Ustanowienie i analiza trójwymiarowych (3D) organoidów pochodzących z próbek przerzutów do kości raka prostaty u pacjentów i ich ksenoprzeszczepów
February 3rd, 2020
Trójwymiarowe hodowle próbek BMPC pacjentów i ksenoprzeszczepów raka prostaty z przerzutami do kości utrzymują funkcjonalną heterogeniczność swoich pierwotnych guzów, co prowadzi do powstawania torbieli, sferoid i złożonych, podobnych do guzów organoidów. Niniejszy manuskrypt zawiera strategię i protokół optymalizacji hodowli 3D heterogenicznych próbek pobranych od pacjentów i ich analizy przy użyciu IFC.
Opisujemy strategie i protokoły krok po kroku w celu ustanowienia seryjnych organoidów 3D pochodzących od pacjentów w raku prostaty z przerzutami do kości. Nasze zoptymalizowane protokoły są praktyczne w tworzeniu kultur 3D do eksperymentów przy użyciu ograniczonego materiału wyjściowego bezpośrednio od pacjentów lub tkanek guza ksenoprzeszczepu pobranych od pacjenta. Organoidy 3D z tego protokołu mogą być wykorzystywane jako modele ex vivo do zrozumienia podstawowych mechanizmów patologii raka prostaty z przerzutami do kości i do testowania leczenia.
Pożywka do hodowli organoidów 3D w tym protokole jest specyficzna dla komórek pochodzących z prostaty. Inne części naszych protokołów mają zastosowanie do różnych typów tkanek nowotworowych i miejsc przerzutowych. Technika domingu może okazać się najtrudniejszą częścią tego procesu.
Praktykowanie techniki domingu zapewni stałą wielkość kopulastej mieszaniny organoidów, pożywek i Matrigelu oraz zminimalizuje tworzenie się pęcherzyków podczas zawieszania próbki. Wizualne zademonstrowanie tej metody pozwala lepiej zrozumieć, jak obchodzić się z lepkim Matrigelem w celu skutecznego hodowania organoidów o mniejszej gęstości z niewielkiej liczby komórek. Zacznij od ponownego zawieszenia osadu komórkowego w odpowiedniej objętości błony podstawnej dla konfiguracji płytki 24-dołkowej.
Delikatnie pipetować w górę i w dół, aby upewnić się, że komórki są ponownie zawieszone, a następnie odpipetować odpowiednią objętość zawiesiny komórek do środka wstępnie podgrzanej płytki do hodowli tkankowej. Odwróć płytkę i natychmiast umieść ją do góry nogami w inkubatorze do hodowli komórkowych ustawionym na 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na 15 minut. Odpipetować odpowiednią objętość wstępnie podgrzanego podłoża zawierającego 10 mikromolowy dichlorowodorek Y-27632 do każdej studzienki.
Aby utworzyć pływającą kopułę z dołączonej okrągłej kopuły, odłącz kopułę od płyty za pomocą skrobaka do komórek. Wytnij kawałek folii parafinowej o wymiarach dwa na cztery cale i umieść go na wgłębieniach pustego stojaka na końcówki z jednomililitrowego plastikowego pudełka na końcówki do pipet. Palcem wskazującym w rękawiczce delikatnie dociśnij folię parafinową, aby obrysować wgłębienia, uważając, aby nie przebić się przez folię.
Spryskaj folię parafinową 70% etanolem i włącz lampę UV w okapie do hodowli komórkowych, aby sterylizować przygotowaną folię przez co najmniej 30 minut. W międzyczasie ponownie zawieś wstępnie przetworzone komórki w 20 mikrolitrach membrany podstawnej. Następnie odpipetować zawiesinę do wgłębień utworzonych w filmie parafinowym.
Umieść zestalone kulki i folię parafinową na płytce sześciodołkowej i odpipetuj od trzech do pięciu mililitrów wstępnie podgrzanego podłoża zawierającego 10 mikromolowych dichlorowodorków Y-27632 do każdej studzienki, delikatnie strzepując kulki z filmu parafinowego. Aby przetworzyć organoidy do histologii, należy usunąć istniejące pożywki ze studni, uważając, aby nie zassać kopuł błony podstawnej. Dodać równą objętość roztworu do odzyskiwania komórek i inkubować płytkę przez 60 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Po inkubacji należy usunąć kopułę błony podstawnej za pomocą pipety i zmiażdżyć ją końcówką pipety. Zbierz zdysocjowaną kopułę i roztwór do odzyskiwania komórek do 1,5 mililitrowej probówki. Odwirować probówkę o ciśnieniu 300 razy g w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut, następnie usunąć supernatant i odstawić go na bok.
Zachowaj wszystkie supernatanty do ostatniego etapu, kiedy obecność organoidów zostanie potwierdzona w żądanej objętości zimnego PBS i delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby mechanicznie usunąć osad bez naruszania organoidów. Powtórzyć wirowanie i usunąć supernatant. Utrwal granulat w dopasowanej objętości 4% PFA przez 60 minut w temperaturze pokojowej.
Po utrwaleniu powtórzyć etap wirowania i płukania PBS. Następnie powoli dodaj 200 mikrolitrów ciepłej 2% agarozy i natychmiast, ale delikatnie, odłącz osad komórkowy od ścianki rurki, nie naruszając go, za pomocą igły o rozmiarze 25 dołączonej do strzykawki o średnicy jednego mililitra. W przypadku metody wirowania agarozy bardzo ważne jest, aby odłączyć osad komórkowy od ścianki probówki zaraz po dodaniu agarozy za pomocą igły o rozmiarze 25.
Gdy agaroza całkowicie zastygnie, odłącz ją od rurki za pomocą igły o rozmiarze 25 dołączonej do jednomililitrowej strzykawki i przenieś do nowej rurki o pojemności 1,5 mililitra. Napełnij probówkę 70% etanolem i postępuj zgodnie z konwencjonalnym protokołem odwadniania tkanek i zatapiania parafiny. Protokół ten został z powodzeniem wykorzystany do stworzenia organoidów 3D z modeli ksenoprzeszczepów raka prostaty z przerzutami do kości, a także bezpośrednio z tkanki nowotworowej.
Organoidy wykazywały różne fenotypy, które objawiały się jako torbiele, sferoidy i organoidy o wyższej złożoności. Całą kopułę błony podstawnej i organoidów można zobaczyć na zszytym obrazie z 25 obrazów o wysokiej rozdzielczości i 10-krotnym powiększeniu. W celu dalszego zbadania tkanki nowotworowej przeprowadzono cytochemię immunofluorescencyjną na skrawku organoidów parafinowym o grubości pięciu mikrometrów ukierunkowanym na marker komórek podstawnego nabłonka cytokeratynę-5, marker komórek nabłonka światła cytokeratyna-8 i DAPI.
Protokół ten można zoptymalizować pod kątem innych zastosowań, takich jak Western blotting, kokultura i cytometria przepływowa w celu zbadania charakterystyki organoidów 3D i efektów leczenia farmakologicznego. Eksperymenty te mogą dotyczyć mechanizmów oporności na leki i skuteczności nowych terapii stosowanych samodzielnie lub w połączeniu z obecnie stosowanymi terapiami. Organoidy 3D z tej techniki zachowują heterogeniczność międzyosobniczą i wewnątrzosobniczą, a zatem są dokładniejszym modelem choroby u pacjentów.
Technika ta toruje naukowcom drogę do zbadania mechanizmów oporności na leki, nowotworzenia, przerzutów i terapii, które mogą być bardziej przewidywalne dla postępu choroby u pacjentów i ich odpowiedzi na terapię.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie przedstawia zoptymalizowane protokoły do ustanowienia trójwymiarowych (3D) kultur organoidalnych pochodzących od pacjentów z przerzutowym rakiem prostaty. Te organoidalne utrzymują funkcyjną heterogeniczność oryginalnych guzów, umożliwiając analizę patologii raka i testowanie leczenia.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Onkologia
- Biologia komórki
Tło
- Przerzutowy rak prostaty na kości stanowi unikalne wyzwania w badaniach.
- 3D kultury mogą lepiej naśladować mikrośrodowisko guza w porównaniu do tradycyjnych kultur 2D.
- Próbki pochodzące od pacjentów są kluczowe dla zrozumienia indywidualnych cech guza.
- Istniejące protokoły mogą nie być zoptymalizowane dla ograniczonego początkowego materiału.
Cel badania
- Opracowanie praktycznych protokołów dla 3D kultur organoidalnych pochodzących od pacjentów.
- Utrzymanie heterogeniczności guzów w kulturze.
- Zastąpienie modelu do badania patologii przerzutowego raka prostaty.
Stosowane metody
- Ustanowienie szeregowo 3D kultur z próbek pochodzących od pacjentów.
- Użycie specyficznego medium kulturowego dla komórek pochodzących z prostaty.
- Zastosowanie techniki domingu do formowania organoidalnego.
- Analiza organoidalnych na potrzeby testów eksperymentalnych.
Główne wyniki
- Skuteczna utrzymanie organoidalnych przypominających guz z próbek pacjentów.
- Demonstracja funkcyjnej heterogeniczności w 3D kulturach.
- Protokoły stosowalne dla różnych typów guzów i miejsc przerzutów.
- Identyfikacja wyzwań związanych z techniką domingu.
Wnioski
- Zoptymalizowane protokoły ułatwiają badania nad przerzutowym rakiem prostaty.
- 3D organoidalne służą jako cenne modele ex vivo do testowania leczenia.
- Przyszłe badania mogą rozwijać te metody dla szerszych zastosowań.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Three-dimensional patient-derived organoids (PDOs) from prostate cancer bone metastases provide a translationally relevant model that preserves tumor heterogeneity and functional characteristics. This capability enables mechanistic de-risking and predictive confidence for drug response and resistance studies at critical discovery and preclinical inflection points. Integrating PDOs into R&D pipelines supports risk-adjusted portfolio decisions and advances personalized therapeutic strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of tumorigenic pathways and resistance mechanisms in a disease-relevant system.
- Supports functional target validation by maintaining patient-specific genomic and phenotypic heterogeneity.
- Facilitates predictive confidence in target selection and mechanistic de-risking for portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Provides validated 3D biological systems for quantitative drug response and resistance assays.
- Enables assay standardization and reproducibility through optimized culture protocols.
- Supports scalable screening of novel therapeutics and combination regimens in a physiologically relevant context.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical models with patient tumor biology for improved translational continuity.
- Enables exploration of drug resistance, metastasis, and therapeutic efficacy in ex vivo systems.
- Supports biomarker discovery and validation in models that reflect clinical heterogeneity.
Pipeline & Workflow Integration
PDO establishment from patient and xenograft specimens bridges early discovery, lead identification, and preclinical validation by providing a reusable, disease-relevant platform.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and mechanistic studies of tumorigenesis and drug resistance.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound evaluation and assay development.
- Analytics: Enables high-content imaging, immunofluorescence, and molecular profiling for comparative analysis.
- Translational Research: Maintains patient-specific heterogeneity for biomarker alignment and therapeutic prediction.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized protocol adaptable to various tumor types and research applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target and drug validation.
- Operational Value: Standardizes 3D culture workflows for reproducibility and scalability across teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by modeling clinical heterogeneity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D culture techniques and handling of viscous matrices like Matrigel.
- Demands access to imaging, histology, and molecular analysis infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for protocol reproducibility and data comparability.
- Adaptable to other tumor types with optimization of culture conditions.
- Limited by technical challenges in doming and sample handling, especially with low cell numbers.
