Name: Ustanowienie i analiza trójwymiarowych (3D) organoidów pochodzących z próbek przerzutów do kości raka prostaty u pacjentów i ich ksenoprzeszczepów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Poznaj protokoły tworzenia trójwymiarowych organoidów z próbek przerzutów do kości raka prostaty u pacjentów. Te modele ex vivo zachowują heterogeniczność guzów i umożliwiają testowanie terapii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Fundację Charytatywną Leo i Anne Albert oraz Fundację JM. Dziękujemy członkom Centrum Onkologicznego Uniwersytetu Kalifornijskiego w San Diego Moores, dr Jing Yangowi i dr Kay T. Yeung za umożliwienie nam korzystania z ich mikrotomu oraz Randallowi Frenchowi z Wydziału Chirurgii za specjalistyczną wiedzę techniczną.

To badanie zostało przeprowadzone w ścisłej zgodności z zaleceniami zawartymi w Przewodniku dla Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej Uniwersytetu Kalifornijskiego w San Diego (UCSD) (IRB). IRB #090401 Otrzymano zgodę od UCSD Institutional Review Board (IRB) na pobranie próbki chirurgicznej od pacjentów do celów badawczych. Uzyskano świadomą zgodę każdego pacjenta i uzyskano wycinek chirurgiczny raka prostaty z przerzutów do kości w wyniku ortopedycznej naprawy patologicznego złamania kości udowej. Protokoły dotyczące zwierząt zostały przeprowadzone w ramach protokołu zatwierdzonego przez Uniwersytet Kalifornijski w San Diego (UCSD) oraz zatwierdzonego przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) #S10298. Komórki z mechanicznie i enzymatycznie zdysocjowanej tkanki nowotworowej pacjenta wstrzyknięto do kości udowej 6 do 8 tygodniowego samca Rag2-/-; γ myszy c-/- zgodnie z wcześniejszym opisem17. Objętość guza ksenoprzeszczepu określono za pomocą systemu obrazowania bioluminescencyjnego in vivo i pomiarów suwmiarką. Po wzroście guza do 2,0 cm (maksymalny dopuszczalny rozmiar zatwierdzony przez IACUC), guz został pobrany w celu ustanowienia organoidów 3D.
UWAGA: Rysunek 1 pokazuje przebieg tworzenia organoidów 3D oraz numer protokołu dla każdego etapu procedur eksperymentalnych.
1. Przetwarzanie tkanek nowotworowych ksenoprzeszczepu pobranego od pacjenta (PDX)
UWAGA: To jest pierwszy krok do stworzenia organoidów dla guza pochodzącego z mysiego modelu ksenoprzeszczepu. Protokół ten jest zaadaptowany z poprzedniej publikacji Drost et al.5 i zmodyfikowaliśmy warunki pożywki, aby uwzględnić suplementację surowicy do pożywek organoidowych.
<ol>
	<li>Przetwarzaj próbkę guza zgodnie z poniższym opisem.
	<ol>
		<li>Próbki guza należy rozdrobnić na 1-3 mm3 kawałki i trawić próbki za pomocą 10 ml roztworu do dysocjacji komórek przez 45 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Aby zakończyć trawienie, dodaj do próbek 20 ml kompletnej pożywki DMEM.</li>
		<li>Przefiltrować zawiesinę przez sitko o pojemności 70 μm. Użyj sterylnego kołnierza tłoka, aby wepchnąć resztki tkanki na wierzch sitka komórkowego o wielkości 70 μm.</li>
		<li>Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Umyj osad komórkowy trzykrotnie świeżą kompletną pożywką adDMEM. Dopasować objętość pożywki do przemywania i ponownego zawieszenia do objętości pożywki sugerowanej w Tabeli 3. Na przykład w przypadku hodowli na płytkach 24-dołkowych objętość prania powinna wynosić 500 μl. 
		UWAGA: Jak pokazano w tabeli 3, protokół ma zastosowanie do różnych warunków hodowli.</li>
		<li>Określ końcową liczbę komórek za pomocą niebieskiego barwnika trypanowego i hemocytometru.</li>
		<li>Po uzyskaniu liczby komórek ponownie zawiesić osad komórkowy w 80 μl 2% FBS w PBS na 2 x 106 komórek nowotworowych.</li>
		<li>Dodaj 20 μl koktajlu zubożenia komórek myszy na 2 x 106 komórek nowotworowych. Dobrze wymieszać i inkubować przez 15 minut w temperaturze 2-8 °C.</li>
		<li>Dostosuj objętość do 500 μl z 2% FBS w buforze PBS na 2 x 106 komórek nowotworowych. 
		UWAGA: Na jednej kolumnie LS można przetworzyć do 1 x 107 komórek nowotworowych w 2,5 ml zawiesiny komórkowej.</li>
		<li>Załaduj kolumny LS na magnetyczny separator kolumnowy i umieść stożkową rurkę o pojemności 15 ml na stojaku pod spodem, aby zebrać przepływ.</li>
		<li>Przepłukać każdą kolumnę 3 ml 2% FBS w buforze PBS. Wyrzuć stożkową probówkę z przepływem do płukania i zastąp nową, sterylną probówką stożkową o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Dodaj zawiesinę komórkową (do 2,5 ml 1 x 107 komórek nowotworowych) do kolumny. Zbierz przepływ, który zostanie wzbogacony o ludzkie komórki nowotworowe.</li>
		<li>Przepłukać kolumnę dwukrotnie 1 ml 2% FBS w buforze PBS. 
		UWAGA: Ważne jest, aby wykonać kroki mycia, gdy tylko kolumna będzie pusta. Staraj się również unikać tworzenia się pęcherzyków powietrza.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odpowiednią objętość zawiesiny komórkowej należy przeznaczyć na probówkę o pojemności 1,5 ml w celu uzyskania pożądanej hodowli (Tabela 3).</li>
	<li>Odwirować probówkę o pojemności 1,5 ml przy ciśnieniu 300 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant.</li>
</ol>
2. Przetwarzanie pierwotnych tkanek nowotworowych pacjenta
UWAGA: To jest pierwszy krok do założenia organoidów.
<ol>
	<li>Postępuj zgodnie ze wszystkimi krokami 1 z wyjątkiem procesu wyczerpywania się komórek myszy, który nie jest konieczny do przetwarzania pierwotnych tkanek nowotworowych pacjenta.</li>
</ol>
3. Formowanie dołączonej okrągłej kopuły na płycie
UWAGA: Ten manuskrypt opisuje trzy sposoby na wykonanie kopuły z mieszaniny osadu komórkowego i błony podstawnej (np. Matrigel), jak pokazano w Rysunek 1 i Rysunek 2. W krokach 2-4 komórki i błona podstawna powinny być trzymane na lodzie, aby zapobiec zestaleniu się błony podstawnej.
<ol>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej objętości błony podstawnej (np. 40 μl) dla zestawu płytek 24-dołkowych (tabela 3).</li>
	<li>Delikatnie pipetować w górę i w dół, aby upewnić się, że komórki są dobrze zawieszone w błonie podstawnej.</li>
	<li>Odpipetować odpowiednią objętość (Tabela 3) mieszaniny błony komórkowej i podstawnej (i opcjonalnie 10 μl kompletnej pożywki adDMEM) do środka wstępnie podgrzanej płytki do hodowli tkankowej.</li>
	<li>Odwrócić płytkę i natychmiast umieścić ją do góry nogami w inkubatorze do hodowli komórkowych CO2 ustawionym na 5% CO2 , 37 °C na 15 minut. Zapobiega to osiadaniu komórek i przyleganiu do dna płytki, jednocześnie umożliwiając zestalenie się błony podstawnej.</li>
	<li>Odpipetować odpowiednią objętość (Tabela 3) wstępnie podgrzanego podłoża zawierającego 10 μM dichlorowodorku Y-27632 do każdej studzienki.</li>
	<li>Umieścić płytkę prawą stroną do góry w inkubatorze do hodowli komórkowych CO2 (5% CO2, 37 °C).</li>
	<li>Zmieniaj nośnik co 3-4 dni. Po 5-7 dniach użyj pożywki hodowlanej bez 10 μM dichlorowodorku Y-27632 w celu utrzymania kultur.</li>
</ol>
4. Formowanie pływającej kopuły z dołączonej okrągłej kopuły na płycie
<ol>
	<li>Po kroku 3.7 odłącz kopułę za pomocą skrobaka do komórek.</li>
</ol>
5. Formowanie pływających koralików
UWAGA: Ten protokół nazywa się pływającymi koralikami, ponieważ mieszanina membrany podstawnej, mediów i organoidów wygląda jak koraliki.
<ol>
	<li>Wytnij kawałek folii parafinowej o wymiarach 2 cale x 4 cale.</li>
	<li>Umieść folię parafinową na wgłębieniach pustego stojaka na końcówki z plastikowego pudełka na końcówki o pojemności 1000 μl.</li>
	<li>Delikatnie dociśnij folię parafinową, aby obrysować wgłębienia za pomocą palca wskazującego w rękawiczce, ale bez przebijania się przez folię parafinową.</li>
	<li>Spryskaj folię parafinową 70% etanolem i włącz lampę UV w kapturze do hodowli komórkowych, aby sterylizować przygotowaną folię parafinową przez co najmniej 30 minut.</li>
	<li>Przygotować mieszaninę komórek i 20 μl błony podstawnej. Gęstość wysiewu może wynosić 50 000 - 250 000 komórek na kopułę.</li>
	<li>Odpipetować mieszaninę komórek przetworzonych z etapu 1 lub 2 i 20 μl błony podstawnej do formy divot utworzonej w przygotowanym filmie parafinowym.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w błonie podstawnej i odpipetować zawiesinę komórek w przygotowanych wgłębieniach pokrytych parafiną.</li>
	<li>Umieść zestalone kulki i folię parafinową na 6-dołkowej płytce. W jednym dołku w płytce 6-dołkowej może zmieścić się do 5 koralików.</li>
	<li>Odpipetować 3-5 ml wstępnie podgrzanego podłoża zawierającego 10 μM dichlorowodorku Y-27632 do każdej studzienki, delikatnie strzepując kulki z filmu parafinowego. 
	UWAGA: Jako minimalną objętość zalecane jest 3 ml. Dla maksymalnej liczby kulek (N=5) na studzienkę zaleca się 5 ml podłoża.</li>
	<li>Umieścić płytkę w inkubatorze CO2 (5% CO2 , 37 °C).</li>
	<li>Zmieniaj pożywkę organoidową co 3-4 dni. Po 5-7 dniach użyj pożywki hodowlanej bez 10 μM dichlorowodorku Y-27632 w celu utrzymania kultur.</li>
</ol>
6. Łączenie obrazów organoidów in vivo za pomocą mikroskopu8
UWAGA: Niektóre mikroskopy nie są w stanie dotrzeć do zewnętrznego obwodu płytki komórkowej (ściany krawędziowej); dlatego sugerujemy używanie studzienek blisko obwodu płytki komórkowej podczas łączenia obrazów.
<ol>
	<li>Umieść płytkę do hodowli komórkowej w pozycji skierowanej do góry w uchwycie płytki w mikroskopie Keyence.</li>
	<li>Umieść soczewkę na środku kopuły celu.</li>
	<li>Skonfiguruj automatyczny proces zszywania, wybierając liczbę klatek. Na przykład można wybrać 3 x 3 lub 5 x 5, aby wygenerować 9 obrazów lub łącznie 25 obrazów.</li>
	<li>Naciśnij przycisk przechwytywania, aby rozpocząć proces obrazowania.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie przeglądarki obrazów i załaduj grupę obrazów wykonanych w kroku 4.</li>
	<li>Kliknij opcję Zszywanie obrazów, aby utworzyć zszyty obraz o wysokiej rozdzielczości. 
	UWAGA: Przechwytywanie obrazów seryjnych 9 lub 25 można wykonać ręcznie lub automatycznie w celu ustawienia ostrości komórek.</li>
</ol>
7. Przetwarzanie organoidów do histologii: metoda odwirowania agarozy
UWAGA: Ten protokół jest adaptacją poprzedniej publikacji Vlachogiannis et al.7. Dodaliśmy krok polegający na osadzaniu agarozy, aby z powodzeniem osadzić wszystkie populacje organoidów.
<ol>
	<li>Usuń istniejące media ze studni. Uważaj, aby nie zasysać kopuł membrany podstawnej.</li>
	<li>Dodać równą (równą objętości pożywki usuniętej z kroku 1) objętość roztworu do odzyskiwania komórek i inkubować przez 60 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usuń kopułę membrany podstawnej za pomocą pipety i zmiażdż kopułę membrany podstawnej za pomocą końcówki pipety. Zebrać zdysocjowaną kopułę i roztwór do odzyskiwania komórek w probówce o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Wirować w temperaturze 300 x g i temperaturze 4 °C przez 5 min.</li>
	<li>Usunąć supernatant (roztwór do odzyskiwania komórek). Zachować wszystkie supernatanty w oddzielnych probówkach do końca, gdy obecność organoidów zostanie potwierdzona na ostatnim etapie granulowania.</li>
	<li>Dodać żądaną objętość (Tabela 3) zimnego PBS i delikatnie pipetować w górę i w dół, aby mechanicznie zakłócić osad</li>.
	<li>Wirować w temperaturze 300 x g i temperaturze 4 °C przez 5 min.</li>
	<li>Usunąć supernatant (PBS).</li>
	<li>Utrwalić osad w dopasowanej objętości (np. 500 μl na jeden osad z 24-dołkowej hodowli na płytce, tabela 3) 4% PFA przez 60 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po utrwaleniu odwirować przy ciśnieniu 300 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Usunąć supernatant (PFA).</li>
	<li>Przemyć odpowiednią objętością (np. 500 μl na jeden osad z 24-dołkowej hodowli na płytkach, tabela 3) PBS i odwirować przy 300 x g i temperaturze 4 °C przez 5 min.</li>
	<li>Przygotuj ciepłą agarozę (2% agarozy w PBS). 
	UWAGA: W tym przypadku granulki komórkowe do zamrożonych odcinków mogą być bezpośrednio ponownie zawieszone w 200 μl związku OCT bez dalszych kroków w Protokole 7.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad komórkowy w 200 μl agarozy (2% w PBS).
	<ol>
		<li>Natychmiast po dodaniu agarozy delikatnie oderwać osad komórkowy od ścianki probówki o pojemności 1,5 ml za pomocą igły 25 G dołączonej do strzykawki o pojemności 1 ml. Jak pokazano w Rysunek 3, jeśli osad komórkowy nie jest fizycznie oderwany od ścianki probówki o pojemności 1,5 ml, istnieje ryzyko utraty całości lub części osadu komórkowego podczas procesu zatapiania agarozy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Poczekaj, aż 2% agaroza w PBS całkowicie się zestali.</li>
	<li>Odłączyć zestalony blok agarozy od probówki o pojemności 1,5 ml za pomocą igły 25 G dołączonej do strzykawki o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Przenieść odłączony blok agarozy zawierający osad komórkowy do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Napełnij probówkę 70% EtOH i kontynuuj, stosując konwencjonalny protokół odwadniania tkanek i zatapiania parafiny.</li>
</ol>
8. Histologia i cytochemia immunofluorescencyjna (IFC) organoidów
<ol>
	<li>Wybierz slajdy do histologii lub IFC.</li>
	<li>Przed rozpoczęciem procesu barwienia dowiedz się, gdzie znajdują się komórki na szkiełku i narysuj okrąg wokół komórek na szkiełku za pomocą markera.</li>
	<li>Narysuj obwód wokół krawędzi lub krawędzi szkiełka oraz miejsca, w których znajdują się okręgi na szkiełku w zeszycie laboratoryjnym, aby zapisać ich położenie.</li>
	<li>Wykonaj żądane barwienie. 
	UWAGA: Podczas tego procesu zaznaczone kółka znikają, ponieważ zwykły ekspres nie jest odporny na chemikalia. Nawet niektóre markery histologiczne mogą zostać usunięte podczas procesu barwienia.</li>
	<li>Po procesie barwienia umieść szkiełko nad rysunkiem w zeszycie laboratoryjnym, aby znaleźć lokalizacje komórek na szkiełku.</li>
</ol>

<ol><li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li>
<li>Tushir, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unregulated+ARF6+activation+in+epithelial+cysts+generates+hyperactive+signaling+endosomes+and+disrupts+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Unregulated ARF6 activation in epithelial cysts generates hyperactive signaling endosomes and disrupts morphogenesis.</a> Molecular Biology of the Cell. 21 (13), 2355-2366 (2010).</li>
<li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li>
<li>McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Handling+and+Assessment+of+Human+Primary+Prostate+Organoid+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), 59051(2019).</li>
<li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).</li>
<li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li>
<li>Vlachogiannis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+model+treatment+response+of+metastatic+gastrointestinal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.</a> Science. 359 (6378), 920-926 (2018).</li>
<li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li>
<li>Abou-Kheir, W. G., Hynes, P. G., Martin, P. L., Pierce, R., Kelly, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+contribution+of+stem%2Fprogenitor+cells+to+tumorigenesis+in+the+Pten-%2F-TP53-%2F-+prostate+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Characterizing the contribution of stem/progenitor cells to tumorigenesis in the Pten-/-TP53-/- prostate cancer model.</a> Stem Cells. 28 (12), 2129-2140 (2010).</li>
<li>Beshiri, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+PDX%2FOrganoid+Biobank+of+Advanced+Prostate+Cancers+Captures+Genomic+and+Phenotypic+Heterogeneity+for+Disease+Modeling+and+Therapeutic+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A PDX/Organoid Biobank of Advanced Prostate Cancers Captures Genomic and Phenotypic Heterogeneity for Disease Modeling and Therapeutic Screening.</a> Clinical Cancer Research. 24 (17), 4332-4345 (2018).</li>
<li>Debnath, J., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+glandular+epithelial+cancers+in+three-dimensional+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures.</a> Nature Reviews Cancer. 5 (9), 675-688 (2005).</li>
<li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Evolution+and+Drug+Response+in+Patient-Derived+Organoid+Models+of+Bladder+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor Evolution and Drug Response in Patient-Derived Organoid Models of Bladder Cancer.</a> Cell. 173 (2), 515-528 (2018).</li>
<li>Puca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient+derived+organoids+to+model+rare+prostate+cancer+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes.</a> Nature Communications. 9 (1), 2404(2018).</li>
<li>Murrow, L. M., Weber, R. J., Gartner, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+stem+cell+niche+with+organoid+models%3A+an+engineering-based+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dissecting the stem cell niche with organoid models: an engineering-based approach.</a> Development. 144 (6), 998-1007 (2017).</li>
<li>Neal, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+Modeling+of+the+Tumor+Immune+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment.</a> Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).</li>
<li>Simmons, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Models+of+Bone+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">Animal Models of Bone Metastasis.</a> Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).</li>
<li>Godebu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCSD1%2C+a+new+patient-derived+model+of+bone+metastatic+prostate+cancer%2C+is+castrate-resistant+in+the+bone-niche%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">PCSD1, a new patient-derived model of bone metastatic prostate cancer, is castrate-resistant in the bone-niche.</a> Journal of Translational Medicine. 12, 275(2014).</li>
<li>Keyence Fluorescence Microscope. , Keyence Corporation. Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.keyence.com/ss/products/microscope/bz-x/">https://www.keyence.com/ss/products/microscope/bz-x/</a> (2019).</li>
</ol>

Sanghee Lee i Christina A.M. Jamieson są gościnnymi redaktorkami JoVE Methods Collection.

Organoidy 3D pochodzące z komórek raka prostaty z przerzutami do kości pacjenta są nadal stosunkowo rzadkie. W tym miejscu opisujemy strategie i dalej zoptymalizowany protokół do pomyślnego ustanowienia seryjnych organoidów 3D pochodzących od pacjentów (PDO) BMPC. Ponadto opisano protokoły zabezpieczania organoidów w próbkach o mniejszej gęstości komórek do analizy IFC i IHC. Zróżnicowane fenotypy w postaci torbieli, sferoid i bardziej złożonych organoidów wskazują, że protokół ten zapewnia warunki hodowli, które pozwala...

Trójwymiarowe organoidy hodowlane zwróciły uwagę ze względu na ich potencjał do podsumowania architektury in vivo, funkcjonalności komórkowej i sygnatury genetycznej ich oryginalnych tkanek1,2,3,4,5. Co najważniejsze, organoidy 3D utworzone na podstawie tkanek nowotworowych pacjenta lub modeli ksenoprzeszczepów pobranych od pacjenta (PDX) zapewniają nieocenione możliwości zrozumienia mechanizmów sygnalizacji komórkowej po nowotworzeniu i określenia wpływu leczenia farmakologicznego na każdą populację komórek6,7,8,9,10,11,12,13. Drost et al.5 opracowali standardowy protokół tworzenia ludzkich i mysich organoidów prostaty, który został szeroko przyjęty w dziedzinie urologii. Ponadto włożono wiele wysiłku w dalszą charakterystykę organoidów 3D i zrozumienie szczegółowych mechanizmów nowotworzenia i przerzutów4,12,14,15. Oprócz wcześniej ustalonego i powszechnie akceptowanego protokołu dla kultur organoidów 3D, opisujemy tutaj krok po kroku protokół dla hodowli 3D PDO przy użyciu trzech różnych metod domingu w zoptymalizowanych warunkach hodowli.
W tym manuskrypcie organoidy 3D zostały stworzone jako model ex vivo raka prostaty z przerzutami do kości (BMPC). Komórki użyte do tych hodowli pochodziły z serii Prostate Cancer San Diego (PCSD) i pochodziły bezpośrednio z tkanek nowotworowych z przerzutami do kości raka prostaty (PCSD18 i PCSD22) lub modeli guza ksenoprzeszczepu (PDX) pochodzących od pacjenta (próbki o nazwach PCSD1, PCSD13 i PCSD17). Ponieważ spontaniczne przerzuty komórek raka prostaty do kości są rzadkie w genetycznie modyfikowanych modelach mysich16, zastosowaliśmy bezpośrednie wstrzyknięcie ludzkich komórek nowotworowych do kości udowej (IF) samcom myszy Rag2-/-γc-/- w celu ustalenia modeli PDX raka prostaty z przerzutami do kości17.
Po ustaleniu organoidów 3D z heterogenicznych komórek nowotworowych pacjenta lub ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjenta, konieczne jest potwierdzenie ich tożsamości jako komórek nowotworowych prostaty i określenie ich fenotypów w hodowlach organoidów 3D. Chemia immunofluorescencyjna (IFC) umożliwia wizualizację ekspresji białek in situ w każdej komórce, często wskazując potencjalne funkcje dla określonych populacji komórek2,4. Ogólnie rzecz biorąc, protokoły IFC dla zdecydowanej większości próbek, w tym tkanek i komórek, są proste i w pełni zoptymalizowane. Jednak gęstość komórek i liczba organoidów może być znacznie niższa niż w przypadku konwencjonalnej hodowli. W związku z tym protokół IFC dla organoidów wymaga dodatkowych kroków w celu zapewnienia prawidłowego przetwarzania i zatapiania w parafinie dla wszystkich organoidów w próbkach. Opisujemy dodatkowe kroki procesu wstępnego zatapiania agarozy oraz wskazówki dotyczące oznaczania lokalizacji podzielonych organoidów na szkiełku, co zwiększa wskaźnik sukcesu IFC na organoidach, zwłaszcza gdy próbki organoidów mają mniejszą gęstość komórek niż pożądana.

<table><tbody><tr><td>1 ml Pipettman</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Strzykawka</td><td>BD</td><td>329654</td><td></td></tr><tr><td>probówka 1,5 ml</td><td>Spectrum Lab Products</td><td>941-11326-ATP083</td><td></td></tr><tr><td>Igła 25G</td><td>BD PrecisionGlide</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehydu (PFA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>J61899</td><td></td></tr><tr><td>70% etanolu (EtOH)</td><td>VWR</td><td>BDH1164-4LP</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris Bioscience</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>Accumax</td><td>Innowacyjne technologie komórkowe, Inc.</td><td>AM105</td><td></td></tr><tr><td>adDMEM</td><td>Life Technologies</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Lonza</td><td>50000</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało -dla cytokeratyny 5</td><td>Przeciwciało 905901</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biolegend dla cytokeratyny 8</td><td>Biolegend</td><td>904801</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>System obrazowania bioluminescencyjnego, IVIS 200</td><td>Perkin Elmer Inc</td><td>IVIS 200</td><td></td></tr><tr><td>Płytka do hodowli komórkowych - 24-dołkowa</td> płytka do hodowli komórkowych <td>Costar</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>- 48-dołkowa</td> płytka do hodowli komórkowych <td>Costar</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>- 6-dołkowa</td> Roztwór do dysocjacji komórek <td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>, Accumax</td><td>Innovative Cell Technologies, Inc.</td><td>AM105</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do odzyskiwania komórek</td><td>Corning</td><td>354253</td><td></td></tr><tr><td>Skrobak do komórek</td><td>Sarstedt</td><td>83.180</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek</td><td>Falcon (Corning)</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2</td><td>Fisher Scientific</td><td>3546</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Vector Vectashield</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>DHT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-073-1ML</td><td></td></tr><tr><td>dPBS</td><td>Corning/Cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>PeproTech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Kleszcze PeproTech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Denville Scientific</td><td>S728696</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>LS Kolumny</td><td>Miltenyi</td><td>130-0420401</td><td></td></tr><tr><td>Magnetyczny separator kolumn: Separator QuadroMACS</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Marker</td><td>VWR</td><td>52877-355</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (Obniżony współczynnik wzrostu)</td><td>Mediatech Inc. (Corning)</td><td></td><td></td>356231</tr><tr><td>Matrigel (wysokie stężenie)</td><td>BD (Fisher Scientific)</td><td>CB354248</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania mikroskopem, Keyence</td><td>BZ-X800 (najnowsze oprogramowanie) BZ-X700 (stare oprogramowanie)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop, Keyence</td><td>BZ-X700 (model 2016-2017)/BZ-X710 (model 2018-2019)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do zmniejszania liczby komórek myszy</td><td>Miltenyi</td><td>130-104-694</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylocysteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>Nikotynamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636-100G</td><td></td></tr><tr><td>Noggin</td><td>PeproTech</td><td>120-10C</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>Compound Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>American National Can</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Mediatech Inc. (Corning)</td><td>30-002-CI-1</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet na 1 ml (niebieskie końcówki)</td><td>Fisherbrand Redi-Tip</td><td>21-197-85</td><td></td></tr><tr><td>Tłok (od strzykawki 3 ml)</td><td>Strzykawka BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Prostaglandyna E2</td><td>Tocris Bioscience</td><td>2296</td><td></td></tr><tr><td>R-Spondin 1</td><td>Trevigen</td><td>3710-001-01</td><td></td></tr><tr><td>SB2021190</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7076-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Mały blat Wirówka</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75002426</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel Wodna</td><td>Fisher Sci</td><td>2320</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 Dichlorowodorek</td><td>Abmole</td><td>Bioscience M1817</td><td></td></tr></tbody></table>

ustanowienie i analiza trójwymiarowych (3d) organoidów pochodzących z próbek przerzutów do kości raka prostaty u pacjentów i ich ksenoprzeszczepów

Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Trójwymiarowa (3D) hodowla organoidów z próbek guzów ludzkich pacjentów oraz modele ksenoprzeszczepów (PDX) raka prostaty, określane jako organoidy pochodzące od pacjentów (PDO), są nieocenionym źródłem do badania mechanizmu nowotworzenia i przerzutów raka prostaty. Ich główną zaletą jest to, że zachowują charakterystyczną genomową i funkcjonalną heterogeniczność oryginalnej tkanki w porównaniu z konwencjonalnymi liniami komórkowymi, które tego nie robią. Co więcej, hodowle 3D ChNP mogą być wykorzystywane do przewidywania skutków leczenia farmakologicznego u poszczególnych pacjentów i stanowią krok w kierunku medycyny spersonalizowanej. Pomimo tych zalet, niewiele grup rutynowo stosuje tę metodę, częściowo ze względu na rozległą optymalizację warunków hodowli PDO, które mogą być wymagane dla różnych próbek pacjentów. Wcześniej wykazaliśmy, że nasz model PDX przerzutów do kości raka prostaty, PCSD1, podsumowuje oporność przerzutów do kości dawcy na terapię antyandrogenową. Wykorzystaliśmy organoidy 3D PCSD1 do dalszego scharakteryzowania mechanizmów oporności antyandrogenowej. Po przeglądzie obecnie opublikowanych badań modeli PDX i PDO, opisujemy krok po kroku protokół hodowli 3D PDO przy użyciu kopułowych lub pływających kulek z błoną podstawną (np. Matrigel) w zoptymalizowanych warunkach hodowli. Opisano również obrazowanie in vivo ściegami i przetwarzanie komórek na potrzeby histologii. Protokół ten może być dodatkowo zoptymalizowany pod kątem innych zastosowań, w tym western blot, kokultury itp., i może być wykorzystany do zbadania cech chNP hodowanych w 3D w odniesieniu do oporności na leki, nowotworzenia, przerzutów i terapii.

Organoidowe struktury trójwymiarowe zostały pomyślnie wyizolowane z modelu ksenotransplantatu pochodzącego od pacjenta (PDX) raka prostaty z przerzutami do kości (BMPC), a także bezpośrednio z tkanki pacjenta z przerzutami kostnymi raka prostaty (Rycina 4). W skrócie, nasze modele PDX raka prostaty z przerzutami do kości zostały uzyskane poprzez wstrzyknięcie komórek nowotworowych do jamy udowej (IF) samców myszy linii Rag2-/- c-/-, a następnie guzy PDX zostały zebrane ...

Trójwymiarowe hodowle próbek BMPC pacjentów i ksenoprzeszczepów raka prostaty z przerzutami do kości utrzymują funkcjonalną heterogeniczność swoich pierwotnych guzów, co prowadzi do powstawania torbieli, sferoid i złożonych, podobnych do guzów organoidów. Niniejszy manuskrypt zawiera strategię i protokół optymalizacji hodowli 3D heterogenicznych próbek pobranych od pacjentów i ich analizy przy użyciu IFC.

Ustanowienie i analiza trójwymiarowych (3D) organoidów pochodzących z próbek przerzutów do kości raka prostaty u pacjentów i ich ksenoprzeszczepów

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred ...

Opisujemy strategie i protokoły krok po kroku w celu ustanowienia seryjnych organoidów 3D pochodzących od pacjentów w raku prostaty z przerzutami do kości. Nasze zoptymalizowane protokoły są praktyczne w tworzeniu kultur 3D do eksperymentów przy użyciu ograniczonego materiału wyjściowego bezpośrednio od pacjentów lub tkanek guza ksenoprzeszczepu pobranych od pacjenta. Organoidy 3D z tego protokołu mogą być wykorzystywane jako modele ex vivo do zrozumienia podstawowych mechanizmów patologii raka prostaty z przerzutami do kości i do testowania leczenia.Pożywka do hodowli organoidów 3D w tym protokole jest specyficzna dla komórek pochodzących z prostaty. Inne części naszych protokołów mają zastosowanie do różnych typów tkanek nowotworowych i miejsc przerzutowych. Technika domingu może okazać się najtrudniejszą częścią tego procesu.Praktykowanie techniki domingu zapewni stałą wielkość kopulastej mieszaniny organoidów, pożywek i Matrigelu oraz zminimalizuje tworzenie się pęcherzyków podczas zawieszania próbki. Wizualne zademonstrowanie tej metody pozwala lepiej zrozumieć, jak obchodzić się z lepkim Matrigelem w celu skutecznego hodowania organoidów o mniejszej gęstości z niewielkiej liczby komórek. Zacznij od ponownego zawieszenia osadu komórkowego w odpowiedniej objętości błony podstawnej dla konfiguracji płytki 24-dołkowej.Delikatnie pipetować w górę i w dół, aby upewnić się, że komórki są ponownie zawieszone, a następnie odpipetować odpowiednią objętość zawiesiny komórek do środka wstępnie podgrzanej płytki do hodowli tkankowej. Odwróć płytkę i natychmiast umieść ją do góry nogami w inkubatorze do hodowli komórkowych ustawionym na 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na 15 minut. Odpipetować odpowiednią objętość wstępnie podgrzanego podłoża zawierającego 10 mikromolowy dichlorowodorek Y-27632 do każdej studzienki.Aby utworzyć pływającą kopułę z dołączonej okrągłej kopuły, odłącz kopułę od płyty za pomocą skrobaka do komórek. Wytnij kawałek folii parafinowej o wymiarach dwa na cztery cale i umieść go na wgłębieniach pustego stojaka na końcówki z jednomililitrowego plastikowego pudełka na końcówki do pipet. Palcem wskazującym w rękawiczce delikatnie dociśnij folię parafinową, aby obrysować wgłębienia, uważając, aby nie przebić się przez folię.Spryskaj folię parafinową 70% etanolem i włącz lampę UV w okapie do hodowli komórkowych, aby sterylizować przygotowaną folię przez co najmniej 30 minut. W międzyczasie ponownie zawieś wstępnie przetworzone komórki w 20 mikrolitrach membrany podstawnej. Następnie odpipetować zawiesinę do wgłębień utworzonych w filmie parafinowym.Umieść zestalone kulki i folię parafinową na płytce sześciodołkowej i odpipetuj od trzech do pięciu mililitrów wstępnie podgrzanego podłoża zawierającego 10 mikromolowych dichlorowodorków Y-27632 do każdej studzienki, delikatnie strzepując kulki z filmu parafinowego. Aby przetworzyć organoidy do histologii, należy usunąć istniejące pożywki ze studni, uważając, aby nie zassać kopuł błony podstawnej. Dodać równą objętość roztworu do odzyskiwania komórek i inkubować płytkę przez 60 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po inkubacji należy usunąć kopułę błony podstawnej za pomocą pipety i zmiażdżyć ją końcówką pipety. Zbierz zdysocjowaną kopułę i roztwór do odzyskiwania komórek do 1,5 mililitrowej probówki. Odwirować probówkę o ciśnieniu 300 razy g w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut, następnie usunąć supernatant i odstawić go na bok.Zachowaj wszystkie supernatanty do ostatniego etapu, kiedy obecność organoidów zostanie potwierdzona w żądanej objętości zimnego PBS i delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby mechanicznie usunąć osad bez naruszania organoidów. Powtórzyć wirowanie i usunąć supernatant. Utrwal granulat w dopasowanej objętości 4% PFA przez 60 minut w temperaturze pokojowej.Po utrwaleniu powtórzyć etap wirowania i płukania PBS. Następnie powoli dodaj 200 mikrolitrów ciepłej 2% agarozy i natychmiast, ale delikatnie, odłącz osad komórkowy od ścianki rurki, nie naruszając go, za pomocą igły o rozmiarze 25 dołączonej do strzykawki o średnicy jednego mililitra. W przypadku metody wirowania agarozy bardzo ważne jest, aby odłączyć osad komórkowy od ścianki probówki zaraz po dodaniu agarozy za pomocą igły o rozmiarze 25.Gdy agaroza całkowicie zastygnie, odłącz ją od rurki za pomocą igły o rozmiarze 25 dołączonej do jednomililitrowej strzykawki i przenieś do nowej rurki o pojemności 1,5 mililitra. Napełnij probówkę 70% etanolem i postępuj zgodnie z konwencjonalnym protokołem odwadniania tkanek i zatapiania parafiny. Protokół ten został z powodzeniem wykorzystany do stworzenia organoidów 3D z modeli ksenoprzeszczepów raka prostaty z przerzutami do kości, a także bezpośrednio z tkanki nowotworowej.Organoidy wykazywały różne fenotypy, które objawiały się jako torbiele, sferoidy i organoidy o wyższej złożoności. Całą kopułę błony podstawnej i organoidów można zobaczyć na zszytym obrazie z 25 obrazów o wysokiej rozdzielczości i 10-krotnym powiększeniu. W celu dalszego zbadania tkanki nowotworowej przeprowadzono cytochemię immunofluorescencyjną na skrawku organoidów parafinowym o grubości pięciu mikrometrów ukierunkowanym na marker komórek podstawnego nabłonka cytokeratynę-5, marker komórek nabłonka światła cytokeratyna-8 i DAPI.Protokół ten można zoptymalizować pod kątem innych zastosowań, takich jak Western blotting, kokultura i cytometria przepływowa w celu zbadania charakterystyki organoidów 3D i efektów leczenia farmakologicznego. Eksperymenty te mogą dotyczyć mechanizmów oporności na leki i skuteczności nowych terapii stosowanych samodzielnie lub w połączeniu z obecnie stosowanymi terapiami. Organoidy 3D z tej techniki zachowują heterogeniczność międzyosobniczą i wewnątrzosobniczą, a zatem są dokładniejszym modelem choroby u pacjentów.Technika ta toruje naukowcom drogę do zbadania mechanizmów oporności na leki, nowotworzenia, przerzutów i terapii, które mogą być bardziej przewidywalne dla postępu choroby u pacjentów i ich odpowiedzi na terapię.

establishment-analysis-three-dimensional-3d-organoids-derived-from

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Organoidy pochodzące z nowotworów są rodzajem modelu hodowli komórek 3D, który może zachować patologiczne cechy i specyficzną dla narządu linię komórkową guzów. W przykładowym protokole zobaczymy, jak naukowcy generują organoidy z guza prostaty z genetycznie zmodyfikowanego modelu myszy.

Przygotowanie organoidów z guzów: model guza 3D in vitro

Ten manuskrypt szczegółowo opisuje metodę używaną do generowania ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem prostaty (PDX) z krążących komórek nowotworowych (CTC). Generowanie modeli PDX z CTC zapewnia alternatywny model eksperymentalny do badania raka prostaty; Najczęściej diagnozowany nowotwór i częsta przyczyna zgonów z powodu raka u mężczyzn.

Generowanie modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem prostaty z krążących komórek nowotworowych

Rak prostaty jest drugą najczęstszą przyczyną zgonów związanych z rakiem w Stanach Zjednoczonych. Ortotopowy model raka stanowi użyteczne podejście do zrozumienia biologii raka prostaty i oceny skuteczności schematów terapeutycznych. Protokół ten opisuje szczegółowe kroki niezbędne do ustalenia ortotopowego modelu myszy raka prostaty.

Przedkliniczny ortotopowy mysi model ludzkiego raka prostaty

Tutaj prezentujemy protokół, który pomaga w postępowaniu z ludzkimi organoidami pierwotnymi prostaty, a następnie sugerujemy punkty końcowe do oceny fenotypu. Opisano wysiew, utrzymanie kultur, odzysk z żelu matrycowego, kwantyfikację morfologiczną, osadzanie i sekcjonowanie, cięcie FFPE, barwienie całego mocowania oraz zastosowanie testów komercyjnych.

Postępowanie z ludzką pierwotną hodowlą organoidów gruczołu krokowego i ich ocena

Pokazujemy metodę sekcji zwłok i sekcji mysich modeli raka prostaty, skupiając się na sekcji guza prostaty. Przedstawiono również protokół krok po kroku generowania organoidów guza gruczołu krokowego u myszy.

Generowanie organoidów nowotworowych z genetycznie modyfikowanych mysich modeli raka prostaty

Prezentowany tutaj jest protokół do badania reakcji farmakologicznych w organoidach nabłonka prostaty. Organoidy bardzo przypominają biologię in vivo i podsumowują genetykę pacjenta, co czyni je atrakcyjnymi systemami modelowymi. Organoidy prostaty można ustalić z prostaty typu dzikiego, genetycznie modyfikowanych modeli myszy, łagodnych tkanek ludzkich i zaawansowanego raka prostaty.

Hodowle organoidów prostaty jako narzędzia do translacji genotypów i profili mutacji na odpowiedzi farmakologiczne

Opisano metodę tworzenia organoidów przy użyciu ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjenta (PDX) do badań przesiewowych in vitro, co daje dopasowane pary modeli in vivo/in vitro. Guzy PDX zostały zebrane/przetworzone na małe kawałki mechanicznie lub enzymatycznie, a następnie metodą Cleversa do wyhodowania organoidów nowotworowych, które zostały pasażowane, kriokonserwowane i scharakteryzowane w stosunku do oryginalnego PDX.

Tworzenie dopasowanych par modeli in vivo/in vitro pochodzących od pacjentów PDX i organoidów pochodzących z PDX do badań farmakologicznych nad nowotworami

Organoidy pochodzące od pacjentów (PDO) są potężnym narzędziem w translacyjnych badaniach nad rakiem, odzwierciedlając zarówno genetyczną i fenotypową heterogeniczność choroby, jak i odpowiedź na spersonalizowane terapie przeciwnowotworowe. W tym miejscu szczegółowo omówiono skonsolidowany protokół generowania PDO ludzkiego pierwotnego raka pęcherza moczowego w ramach przygotowań do oceny analiz fenotypowych i odpowiedzi na leki.

Hodowla organoidów raka pęcherza moczowego jako narzędzia medycyny precyzyjnej

Szczegółowy protokół jest tutaj podany do ustalania ludzkich organoidów piersi na podstawie resekcji guza piersi pochodzących od pacjenta lub normalnej tkanki piersi. Protokół zawiera kompleksowe instrukcje krok po kroku dotyczące hodowli, zamrażania i rozmrażania organoidów piersi pochodzących od ludzkich pacjentów.

Tworzenie i hodowla organoidów piersi pochodzących od pacjentów

Organoidy nowotworowe zrewolucjonizowały badania nad rakiem i podejście do medycyny spersonalizowanej. Reprezentują one klinicznie istotny model guza, który pozwala naukowcom być o krok przed guzem w klinice. Protokół ten ustanawia organoidy nowotworowe ze świeżych próbek tkanki guza trzustki i ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów pochodzących od gruczolakoraka trzustki.

Tworzenie organoidów nowotworowych i fibroblastów pochodzących z raka trzustki ze świeżych tkanek

Heterogeniczność raka prostaty i oporność na leczenie pozostają wyzwaniami. Opisujemy protokół generowania organoidów pochodzących od pacjentów (PDO), które zachowują kluczowe cechy guza rodzicielskiego. Ten standaryzowany model wspiera badania przesiewowe leków i postępy w medycynie precyzyjnej.

Ustanowienie i utrzymanie organoidów raka prostaty pochodzących od pacjentów: szczegółowy protokół eksperymentalny

Poznaj protokoły tworzenia trójwymiarowych organoidów z próbek przerzutów do kości raka prostaty u pacjentów. Te modele ex vivo zachowują heterogeniczność guzów i umożliwiają testowanie terapii.

Ustanowienie i analiza trójwymiarowych (3D) organoidów pochodzących z próbek przerzutów do kości raka prostaty u pacjentów i ich ksenoprzeszczepów (Wideo) | JoVE Journal

Ustanowienie i analiza trójwymiarowych (3D) organoidów pochodzących z próbek przerzutów do kości raka prostaty u pacjentów i ich ksenoprzeszczepów

Przeglądaj więcej filmów