Elektroforeza kapilarna z przesunięciem ruchliwości i powinowactwa: metoda analizy interakcji próbka-ligand w zależności od zróżnicowanej migracji kompleksów białko-ligand

Ligandy, takie jak jony metali, wiążą się niekowalencyjnie z określonym białkiem, tworząc kompleks jonowy białko-metal. To wiązanie zmienia ogólny ładunek białka, co pozwala na scharakteryzowanie tych kompleksów za pomocą elektroforezy kapilarnej o powinowactwie.

Na początek weź cienką, wstępnie kondycjonowaną szklaną kapilarnę z naładowanymi grupami silanolowymi na wewnętrznej powierzchni. Przepłukać kapilar roztworem EDTA. EDTA jest środkiem chelatującym, który usuwa wszelkie zanieczyszczenia jonami metali. Teraz hydrodynamicznie wstrzyknij roztwór próbki zawierający pożądane białko do kapilary z jej dodatniego końca lub anody.

Zastosuj wysokie napięcie, aby wytworzyć przepływ elektroosmotyczny, zmuszając białka w ich natywnej konformacji z nieodłącznymi ładunkami do przemieszczania się wewnątrz kapilary w kierunku katody. Rejestruj wzorzec migracji niezwiązanych białek z naczynia włosowatego.

Następnie wprowadź określony roztwór liganda do kapilary wraz z próbkami białek i zastosuj to samo napięcie. Wewnątrz kapilary cząsteczki liganda wiążą się niekowalencyjnie z białkiem docelowym, tworząc kompleksy.

Powoduje to zmianę konformacyjną w białkach, prowadząc do zmiany ich nieodłącznych ładunków i wpływając na stosunek ładunku do wielkości. Zmiany te modulują ich interakcje z naładowaną powierzchnią naczynia włosowatego, powodując ich odmienny przepływ w porównaniu z białkiem niezwiązanym.

Rejestruj te zmiany w ruchliwości elektroforetycznej, które korelują z siłą oddziaływania białko-ligand

Po przygotowaniu metody do pomiarów bez ligandów, należy przygotować metodę pomiarów z użyciem ligandów, najpierw używając 0,1 molowego roztworu EDTA do płukania kapilary pod ciśnieniem 2,5 bara przez 1 minutę. Następnie użyj wody dejonizowanej do przepłukania kapilary. Następnie wyrównaj kapilatę za pomocą roztworu liganda, aby przepłukać ją pod ciśnieniem 2,5 bara przez 1,5 minuty.

Następnie wstrzyknąć roztwór acetanilidu pod ciśnieniem 0,05 bara przez 6 sekund i zmienić fiolki wlotowe i wylotowe na fiolki z buforem zawierającym ligand. Nakładaj 0,05 bara przez 2,4 sekundy, aby wepchnąć roztwór acetanilidu głębiej od końcówki naczynia włosowatego. Zastosuj 10,0 kilowoltów przez 6 minut i wykryj pik acetanilidu na długości fali 200 nanometrów.

Po przepłukaniu kapilary EDTA, wodą dejonizowaną i roztworem liganda jak poprzednio, wstrzyknąć próbkę białka i zmienić fiolki wlotowe i wylotowe na świeże fiolki buforowe zawierające ligand. Ostatecznie powtórz wykonywanie pomiarów z ligandami i bez.