Name: Predykcyjne modelowanie immunologiczne guzów litych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Poznaj metodę RNA do profilowania immunologicznego guzów litych w badaniach immuno-onkologicznych. Technika ta umożliwia wykrywanie biomarkerów i ocenę odpowiedzi immunologicznej na terapię.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować TriStar Technology Group za dostarczenie próbek biologicznych do reprezentatywnych wyników, a także całemu zespołowi molekularnemu, analitycznemu, produktowemu i komercyjnemu w Cofactor Genomics za ich techniczną wiedzę i wsparcie.

<ol><li>Brambilla, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+Effect+of+Tumor+Lymphocytic+Infiltration+in+Resectable+Non-Small-Cell+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Prognostic Effect of Tumor Lymphocytic Infiltration in Resectable Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 34 (11), 1223-1230 (2016).</li>
<li>Iacono, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-infiltrating+lymphocytes%2C+programmed+death+ligand+1+and+cyclooxygenase-2+expression+in+skin+melanoma+of+elderly+patients%3A+clinicopathological+correlations%5BTitle%5D)+AND+%22Melanoma+Research%22%5BJournal%5D)">Tumour-infiltrating lymphocytes, programmed death ligand 1 and cyclooxygenase-2 expression in skin melanoma of elderly patients: clinicopathological correlations.</a> Melanoma Research. 28 (6), 547-554 (2018).</li>
<li>Fridman, W. H., Zitvogel, L., Sautes-Fridman, C., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+contexture+in+cancer+prognosis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">The immune contexture in cancer prognosis and treatment.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (12), 717-734 (2017).</li>
<li>Sierant, M. C., Choi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Sequencing+in+Cancer%3A+Recent+Applications+to+Immunogenomics+and+Multi-omics+Tools%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+Inform%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Sequencing in Cancer: Recent Applications to Immunogenomics and Multi-omics Tools.</a> Genomics Inform. 16, (2018).</li>
<li>Klauschen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scoring+of+tumor-infiltrating+lymphocytes%3A+From+visual+estimation+to+machine+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Scoring of tumor-infiltrating lymphocytes: From visual estimation to machine learning.</a> Seminars in Cancer Biology. 52 (Pt 2), 151-157 (2018).</li>
<li>Danaher, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+markers+of+Tumor+Infiltrating+Leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+ImmunoTherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Gene expression markers of Tumor Infiltrating Leukocytes.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 5, 18(2017).</li>
<li>Aran, D., Hu, Z., Butte, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((xCell%3A+digitally+portraying+the+tissue+cellular+heterogeneity+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">xCell: digitally portraying the tissue cellular heterogeneity landscape.</a> Genome Biology. 18 (1), 220(2017).</li>
<li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+enumeration+of+cell+subsets+from+tissue+expression+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Robust enumeration of cell subsets from tissue expression profiles.</a> Nature Methods. 12 (5), 453-457 (2015).</li>
<li>Becht, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+the+population+abundance+of+tissue-infiltrating+immune+and+stromal+cell+populations+using+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Estimating the population abundance of tissue-infiltrating immune and stromal cell populations using gene expression.</a> Genome Biology. 17 (1), 218(2016).</li>
<li>Newman, A. M., Gentles, A. J., Liu, C. L., Diehn, M., Alizadeh, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+normalization+considerations+for+digital+tumor+dissection%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Data normalization considerations for digital tumor dissection.</a> Genome Biology. 18 (1), 128(2017).</li>
<li>Chen, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+profiling+deconvolution+approach+to+estimating+immune+cell+composition+from+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A gene profiling deconvolution approach to estimating immune cell composition from complex tissues.</a> BMC Bioinformatics. 19 (Suppl 4), 154(2018).</li>
<li>Yoshihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inferring+tumour+purity+and+stromal+and+immune+cell+admixture+from+expression+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Inferring tumour purity and stromal and immune cell admixture from expression data.</a> Nature Communications. 4, 2612(2013).</li>
<li>Foley, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-expression+profiling+of+single+cells+from+archival+tissue+with+laser-capture+microdissection+and+Smart-3SEQ%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Gene-expression profiling of single cells from archival tissue with laser-capture microdissection and Smart-3SEQ.</a> Genome Research. , (2019).</li>
<li>Civita, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Capture+Microdissection+and+RNA-Seq+Analysis%3A+High+Sensitivity+Approaches+to+Explain+Histopathological+Heterogeneity+in+Human+Glioblastoma+FFPE+Archived+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Laser Capture Microdissection and RNA-Seq Analysis: High Sensitivity Approaches to Explain Histopathological Heterogeneity in Human Glioblastoma FFPE Archived Tissues.</a> Front Oncol. 9, 482(2019).</li>
<li>PD-L1 in cancer: ESMO Biomarker Factsheet | OncologyPRO. , OncologyPRO. https://oncologypro.esmo.org/Education-Library/Factsheets-on-Biomarkers/PD-L1-in-Cancer (2019).</li>
<li>Haslam, A., Prasad, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+the+Percentage+of+US+Patients+With+Cancer+Who+Are+Eligible+for+and+Respond+to+Checkpoint+Inhibitor+Immunotherapy+Drugs%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Network+Open%22%5BJournal%5D)">Estimation of the Percentage of US Patients With Cancer Who Are Eligible for and Respond to Checkpoint Inhibitor Immunotherapy Drugs.</a> JAMA Network Open. 2 (5), e192535(2019).</li>
<li>Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardizing+immunophenotyping+for+the+Human+Immunology+Project%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project.</a> Nature Reviews Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).</li>
<li>Schillebeeckx, I., et al. Analytical Performance of an Immunoprofiling Assay Based on RNA Models. Association for Molecular Pathology 2019 Annual Meeting. Journal of Molecular Diagnostics. 21, Baltimore, MD. (2019).</li>
<li>Uryvaev, A., Passhak, M., Hershkovits, D., Sabo, E., Bar-Sela, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+tumor-infiltrating+lymphocytes+%28TILs%29+as+a+predictive+biomarker+of+response+to+anti-PD1+therapy+in+patients+with+metastatic+non-small+cell+lung+cancer+or+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Oncology%22%5BJournal%5D)">The role of tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) as a predictive biomarker of response to anti-PD1 therapy in patients with metastatic non-small cell lung cancer or metastatic melanoma.</a> Medical Oncology. 35 (3), 25(2018).</li>
<li>Wang, K., Shen, T., Siegal, G. P., Wei, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CD4%2FCD8+ratio+of+tumor-infiltrating+lymphocytes+at+the+tumor-host+interface+has+prognostic+value+in+triple-negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Pathology%22%5BJournal%5D)">The CD4/CD8 ratio of tumor-infiltrating lymphocytes at the tumor-host interface has prognostic value in triple-negative breast cancer.</a> Human Pathology. 69, 110-117 (2017).</li>
<li>Carney, W. P., Bhagat, M., LaFranzo, N. Multidimensional gene expression models for characterizing response and metastasis in solid tumor samples [abstract]. American Association for Cancer Research Annual Meeting. Cancer Research. 79 (13 Suppl), Atlanta, GA. (2019).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy są zatrudnieni przez Cofactor Genomics, Inc., firmę, która opracowała i produkuje zestaw odczynników ImmunoPrism oraz narzędzia informatyczne wykorzystane w tym artykule. Test ImmunoPrism jest przeznaczony wyłącznie do celów badawczych i nie jest przeznaczony do stosowania w procedurach diagnostycznych.

Protokół wymaga 20 ng nienaruszonego lub 40 ng wysoce zdegradowanego (FFPE) RNA. Próbka RNA powinna być wolna od DNA, soli (np. Mg2+ lub soli guanidyny), dwuwartościowych czynników chelatujących kationy (np. EDTA, EGTA, cytrynian) lub substancji organicznych (np. fenolu i etanolu). Nie zaleca się postępowania z próbkami RNA, które mają DV200 <20%. Zdecydowanie zaleca się stosowanie wbudowanego kontrolnego RNA, ponieważ te kontrole zapewniają środki do oceny wydajności w całym protokole, od przygotowania biblioteki po analizę.
Protokół przeznaczony jest do wykonania przy użyciu 0,2 ml probówek paskowych do PCR. Jeśli jest to preferowane, protokół można również wykonać przy użyciu dołków w 96-dołkowej płytce PCR. Po prostu użyj dołków 96-dołkowej płytki PCR zamiast wszystkich odniesień do probówek do PCR lub probówek paskowych. Używaj płytek PCR tylko z przezroczystymi dołkami, ponieważ bardzo ważne jest wizualne potwierdzenie całkowitego ponownego zawieszenia kulek podczas oczyszczania kulek i etapów mycia.
Przez cały czas trwania protokołu odczynniki należy przechowywać w stanie zamrożonym lub na lodzie, chyba że określono inaczej. Nie używaj odczynników, dopóki nie zostaną całkowicie rozmrożone. Pamiętaj, aby dokładnie wymieszać wszystkie odczynniki przed użyciem.
Enzymy należy przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu przygotowania do użycia i natychmiast po użyciu powrócić do temperatury -20 °C. Używaj tylko wody wolnej od nukleaz molekularnych; nie zaleca się używania wody uzdatnionej przez DEPC. Podczas pipetowania w celu wymieszania należy delikatnie zassać i dozować co najmniej 50% całkowitej objętości, aż roztwory dobrze się wymieszają. Odpipetować wszystkie mieszanki wzorcowe zawierające enzymy. Użycie wiru do mieszania enzymów może prowadzić do denaturacji i pogorszyć ich wydajność. Podczas oczyszczania kulek używaj świeżo przygotowanych 80% roztworów etanolu z etanolu molekularnego. Stosowanie roztworów etanolu, które nie są świeże, może skutkować niższymi plonami. Unikaj nadmiernego suszenia kulek, ponieważ może to zmniejszyć wydajność elucji (kulki wyglądają na popękane, jeśli są nadmiernie wysuszone).
Jak opisano w kroku 10, do każdej reakcji dodawane są unikalne startery indeksowe. Opierając się na sekwencjach tych wskaźników, dla multipleksowania niskopoziomowego, pewne kombinacje indeksów są optymalne. Sekwencje tych wskaźników są wymagane do demultipleksacji danych po sekwencjonowaniu. Sekwencje i zalecane kombinacje multipleksowania podano w tabeli uzupełniającej 3. Na tym samym etapie należy zauważyć, że liczba zalecanych cykli PCR różni się w zależności od jakości użytego RNA i może być wymagana pewna optymalizacja, aby zapobiec nadmiernej amplifikacji PCR. W przypadku ImmunoPrism Intact Control RNA i innych wysokiej jakości RNA rozpocznij optymalizację od 10 cykli PCR. W przypadku RNA kontrolnego ImmunoPrism FFPE i innych wysoce zdegradowanych/FFPE RNA rozpocznij optymalizację od 15 cykli PCR. Zaleca się stworzenie biblioteki testowej przy użyciu RNA reprezentatywnego dla analizowanego materiału w celu optymalizacji cykli PCR. Należy zastosować minimalną liczbę cykli PCR, które konsekwentnie zapewniają wystarczającą wydajność biblioteki wstępnego wychwytywania (>200 ng). Wtórny pik około 1000 pz na śladzie bioanalizatora wskazuje na nadmierną amplifikację (ryc. 4). Nadmierne wzmocnienie powinno być zminimalizowane, ale obecność małego piku wtórnego nie będzie kolidować z wynikami testu.
Aby zminimalizować utratę próbki i uniknąć wymiany probówek, Krok 13 można wykonać w probówkach PCR, probówkach paskowych lub 96-dołkowej płytce PCR zamiast mikroprobówek o pojemności 1,5 ml, jeśli pozwala na to koncentrator próżniowy. Wirnik można zdemontować w wielu koncentratorach. Dzięki temu rurki lub płyty paskowe mogą paskować się w próżni. Zatężanie próżni można następnie uruchomić przy użyciu ustawienia suszenia wodnego bez wirowania. Zapoznaj się z instrukcją obsługi koncentratora próżniowego, aby uzyskać instrukcje. Jeśli próbki są suszone w probówkach paskowych lub na płytce 96-dołkowej, etap hybrydyzacji można przeprowadzić w tym samym naczyniu.
Podczas kroku 17 pamiętaj, aby wirować co 10-12 minut, aby zwiększyć skuteczność wychwytywania koralików. Podczas mieszania ostrożnie trzymaj nakrętki tubek z ciepłymi paskami, aby zapobiec otwieraniu się probówek.
Mycie opisane w kroku 18 ma kluczowe znaczenie dla uniknięcia wysokiego zanieczyszczenia niespecyficznego i należy ich ściśle przestrzegać. Należy pamiętać o całkowitym ponownym zawieszeniu kulek przy każdym myciu, całkowicie usunąć do mycia, a podczas mycia Wash Buffer 2 przenieść próbki do świeżej probówki paskowej (krok 18.6.5). Upewnij się, że kulki streptawidyny są całkowicie ponownie zawieszone i pozostają w zawiesinie przez cały czas inkubacji. Rozpryskiwanie się nasadek tubusu nie wpłynie negatywnie na chwytanie. Podczas mycia w temperaturze pokojowej można użyć mieszalnika wirowego z mikropłytkami do wirowania próbek przez cały dwuminutowy okres inkubacji w celu łatwiejszego ponownego zawieszenia. Nie pozwól, aby kulki streptawidyny wyschły. W razie potrzeby przedłuż inkubacje w, aby uniknąć wysuszenia kulek. Jeśli używasz więcej niż jednej tubki paskowej, pracuj z jedną tubką paskową na raz przy każdym praniu, podczas gdy pozostałe tubki paskowe znajdują się w termocyklerze. Może to pomóc uniknąć nadmiernego wysuszenia kulek lub pośpiechu, co skutkuje słabym ponownym zawieszeniem lub innymi nieoptymalnymi technikami. Dla początkujących użytkowników nie zaleca się przetwarzania więcej niż 8 reakcji biblioteki jednocześnie.
Obecne techniki profilowania immunologicznego dostarczają kontinuum informacji - od tysięcy punktów danych, które wymagają znaczącej interpretacji (sekwencjonowanie RNA) do pojedynczego, dyskretnego punktu danych (IHC single-plex). Opisany tutaj protokół reprezentuje podejście, które znajduje się gdzieś pośrodku, z ukierunkowanym zakresem umożliwiającym wysoką czułość, ale przechwytującym tylko podzbiór klinicznie istotnych danych transkryptomicznych. Ze względu na charakter masowej ekstrakcji RNA, protokół ten nie dostarcza informacji na temat relacji przestrzennych między komórkami odpornościowymi a mikrośrodowiskiem guza, jednak wyniki mogą być uzupełnione technologiami obrazowania w celu dodania tych informacji. Istnieje niezliczona ilość zastosowań danych generowanych przez ten protokół, ponieważ jest wiele do nauczenia się o biologii raka jako choroby i terapiach opracowywanych w celu jego leczenia. Jak pokazano w reprezentatywnych wynikach, indywidualny raport immunologiczny jest przydatny do zrozumienia, w jaki sposób profil immunologiczny pacjenta może się zmienić w odpowiedzi na zdarzenia, takie jak progresja choroby lub leczenie. Podczas gdy przedstawione tutaj wyniki dostarczają kilku przykładowych przypadków użycia, inne zastosowania, takie jak badanie mechanizmu działania terapii i identyfikacja przypuszczalnych biomarkerów wyników klinicznych, takich jak wolne od progresji i całkowite przeżycie, są również praktyczne. Podczas korzystania z tego protokołu do zastosowań związanych z odkrywaniem biomarkerów ważne jest, aby dobrze zaprojektować badanie, aby zapewnić analizę jednorodnych populacji, uwzględnienie wystarczającej liczby próbek dla mocy statystycznej i uwzględnienie źródeł błędu systematycznego. Ze względu na skoncentrowany, uproszczony charakter testu, możliwe jest wyobrażenie sobie drogi do walidacji klinicznej i dalszego zastosowania tych biomarkerów po ich odkryciu.

Ilościowe oznaczanie limfocytów naciekających guz (TILs) oraz innych cząsteczek związanych z układem odpornościowym w utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie (FFPE) próbkach tkanek guzów litych człowieka wykazało znaczną wartość w badaniach klinicznych1,2,3. Powszechne techniki, takie jak cytometria przepływowa i sekwencjonowanie kwasu rybonukleinowego (RNA) pojedynczych komórek, są użyteczne w przypadku świeżych tkanek i krwi4, lecz nie nadają się do analizy materiałów FFPE ze względu na brak możliwości przygotowania żywych zawiesin komórkowych. Obecne metody stosowane do ilościowego oznaczania tych komórek w tkankach FFPE wiążą się z istotnymi trudnościami. Immunohistochemia (IHC) i inne podobne procedury obrazowania wymagają specyficznych przeciwciał do wykrywania białek powierzchniowych komórek, co może być trudne do standaryzacji między laboratoriami w celu zapewnienia powtarzalności wyników ilościowych5. Platformy takie jak system nCounter opierają się na ekspresji pojedynczych genów w celu zdefiniowania kluczowych komórek odpornościowych6, co ogranicza czułość i swoistość detekcji. Dostępne są bardziej ogólne metody sekwencjonowania RNA w połączeniu z autonomicznymi narzędziami programowymi, jednak wymagają one znacznej optymalizacji i walidacji przed zastosowaniem7,8,9,10,11,12. Niedawne postępy w łączeniu laserowej mikrodysekcji (LCM) z sekwencjonowaniem RNA dla tkanek FFPE są obiecujące, jednak do badań translacyjnych mających na celu identyfikację wiarygodnych biomarkerów wymagane jest rozwiązanie o większej przepustowości typu „turnkey”13,14. Metody generowania wielowymiarowych biomarkerów, takie jak modelowanie odporności predykcyjnej (Predictive Immune Modeling), które definiują kohorty pacjentów, w tym osoby odpowiadające na terapię, podtypy nowotworów lub wyniki przeżywalności z wysoką dokładnością predykcyjną i istotnością statystyczną, stają się coraz ważniejsze w erze medycyny precyzyjnej i immunoterapii15,16.
Aby zaspokoić tę potrzebę, opracowano test profilowania immunologicznego umożliwiający czułe i specyficzne ilościowe oznaczenie komórek odpornościowych w tkance guza litego utrwalonej w FFPE, przy użyciu zestandaryzowanych odczynników do sekwencjonowania RNA i informatyki w chmurze. Oprócz możliwości analizy zdegradowanego RNA z tkanki FFPE, protokół pozwala na analizę RNA pochodzącego z ograniczonych próbek tkankowych, takich jak biopsje gruboigłowe, aspiraty igłowe oraz tkanki mikro- lub makro-wycięte. Dane RNA z każdej próbki są porównywane z bazą danych modeli ekspresji genów komórek odpornościowych, nazwanych immune Health Expression Models, w celu ilościowego oznaczenia komórek odpornościowych jako procentu całkowitej liczby komórek obecnych w próbce. W skrócie, modele te zostały zbudowane przy użyciu metod uczenia maszynowego w celu identyfikacji unikalnych wielogenowych wzorców ekspresji z danych całego transkryptomu, generowanych z oczyszczonych populacji komórek odpornościowych (izolowanych przy użyciu kanonicznych markerów powierzchniowych komórek)17,18. Wielowymiarowe modele Health Expression Models leżące u podstaw tej technologii pozwalają testowi na ilościowe oznaczenie każdej komórki odpornościowej jako procentu całkowitej liczby komórek obecnych w heterogenicznej mieszaninie. Umożliwia to badaczowi generowanie porównań komórek odpornościowych między próbkami oraz w obrębie jednej próbki, co wykazuje wartość kliniczną19,20. Inne zastosowania obejmują ilościowe oznaczenie odpowiedzi immunologicznej przed i po leczeniu, jak opisano w reprezentatywnych wynikach. Test dostarcza informacji o wielu cechach kontekstu immunologicznego guza i mikrośrodowiska guza, w tym o wartościach procentowych ośmiu typów komórek odpornościowych (pochodzących z modeli ekspresji genów): limfocytów T CD4+, limfocytów T CD8+, komórek Natural Killer CD56+, limfocytów B CD19+, monocytów CD14+, Tregs, makrofagów M1 oraz makrofagów M2. Ponadto test określa poziom ekspresji (w transkryptach na milion, czyli TPM) dziesięciu genów ucieczki immunologicznej: PD-1, PD-L1, CTLA4, OX40, TIM-3, BTLA, ICOS, CD47, IDO1 oraz ARG1.
Zestaw odczynników służy do przygotowania wysokiej jakości bibliotek gotowych do sekwencjonowania na platformie Illumina przy użyciu metody przygotowania bibliotek opartej na hybrydyzacyjnym wychwytywaniu, jak pokazano na Rysunku 1. Jeśli badacz nie posiada w swoim laboratorium platformy sekwencjonowania Illumina, może przekazać próbki do sekwencjonowania do laboratorium centralnego. Po wygenerowaniu dane z sekwencjonowania są przesyłane do portalu Prism Portal w celu zautomatyzowanej analizy, a użytkownik otrzymuje kompleksowy, ilościowy profil dla każdej pojedynczej próbki w formie Raportu Immunologicznego (Immune Report) (Rysunek 2A). Użytkownicy mogą również definiować grupowanie próbek w Prism Portal w celu wygenerowania Raportu Biomarkerów (Biomarker Report) (Rysunek 2B), który wyróżnia statystycznie istotne biomarkery różnicujące dwie kohorty pacjentów. Należy pamiętać, że dane generowane za pomocą zestawu odczynników są przeznaczone wyłącznie do celów badawczych i nie mogą być wykorzystywane do celów diagnostycznych.
<img alt="Schemat procesu sekwencjonowania RNA; synteza cDNA, PCR, hybrydyzacja; diagram przepływu procesu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig1a.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przegląd schematu postępowania. W tym protokole RNA jest najpierw konwertowane do cDNA. Następnie ligowane są adaptory do sekwencjonowania, a cDNA z ligowanymi adaptorami jest amplifikowane i znakowane kodami kreskowymi (barcoding) za pomocą PCR w celu utworzenia biblioteki przed wychwytywaniem. Następnie biotynilowane sondy są hybrydyzowane ze specyficznymi celami cDNA, które są następnie wychwytywane za pomocą kulek z streptawidyną. Niewiązane, nietarczowe cDNA są usuwane poprzez przemywanie. Końcowe wzbogacenie metodą PCR daje bibliotekę po wychwytywaniu, gotową do sekwencjonowania. *Całkowite RNA musi pochodzić z próbek ludzkich; może być RNA nienaruszone lub zdegradowane (FFPE). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Profilowanie ImmunoPrism, wykres typów komórek odpornościowych, wykres dokładności predykcyjnej, analiza biomarkerów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Reprezentatywne raporty immunologiczne. Przepływ pracy generuje dwa raporty: indywidualny raport immunologiczny (A) dla każdej przetworzonej próbki oraz raport biomarkerów (B) dla zdefiniowanych kohort pacjentów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Protokół wymaga około 16 h czasu przygotowania (od całkowitego RNA do bibliotek gotowych do sekwencjonowania); istnieją jednak liczne opcjonalne punkty przerwania pracy, o czym wspomniano w protokole. Metoda ta wykorzystuje bogatą i dynamiczną naturę transkryptomiki, aby przejść od tradycyjnych biomarkerów opartych na pojedynczym analitycie do wielowymiarowych modeli ekspresji genów, co umożliwia kompleksową charakterystykę biologiczną próbek tkanek przy użyciu standaryzowanych odczynników i łatwych w obsłudze narzędzi programistycznych. Pozwala to badaczom na wykorzystanie nowoczesnej technologii we własnym laboratorium dzięki zastosowaniu uczenia maszynowego oraz bazy danych Modeli Ekspresji Zdrowia (Health Expression Models) w celu uzyskania dokładniejszych, ilościowych profili odpornościowych cennych próbek klinicznych oraz odkrycia wielowymiarowych biomarkerów RNA przy pełnej analizie statystycznej.

<table><tbody><tr><td>0,2 ml PCR 8 probówek</td><td>USA Scientific</td><td>1402-2700</td><td>USA Scientific 0,2 ml PCR 8-tubowy pasek</td></tr><tr><td>200 Proof Ethanol</td><td>MilliporeSigma</td><td>EX0276-1</td><td>Przygotuj 80% przez zmieszanie z wodą wolną od nukleaz w dniu eksperymentu</td></tr><tr><td>96-dołkowe termocyklery</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki do odwracalnego immobilizacji w fazie stałej (SPRI)</td><td>Beckman-Coulter</td><td>A63882</td><td>Agencourt AMPure XP &ndash; Koraliki oczyszczające PCR</td></tr><tr><td>Cyfrowe chipy i zestaw do elektroforezy</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td>Chipy i zestaw DNA Agilent o wysokiej czułości</td></tr><tr><td>Cyfrowy system elektroforezy</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td>Bioanalizator elektroforezy Agilent 2100</td></tr><tr><td>Koraliki streptawidyny</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>65306</td><td>Dynabeads M-270 Streptawidin</td></tr><tr><td>ImmunoPrism Kit & ndash; 24 reakcje</td><td>Cofactor Genomics</td><td>CFGK-302</td><td>Cofactor ImmunoPrism Zestaw do profilowania immunologicznego &ndash; 24 reakcje</td></tr><tr><td>Ludzki Cot-1 DNA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15279011</td><td>Marka Invitrogen</td></tr><tr><td>Magnetyczny stojak separacyjny</td><td>Alpaqua/Invitrogen</td><td>A001322/12331D</td><td>96-dołkowy magnetyczny stojak na pierścień</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>22620701</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek</td><td>USA Scientific</td><td>1415-2600</td><td>USA Scientific 1,5 ml probówka do mikrowirówek o niskiej przyczepności</td></tr><tr><td>NastępnySeq550</td><td>Illumina</td><td>SY-415-1002</td><td>Do tego protokołu można użyć dowolnego sekwenatora Illumina</td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji pryzmatu</td><td>Cofactor Genomics</td><td>CFGK-401</td><td>Zestaw do ekstrakcji pryzmatu kofaktora FFPE i ndash; 24 próbki</td></tr><tr><td>Oczyszczone RNA</td> <td>-</td><td></td> <td>oczyszczone z próbek tkanek ludzkich</td></tr><tr><td>Fluorometr</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33226</td><td>System Qubit 4</td></tr><tr><td>Probówki do testów fluorometrycznych</td><td>Axygen</td><td>PCR-05-C</td><td>0,5 ml cienkościenne probówki do PCR z płaskimi nasadkami</td></tr><tr><td>Zestaw odczynników fluorometrycznych o wysokiej czułości</td><td>Life Technologies</td><td>Q32854</td><td>Zestaw</td></tr> <tr><td>do oznaczania kubitów dsDNA HSKoncentrator próżniowy</td><td>Eppendorf</td><td>22820001</td><td>VacufugePlus</td></tr><tr><td>Mieszarka wirowa</td><td>VWR</td><td>10153-838</td><td></td></tr><tr><td>Łaźnia wodna lub blok grzewczy</td><td>VWR/USA Scientific</td><td>NA/2510-1102</td><td>Łaźnia wodna VWR/USA Naukowy blok grzewczy</td></tr></tbody></table>

predykcyjne modelowanie immunologiczne guzów litych

Predictive Immune Modeling of Solid Tumors

Immunoterapie są obiecujące w leczeniu pacjentów onkologicznych, ale złożona heterogeniczność mikrośrodowiska guza sprawia, że przewidywanie odpowiedzi na leczenie jest trudne. Wykazano, że zdolność do rozpoznawania względnych populacji komórek odpornościowych obecnych w tkance nowotworowej i wokół niej jest klinicznie istotna dla zrozumienia odpowiedzi, ale jest ograniczona przez tradycyjne techniki, takie jak cytometria przepływowa i immunohistochemia (IHC), ze względu na dużą wymaganą ilość tkanki, brak dokładnych markerów typu komórki oraz wiele przeszkód technicznych i logistycznych. Jeden test (np. Test profilowania immunologicznego ImmunoPrism) pokonuje te wyzwania, uwzględniając zarówno niewielkie ilości RNA, jak i wysoce zdegradowane RNA, wspólne cechy RNA wyekstrahowanego z klinicznie zarchiwizowanej tkanki guza stałego. Dostęp do testu jest możliwy za pośrednictwem zestawu odczynników i informatyki opartej na chmurze, która zapewnia kompleksowe, ilościowe, wysokoprzepustowe rozwiązanie do profilowania immunologicznego dla platform sekwencjonowania Illumina. Naukowcy zaczynają od zaledwie dwóch odcinków tkanki zatopionej w parafinie (FFPE) utrwalonej w formalinie lub 20-40 ng całkowitego RNA (w zależności od jakości próbki), a protokół generuje raport profilu immunologicznego określający ilościowo osiem typów komórek odpornościowych i dziesięć genów ucieczki immunologicznej, uzyskując pełny obraz mikrośrodowiska guza. Do wykorzystania uzyskanych danych nie jest wymagana dodatkowa analiza bioinformatyczna. Przy odpowiednich kohortach prób protokół może być również wykorzystany do identyfikacji statystycznie istotnych biomarkerów w populacji pacjentów będących przedmiotem zainteresowania.

W całym protokole znajduje się szereg punktów kontrolnych, które umożliwiają użytkownikowi ocenę jakości i ilości wytworzonych materiałów. Po wykonaniu Kroku 12 opisanego w protokole generowany jest elektroferogram przedstawiony na Rysunku 3, który jest reprezentatywny dla typowej biblioteki przed etapem wychwytu dla nienaruszonej próbki RNA (RIN = 7,8).
<img alt="Wykres analizy elektroforezy, rozdział DNA, jednostki fluorescencji w funkcji par zasad, dane o pikach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Typowy ślad z Bioanalyzera dla biblioteki przed wychwytem (Pre-capture Library) dla nieuszkodzonej próbki RNA. Biblioteki przed wychwytem objawiają się jako szeroki pik o rozmiarze około 250-400 par zasad (bp). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Należy zachować ostrożność, aby uniknąć nadmiernej amplifikacji, na co wskazuje drugi pik w okolicach 1 000 bp widoczny na Ryc. 4, która przedstawia reprezentatywny elektroferogram biblioteki przed wzbogaceniem (pre-capture library) wygenerowanej z próbki RNA FFPE (DV200 = 46). Jeśli pik ten jest mały w stosunku do piku głównego (około 250-400 par zasad (bp), jak pokazano), nie będzie on zakłócał kolejnych etapów lub analizy. Jeśli drugi pik jest duży w stosunku do piku 250-400 bp, bibliotekę przed wzbogaceniem można przygotować ponownie, stosując mniejszą liczbę cykli PCR w celu ograniczenia nadmiernej amplifikacji.
<img alt="Elektroferogram przedstawiający analizę fragmentów DNA, intensywność piku w funkcji wielkości fragmentu, skala w bp." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Typowy ślad Bioanalyzer biblioteki przed wychwytem dla próbki RNA FFPE. Drugi pik w okolicy 1 000 bp wskazuje na nadmierną amplifikację. Jeśli pik ten jest mały w stosunku do głównego piku w zakresie 250-400 bp (jak pokazano), nie będzie on zakłócać kolejnych etapów lub analizy. Jeśli drugi pik jest duży w stosunku do piku 250-400 bp, bibliotekę przed wychwytem można przygotować ponownie, stosując mniejszą liczbę cykli PCR w celu ograniczenia nadmiernej amplifikacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Zgodnie z opisem w kroku 12.1.3, należy ocenić obecność dimerów adapterów, aby ustalić, czy konieczne jest dodatkowe oczyszczanie. Elektroforeogramy przedstawione na Rysunku 5 są reprezentatywne dla nieakceptowalnych (Rysunek 5A, DV200 = 33) oraz akceptowalnych (Rysunek 5B, DV200 = 46) poziomów dimerów adapterów, które pojawiają się jako ostry pik w okolicach 128 bp.
<img alt="Porównanie wykresów spektroskopowych przedstawiające piki absorpcji; analiza składu chemicznego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Ślady Bioanalizera biblioteki przed wychwytem. Dimer adaptora pojawia się jako ostry pik w okolicach 128 bp. (A) Na tym elektroferogramie widoczne są nadmierne ilości dimerów adaptorów. (B) Ten ślad przedstawia akceptowalne poziomy dimerów adaptorów. Oba ślady wykazują oznaki lekkiej nadamplifikacji, co jednak nie powinno zakłócać przebiegu analizy ImmunoPrism. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig5alarge.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Po zakończeniu protokołu, przed sekwencjonowaniem, końcowe biblioteki są ponownie oceniane za pomocą elektroforezy cyfrowej. Biblioteki przygotowane z RNA z materiałów FFPE mają tendencję do mniejszego średniego rozkładu wielkości niż biblioteki przygotowane z nienaruszonego RNA. W przypadku próbek nienaruszonego RNA uzyskany ślad powinien być zbliżony do Rysunku 6 (RIN = 9,5). W przypadku RNA zdegradowanego lub z materiałów FFPE uzyskany ślad powinien być zbliżony do Rysunku 7 (DV200 = 36).
<img alt="Elektroferogram; wynik elektroforezy kapilarnej; analiza fragmentów DNA; wykres intensywności piku." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Typowy ślad Bioanalyzer końcowej biblioteki dla nieuszkodzonej próbki RNA. Końcowe biblioteki pojawiają się jako szeroki pik o rozmiarze około 250-400 par zasad (bp). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wyniki elektroforezy; wykres analizy piku; rozdział fragmentów DNA; FU vs bp." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7: Typowy ślad Bioanalyzer końcowej biblioteki dla próbki RNA FFPE. Biblioteki przygotowane z RNA FFPE mają tendencję do mniejszej średniej rozkładu wielkości niż biblioteki przygotowane z nienaruszonego RNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig7large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Jak opisano, wyniki uzyskane za pomocą tego protokołu mogą być zastosowane w dwa kluczowe sposoby, co przedstawiono na Rysunku 8.
<img alt="Indywidualne i wielowymiarowe profilowanie immunologiczne; sekwencjonowanie RNA; schemat; odkrywanie biomarkerów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8: Dwa zastosowania protokołu. Wyniki uzyskane za pomocą tego testu profilowania immunologicznego są wykorzystywane w dwóch kluczowych zastosowaniach translacyjnych. (A) Pierwszy przypadek zastosowania rozpoczyna się od ludzkiej tkanki guza litego (w tym archiwów FFPE) i generuje indywidualny profil immunologiczny dla próbki. (B) Po uzyskaniu danych dla kohorty ludzkich próbek są one łączone za pomocą Prism Portal w celu wygenerowania wielowymiarowego biomarkera i odpowiadającego mu Raportu o Biomarkerze. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig8large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Aby zademonstrować każdy z tych przypadków użycia, dołączono reprezentatywne dane z niewielkiego badania translacyjnego21. Próbki wykorzystane w tym badaniu stanowią zestaw preparatów od 7 pacjentów zdiagnozowanych i leczonych z powodu niedrobnokomórkowego raka płuca (NSCLC). Próbki to dopasowane do pacjentów tkanki guza litego pobrane z biopsji przed i po leczeniu. W pierwszej kolejności przeanalizowano poszczególne próbki w celu stworzenia profilu immunologicznego, takiego jak przykładowy raport przedstawiony na Rysunku 9.
<img alt="Wykres i wynik raportu ImmunoPrism; analiza profilu immunologicznego; limfocyty T CD4+, limfocyty T CD8+, limfocyty B." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig9.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 9"> 
Rysunek 9: Przykład indywidualnego raportu immunologicznego dla próbki NSCLC. Potok przetwarzania Prism Portal generuje raport graficzny dla każdej przetworzonej próbki; tutaj przedstawiono reprezentatywny raport wygenerowany dla próbki guza litego NSCLC. (A) Przednia strona raportu graficznie przedstawia podział komórek immunologicznych obecnych w próbce RNA wyekstrahowanej z tkanki FFPE. (B) Rewers raportu zawiera tabelę komórek immunologicznych (w wartościach procentowych bezwzględnych) oraz ekspresję genów ucieczki (w liczbie transkryptyw na milion, TPM), a także oświadczenie dotyczące wydajności analizy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig9alarge.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Profile immunologiczne sprzed i po leczeniu mogą posłużyć do zrozumienia, w jaki sposób terapia (w niniejszym badaniu chemioterapia lub radioterapia) zmodyfikowała mikrośrodowisko guza. Przykład przedstawiono na Rysunku 10, gdzie pokazano zmiany procentowe dla każdego rodzaju komórek odpornościowych oraz całkowitą zawartość komórek immunologicznych przed i po chemioterapii u jednego pacjenta.
<img alt="Zmiany procentowe komórek odpornościowych przed i po eksperymencie; wykres liniowy; limfocyty T CD4+, CD8+; badanie immunologiczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig10.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 10"> 
Rysunek 10: Przykład wyników przed i po leczeniu. Przedstawiono dane dotyczące poszczególnych komórek odpornościowych oraz całkowitej zawartości komórek odpornościowych uzyskane z próbek pobranych przed i po leczeniu od jednego pacjenta z NSCLC. W tym przykładzie pacjent otrzymał schemat chemioterapii jako formę leczenia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig10large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Pacjentów można pogrupować według kryteriów takich jak wyniki kliniczne lub fenotypy w celu przeprowadzenia porównania. Na przykład na Rysunku 11 próbki w badaniu NSCLC zostały porównane pod kątem czasu do progresji choroby po leczeniu. Podgrupa pacjentów wykazała nawrót choroby w czasie &gt;18 miesięcy, a inna podgrupa progresję szybciej, w czasie ≤18 miesięcy. Wartości mediany delta (różnica między wartościami przed i po leczeniu) są porównywane dla każdej próbki w celu zidentyfikowania potencjalnych biomarkerów progresji choroby.
<img alt="Wykres słupkowy procentowej zawartości komórek odpornościowych z porównaniem grup wiekowych; limfocyty T CD4, limfocyty T CD8, limfocyty B, monocyty." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig11.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 11"> 
Rycina 11: Przykład porównania wyników klinicznych. Obliczono ilościowe zmiany procentowej zawartości komórek odpornościowych w dopasowanych próbkach NSCLC pobranych przed i po leczeniu, które przedstawiono jako wartość „delta”. Elementy wyróżnione na żółto wskazują wyraźne zmiany sygnału w zależności od statusu przeżycia. Niebieskie słupki reprezentują mediany wartości delta dla czasu do progresji choroby &gt;18 miesięcy, a pomarańczowe słupki reprezentują mediany wartości delta dla czasu do progresji choroby ≤18 miesięcy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig11large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Na koniec, podobne grupowania próbek można wykorzystać do analizy konkretnie próbek pobranych przed leczeniem w celu zidentyfikowania biomarkerów prognostycznych, wykorzystując portal Prism Portal do wygenerowania raportu z biomarkerami (Biomarker Report). Jak pokazano na Rysunku 12, grupowanie próbek definiuje ten sam fenotyp kliniczny (progresja choroby), który opisano powyżej. W tym przykładzie dwa geny ucieczki immunologicznej zostały zidentyfikowane jako statystycznie istotne czynniki różnicujące grupy próbek (CD47 i OX40, pokazane na dolnym panelu Rysunku 12A). W tym przypadku, ponieważ poszczególne biomarkery genowe są wiarygodne i wykazują wyraźną istotność statystyczną, wielowymiarowy biomarker nie wnosi znaczącej wartości prognostycznej (ImmunoPrism, oznaczone na górnym prawym wykresie słupkowym Rysunku 12B). Pełna tabela danych, zawierająca wyniki dla wszystkich 18 analitów w teście, wraz z analizą statystyczną i krótkim podsumowaniem metod, znajduje się na odwrocie raportu.
<img alt="Raport z badania biomarkerów ImmunoPrism podkreślający dokładność prognostyczną wraz z wykresem danych dotyczących wydajności analitycznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig12.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 12"> 
Rysunek 12: Przykład raportu z badania biomarkerów dla próbek NSCLC. Proces odkrywania biomarkerów dostarcza raport wizualny dla poszczególnych biomarkerów oraz wielowymiarowy biomarker opracowany za pomocą uczenia maszynowego, wraz ze szczegółowymi statystykami. (A) W niniejszym badaniu proces ten zidentyfikował dwa pojedyncze biomarkery (CD47 i OX40) jako istotne statystycznie dla określenia progresji choroby przy progu 18 miesięcy. (B) Szczegóły dotyczące metody oraz pełne wyniki znajdują się na odwrocie raportu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig12alarge.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Tabela uzupełniająca 1: Materiały z zestawu odczynników. Zamieszczono listę materiałów dostarczonych w zestawie ImmunoPrism wraz z numerami katalogowymi wskazanymi w protokole producenta. Wszystkie pozostałe wymagane urządzenia i materiały znajdują się w Tabeli materiałów. Karty charakterystyki (SDS) są dostępne pod adresem <a href="https://cofactorgenomics.com/product/immunoprism-kit/" target="_blank">https://cofactorgenomics.com/product/immunoprism-kit/</a>. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/supplemental_table1.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten plik (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).</a>
Tabela uzupełniająca 2: Programy termocyklera. Rekomendowane programy cyklera przywoływane w całym protokole zostały podsumowane w celu ułatwienia programowania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/supplemental_table2.xlsx" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić ten plik (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).</a>
Tabela uzupełniająca 3: Przewodnik po indeksach sekwencjonowania. Wymienione zostały primery indeksowe zawarte w zestawie odczynników; do każdej reakcji dodaje się unikalny primer w celu demultipleksowania po sekwencjonowaniu. Podano również zalecane kombinacje dla multipleksowania na niskim poziomie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/supplemental_table3.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten plik (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).</a>

Użycie podejścia opartego na RNA do określenia ilościowych profili immunologicznych tkanek guza litego i wykorzystania kohort klinicznych do odkrycia biomarkerów immunologicznych onkologicznych jest opisane za pomocą protokołów molekularnych i informatycznych.

Predykcyjne modelowanie immunologiczne guzów litych

Immunotherapies show promise in the treatment of oncology patients, but complex heterogeneity of the tumor microenvironment makes predicting treatment ...

Kompleksowe scharakteryzowanie mikrośrodowiska guza jest niezbędne w badaniach immunoonkologicznych. Ten test jest pierwszym, w którym wykorzystano modele ekspresji zdrowotnej oparte na RNA do pomiaru komórek odpornościowych w tkance guza litego. Test ten umożliwia naukowcom uzyskanie bardzo czułych i specyficznych pomiarów tekstury immunologicznej w tkankach guza litego FFB oraz połączenie tych wyników w wielowymiarowy biomarker.Wszystkie metody leczenia raka, nie tylko immunoterapie, wywołują odpowiedź immunologiczną w miejscu guza litego. Pomiar tej odpowiedzi immunologicznej jest ważny dla zrozumienia progresji choroby i odpowiedzi na terapię. Protokół ten łączy tradycyjne techniki przygotowania biblioteki RNA z ukierunkowanym wychwytywaniem.Chociaż jest to czasochłonne, przestrzeganie etapów mycia i monitorowanie punktów kontrolnych kontroli jakości zgodnie z sugestiami jest bardzo ważne dla sukcesu. W przypadku wysoce zdegradowanego RNA z próbek zatopionych w parafinie utrwalonym w formalinie, reakcję syntezy pierwszej nici należy przeprowadzić na lodzie zgodnie z tabelą. Dokładnie wymieszać reakcje, pipetując kilkakrotnie w górę i w dół, a następnie na krótko odwirować próbki w mikrowirówce.Po zakończeniu wirowania natychmiast umieścić próbki w nagrzanym termocyklerze zgodnie z programem numer trzy z tabeli. Aby uzyskać wysokiej jakości nienaruszone RNA, złóż reakcję syntezy pierwszej nici na lodzie w probówce PCR bez nukleazy, jak opisano w tabelach. Aby rozpocząć tę procedurę, wymieszaj 200 nanogramów interesującej nas biblioteki kodów kreskowych z dwoma mikrogramami DNA COT-1 i dwoma mikrolitrami oligonukleukleotydów blokujących w probówce PCR bez nukleazy.Następnie użyj koncentratora próżniowego ustawionego na 30 do 45 stopni Celsjusza, aby wysuszyć zawartość tuby. Po hybrydyzacji wyjmij próbki z termocyklera i ustaw termocykler na inkubację w temperaturze 65 stopni Celsjusza z podgrzewaną pokrywką ustawioną na 70 stopni Celsjusza. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 17 mikrolitrów w pełni homogenizowanych kulek do próbek i dokładnie pipetuj w górę i w dół 10 razy.Aby związać DNA z kulkami, umieść probówki w termocyklerze zgodnie z programem 10, na krótko usuwając odizolowane rurki co 10 do 12 minut na trzy sekundy delikatnego wirowania, aby kulki pozostały ponownie zawieszone. Bezpośrednio po inkubacji wiązania wyjąć jeden pasek probówek z termocyklera i dodać 100 mikrolitrów podgrzanego buforu do przemywania do probówek. Dokładnie pipetować w górę i w dół 10 razy i umieścić probówki na stojaku magnetycznym, aby kulki całkowicie oddzieliły się od roztworu płuczącego przed zasysaniem niezwiązanego DNA zawierającego supernatant.Wyjmij probówki ze stojaka i dodaj 150 mikrolitrów wstępnie podgrzanego, rygorystycznego buforu do mycia z dokładnym wymieszaniem, aby całkowicie zawiesić kulki, uważając, aby uniknąć pęcherzyków. Umieść probówki z powrotem w termocyklerze w temperaturze 65 stopni Celsjusza na pięć minut przed umieszczeniem probówek z powrotem na stojaku magnetycznym, aby umożliwić całkowite oddzielenie się kulek od supernatantów. Odrzucić niezwiązane DNA zawierające supernatanty, przemyć kulki jeszcze raz podgrzanym rygorystycznym buforem do mycia, jak właśnie pokazano, w sumie dla dwóch rygorystycznych płukań.Po ostatnim płukaniu usunąć supernatant i dodać 150 mikrolitrów pierwszego buforu do przemywania w temperaturze pokojowej do probówek. Odpipetować płukanie 10 do 20 razy, aby całkowicie zawiesić kulki i inkubować próbki z zamkniętą pokrywką przez dwie minuty, na przemian wirując przez 30 sekund i odpoczywając przez 30 sekund. Pod koniec inkubacji należy krótko odwirować i umieścić probówki na stojaku magnetycznym i usunąć supernatant, gdy kulki całkowicie przylgną do magnesu.Odwirować krótko probówki z zamkniętymi nakrętkami i umieścić próbki z powrotem na stojaku magnetycznym. Użyj pipety o pojemności 10 mikrolitrów, aby usunąć resztki buforu do płukania i dodaj 150 mikrolitrów buforu do płukania w temperaturze pokojowej dwa. Odpipetować płukanie od 10 do 20 razy, aby całkowicie zawiesić kulki i inkubować próbki z zamkniętymi pokrywkami przez dwie minuty, na przemian wirując przez 30 sekund i odpoczywając przez 30 sekund.Po krótkim odwirowaniu przenieś całą objętość kulek z każdej probówki do czystych probówek PCR bez nukleaz i umieść probówki na stojaku magnetycznym. Po odrzuceniu niezwiązanego DNA zawierającego supernatanty, ponownie krótko odwirować próbki i użyć pipety o pojemności 10 mikrolitrów, aby usunąć resztki buforu do płukania z kulek, gdy znajdują się one w stojaku magnetycznym. Dodaj 150 mikrolitrów buforu do płukania trzy do probówek i pipetuj w górę iw dół 10 do 20 razy, aby całkowicie zawiesić kulki.Inkubować probówkę przez dwie minuty, na przemian przez 30 sekund delikatnego wirowania i 30 sekund odpoczynku, a następnie krótko odwirować. Umieść probówki na stojaku magnetycznym, aby zassać supernatanty i ponownie krótko odwirować próbki kulek. Użyj pipety o pojemności 10 mikrolitrów, aby usunąć resztki buforu płuczącego z kulek, gdy znajdują się one w stojaku magnetycznym, przed wyjęciem probówek ze stojaka i ponownym zawieszeniem kulek w 20 mikrolitrach wody wolnej od nukleaz na probówkę.Następnie odpipetuj kulki 10 razy, aby upewnić się, że wszystkie koraliki przyklejone do boku probówek zostały ponownie zawieszone. Należy ocenić obecność dimerów adaptera, aby określić, czy konieczne jest dodatkowe czyszczenie. Na przykład ten elektroferogram pokazuje akceptowalny poziom dimeru adaptera, który pojawia się jako ostry pik wokół 128 par zasad, podczas gdy ten elektroferogram pokazuje niedopuszczalny poziom dimera adaptera.Profile immunologiczne przed i po leczeniu mogą być wykorzystane do zrozumienia wpływu określonej terapii na mikrośrodowisko guza, tak jak w tej reprezentatywnej analizie, dla której zmiany procentowe dla każdej komórki odpornościowej będącej przedmiotem zainteresowania oraz całkowita zawartość immunologiczna są pokazane przed i po chemioterapii dla jednego pacjenta. W tej analizie próbki między grupami pacjentów porównano pod względem czasu do progresji choroby po leczeniu. Podgrupa pacjentów wykazała nawrót choroby po 18 miesiącach, podczas gdy inna podgrupa postępowała szybciej w ciągu 18 lub mniej miesięcy.Mediana wartości delta może być następnie porównana dla każdej próbki w celu zidentyfikowania przypuszczalnych biomarkerów postępu choroby. Na przykład w tym przypadku zidentyfikowano dwa geny ucieczki immunologicznej jako statystycznie istotne różnicowniki grup próbek. Ponieważ poszczególne biomarkery genów były solidne i miały wyraźną istotność statystyczną, wielowymiarowy biomarker nie dodał istotnej wartości predykcyjnej.Pamiętaj, aby wykonywać pranie na gorąco po jednym pasku na raz, aby zapobiec wychłodzeniu próbki i pamiętaj, aby przenieść kulki do świeżych probówek, aby uniknąć zanieczyszczenia poza celem. Protokół ten demonstruje wykorzystanie modeli ekspresji genów do ilościowego oznaczania komórek odpornościowych i tkanki nowotworowej. Opracowywane są nowe modele do pomiaru stanów komórek, takich jak wyczerpanie lub aktywacja.

predictive-immune-modeling-of-solid-tumors

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przedstawiono generowanie ortotopowego szczurzego modelu międzybłoniaka opłucnej przez wszczepienie komórek międzybłoniaka II-45 do jamy opłucnej szczurów o usposobieniu immunologicznym. Opisano również metodę cytometrii przepływowej do analizy siedmiu podzbiorów komórek odpornościowych u tych zwierząt z próbki krwi o objętości 25 μl.

Implantacja ortotopowa i monitorowanie obwodowych komórek odpornościowych w modelu międzybłoniaka syngenicznego szczura II-45

Badanie mikrośrodowiska guza może zidentyfikować prognostyczne lub predykcyjne biomarkery klinicznej odpowiedzi na immunoterapię. Przedstawiona tutaj jest innowacyjna metoda oparta na obrazowaniu wielospektralnym fluorescencji in situ w celu automatycznej analizy i zliczania różnych subpopulacji limfocytów T CD8 +. Ta powtarzalna i niezawodna technika nadaje się do dużych analiz kohortowych.

Multipleksowa analiza immunofluorescencyjna i kwantyfikacja wewnątrznowotworowych limfocytów T PD-1 + Tim-3 + CD8 +

Eksperymentalna procedura immunofenotypowania mysich ortotopowych homograftów PDAC ma na celu profilowanie immuno-mikrośrodowiska guza. Guzy są wszczepiane ortotopowo za pomocą operacji. Guzy o wielkości 200–600 mm3 pobrano i zdysocjowano w celu przygotowania zawiesin jednokomórkowych, a następnie przeprowadzono analizę FACS pod kątem wielu markerów immunologicznych przy użyciu różnych przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie.

Immunofenotypowanie homograftu ortotopowego (syngenecznego) mysiego pierwotnego gruczolakoraka przewodowego trzustki KPC za pomocą cytometrii przepływowej

Tutaj opisujemy metodę rozdzielania i wzbogacania składników mikrośrodowiska immunologicznego i nieimmunologicznego guza w ustalonych guzach podskórnych. Technika ta pozwala na oddzielną analizę nacieków immunologicznych guza i nieimmunologicznych frakcji guza, co może pozwolić na kompleksową charakterystykę mikrośrodowiska immunologicznego guza.

Wzbogacenie i charakterystyka mikrośrodowisk immunologicznych i nieimmunologicznych guza w ustalonych podskórnych guzach myszy

W dobie immunoterapii i profilowania genomu pojedynczej komórki, biologia nowotworów wymaga nowatorskich narzędzi in vitro i obliczeniowych do badania interfejsu nowotworowo-immunologicznego we właściwym kontekście czasoprzestrzennym. Opisujemy protokoły wykorzystania kokultur mikroprzepływowych immunologicznych z nowotworami w warunkach 2D i 3D, kompatybilnych z dynamicznym, wieloparametrycznym monitorowaniem funkcji komórkowych.

Mikroprzepływowe modele kohodowli do analizy odpowiedzi immunologicznej w mikrośrodowiskach nowotworowych in vitro

Tutaj prezentujemy protokół przeszczepu guza do charakterystyki limfocytów naciekanych nowotworem w modelu guza myszy w intruzie naturalnym i pochodzącym z obwodu limfocytach. Specyficzne śledzenie napływu komórek odpornościowych pochodzących od biorcy za pomocą cytometrii przepływowej ujawnia dynamikę zmian fenotypowych i funkcjonalnych tych komórek podczas przeciwnowotworowych odpowiedzi immunologicznych.

Przeszczep guza w celu oceny dynamiki limfocytów T CD8 + naciekających nowotwór u myszy

Protokół przedstawia model immunoterapii nowotworów za pomocą komórkowego szczepienia guza z ekspresją Flt3L czerniaka B16-F10. Protokół ten demonstruje procedury, w tym przygotowanie hodowanych komórek nowotworowych, implantację guza, napromienianie komórek, pomiar wzrostu guza, izolację wewnątrznowotworowych komórek odpornościowych i analizę cytometrii przepływowej.

Eksperymentalny model immunoterapii czerniaka z wykorzystaniem szczepienia przeciwnowotworowego cytokiną krwiotwórczą

Ten protokół opisuje generowanie myszy z ludzkim układem odpornościowym (HIS) do badań immunoonkologicznych. Przedstawiono instrukcje i rozważania dotyczące stosowania tego modelu do testowania ludzkich immunoterapeutyków na ludzkich nowotworach wszczepionych w tym modelu z naciskiem na scharakteryzowanie odpowiedzi ludzkiego układu odpornościowego na guz.

Testowanie immunoterapeutyków przeciwnowotworowych w humanizowanym modelu mysim z ludzkimi nowotworami

Ten protokół opisuje szczegółowo, jak przeprowadzana jest charakterystyka komórek odpornościowych mikrośrodowiska guza za pomocą multipleksowej immunohistochemii.

Multipleksowa analiza immunohistochemiczna przestrzennego krajobrazu komórek odpornościowych w mikrośrodowisku guza

Tutaj prezentujemy metodę identyfikacji związków, które modulują mechanizm ADCC, ważny mechanizm zabijania komórek nowotworowych przez przeciwciała przeciwnowotworowe. Działanie cytotoksyczne komórek NK mierzy się w sferoidach komórek raka piersi w obecności trastuzumabu. Analiza obrazu identyfikuje żywe i martwe komórki zabójcze i docelowe w sferoidach.

Kwantyfikacja cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał w modelu sferoidalnym guza: zastosowanie do odkrywania leków

Poznaj metodę RNA do profilowania immunologicznego guzów litych w badaniach immuno-onkologicznych. Technika ta umożliwia wykrywanie biomarkerów i ocenę odpowiedzi immunologicznej na terapię.

Predykcyjne modelowanie immunologiczne guzów litych

Przeglądaj więcej filmów