania i rozszerzania komórek śródbłonka z aorty myszy bez użycia specjalnego sprzętu. Nasz protokół zapewnia skuteczny sposób identyfikacji mechanizmów w fizjopatologii komórek śródbłonka.

Izolacja i pierwotna hodowla komórek śródbłonka aorty myszy

Opisano technikę izolowania ludzkich hepatocytów i niemiąższowych komórek wątroby od tego samego dawcy. Różne typy komórek wątroby stanowią podstawę funkcjonalnych modeli wątroby i inżynierii tkankowej. Ta nowa metoda ma na celu wyizolowanie komórek wątroby w celu uzyskania wysokiej wydajności i żywotności.

Protokół izolacji pierwotnych ludzkich hepatocytów i odpowiadających im głównych populacji niemiąższowych komórek wątroby

Ten protokół jest przygotowany, aby podzielić się naszą metodą izolowania komórek śródbłonka naczyń wieńcowych myszy w celu obrazowania lub przeprowadzania eksperymentów z biologii molekularnej.

Izolacja mysich komórek śródbłonka naczyń wieńcowych

Celem tego protokołu jest uzyskanie wysokiej żywotności i wysokiej wydajności hepatocytów i komórek śródbłonka sinusoidalnego z wątroby. Osiąga się to poprzez perfuzję wątroby roztworem kolagenazy typu IV przez żyłę wrotną, a następnie wirowanie różnicowe w celu uzyskania hepatocytów i sinusoidalnych komórek śródbłonka.

Oczyszczanie hepatocytów i sinusoidalnych komórek śródbłonka z perfuzji wątroby myszy

Tutaj prezentujemy protokół izolacji zdrowych i funkcjonalnych pierwotnych hepatocytów myszy. Opracowano instrukcje dotyczące wykrywania powstającej syntezy białek wątrobowych za pomocą nieradioaktywnego substratu znakującego, aby pomóc w zrozumieniu mechanizmów leżących u podstaw syntezy białek w kontekście homeostazy metabolizmu energetycznego w wątrobie.

Izolacja pierwotnych hepatocytów myszy do analizy powstającej syntezy białek metodą znakowania nieradioaktywnej L-azydohomoalaniny

Mikronaczyniowe komórki śródbłonka mięśni szkieletowych (MMEC) kształtują wewnętrzną ścianę naczyń włosowatych mięśni i regulują zarówno wymianę płynów/molekuł, jak i migrację komórek (immunologicznych) między tkanką mięśniową a krwią. Opisana tutaj izolacja pierwotnego mysiego MMEC umożliwia kompleksowe badania in vitro "jednostki mięśniowo-naczyniowej".

Izolacja pierwotnych mysich komórek śródbłonka mikronaczyniowego mięśni szkieletowych

Prezentowany tutaj jest protokół izolacji hepatocytów myszy z wątroby dorosłych myszy przy użyciu zmodyfikowanej techniki perfuzji kolagenazy. Opisano również długoterminową hodowlę hepatocytów w warstwie kolagenowej 3D, a także znakowanie immunologiczne składników cytoszkieletu w celu zbadania tworzenia kanałów żółciowych i ich odpowiedzi na leczenie.

Izolacja i hodowla kanapkowa kolagenu 3D pierwotnych hepatocytów myszy w celu zbadania roli cytoszkieletu w tworzeniu kanałów żółciowych in vitro

Pierwotne hepatocyty są cennym narzędziem do badania reakcji wątroby i metabolizmu in vitro. Wykorzystując dostępne na rynku odczynniki, opracowano ulepszony, efektywny czasowo i pracochłonnie protokół izolacji pierwotnych hepatocytów myszy.

Ulepszony protokół izolacji pierwotnych hepatocytów myszy pod względem czasu i pracy

W tym artykule, pierwotne komórki śródbłonka płuc zostały wyizolowane i wyhodowane od nowonarodzonych myszy.

Izolacja pierwotnych komórek śródbłonka płuc myszy

Ten protokół opisuje izolację komórek śródbłonka myszy z całej trzustki.

Izolacja komórek śródbłonka trzustki myszy

Poznaj metodę izolacji pierwotnych komórek śródbłonka sinusoidalnego wątroby myszy przy użyciu perfuzji kolagenazowej i selekcji magnetycznej. Protokół zapewnia ponad 90% czystość i ponad 94% żywotność komórek LSEC.

Izolacja i charakterystyka pierwotnych sinusoidalnych komórek śródbłonka wątroby myszy

Przeglądaj więcej filmów