Name: Kwantyfikacja wymywania metali w chromatografii powinowactwa do unieruchomionych metali (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-17T16:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 35 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji metali w próbkach z chromatografii powinowactwa do unieruchomionych metali przy użyciu hydroksynaftolu niebieskiego i spektrofotometrii UV-Vis. Technika umożliwia szybką ocenę zanieczyszczenia metalami przejściowymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten materiał jest oparty na pracy wspieranej przez National Science Foundation w ramach grantu MCB-1817448 oraz na podstawie nagrody od Thomas F. and Kate Miller Jeffress Memorial Trust, Bank of America, Trustee i określonego darczyńcy Hazel Thorpe Carman i George Gay Carman Trust.

1. Przygotowanie komponentów testu
<ol>
	<li>Wyznaczyć frakcje chromatograficzne do analizy, wykorzystując absorbancję optyczną przy 280 nm lub alternatywne metody oznaczania ilości białka w celu zidentyfikowania frakcji wzbogaconych w białko. 
	UWAGA: W niniejszej pracy wykorzystano spektrofotometr UV-Vis z detektorem macierzy diodowej. W celu zwiększenia przepustowości można zastosować czytnik płytek zdolny do pomiaru absorbancji UV-Vis.</li>
	<li>Przygotowanie niezbędnych komponentów do analizy
	<ol>
		<li>Przygotować lub pozyskać bufor 10-100 mM („bufor do próbek”) o pH w zakresie od 7 do 12. 
		UWAGA: Do analizy odpowiednie są powszechnie stosowane bufory biochemiczne, takie jak Tris, HEPES, MOPS oraz fosforanowy o pH neutralnym lub zasadowym. Można stosować tricynę i histydynę, jednak wymagają one krzywych kalibracyjnych, ponieważ obie substancje w znacznym stopniu chelatują jony metali. Przykład kalibracji dla histydyny przedstawiono w źródle20.</li>
		<li>Przygotować 12% w/v (20-krotnie stężony) roztwór dyspersji błękitu hydroksynaftolowego (HNB) w buforze do próbek, używając 120 mg odczynnika HNB na każdy mililitr przygotowanego roztworu stokowego. 
		OSTROŻNIE: Kontakt HNB z oczami może spowodować poważne uszkodzenia i podrażnienia. Podczas pracy z HNB należy stosować ochronę oczu, a po zakończeniu czynności dokładnie umyć ręce. 
		UWAGA: HNB jest sprzedawany przez głównych dostawców odczynników naukowych jako dyspersja na KCl. W związku z tym rzeczywiste stężenie w roztworze będzie różnić się w zależności od producenta, partii oraz miejsca pobrania dyspersji HNB z butelki. Idealnie po 20-krotnym rozcieńczeniu roztworu stokowego należy uzyskać absorbancję w zakresie 0,5-0,8 przy 647 nm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie i pomiar próbek
<ol>
	<li>Przygotowanie spektrofotometru do gromadzenia danych
	<ol>
		<li>Włączyć i rozgrzać spektrofotometr UV-Vis. Ustawić spektrofotometr na pomiar danych przy 647 nm. 
		UWAGA: Jeśli spektrofotometr na to pozwala, dodatkowo gromadzić dane przy 850 nm lub innej długości fali, przy której nie występują znaczące zmiany związane ze spektrami barwnika i kompleksu barwnik-metal, w celu przeprowadzenia korekcji linii bazowej.</li>
		<li>Wyzerować spektrofotometr (pomiar blank), używając Buforu Próbkowego (Sample Buffer). 
		UWAGA: Można stosować kuwety kwarcowe lub jednorazowe plastikowe. W analizie ilościowej preferowane są kuwety kwarcowe, ponieważ zapewniają one wyższą dokładność i precyzję niż kuwety plastikowe. Jednak kuwety plastikowe blokują światło UV, które może być obecne w wiązkach pomiarowych niektórych spektrofotometrów z matrycą dioidową. Narażenie HNB na intensywne światło UV powoduje wyraźną degradację barwnika i niepożądany powolny spadek absorbancji, który może zostać pomylony z powolnym wiązaniem metalu (np. patrz Rysunek 1 w Informacjach Uzupełniających do Referencji 20).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie i pomiar absorbancji kontroli
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór kontrolny zawierający 50 μL stoku HNB na mililitr całkowitej objętości analizy. Aby zapewnić dobre wymieszanie wszystkich próbek, najpierw pipetować małe objętości, następnie dodać Bufor Próbkowy, a potem wymieszać poprzez pipetowanie. Rozcieńczony roztwór HNB należy przygotować na świeżo, jednak stoki HNB można przechowywać w temperaturze 4 °C, chroniąc je przed światłem przez wiele tygodni bez znaczącej degradacji.</li>
		<li>Inkubować kontrolę przez minimum 3 min w temperaturze pokojowej. 
		UWAGA: Dłuższy czas inkubacji może być konieczny dla próbek o pH zasadowym lub w obecności fosforanów ze względu na tworzenie słabo rozpuszczalnych kompleksów metali, co skutkuje wolniejszym osiągnięciem stanu równowagi.</li>
		<li>Zmierzyć i zapisać absorbancję przy 647 nm dla próbki kontrolnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie i pomiar absorbancji próbek
	<ol>
		<li>Przygotować próbki do analizy, mieszając 50 μL stoku HNB z 950 µL odpowiednio rozcieńczonych frakcji białkowych w Buforze Próbkowym. 
		UWAGA: Ponieważ poziomy zanieczyszczeń metalami raportowane w literaturze różnią się ponad tysiąckrotnie w zależności od warunków elucji16,20, może być konieczne przetestowanie kilku rozcieńczeń analizowanych frakcji białkowych w Buforze Próbkowym (patrz krok 1.2.1 powyżej), aby uzyskać zmiany absorbancji mieszczące się w zakresie dynamicznym analizy. 
		OSTRZEŻENIE: Nikiel i inne metale stosowane w IMAC są znanymi substancjami drażniącymi skórę, podejrzewanymi o działanie rakotwórcze oraz mogą uszkadzać nerki i krew po długotrwałej ekspozycji. Podczas pracy z próbkami białek przygotowanymi metodą IMAC należy stosować rękawice i ochronę oczu.</li>
		<li>Inkubować próbkę przez minimum 3 min w temperaturze pokojowej i zmierzyć absorbancję przy 647 nm. 
		UWAGA: Etapem ograniczającym czas trwania analizy jest inkubacja. Dane do niniejszej pracy zostały zebrane przy użyciu jednej kuwety kwarcowej, którą starannie myto między każdą próbką. Nawet uwzględniając czas mycia i przygotowania stoku HNB, gromadzenie danych dla 14 próbek i kontroli zajęło około półtorej godziny, w związku z czym protokół można łatwo zrealizować bez konieczności przerywania pracy.</li>
		<li>Powtórzyć kroki 2.3.1 i 2.3.2 dla każdej frakcji przeznaczonej do pomiaru. 
		UWAGA: Jeśli do wielu próbek używane będą różne kuwety, próbki należy przygotować w sposób zapewniający porównywalny czas inkubacji i ekspozycję na światło otoczenia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Oznaczanie ilości metali
<ol>
	<li>Wyznaczanie stężenia metalu w każdej próbce
	<ol>
		<li>Oblicz różnicę absorbancji każdej próbki przy 647 nm względem kontroli HNB.</li>
		<li>Wyznacz stężenie metalu (w µM), korzystając z poniższego wzoru: 
		 
		<img alt="Wzór na stężenie jonów niklu, równanie do analizy spektroskopowej, obliczanie absorpcji." src="/files/ftp_upload/60690/60690equfig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1"> 
		 
		gdzie DF to czynnik rozcieńczenia frakcji analizowanej, ΔAbs647 to zmiana absorbancji przy 647 nm, 3,65x10-2 reprezentuje współczynnik ekstynkcji HNB (ε=36,5 mM-1·cm-1 patrz Odnośnik20 w celu uzyskania szczegółowych informacji), a l to droga optyczna kuwety w cm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Porath, J., Carlsson, J. A. N., Olsson, I., Belfrage, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+chelate+affinity+chromatography%2C+a+new+approach+to+protein+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation.</a> Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).</li>
<li>Block, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0076687909630275">Immobilized-Metal Affinity Chromatography (IMAC): A Review.</a> Methods in Enzymology. 463, 439-473 (2009).</li>
<li>Takeda, N., Matsuoka, T., Gotoh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potentiality+of+IMAC+as+sample+pretreatment+tool+in+food+analysis+for+veterinary+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Chromatographia%22%5BJournal%5D)">Potentiality of IMAC as sample pretreatment tool in food analysis for veterinary drugs.</a> Chromatographia. 72 (1/2), 127-131 (2010).</li>
<li>Felix, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+serum+proteins+involved+in+pancreatic+cancer+cachexia%5BTitle%5D)+AND+%22Life+sciences%22%5BJournal%5D)">Identification of serum proteins involved in pancreatic cancer cachexia.</a> Life sciences. 88 (5-6), 218-225 (2011).</li>
<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+enhanced+laser+desorption%2Fionization+profiling%3A+New+diagnostic+method+of+HBV-related+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Surface enhanced laser desorption/ionization profiling: New diagnostic method of HBV-related hepatocellular carcinoma.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 24 (1), 55-62 (2009).</li>
<li>Goldsmith, J. O., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+bacterial+photosynthetic+reaction+centers+with+an+engineered+poly-histidine+tag%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of bacterial photosynthetic reaction centers with an engineered poly-histidine tag.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1276 (3), 171-175 (1996).</li>
<li>Guergova-Kuras, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+one-step+purification+of+a+fully+active+polyhistidine-tagged+cytochrome+bc1+complex+from+Rhodobacter+sphaeroides%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Expression and one-step purification of a fully active polyhistidine-tagged cytochrome bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides.</a> Protein Expression and Purification. 15 (3), 370-380 (1999).</li>
<li>Mitchell, D. M., Gennis, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+purification+of+wildtype+and+mutant+cytochrome+c+oxidase+from+Rhodobacter+sphaeroides+by+Ni%282%2B%29-NTA+affinity+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Rapid purification of wildtype and mutant cytochrome c oxidase from Rhodobacter sphaeroides by Ni(2+)-NTA affinity chromatography.</a> FEBS Letters. 368 (1), 148-150 (1995).</li>
<li>Tian, H., White, S., Yu, L., Yu, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+head+domain+movement+of+the+rieske+iron-sulfur+protein+in+electron+transfer+reaction+of+the+cytochrome+bc1+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Evidence for the head domain movement of the rieske iron-sulfur protein in electron transfer reaction of the cytochrome bc1 complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (11), 7146-7152 (1999).</li>
<li>Tian, H., Yu, L., Mather, M. W., Yu, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexibility+of+the+neck+region+of+the+rieske+iron-sulfur+protein+is+functionally+important+in+the+cytochrome+bc1+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Flexibility of the neck region of the rieske iron-sulfur protein is functionally important in the cytochrome bc1 complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (43), 27953-27959 (1998).</li>
<li>Louie, A. Y., Meade, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+complexes+as+enzyme+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Metal complexes as enzyme inhibitors.</a> Chemical Reviews. 99 (9), 2711-2734 (1999).</li>
<li>Tamás, M. J., Sharma, S. K., Ibstedt, S., Jacobson, T., Christen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heavy+Metals+and+Metalloids+As+a+Cause+for+Protein+Misfolding+and+Aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Heavy Metals and Metalloids As a Cause for Protein Misfolding and Aggregation.</a> Biomolecules. 4 (1), 252-267 (2014).</li>
<li>Gerencser, L., Maroti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retardation+of+proton+transfer+caused+by+binding+of+the+transition+metal+ion+to+the+bacterial+reaction+center+is+due+to+pKa+shifts+of+key+protonatable+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Retardation of proton transfer caused by binding of the transition metal ion to the bacterial reaction center is due to pKa shifts of key protonatable residues.</a> Biochemistry. 40 (6), 1850-1860 (2001).</li>
<li>Klishin, S. S., Junge, W., Mulkidjanian, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flash-induced+turnover+of+the+cytochrome+bc1+complex+in+chromatophores+of+Rhodobacter+capsulatus%3A+binding+of+Zn2%2B+decelerates+likewise+the+oxidation+of+cytochrome+b%2C+the+reduction+of+cytochrome+c1+and+the+voltage+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Flash-induced turnover of the cytochrome bc1 complex in chromatophores of Rhodobacter capsulatus: binding of Zn2+ decelerates likewise the oxidation of cytochrome b, the reduction of cytochrome c1 and the voltage generation.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1553 (3), 177-182 (2002).</li>
<li>Link, T. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+ions+inhibit+the+QP+center+of+bovine+heart+mitochondrial+bc1+complex+by+blocking+a+protonatable+group%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Zinc ions inhibit the QP center of bovine heart mitochondrial bc1 complex by blocking a protonatable group.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (42), 25001-25006 (1995).</li>
<li>Block, H., Kubicek, J., Labahn, J., Roth, U., Schäfer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+comprehensive+quality+control+of+recombinant+human+Interleukin-1beta%3A+a+case+study+for+a+process+development+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Production and comprehensive quality control of recombinant human Interleukin-1beta: a case study for a process development strategy.</a> Protein Expression and Purification. 57 (2), 244-254 (2008).</li>
<li>Kokhan, O., Shinkarev, V. P., Wraight, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+imidazole+to+the+heme+of+cytochrome+c1+and+inhibition+of+the+bc1+complex+from+Rhodobacter+sphaeroides%3A+II.+Kinetics+and+mechanism+of+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Binding of imidazole to the heme of cytochrome c1 and inhibition of the bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides: II. Kinetics and mechanism of binding.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (29), 22522-22531 (2010).</li>
<li>Kokhan, O., Shinkarev, V. P., Wraight, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+imidazole+to+the+heme+of+cytochrome+c1+and+inhibition+of+the+bc1+complex+from+Rhodobacter+sphaeroides%3A+I.+Equilibrium+and+modeling+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Binding of imidazole to the heme of cytochrome c1 and inhibition of the bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides: I. Equilibrium and modeling studies.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (29), 22513-22521 (2010).</li>
<li>Bornhorst, J. A., Falke, J. J. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0076687900260588">Purification of proteins using polyhistidine affinity tags.</a> Methods in Enzymology. 326, 245-254 (2000).</li>
<li>Kokhan, O., Marzolf, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantification+of+transition+metal+leaching+in+metal+affinity+chromatography+with+hydroxynaphthol+blue%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Detection and quantification of transition metal leaching in metal affinity chromatography with hydroxynaphthol blue.</a> Analytical Biochemistry. 582, 113347(2019).</li>
<li>Doyle, C., Naser, D., Bauman, H., Rumfeldt, J., Meiering, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrophotometric+method+for+simultaneous+measurement+of+zinc+and+copper+in+metalloproteins+using+4-%282-pyridylazo%29resorcinol%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Spectrophotometric method for simultaneous measurement of zinc and copper in metalloproteins using 4-(2-pyridylazo)resorcinol.</a> Analytical Biochemistry. 579, 44-56 (2019).</li>
<li>Furrer, J., Smith, G. S., Therrien, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFurrer%2C+J+%22Inorganic+Chemical+Biology%22">Inorganic Chemical Biology</a>. Gasser, G. , (2014).</li>
<li>Hogeling, S. M., Cox, M. T., Bradshaw, R. M., Smith, D. P., Duckett, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+proteins+in+whole+blood%2C+plasma+and+DBS%2C+with+element-labelled+antibody+detection+by+ICP-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Quantification of proteins in whole blood, plasma and DBS, with element-labelled antibody detection by ICP-MS.</a> Analytical Biochemistry. 575, 10-16 (2019).</li>
<li>Yamasaki, S., Tsumura, A., Takaku, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultratrace+Elements+in+Terrestrial+Water+as+Determined+by+High-Resolution+ICP-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Microchemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Ultratrace Elements in Terrestrial Water as Determined by High-Resolution ICP-MS.</a> Microchemical Journal. 49 (2), 305-318 (1994).</li>
<li>Brittain, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+Formation+Between+Hydroxy+Naphthol+Blue+and+First+Row+Transition+Metal+Cyanide+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Letters%22%5BJournal%5D)">Complex Formation Between Hydroxy Naphthol Blue and First Row Transition Metal Cyanide Complexes.</a> Analytical Letters. 10 (13), 1105-1113 (1977).</li>
<li>Brittain, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+Transition+Metal+Ions+by+the+Calcium+Indicator+Hydroxy+Naphthol+Blue%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Letters%22%5BJournal%5D)">Binding of Transition Metal Ions by the Calcium Indicator Hydroxy Naphthol Blue.</a> Analytical Letters. 11 (4), 355-362 (1978).</li>
<li>Temel, N. K., Sertakan, K., Gürkan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preconcentration+and+Determination+of+Trace+Nickel+and+Cobalt+in+Milk-Based+Samples+by+Ultrasound-Assisted+Cloud+Point+Extraction+Coupled+with+Flame+Atomic+Absorption+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Trace+Element+Research%22%5BJournal%5D)">Preconcentration and Determination of Trace Nickel and Cobalt in Milk-Based Samples by Ultrasound-Assisted Cloud Point Extraction Coupled with Flame Atomic Absorption Spectrometry.</a> Biological Trace Element Research. 186 (2), 597-607 (2018).</li>
<li>Ferreira, S. L. C., Santos, B. F., de Andrade, J. B., Costa, A. C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrophotometric+and+derivative+spectrophotometric+determination+of+nickel+with+hydroxynaphthol+blue%5BTitle%5D)+AND+%22Microchimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Spectrophotometric and derivative spectrophotometric determination of nickel with hydroxynaphthol blue.</a> Microchimica Acta. 122 (1), 109-115 (1996).</li>
<li>Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+Self-Assembly+of+Monodisperse+Phospholipid+Bilayer+Nanodiscs+with+Controlled+Size%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Directed Self-Assembly of Monodisperse Phospholipid Bilayer Nanodiscs with Controlled Size.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (11), 3477-3487 (2004).</li>
<li>Grinkova, Y. V., Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+extended+membrane+scaffold+proteins+for+self-assembly+of+soluble+nanoscale+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Engineering%2C+Design+and+Selection%22%5BJournal%5D)">Engineering extended membrane scaffold proteins for self-assembly of soluble nanoscale lipid bilayers.</a> Protein Engineering, Design and Selection. 23 (11), 843-848 (2010).</li>
<li>Bonta, M., Hegedus, B., Limbeck, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+dried-droplets+deposited+on+pre-cut+filter+paper+disks+for+quantitative+LA-ICP-MS+imaging+of+biologically+relevant+minor+and+trace+elements+in+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Application of dried-droplets deposited on pre-cut filter paper disks for quantitative LA-ICP-MS imaging of biologically relevant minor and trace elements in tissue samples.</a> Analytica Chimica Acta. 908, 54-62 (2016).</li>
<li>Olmedo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+method+to+quantify+chromium%2C+cadmium%2C+manganese%2C+nickel+and+lead+in+human+whole+blood%2C+urine%2C+saliva+and+hair+samples+by+electrothermal+atomic+absorption+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Validation of a method to quantify chromium, cadmium, manganese, nickel and lead in human whole blood, urine, saliva and hair samples by electrothermal atomic absorption spectrometry.</a> Analytica Chimica Acta. 659 (1), 60-67 (2010).</li>
<li>Shyamal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Selective+Turn-On+Fluorogenic+Chemosensor+for+Robust+Quantification+of+Zn%28II%29+Based+on+Aggregation+Induced+Emission+Enhancement+Feature%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Sensors%22%5BJournal%5D)">Highly Selective Turn-On Fluorogenic Chemosensor for Robust Quantification of Zn(II) Based on Aggregation Induced Emission Enhancement Feature.</a> ACS Sensors. 1 (6), 739-747 (2016).</li>
<li>Kudo, H., Yamada, K., Watanabe, D., Suzuki, K., Citterio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paper-Based+Analytical+Device+for+Zinc+Ion+Quantification+in+Water+Samples+with+Power-Free+Analyte+Concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Paper-Based Analytical Device for Zinc Ion Quantification in Water Samples with Power-Free Analyte Concentration.</a> Micromachines. 8 (4), 127(2017).</li>
<li>Liu, R., Zhang, P., Li, H., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lab-on-cloth+integrated+with+gravity%2Fcapillary+flow+chemiluminescence+%28GCF-CL%29%3A+towards+simple%2C+inexpensive%2C+portable%2C+flow+system+for+measuring+trivalent+chromium+in+water%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators+B%3A+Chemical%22%5BJournal%5D)">Lab-on-cloth integrated with gravity/capillary flow chemiluminescence (GCF-CL): towards simple, inexpensive, portable, flow system for measuring trivalent chromium in water.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 236 (C), 35-43 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Detekcja kolorymetryczna metali za pomocą HNB zapewnia prosty sposób ilościowego określenia stopnia zanieczyszczenia białek jonami metali przejściowych z żywic IMAC. Jak ustaliliśmy w odnośniku 20, Ni2+ wiąże się z HNB za pomocą stechiometrii 1:1, a stała dysocjacji dla kompleksu Ni-HNB zmienia się wraz z pH. Jednak kompleks Kd znajduje się w zakresie sub-nM dla wszystkich zalecanych (7-12) wartości pH. W praktyce oznacza to, że wszystkie Ni2+ w dowolnych badanych frakcjach będą wiązać si...

Od momentu powstania przez Poratha i współpracowników1, chromatografia powinowactwa do metali immobilizowanych (IMAC) stała się metodą szybkiego rozdzielania białek na podstawie ich zdolności do wiązania się z jonami metali przejściowych, takich jak Zn2+, Ni2+, Cu2+ i Co2+. Najczęściej odbywa się to za pomocą zmodyfikowanych znaczników polihistydynowych i jest obecnie jedną z najczęstszych technik oczyszczania chromatograficznego do izolacji białek rekombinowanych2. IMAC znalazł również zastosowania poza oczyszczaniem białek rekombinowanych jako sposób izolowania chinolonów, tetracyklin, aminoglikozydów, makrolidów i β-laktamów do analizy próbek żywności3 oraz jako krok w identyfikacji markerów białkowych krwi w raku wątroby i trzustki4,5. Nic dziwnego, że IMAC stał się również metodą z wyboru do izolacji wielu natywnych enzymów bioenergetycznych6,7,8,9,10. Jednak pomyślne wdrożenie tych metod oczyszczania do badań nad enzymatycznie aktywnymi białkami bioenergetycznymi jest uzależnione od obecności znikomych poziomów kationów metali wypłukiwanych z matrycy kolumny do eluatu. Kationy metali dwuwartościowych powszechnie stosowane w IMAC mają znane patologiczne znaczenie biologiczne, nawet w niskich stężeniach11,12. Fizjologiczne działanie tych metali jest najbardziej widoczne w systemach bioenergetycznych, gdzie mogą okazać się śmiertelne jako inhibitory oddychania komórkowego lub fotosyntezy13,14,15. Podobne problemy są nieuniknione w przypadku większości klas białek, w których resztkowe metale zanieczyszczające mogą zakłócać funkcje biologiczne białka lub charakterystykę za pomocą technik biochemicznych i biofizycznych.
Podczas gdy poziomy zanieczyszczenia metalami w warunkach utleniania i stosowania imidazolu jako eluantu są zazwyczaj niskie16, izolacje białek wykonywane w obecności środków redukujących cysteinę (DTT, β-merkaptoetanol, itp.) lub silniejszych chelatorów, takich jak histydyna17,18 lub kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) powodują znacznie wyższe poziomy zanieczyszczenia metalami19,20. Podobnie, ponieważ jony metali w żywicach IMAC są często koordynowane przez grupy karboksylowe, elucja białek przeprowadzana w warunkach kwaśnych może również mieć znacznie wyższy poziom zanieczyszczenia metalami. Zawartość metalu w roztworach można ocenić za pomocą atomowej spektroskopii absorpcyjnej (AAS) i spektrometrii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie (ICP-MS) do granicy wykrywalności w zakresie ppb-ppt21,22,23,24. Niestety, AAS i ICP-MS nie są realistycznymi metodami wykrywania w tradycyjnym laboratorium biochemicznym, ponieważ metody te wymagałyby dostępu do specjalistycznego sprzętu i szkolenia.
Poprzednia praca Brittain25,26 badała użycie błękitu hydroksynaftolowego (HNB) jako sposobu identyfikacji obecności metali przejściowych w roztworze. Było jednak kilka wewnętrznych sprzeczności w data20 i te prace nie oferowały odpowiedniego protokołu. Badania przeprowadzone przez Temel et al.27 oraz Ferreira et al.28 rozszerzyły prace Brittaina z HNB jako potencjalnym wskaźnikiem metalu. Jednak Temel opracował protokół, który wykorzystuje AAS do analizy próbek, używając HNB tylko jako czynnika chelatującego. W badaniu Ferreiry wykorzystano zmianę widm absorbancji HNB przy 563 nm, regionie widm HNB wolnego barwnika, który w dużym stopniu pokrywa się z widmami kompleksów HNB-metal przy pH 5,7, co sprawia, że czułość testu jest dość niska, a także skutkuje stosunkowo słabym powinowactwem do wiązania metali20. Aby rozwiązać problemy w naszym własnym laboratorium z wymywaniem Ni2+ z IMAC, rozszerzyliśmy pracę wykonaną przez Brittain25,26 i Ferreria28, aby opracować łatwy test zdolny do wykrywania poziomów nanomolowych kilku metali przejściowych. Wykazaliśmy, że HNB wiąże nikiel i inne typowe dla IMAC metale o powinowactwie wiązania sub-nanomolowego i tworzy kompleks 1:1 w szerokim zakresie wartości pH20. Przedstawiony tutaj test opiera się na tych wynikach i wykorzystuje zmiany absorbancji w widmie HNB przy 647 nm do ilościowego oznaczania metalu. Test można przeprowadzić w fizjologicznym zakresie pH przy użyciu typowych i oprzyrządowania znajdującego się w typowym laboratorium biochemicznym, wykorzystując kolorymetryczne wykrywanie i kwantyfikację kompleksów metal-barwnik oraz związaną z tym zmianę absorbancji wolnego barwnika, gdy wiąże się on z metalem.

<table><tbody><tr><td>2xYT bulion</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9743-500</td><td>pożywka do wzrostu E.coli</td></tr><tr><td>HEPES, wolny kwas</td><td>BioBasic</td><td>HB0264</td><td>alternatywny bufor</td></tr><tr><td>Żywica HisPur Ni-NTA</td><td>Thermo Scientific</td><td>88222</td><td></td></tr><tr><td>Hydroksynaftol niebieska sól disoidum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>219916-5g</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3196-500</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>BioBasic</td><td>IB0277</td><td></td></tr><tr><td>MOPS, wolny kwas</td><td>BioBasic</td><td>MB0360</td><td>alternatywny bufor</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S369-500</td><td>alternatywny bufor</td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Gold Bio</td><td>T870-100</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284-500</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja wymywania metali w chromatografii powinowactwa do unieruchomionych metali

Quantification of Metal Leaching in Immobilized Metal Affinity Chromatography

Zanieczyszczenie enzymów metalami wypłukanymi z kolumn IMAC (immobilizowanej chromatografii powinowactwa do metali) stanowi poważny problem dla enzymologów, ponieważ wiele popularnych kationów dwu- i trójwartościowych stosowanych w żywicach IMAC ma działanie hamujące na enzymy. Jednak zakres wymywania metali i wpływ różnych odczynników eluujących i redukujących są słabo poznane w dużej mierze ze względu na brak prostych i praktycznych protokołów kwantyfikacji metali przejściowych, które wykorzystują sprzęt zwykle dostępny w laboratoriach biochemicznych. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy protokół umożliwiający szybkie ilościowe określenie ilości zanieczyszczeń metalami w próbkach przygotowanych przy użyciu IMAC jako etapu oczyszczania. W metodzie wykorzystuje się błękit hydroksynaftolowy (HNB) jako wskaźnik kolorymetryczny zawartości kationów metali w roztworze próbki oraz spektroskopię UV-Vis jako sposób do ilościowego określenia ilości obecnego metalu w zakresie nanomolowym na podstawie zmiany widma HNB przy 647 nm. Podczas gdy zawartość metalu w roztworze była historycznie określana za pomocą atomowej spektroskopii absorpcyjnej lub technik plazmy sprzężonej indukcyjnie, metody te wymagają specjalistycznego sprzętu i szkolenia wykraczającego poza zakres typowego laboratorium biochemicznego. Proponowana tutaj metoda zapewnia biochemikom prosty i szybki sposób określania zawartości metalu w próbkach przy użyciu istniejącego sprzętu i wiedzy bez poświęcania dokładności.

Widmo wolnego HNB przy obojętnym pH (linia czarna) oraz reprezentatywne widma frakcji analizowanych pod kątem Ni2+ z izolacji MSP1E3D129 przedstawiono na Ryc. 2. Prawidłowo przeprowadzona seria analiz powinna wykazać spadek absorbancji przy 647 nm w porównaniu z kontrolą HNB, co odpowiada tworzeniu się kompleksów HNB w obecności metalu przejściowego. Błędny wynik analizy objawiałby się wzrostem absorbancji przy 647 nm. Z kolei spadek absorbancji przy 647 nm...

Prezentujemy test do łatwej kwantyfikacji metali wprowadzonych do próbek przygotowanych za pomocą chromatografii powinowactwa do metali unieruchomionych. Metoda wykorzystuje błękit hydroksynaftolowy jako kolorymetryczny wskaźnik metalu i spektrofotometr UV-Vis jako detektor.

Kwantyfikacja wymywania metali w chromatografii powinowactwa do unieruchomionych metali

Contamination of enzymes with metals leached from immobilized metal affinity chromatography (IMAC) columns poses a major concern for enzymologists, as ...

Nasza metoda jest znacząca, ponieważ pozwala przeciętnemu biochemikowi szybko określić, czy próbki wyizolowane za pomocą chromatografii powinowactwa do unieruchomionych metali są zanieczyszczone metalami przejściowymi. Główną zaletą jest łatwość, z jaką można przeprowadzić test. Test wykorzystuje oprzyrządowanie i techniki typowe dla większości laboratoriów biochemicznych i można go łatwo i szybko wdrożyć.Chociaż w tym artykule stosujemy tę metodę do próbek wyizolowanych za pomocą kolumny niklowo-NTA, metodę tę można zastosować do każdej innej żywicy o powinowactwie do metalu. Początkujący użytkownicy powinni wypróbować tę metodę z roztworem podstawowym niklu o znanym stężeniu. Pozwoli to zapoznać ich z przepływem pracy, przykładowymi kolorami i żywicami pokazanymi w zmianach spektralnych.Procedurę zademonstruje Cole Swain, technik z mojego laboratorium. Aby rozpocząć, włącz i rozgrzej spektrofotometr UV-Vis. Oznaczyć frakcje chromatograficzne do oznaczenia za pomocą spektrofotometru UV-Vis z matrycą diodową o absorbancji optycznej przy 280 nanometrach w celu ilościowego określenia białka.Uzyskać bufor próbki o objętości od 10 do 100 milimolów o pH od 7 do 12, taki jak Tris, HEPES, MOPS i bufor fosforanowy. Przygotować 12% wagowo objętościowy roztwór dyspersji HNB w buforze próbki, używając 120 miligramów odczynnika HNB na każdy mililitr przygotowanego roztworu podstawowego. Ustaw spektrofotometr tak, aby zbierał dane o długości 647 nanometrów.Użyj kuwety kwarcowej wypełnionej buforem próbki, aby wygasić spektrofotometr. Przygotować roztwór kontrolny w kuwecie zawierającej 50 mikrolitrów wywaru HNB na mililitr całkowitej objętości testu. Pozostawić kontrolę do inkubacji przez co najmniej trzy minuty w temperaturze pokojowej.Zmierzyć i zapisać absorbancję przy 647 nanometrach dla próbki kontrolnej. Przygotować próbki do oznaczania, mieszając 150 mikrolitrów surowca HNB z 2850 mikrolitrami odpowiednio rozcieńczonych frakcji białkowych z buforem próbki. Pozostawić próbkę do inkubacji przez co najmniej trzy minuty w temperaturze pokojowej.Powtórz zapis widma dla każdej mierzonej frakcji. W przypadku, gdy uzyskuje się niewystarczające rozcieńczenie, całe pasmo widmowe przy 647 nanometrach znika. Przy zbyt silnym rozcieńczeniu próbka jest nie do odróżnienia od kontroli.Aby określić stężenie metalu w każdej próbce, najpierw znajdź różnicę absorbancji każdej próbki w odległości 647 nanometrów od kontroli HNB. Określić stężenie metalu w mikromolach za pomocą wzoru, gdzie DF jest współczynnikiem rozcieńczenia dla frakcji testowej, delta ABS 647 to zmiana absorbancji przy 647 nanometrach, 3,65 razy 10 do minus 2 oznacza współczynnik ekstynkcji HNB, a l to ścieżka optyczna kuwety w centymetrach. W niniejszej pracy przedstawiono widmo wolnego HNB przy neutralnym pH w reprezentatywnych widmach frakcji oznaczanych dla jonów niklu z izolacji MSP1E3D1.Zaobserwowano zmniejszoną absorbancję przy 647 nanometrach w porównaniu z kontrolą HNB, co odpowiadało tworzeniu się kompleksów HNB w obecności metalu przejściowego. Aby zademonstrować zastosowanie tego testu, przeanalizowano dwa znakowane przez niego białka rusztowania błonowego, MSP1E3D1, MSP2N2 i nowy, trójhemowy, cytochromowy GSU0105 typu c z geobacter sulfurreducens. Zawartość białka i jonów niklu w każdej frakcji dla GSU0105 była znacznie przesunięta względem siebie, podczas gdy frakcje dla MSP1E3D1 i MSP2N2, które zawierały najwięcej białka, miały również najwyższą zawartość niklu.Wykazano również, że zawartość metalu może nie być równomiernie rozłożona między frakcjami zebranymi za pomocą mobilizowanej chromatografii powinowactwa do metali. Najważniejsze jest, aby odpowiednio i konsekwentnie mieszać ślepą próbę we wszystkich próbkach i zapewnić równe czasy inkubacji ślepej próby we wszystkich próbkach. Frakcje białkowe o szczególnym znaczeniu mogą być dalej analizowane za pomocą atomowej spektrometrii absorpcyjnej lub ICPMS w celu potwierdzenia zanieczyszczenia metalami i przetestowania chelatowanych lub silnie związanych jonów metali białkowych.Oprócz wykrywania wymywania metali przejściowych, technika ta może być stosowana do pomiaru powinowactwa wiązania jonów metali przejściowych do białek. HNB i nikiel obecny w próbkach działają drażniąco odpowiednio na oczy i skórę. Podczas metody należy używać standardowych środków ochrony indywidualnej, w tym rękawic i okularów ochronnych.

quantification-metal-leaching-immobilized-metal-affinity

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Ten film opisuje metodę analizy interakcji białko-ligand za pomocą elektroforezy kapilarnej z przesunięciem ruchliwości. Metoda ta może być stosowana do charakteryzowania zachowania wiązania białka z różnymi naładowanymi ligandami.

Elektroforeza kapilarna z przesunięciem ruchliwości i powinowactwa: metoda analizy interakcji próbka-ligand w zależności od zróżnicowanej migracji kompleksów białko-ligand

Integracja hodowli mikroalg z przemysłowymi gazami spalinowymi ostatecznie wprowadzi metale ciężkie i inne związki nieorganiczne do podłoża wzrostowego. W pracy przedstawiono procedurę zastosowaną do określenia końcowego losu i wpływu metali ciężkich i zanieczyszczeń nieorganicznych na wzrost Nannochloropsis salina hodowanych w fotobioreaktorach.

Kwantyfikacja metali ciężkich i innych zanieczyszczeń nieorganicznych na produktywność mikroglonów

Ze względu na znaczenie i szerokie zastosowanie palladu, złota i kobaltu w sprzęcie high-tech, ich odzysk i recykling stanowią ważne wyzwanie przemysłowe. Opisany w niniejszym dokumencie system odzysku metali jest prostym, tanim sposobem na skuteczne wykrywanie, usuwanie i odzysk tych metali z kopalni miejskiej.

Wykrywanie i odzyskiwanie palladu, złota i metali kobaltowych z kopalni miejskiej przy użyciu nowatorskich czujników/adsorbentów oznaczonych nanoskalowymi porami w kształcie koła wagonowego

Przedstawiono protokół produkcji mikrochipa do ekstrakcji do fazy stałej wspomaganego dipolem do analizy metali śladowych.

Wytwarzanie mikrochipa do ekstrakcji do fazy stałej wspomaganego dipolem do analizy metali śladowych w próbkach wody

Chromatografia wykluczania wielkości z łącznikiem plazmy sprzężonej indukcyjnie - spektrometria mas (ICP-MS) to potężne narzędzie do pomiaru zmian w obfitości metaloprotein bezpośrednio z próbek biologicznych. W tym miejscu opisujemy zestaw wzorców metaloprotein używanych do szacowania masy cząsteczkowej i ilości metalu związanego z nieznanymi białkami.

Standardy ilościowej analizy metaloproteomicznej z wykorzystaniem wykluczenia wielkości ICP-MS

Wymagana jest szczególna ostrożność przy użyciu "czystych technik" do prawidłowego pobierania i przetwarzania próbek wody do badań metali śladowych w środowisku wodnym. Przedstawiono protokół pobierania próbek, przetwarzania i procedur analitycznych w celu uzyskania wiarygodnych danych i wyników z monitoringu środowiskowego o wysokiej czułości dla szczegółowych badań metali śladowych.

Czyste pobieranie próbek i analiza wód rzecznych i ujść rzek do badań metali śladowych

Przedstawiono protokół równoległej produkcji wytrąconego węglanu wapnia i materiału zeolitowego z żużla wielkopiecowego poprzez karbonatyzację minerałów i alkaliczną konwersję hydrotermalną. Badana jest wydajność materiału zeolitowego w kierunku adsorpcji niklu.

Dwukierunkowa waloryzacja żużla wielkopiecowego: synteza wytrąconego węglanu wapnia i zeolitowego adsorbentu metali ciężkich

Przedstawiono protokół ekstrakcji białka opiekuńczego z peryplazmatycznego metalu przejściowego w kontekście jego natywnych partnerów wiążących, oraz biofizyczną charakterystykę zawartości jego substratu za pomocą fluorescencji rentgenowskiej i wychwytu radiometalu.

Niezbędny wychwyt metali przez bakterie Gram-ujemne: fluorescencja rentgenowska, radioizotopy i frakcjonowanie komórek

Tutaj prezentujemy protokół oczyszczania metodą chromatografii z immobilizowanym metalem metodą powinowactwa do metalu, a następnie odtworzenia oznaczonej polihistydyną, niehemowej dioksygenazy wiążącej żelazo, odpowiedniej dla laboratorium nauczania na studiach licencjackich.

Laboratoryjna chromatografia powinowactwa do immobilizowanych metali, rekonstytucja i oznaczanie metaloenzymu znakowanego polihistydyną dla laboratorium licencjackiego

Prezentowany protokół opisuje homogenizację próbki za pomocą laboratoryjnego miksera, trawienie kwasem próbek żywności przy użyciu mieszaniny 68% wagowych HNO3 i 30% wagowych H2O2 poprzez mikrofalowo wspomagane trawienie kwasem na mokro oraz oznaczanie wielopierwiastkowe wykonywane za pomocą spektrometrii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie.

Przygotowanie próbek żywności z wykorzystaniem homogenizacji i roztwarzania kwasowego na mokro wspomaganego mikrofalami w celu oznaczania wielu pierwiastków za pomocą ICP-MS

Poznaj metodę kwantyfikacji metali w próbkach z chromatografii powinowactwa do unieruchomionych metali przy użyciu hydroksynaftolu niebieskiego i spektrofotometrii UV-Vis. Technika umożliwia szybką ocenę zanieczyszczenia metalami przejściowymi.

Kwantyfikacja wymywania metali w chromatografii powinowactwa do unieruchomionych metali

Przeglądaj więcej filmów