Ustanowienie i analiza trójwymiarowych (3D) organoidów pochodzących z próbek przerzutów do kości raka prostaty u pacjentów i ich ksenoprzeszczepów
3 lutego 2020
Trójwymiarowe hodowle próbek BMPC pacjentów i ksenoprzeszczepów raka prostaty z przerzutami do kości utrzymują funkcjonalną heterogeniczność swoich pierwotnych guzów, co prowadzi do powstawania torbieli, sferoid i złożonych, podobnych do guzów organoidów. Niniejszy manuskrypt zawiera strategię i protokół optymalizacji hodowli 3D heterogenicznych próbek pobranych od pacjentów i ich analizy przy użyciu IFC.
Opisujemy strategie i protokoły krok po kroku w celu ustanowienia seryjnych organoidów 3D pochodzących od pacjentów w raku prostaty z przerzutami do kości. Nasze zoptymalizowane protokoły są praktyczne w tworzeniu kultur 3D do eksperymentów przy użyciu ograniczonego materiału wyjściowego bezpośrednio od pacjentów lub tkanek guza ksenoprzeszczepu pobranych od pacjenta. Organoidy 3D z tego protokołu mogą być wykorzystywane jako modele ex vivo do zrozumienia podstawowych mechanizmów patologii raka prostaty z przerzutami do kości i do testowania leczenia.
Pożywka do hodowli organoidów 3D w tym protokole jest specyficzna dla komórek pochodzących z prostaty. Inne części naszych protokołów mają zastosowanie do różnych typów tkanek nowotworowych i miejsc przerzutowych. Technika domingu może okazać się najtrudniejszą częścią tego procesu.
Praktykowanie techniki domingu zapewni stałą wielkość kopulastej mieszaniny organoidów, pożywek i Matrigelu oraz zminimalizuje tworzenie się pęcherzyków podczas zawieszania próbki. Wizualne zademonstrowanie tej metody pozwala lepiej zrozumieć, jak obchodzić się z lepkim Matrigelem w celu skutecznego hodowania organoidów o mniejszej gęstości z niewielkiej liczby komórek. Zacznij od ponownego zawieszenia osadu komórkowego w odpowiedniej objętości błony podstawnej dla konfiguracji płytki 24-dołkowej.
Delikatnie pipetować w górę i w dół, aby upewnić się, że komórki są ponownie zawieszone, a następnie odpipetować odpowiednią objętość zawiesiny komórek do środka wstępnie podgrzanej płytki do hodowli tkankowej. Odwróć płytkę i natychmiast umieść ją do góry nogami w inkubatorze do hodowli komórkowych ustawionym na 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na 15 minut. Odpipetować odpowiednią objętość wstępnie podgrzanego podłoża zawierającego 10 mikromolowy dichlorowodorek Y-27632 do każdej studzienki.
Aby utworzyć pływającą kopułę z dołączonej okrągłej kopuły, odłącz kopułę od płyty za pomocą skrobaka do komórek. Wytnij kawałek folii parafinowej o wymiarach dwa na cztery cale i umieść go na wgłębieniach pustego stojaka na końcówki z jednomililitrowego plastikowego pudełka na końcówki do pipet. Palcem wskazującym w rękawiczce delikatnie dociśnij folię parafinową, aby obrysować wgłębienia, uważając, aby nie przebić się przez folię.
Spryskaj folię parafinową 70% etanolem i włącz lampę UV w okapie do hodowli komórkowych, aby sterylizować przygotowaną folię przez co najmniej 30 minut. W międzyczasie ponownie zawieś wstępnie przetworzone komórki w 20 mikrolitrach membrany podstawnej. Następnie odpipetować zawiesinę do wgłębień utworzonych w filmie parafinowym.
Umieść zestalone kulki i folię parafinową na płytce sześciodołkowej i odpipetuj od trzech do pięciu mililitrów wstępnie podgrzanego podłoża zawierającego 10 mikromolowych dichlorowodorków Y-27632 do każdej studzienki, delikatnie strzepując kulki z filmu parafinowego. Aby przetworzyć organoidy do histologii, należy usunąć istniejące pożywki ze studni, uważając, aby nie zassać kopuł błony podstawnej. Dodać równą objętość roztworu do odzyskiwania komórek i inkubować płytkę przez 60 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Po inkubacji należy usunąć kopułę błony podstawnej za pomocą pipety i zmiażdżyć ją końcówką pipety. Zbierz zdysocjowaną kopułę i roztwór do odzyskiwania komórek do 1,5 mililitrowej probówki. Odwirować probówkę o ciśnieniu 300 razy g w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut, następnie usunąć supernatant i odstawić go na bok.
Zachowaj wszystkie supernatanty do ostatniego etapu, kiedy obecność organoidów zostanie potwierdzona w żądanej objętości zimnego PBS i delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby mechanicznie usunąć osad bez naruszania organoidów. Powtórzyć wirowanie i usunąć supernatant. Utrwal granulat w dopasowanej objętości 4% PFA przez 60 minut w temperaturze pokojowej.
Po utrwaleniu powtórzyć etap wirowania i płukania PBS. Następnie powoli dodaj 200 mikrolitrów ciepłej 2% agarozy i natychmiast, ale delikatnie, odłącz osad komórkowy od ścianki rurki, nie naruszając go, za pomocą igły o rozmiarze 25 dołączonej do strzykawki o średnicy jednego mililitra. W przypadku metody wirowania agarozy bardzo ważne jest, aby odłączyć osad komórkowy od ścianki probówki zaraz po dodaniu agarozy za pomocą igły o rozmiarze 25.
Gdy agaroza całkowicie zastygnie, odłącz ją od rurki za pomocą igły o rozmiarze 25 dołączonej do jednomililitrowej strzykawki i przenieś do nowej rurki o pojemności 1,5 mililitra. Napełnij probówkę 70% etanolem i postępuj zgodnie z konwencjonalnym protokołem odwadniania tkanek i zatapiania parafiny. Protokół ten został z powodzeniem wykorzystany do stworzenia organoidów 3D z modeli ksenoprzeszczepów raka prostaty z przerzutami do kości, a także bezpośrednio z tkanki nowotworowej.
Organoidy wykazywały różne fenotypy, które objawiały się jako torbiele, sferoidy i organoidy o wyższej złożoności. Całą kopułę błony podstawnej i organoidów można zobaczyć na zszytym obrazie z 25 obrazów o wysokiej rozdzielczości i 10-krotnym powiększeniu. W celu dalszego zbadania tkanki nowotworowej przeprowadzono cytochemię immunofluorescencyjną na skrawku organoidów parafinowym o grubości pięciu mikrometrów ukierunkowanym na marker komórek podstawnego nabłonka cytokeratynę-5, marker komórek nabłonka światła cytokeratyna-8 i DAPI.
Protokół ten można zoptymalizować pod kątem innych zastosowań, takich jak Western blotting, kokultura i cytometria przepływowa w celu zbadania charakterystyki organoidów 3D i efektów leczenia farmakologicznego. Eksperymenty te mogą dotyczyć mechanizmów oporności na leki i skuteczności nowych terapii stosowanych samodzielnie lub w połączeniu z obecnie stosowanymi terapiami. Organoidy 3D z tej techniki zachowują heterogeniczność międzyosobniczą i wewnątrzosobniczą, a zatem są dokładniejszym modelem choroby u pacjentów.
Technika ta toruje naukowcom drogę do zbadania mechanizmów oporności na leki, nowotworzenia, przerzutów i terapii, które mogą być bardziej przewidywalne dla postępu choroby u pacjentów i ich odpowiedzi na terapię.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie przedstawia zoptymalizowane protokoły do ustanowienia trójwymiarowych (3D) kultur organoidalnych pochodzących od pacjentów z przerzutowym rakiem prostaty. Te organoidalne utrzymują funkcyjną heterogeniczność oryginalnych guzów, umożliwiając analizę patologii raka i testowanie leczenia.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Onkologia
- Biologia komórki
Tło
- Przerzutowy rak prostaty na kości stanowi unikalne wyzwania w badaniach.
- 3D kultury mogą lepiej naśladować mikrośrodowisko guza w porównaniu do tradycyjnych kultur 2D.
- Próbki pochodzące od pacjentów są kluczowe dla zrozumienia indywidualnych cech guza.
- Istniejące protokoły mogą nie być zoptymalizowane dla ograniczonego początkowego materiału.
Cel badania
- Opracowanie praktycznych protokołów dla 3D kultur organoidalnych pochodzących od pacjentów.
- Utrzymanie heterogeniczności guzów w kulturze.
- Zastąpienie modelu do badania patologii przerzutowego raka prostaty.
Stosowane metody
- Ustanowienie szeregowo 3D kultur z próbek pochodzących od pacjentów.
- Użycie specyficznego medium kulturowego dla komórek pochodzących z prostaty.
- Zastosowanie techniki domingu do formowania organoidalnego.
- Analiza organoidalnych na potrzeby testów eksperymentalnych.
Główne wyniki
- Skuteczna utrzymanie organoidalnych przypominających guz z próbek pacjentów.
- Demonstracja funkcyjnej heterogeniczności w 3D kulturach.
- Protokoły stosowalne dla różnych typów guzów i miejsc przerzutów.
- Identyfikacja wyzwań związanych z techniką domingu.
Wnioski
- Zoptymalizowane protokoły ułatwiają badania nad przerzutowym rakiem prostaty.
- 3D organoidalne służą jako cenne modele ex vivo do testowania leczenia.
- Przyszłe badania mogą rozwijać te metody dla szerszych zastosowań.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Three-dimensional patient-derived organoids (PDOs) from prostate cancer bone metastases provide a translationally relevant model that preserves tumor heterogeneity and functional characteristics. This capability enables mechanistic de-risking and predictive confidence for drug response and resistance studies at critical discovery and preclinical inflection points. Integrating PDOs into R&D pipelines supports risk-adjusted portfolio decisions and advances personalized therapeutic strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of tumorigenic pathways and resistance mechanisms in a disease-relevant system.
- Supports functional target validation by maintaining patient-specific genomic and phenotypic heterogeneity.
- Facilitates predictive confidence in target selection and mechanistic de-risking for portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Provides validated 3D biological systems for quantitative drug response and resistance assays.
- Enables assay standardization and reproducibility through optimized culture protocols.
- Supports scalable screening of novel therapeutics and combination regimens in a physiologically relevant context.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical models with patient tumor biology for improved translational continuity.
- Enables exploration of drug resistance, metastasis, and therapeutic efficacy in ex vivo systems.
- Supports biomarker discovery and validation in models that reflect clinical heterogeneity.
Pipeline & Workflow Integration
PDO establishment from patient and xenograft specimens bridges early discovery, lead identification, and preclinical validation by providing a reusable, disease-relevant platform.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and mechanistic studies of tumorigenesis and drug resistance.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound evaluation and assay development.
- Analytics: Enables high-content imaging, immunofluorescence, and molecular profiling for comparative analysis.
- Translational Research: Maintains patient-specific heterogeneity for biomarker alignment and therapeutic prediction.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized protocol adaptable to various tumor types and research applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target and drug validation.
- Operational Value: Standardizes 3D culture workflows for reproducibility and scalability across teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by modeling clinical heterogeneity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D culture techniques and handling of viscous matrices like Matrigel.
- Demands access to imaging, histology, and molecular analysis infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for protocol reproducibility and data comparability.
- Adaptable to other tumor types with optimization of culture conditions.
- Limited by technical challenges in doming and sample handling, especially with low cell numbers.
