Kwantyfikacja wymywania metali w chromatografii powinowactwa do unieruchomionych metali

Nasza metoda jest znacząca, ponieważ pozwala przeciętnemu biochemikowi szybko określić, czy próbki wyizolowane za pomocą chromatografii powinowactwa do unieruchomionych metali są zanieczyszczone metalami przejściowymi. Główną zaletą jest łatwość, z jaką można przeprowadzić test. Test wykorzystuje oprzyrządowanie i techniki typowe dla większości laboratoriów biochemicznych i można go łatwo i szybko wdrożyć.

Chociaż w tym artykule stosujemy tę metodę do próbek wyizolowanych za pomocą kolumny niklowo-NTA, metodę tę można zastosować do każdej innej żywicy o powinowactwie do metalu. Początkujący użytkownicy powinni wypróbować tę metodę z roztworem podstawowym niklu o znanym stężeniu. Pozwoli to zapoznać ich z przepływem pracy, przykładowymi kolorami i żywicami pokazanymi w zmianach spektralnych.

Procedurę zademonstruje Cole Swain, technik z mojego laboratorium. Aby rozpocząć, włącz i rozgrzej spektrofotometr UV-Vis. Oznaczyć frakcje chromatograficzne do oznaczenia za pomocą spektrofotometru UV-Vis z matrycą diodową o absorbancji optycznej przy 280 nanometrach w celu ilościowego określenia białka.

Uzyskać bufor próbki o objętości od 10 do 100 milimolów o pH od 7 do 12, taki jak Tris, HEPES, MOPS i bufor fosforanowy. Przygotować 12% wagowo objętościowy roztwór dyspersji HNB w buforze próbki, używając 120 miligramów odczynnika HNB na każdy mililitr przygotowanego roztworu podstawowego. Ustaw spektrofotometr tak, aby zbierał dane o długości 647 nanometrów.

Użyj kuwety kwarcowej wypełnionej buforem próbki, aby wygasić spektrofotometr. Przygotować roztwór kontrolny w kuwecie zawierającej 50 mikrolitrów wywaru HNB na mililitr całkowitej objętości testu. Pozostawić kontrolę do inkubacji przez co najmniej trzy minuty w temperaturze pokojowej.

Zmierzyć i zapisać absorbancję przy 647 nanometrach dla próbki kontrolnej. Przygotować próbki do oznaczania, mieszając 150 mikrolitrów surowca HNB z 2850 mikrolitrami odpowiednio rozcieńczonych frakcji białkowych z buforem próbki. Pozostawić próbkę do inkubacji przez co najmniej trzy minuty w temperaturze pokojowej.

Powtórz zapis widma dla każdej mierzonej frakcji. W przypadku, gdy uzyskuje się niewystarczające rozcieńczenie, całe pasmo widmowe przy 647 nanometrach znika. Przy zbyt silnym rozcieńczeniu próbka jest nie do odróżnienia od kontroli.

Aby określić stężenie metalu w każdej próbce, najpierw znajdź różnicę absorbancji każdej próbki w odległości 647 nanometrów od kontroli HNB. Określić stężenie metalu w mikromolach za pomocą wzoru, gdzie DF jest współczynnikiem rozcieńczenia dla frakcji testowej, delta ABS 647 to zmiana absorbancji przy 647 nanometrach, 3,65 razy 10 do minus 2 oznacza współczynnik ekstynkcji HNB, a l to ścieżka optyczna kuwety w centymetrach. W niniejszej pracy przedstawiono widmo wolnego HNB przy neutralnym pH w reprezentatywnych widmach frakcji oznaczanych dla jonów niklu z izolacji MSP1E3D1

Zaobserwowano zmniejszoną absorbancję przy 647 nanometrach w porównaniu z kontrolą HNB, co odpowiadało tworzeniu się kompleksów HNB w obecności metalu przejściowego. Aby zademonstrować zastosowanie tego testu, przeanalizowano dwa znakowane przez niego białka rusztowania błonowego, MSP1E3D1, MSP2N2 i nowy, trójhemowy, cytochromowy GSU0105 typu c z geobacter sulfurreducens. Zawartość białka i jonów niklu w każdej frakcji dla GSU0105 była znacznie przesunięta względem siebie, podczas gdy frakcje dla MSP1E3D1 i MSP2N2, które zawierały najwięcej białka, miały również najwyższą zawartość niklu.

Wykazano również, że zawartość metalu może nie być równomiernie rozłożona między frakcjami zebranymi za pomocą mobilizowanej chromatografii powinowactwa do metali. Najważniejsze jest, aby odpowiednio i konsekwentnie mieszać ślepą próbę we wszystkich próbkach i zapewnić równe czasy inkubacji ślepej próby we wszystkich próbkach. Frakcje białkowe o szczególnym znaczeniu mogą być dalej analizowane za pomocą atomowej spektrometrii absorpcyjnej lub ICPMS w celu potwierdzenia zanieczyszczenia metalami i przetestowania chelatowanych lub silnie związanych jonów metali białkowych.

Oprócz wykrywania wymywania metali przejściowych, technika ta może być stosowana do pomiaru powinowactwa wiązania jonów metali przejściowych do białek. HNB i nikiel obecny w próbkach działają drażniąco odpowiednio na oczy i skórę. Podczas metody należy używać standardowych środków ochrony indywidualnej, w tym rękawic i okularów ochronnych.