Predykcyjne modelowanie immunologiczne guzów litych

Kompleksowe scharakteryzowanie mikrośrodowiska guza jest niezbędne w badaniach immunoonkologicznych. Ten test jest pierwszym, w którym wykorzystano modele ekspresji zdrowotnej oparte na RNA do pomiaru komórek odpornościowych w tkance guza litego. Test ten umożliwia naukowcom uzyskanie bardzo czułych i specyficznych pomiarów tekstury immunologicznej w tkankach guza litego FFB oraz połączenie tych wyników w wielowymiarowy biomarker.

Wszystkie metody leczenia raka, nie tylko immunoterapie, wywołują odpowiedź immunologiczną w miejscu guza litego. Pomiar tej odpowiedzi immunologicznej jest ważny dla zrozumienia progresji choroby i odpowiedzi na terapię. Protokół ten łączy tradycyjne techniki przygotowania biblioteki RNA z ukierunkowanym wychwytywaniem.

Chociaż jest to czasochłonne, przestrzeganie etapów mycia i monitorowanie punktów kontrolnych kontroli jakości zgodnie z sugestiami jest bardzo ważne dla sukcesu. W przypadku wysoce zdegradowanego RNA z próbek zatopionych w parafinie utrwalonym w formalinie, reakcję syntezy pierwszej nici należy przeprowadzić na lodzie zgodnie z tabelą. Dokładnie wymieszać reakcje, pipetując kilkakrotnie w górę i w dół, a następnie na krótko odwirować próbki w mikrowirówce.

Po zakończeniu wirowania natychmiast umieścić próbki w nagrzanym termocyklerze zgodnie z programem numer trzy z tabeli. Aby uzyskać wysokiej jakości nienaruszone RNA, złóż reakcję syntezy pierwszej nici na lodzie w probówce PCR bez nukleazy, jak opisano w tabelach. Aby rozpocząć tę procedurę, wymieszaj 200 nanogramów interesującej nas biblioteki kodów kreskowych z dwoma mikrogramami DNA COT-1 i dwoma mikrolitrami oligonukleukleotydów blokujących w probówce PCR bez nukleazy.

Następnie użyj koncentratora próżniowego ustawionego na 30 do 45 stopni Celsjusza, aby wysuszyć zawartość tuby. Po hybrydyzacji wyjmij próbki z termocyklera i ustaw termocykler na inkubację w temperaturze 65 stopni Celsjusza z podgrzewaną pokrywką ustawioną na 70 stopni Celsjusza. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 17 mikrolitrów w pełni homogenizowanych kulek do próbek i dokładnie pipetuj w górę i w dół 10 razy.

Aby związać DNA z kulkami, umieść probówki w termocyklerze zgodnie z programem 10, na krótko usuwając odizolowane rurki co 10 do 12 minut na trzy sekundy delikatnego wirowania, aby kulki pozostały ponownie zawieszone. Bezpośrednio po inkubacji wiązania wyjąć jeden pasek probówek z termocyklera i dodać 100 mikrolitrów podgrzanego buforu do przemywania do probówek. Dokładnie pipetować w górę i w dół 10 razy i umieścić probówki na stojaku magnetycznym, aby kulki całkowicie oddzieliły się od roztworu płuczącego przed zasysaniem niezwiązanego DNA zawierającego supernatant.

Wyjmij probówki ze stojaka i dodaj 150 mikrolitrów wstępnie podgrzanego, rygorystycznego buforu do mycia z dokładnym wymieszaniem, aby całkowicie zawiesić kulki, uważając, aby uniknąć pęcherzyków. Umieść probówki z powrotem w termocyklerze w temperaturze 65 stopni Celsjusza na pięć minut przed umieszczeniem probówek z powrotem na stojaku magnetycznym, aby umożliwić całkowite oddzielenie się kulek od supernatantów. Odrzucić niezwiązane DNA zawierające supernatanty, przemyć kulki jeszcze raz podgrzanym rygorystycznym buforem do mycia, jak właśnie pokazano, w sumie dla dwóch rygorystycznych płukań.

Po ostatnim płukaniu usunąć supernatant i dodać 150 mikrolitrów pierwszego buforu do przemywania w temperaturze pokojowej do probówek. Odpipetować płukanie 10 do 20 razy, aby całkowicie zawiesić kulki i inkubować próbki z zamkniętą pokrywką przez dwie minuty, na przemian wirując przez 30 sekund i odpoczywając przez 30 sekund. Pod koniec inkubacji należy krótko odwirować i umieścić probówki na stojaku magnetycznym i usunąć supernatant, gdy kulki całkowicie przylgną do magnesu.

Odwirować krótko probówki z zamkniętymi nakrętkami i umieścić próbki z powrotem na stojaku magnetycznym. Użyj pipety o pojemności 10 mikrolitrów, aby usunąć resztki buforu do płukania i dodaj 150 mikrolitrów buforu do płukania w temperaturze pokojowej dwa. Odpipetować płukanie od 10 do 20 razy, aby całkowicie zawiesić kulki i inkubować próbki z zamkniętymi pokrywkami przez dwie minuty, na przemian wirując przez 30 sekund i odpoczywając przez 30 sekund.

Po krótkim odwirowaniu przenieś całą objętość kulek z każdej probówki do czystych probówek PCR bez nukleaz i umieść probówki na stojaku magnetycznym. Po odrzuceniu niezwiązanego DNA zawierającego supernatanty, ponownie krótko odwirować próbki i użyć pipety o pojemności 10 mikrolitrów, aby usunąć resztki buforu do płukania z kulek, gdy znajdują się one w stojaku magnetycznym. Dodaj 150 mikrolitrów buforu do płukania trzy do probówek i pipetuj w górę iw dół 10 do 20 razy, aby całkowicie zawiesić kulki.

Inkubować probówkę przez dwie minuty, na przemian przez 30 sekund delikatnego wirowania i 30 sekund odpoczynku, a następnie krótko odwirować. Umieść probówki na stojaku magnetycznym, aby zassać supernatanty i ponownie krótko odwirować próbki kulek. Użyj pipety o pojemności 10 mikrolitrów, aby usunąć resztki buforu płuczącego z kulek, gdy znajdują się one w stojaku magnetycznym, przed wyjęciem probówek ze stojaka i ponownym zawieszeniem kulek w 20 mikrolitrach wody wolnej od nukleaz na probówkę.

Następnie odpipetuj kulki 10 razy, aby upewnić się, że wszystkie koraliki przyklejone do boku probówek zostały ponownie zawieszone. Należy ocenić obecność dimerów adaptera, aby określić, czy konieczne jest dodatkowe czyszczenie. Na przykład ten elektroferogram pokazuje akceptowalny poziom dimeru adaptera, który pojawia się jako ostry pik wokół 128 par zasad, podczas gdy ten elektroferogram pokazuje niedopuszczalny poziom dimera adaptera.

Profile immunologiczne przed i po leczeniu mogą być wykorzystane do zrozumienia wpływu określonej terapii na mikrośrodowisko guza, tak jak w tej reprezentatywnej analizie, dla której zmiany procentowe dla każdej komórki odpornościowej będącej przedmiotem zainteresowania oraz całkowita zawartość immunologiczna są pokazane przed i po chemioterapii dla jednego pacjenta. W tej analizie próbki między grupami pacjentów porównano pod względem czasu do progresji choroby po leczeniu. Podgrupa pacjentów wykazała nawrót choroby po 18 miesiącach, podczas gdy inna podgrupa postępowała szybciej w ciągu 18 lub mniej miesięcy.

Mediana wartości delta może być następnie porównana dla każdej próbki w celu zidentyfikowania przypuszczalnych biomarkerów postępu choroby. Na przykład w tym przypadku zidentyfikowano dwa geny ucieczki immunologicznej jako statystycznie istotne różnicowniki grup próbek. Ponieważ poszczególne biomarkery genów były solidne i miały wyraźną istotność statystyczną, wielowymiarowy biomarker nie dodał istotnej wartości predykcyjnej.

Pamiętaj, aby wykonywać pranie na gorąco po jednym pasku na raz, aby zapobiec wychłodzeniu próbki i pamiętaj, aby przenieść kulki do świeżych probówek, aby uniknąć zanieczyszczenia poza celem. Protokół ten demonstruje wykorzystanie modeli ekspresji genów do ilościowego oznaczania komórek odpornościowych i tkanki nowotworowej. Opracowywane są nowe modele do pomiaru stanów komórek, takich jak wyczerpanie lub aktywacja.