Ustanowienie i analiza trójwymiarowych (3D) organoidów pochodzących z próbek przerzutów do kości raka prostaty u pacjentów i ich ksenoprzeszczepów

Trójwymiarowe hodowle próbek BMPC pacjentów i ksenoprzeszczepów raka prostaty z przerzutami do kości utrzymują funkcjonalną heterogeniczność swoich pierwotnych guzów, co prowadzi do powstawania torbieli, sferoid i złożonych, podobnych do guzów organoidów. Niniejszy manuskrypt zawiera strategię i protokół optymalizacji hodowli 3D heterogenicznych próbek pobranych od pacjentów i ich analizy przy użyciu IFC.

Opisujemy strategie i protokoły krok po kroku w celu ustanowienia seryjnych organoidów 3D pochodzących od pacjentów w raku prostaty z przerzutami do kości. Nasze zoptymalizowane protokoły są praktyczne w tworzeniu kultur 3D do eksperymentów przy użyciu ograniczonego materiału wyjściowego bezpośrednio od pacjentów lub tkanek guza ksenoprzeszczepu pobranych od pacjenta. Organoidy 3D z tego protokołu mogą być wykorzystywane jako modele ex vivo do zrozumienia podstawowych mechanizmów patologii raka prostaty z przerzutami do kości i do testowania leczenia.

Pożywka do hodowli organoidów 3D w tym protokole jest specyficzna dla komórek pochodzących z prostaty. Inne części naszych protokołów mają zastosowanie do różnych typów tkanek nowotworowych i miejsc przerzutowych. Technika domingu może okazać się najtrudniejszą częścią tego procesu.

Praktykowanie techniki domingu zapewni stałą wielkość kopulastej mieszaniny organoidów, pożywek i Matrigelu oraz zminimalizuje tworzenie się pęcherzyków podczas zawieszania próbki. Wizualne zademonstrowanie tej metody pozwala lepiej zrozumieć, jak obchodzić się z lepkim Matrigelem w celu skutecznego hodowania organoidów o mniejszej gęstości z niewielkiej liczby komórek. Zacznij od ponownego zawieszenia osadu komórkowego w odpowiedniej objętości błony podstawnej dla konfiguracji płytki 24-dołkowej.

Delikatnie pipetować w górę i w dół, aby upewnić się, że komórki są ponownie zawieszone, a następnie odpipetować odpowiednią objętość zawiesiny komórek do środka wstępnie podgrzanej płytki do hodowli tkankowej. Odwróć płytkę i natychmiast umieść ją do góry nogami w inkubatorze do hodowli komórkowych ustawionym na 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na 15 minut. Odpipetować odpowiednią objętość wstępnie podgrzanego podłoża zawierającego 10 mikromolowy dichlorowodorek Y-27632 do każdej studzienki.

Aby utworzyć pływającą kopułę z dołączonej okrągłej kopuły, odłącz kopułę od płyty za pomocą skrobaka do komórek. Wytnij kawałek folii parafinowej o wymiarach dwa na cztery cale i umieść go na wgłębieniach pustego stojaka na końcówki z jednomililitrowego plastikowego pudełka na końcówki do pipet. Palcem wskazującym w rękawiczce delikatnie dociśnij folię parafinową, aby obrysować wgłębienia, uważając, aby nie przebić się przez folię.

Spryskaj folię parafinową 70% etanolem i włącz lampę UV w okapie do hodowli komórkowych, aby sterylizować przygotowaną folię przez co najmniej 30 minut. W międzyczasie ponownie zawieś wstępnie przetworzone komórki w 20 mikrolitrach membrany podstawnej. Następnie odpipetować zawiesinę do wgłębień utworzonych w filmie parafinowym.

Umieść zestalone kulki i folię parafinową na płytce sześciodołkowej i odpipetuj od trzech do pięciu mililitrów wstępnie podgrzanego podłoża zawierającego 10 mikromolowych dichlorowodorków Y-27632 do każdej studzienki, delikatnie strzepując kulki z filmu parafinowego. Aby przetworzyć organoidy do histologii, należy usunąć istniejące pożywki ze studni, uważając, aby nie zassać kopuł błony podstawnej. Dodać równą objętość roztworu do odzyskiwania komórek i inkubować płytkę przez 60 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po inkubacji należy usunąć kopułę błony podstawnej za pomocą pipety i zmiażdżyć ją końcówką pipety. Zbierz zdysocjowaną kopułę i roztwór do odzyskiwania komórek do 1,5 mililitrowej probówki. Odwirować probówkę o ciśnieniu 300 razy g w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut, następnie usunąć supernatant i odstawić go na bok.

Zachowaj wszystkie supernatanty do ostatniego etapu, kiedy obecność organoidów zostanie potwierdzona w żądanej objętości zimnego PBS i delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby mechanicznie usunąć osad bez naruszania organoidów. Powtórzyć wirowanie i usunąć supernatant. Utrwal granulat w dopasowanej objętości 4% PFA przez 60 minut w temperaturze pokojowej.

Po utrwaleniu powtórzyć etap wirowania i płukania PBS. Następnie powoli dodaj 200 mikrolitrów ciepłej 2% agarozy i natychmiast, ale delikatnie, odłącz osad komórkowy od ścianki rurki, nie naruszając go, za pomocą igły o rozmiarze 25 dołączonej do strzykawki o średnicy jednego mililitra. W przypadku metody wirowania agarozy bardzo ważne jest, aby odłączyć osad komórkowy od ścianki probówki zaraz po dodaniu agarozy za pomocą igły o rozmiarze 25.

Gdy agaroza całkowicie zastygnie, odłącz ją od rurki za pomocą igły o rozmiarze 25 dołączonej do jednomililitrowej strzykawki i przenieś do nowej rurki o pojemności 1,5 mililitra. Napełnij probówkę 70% etanolem i postępuj zgodnie z konwencjonalnym protokołem odwadniania tkanek i zatapiania parafiny. Protokół ten został z powodzeniem wykorzystany do stworzenia organoidów 3D z modeli ksenoprzeszczepów raka prostaty z przerzutami do kości, a także bezpośrednio z tkanki nowotworowej.

Organoidy wykazywały różne fenotypy, które objawiały się jako torbiele, sferoidy i organoidy o wyższej złożoności. Całą kopułę błony podstawnej i organoidów można zobaczyć na zszytym obrazie z 25 obrazów o wysokiej rozdzielczości i 10-krotnym powiększeniu. W celu dalszego zbadania tkanki nowotworowej przeprowadzono cytochemię immunofluorescencyjną na skrawku organoidów parafinowym o grubości pięciu mikrometrów ukierunkowanym na marker komórek podstawnego nabłonka cytokeratynę-5, marker komórek nabłonka światła cytokeratyna-8 i DAPI.

Protokół ten można zoptymalizować pod kątem innych zastosowań, takich jak Western blotting, kokultura i cytometria przepływowa w celu zbadania charakterystyki organoidów 3D i efektów leczenia farmakologicznego. Eksperymenty te mogą dotyczyć mechanizmów oporności na leki i skuteczności nowych terapii stosowanych samodzielnie lub w połączeniu z obecnie stosowanymi terapiami. Organoidy 3D z tej techniki zachowują heterogeniczność międzyosobniczą i wewnątrzosobniczą, a zatem są dokładniejszym modelem choroby u pacjentów.

Technika ta toruje naukowcom drogę do zbadania mechanizmów oporności na leki, nowotworzenia, przerzutów i terapii, które mogą być bardziej przewidywalne dla postępu choroby u pacjentów i ich odpowiedzi na terapię.