Name: Standardy ilościowej analizy metaloproteomicznej z wykorzystaniem wykluczenia wielkości ICP-MS (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Poznaj metodę ilościowej analizy metaloprotein z wykorzystaniem chromatografii wykluczenia wielkościowego sprzężonej z ICP-MS. Technika ta pozwala mierzyć zawartość metali w białkach w ich stanie natywnym, dostarczając cennych informacji o roli metali w procesach biologicznych i chorobach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Chcielibyśmy podziękować za wsparcie ze strony Programu Wsparcia Infrastruktury Operacyjnej Rządu Wiktorii, Schematu Projektów Linkage Australijskiej Rady ds. Badań Naukowych (z Agilent Technologies), Australijskiej Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych, Wiktoriańskiego Banku Mózgów, Cooperative Research Centre for Mental Health oraz ośrodka Neuroproteomiki.

1. Przygotowanie i próbek
<ol>
	<li>Przygotować 500 ml buforu o stężeniu 200 mM azotanu amonu o pH 7,6 - 7,8 (pH skorygowane wodorotlenkiem amonu (NH4OH)) z dodatkiem cezu (Cs) i antynomii (Sb) do końcowego stężenia 10 ppb. Cez i antynomia powinny być stosowane jako wzorce wewnętrzne do monitorowania wszelkich odchyleń w odpowiedzi ICP-MS. Przed użyciem przefiltrować bufor przez filtr 0,22 μm.</li>
	<li>Przygotować próbkę w zależności od rodzaju próbki: ciecz, hodowla tkankowa lub komórkowa.
	<ol>
		<li>W przypadku próbek, które wymagają homogenizacji (np. tkanek lub komórek), upewnij się, że nie zawierają detergentu. Do przygotowania próbki należy użyć Tris. Alternatywnie należy stosować fosforanowe, ale mogą one negatywnie wpływać na metaloproteom z czasem lub przy cyklach zamrażania i rozmrażania12.</li>
		<li>Homogenizować próbki tkanek lub kultur komórkowych przez ręczne odbijanie lub sonikację przez 5 minut przy użyciu buforowanej soli fizjologicznej Tris (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM chlorek sodu (NaCl) + inhibitory proteazy wolne od kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA)).</li>
		<li>Klarować homogenaty przez odwirowanie przy 16 000 x g przez 5 min. Zebrać otrzymany supernatant. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C. 
		Uwaga: Wszystkie próbki muszą zostać odwirowane przed załadowaniem do fiolek do wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), aby zapobiec blokowaniu kolumny chromatografii wykluczającej wielkość (SEC) przez cząstki stałe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znormalizuj całkowitą ilość białka załadowanego na kolumnę w próbkach. Oznaczyć stężenia białek przy długości fali 280 nm za pomocą spektrofotometru UV do pomiaru mikroobjętości13. Załaduj od 20 do 150 μg białka. Stosować typowe objętości iniekcji w zakresie od 2 do 80 μl, w zależności od stężenia próbki.
	<ol>
		<li>Przed załadowaniem próbki wyczyść ramię spektrofotometru UV o mikroobjętości wodą destylowaną. Ramię próbki to miejsce, w którym ładowane są próbki białka.</li>
		<li>Przeprowadzić ślepą próbę przyrządu w stosunku do 2 μl buforu do próbki. Następnie załadować 2 μl każdej próbki na ramię i zmierzyć absorbancję przy 280 nm.</li>
		<li>Określić stężenia. W przypadku próbek białka surowego należy zastosować współczynnik ekstynkcji wynoszący 1 Abs = 1 mg/ml. Aby określić stężenie białka w próbkach, należy zastosować prawo Beera-Lamberta, A = ε x l x c, gdzie A to absorbancja, ε to współczynnik ekstynkcji, l to długość drogi w centymetrach, a c to stężenie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Masowa analiza wzorców metaloprotein przy użyciu plazmy sprzężonej indukcyjnie - spektrometria mas
<ol>
	<li>Rozgrzej i nastroić instrument zgodnie z protokołami producenta.</li>
	<li>Po rozgrzaniu i dostrojeniu instrumentu wykonaj masowy ICP-MS. 
	Uwaga: Roztwory podstawowe oczyszczonych metaloprotein na ogół muszą być rozcieńczone przed pomiarem. Stężenie metalu w wzorcu można oszacować na podstawie znanych stochiometrii białko-metal i szacowanego stężenia białka. Informacje te można wykorzystać do określenia rozcieńczenia, które będzie odpowiednie, aby mieścić się w zakresie wygenerowanej krzywej wzorcowej.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć wzorce metaloprotein, tyreoglobulinę, ferrytynę, ceruloplazminę, Cu/Zn SOD i witaminę B12, aby upewnić się, że mieszczą się w zakresie 0 - 500 μg/L, stosując 1% kwas azotowy. Aby osiągnąć normy w tym zakresie, nie należy stosować rozcieńczeń przekraczających 1 do 20. W razie potrzeby należy wykonać seryjne rozcieńczenia w wodzie, aby rozcieńczyć zapasy.</li>
		<li>Ustal kolejność wstrzyknięć. Najpierw przeanalizuj siedem poziomów kalibracji, stężenia w zakresie od 0 do 500 μg/L, a następnie wzorce metaloproteinowe. Siedem poziomów kalibracji to 0, 1, 5, 10, 50, 100 i 500 μg/l.</li>
		<li>Wybierz interesujące Cię elementy. Tutaj użyj Fe, Cu, Zn, Co i I, ponieważ są to pierwiastki, z którymi związane są wzorce białkowe. Wybierz pierwiastki w metodzie akwizycji, otwierając zakładkę selektora elementów i dodając pierwiastki oraz odpowiadające im masy izotopowe, które mają być analizowane.</li>
		<li>Wykonaj analizę próbki za pomocą urządzenia, a oprogramowanie przyrządu automatycznie utworzy krzywe kalibracyjne dla każdego z analizowanych elementów. Krzywe kalibracyjne są tworzone przez oprogramowanie poprzez wykreślenie liczb/s wykrytego metalu w stosunku do ilości metalu, którą wzorzec ma zawierać, w μg/L. Użyj krzywych kalibracyjnych, aby określić stężenie metalu w nieznanych próbkach. 
		Uwaga: Za pomocą krzywej kalibracyjnej oprogramowanie określa stężenie metalu w każdym ze wzorców metaloproteiny.</li>
		<li>Na podstawie wyników analizy masowej wygeneruj wzorce metaloprotein, które obejmują trzy najobficiej występujące pierwiastki śladowe w tkankach ssaków, używając mieszaniny Cu, dysmutazy ponadtlenkowej Zn (SOD) rozcieńczonej do 200 μg/l miedzi i oraz ferrytyny (FTN) przy końcowym stężeniu 2,000 μg/l żelaza.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Konfiguracja systemu HPLC i wykluczenie rozmiaru Równoważenie kolumny chromatograficznej 
Uwaga: Ta sekcja powinna być wykonywana równolegle z poprzednią, ponieważ obie wymagały około 1 - 1,5 godziny na ukończenie.
<ol>
	<li>Przepłukać pompy HPLC buforem wykonanym w kroku 1.1 i przepłukać pompy przez 5 minut przy natężeniu przepływu 5 ml/min.</li>
	<li>Po oczyszczeniu systemu ustaw natężenie przepływu na 0,1 ml/min i podłącz kolumnę wykluczającą rozmiar (4,6 x 300 mm, 3 μm, 150 A). 
	Uwaga: Mokre połączenie między rurką a kolumną zapobiega uwięzieniu pęcherzyków powietrza podczas podłączania kolumny.</li>
	<li>Podłącz przeciwległy koniec kolumny do zestawu detektora UV, aby zmierzyć absorbancję przy 280 nm za pomocą rurki PEEK.</li>
	<li>Stopniowo zwiększaj natężenie przepływu kolumny w krokach co 0,05 - 0,1 ml/min, aż do osiągnięcia końcowego natężenia przepływu 0,4 ml/min. W tym czasie sprawdź połączenia przewodów z kolumną pod kątem wycieków. Monitoruj ciśnienie w systemie, aby upewnić się, że nie przekracza ono wymagań kolumny, obserwując ślad ciśnienia na chromatogramie w oprogramowaniu.</li>
	<li>Pozostaw kolumnę do zrównoważenia przy wymaganym natężeniu przepływu przez 5 - 10 objętości kolumny. Po zrównoważeniu podłącz przyrządy, aby umożliwić analizę próbki.</li>
	<li>Ustawić metodę HPLC tak, aby pompować bufor A nad kolumną z prędkością 0,4 ml/min przez 15 minut.</li>
</ol>
4. Konfiguracja i uruchamianie Wykluczenie rozmiaru - Plazma sprzężona indukcyjnie - Spektrometria mas 
Uwaga: Procedury operacyjne mogą się różnić w zależności od przyrządu i modelu. Skontaktuj się ze specjalistą technicznym urządzenia, aby dowiedzieć się więcej o tym, jak skonfigurować używany ICP-MS.
<ol>
	<li>Przełącz ICP - MS w tryb czuwania przed zmianą ustawień sprzętowych.
	<ol>
		<li>W trybie czuwania wyłącz komunikację dla automatycznego samplera i zmień wprowadzenie próbki na "inne". 
		Uwaga: W zależności od konfiguracji oprogramowania i sprzętu można użyć opcji "HPLC" jako przykładowego źródła wprowadzenia. Skontaktuj się ze specjalistą technicznym ds. instrumentu, aby dowiedzieć się, czy ta opcja jest dostępna.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj rurki PEEK (średnica wewnętrzna 0,13 mm), aby podłączyć odpływ z detektora UV bezpośrednio do nebulizatora na ICP-MS.</li>
	<li>Włącz ponownie ICP - MS i pozwól instrumentowi się rozgrzać przez 10 - 20 minut.</li>
	<li>Po zapaleniu się plazmy podłącz zdalny od ICP - MS do tylnej części automatycznego podajnika próbek HPLC. Zrób to, gdy plazma się zapali; w przeciwnym razie system HPLC zostanie automatycznie wyłączony, ponieważ ICP - MS nie jest włączony.</li>
	<li>Zmień metodę ICP-MS w celu zbierania danych dla LC-ICP-MS.
	<ol>
		<li>Zmień metodę akwizycji z widma na akwizycję rozdzielczości czasowej (TRA).</li>
		<li>Wybierz pierwiastki do analizy, Fe, Cu, Zn, Co, I, a także wszelkie inne interesujące Cię elementy, i ustaw czasy całkowania (zwykle od 0,05 do 0,3 sekundy). Po wybraniu interesujących elementów należy dostosować czas akwizycji do czasu trwania chromatografii (np. 900 sekund dla 15-minutowego przebiegu chromatografii).</li>
		<li>Ręcznie dostrój ICP - MS pod kątem czułości i szybkości przepływu helu (He) w komórce zderzeniowej z przepływem bufora chromatograficznego przy użyciu Cs i Sb zawartych w buforze. Natężenia przepływu He są zwykle o ~ 1 ml / min mniejsze niż te stosowane do analizy masowej. Gdy liczba jonów metalu ustabilizuje się, a wartości względnego odchylenia standardowego (RSD) spadną poniżej 5%, system jest gotowy do użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Twórz przykładowe listy przebiegów zarówno w programach HPLC, jak i ICP-MS. Przykładowa lista przebiegów zawiera kolejność, w jakiej każda z próbek ma zostać wstrzyknięta, a także nazwę, pod którą dane zostaną zapisane. Sprawdź, czy łączna liczba próbek na liście jest zgodna między tymi dwoma programami.</li>
	<li>Rozpocznij partię próbki dla ICP-MS przed HPLC, ponieważ wstrzyknięcie próbki przez HPLC spowoduje, że ICP - MS rozpocznie zbieranie danych. Jeśli nie zostanie to zrobione we właściwej kolejności, spowoduje to brakujące dane.</li>
	<li>Generowanie punktów krzywej kalibracyjnej poprzez wstrzykiwanie różnych objętości mieszanego wzorca SOD i FTN od 200 μg/L do 6 000 μg/L wstrzykiwanego na kolumnę dla Cu i Zn oraz 2 000 μg/L do 60 000 μg/L dla Fe. Objętości wtrysku wahają się od 1 do 30 μl. 
	Uwaga: Te zakresy stężeń obejmują stężenia Fe, Cu i Zn zwykle obserwowane w złożonych homogenatach. W przypadku próbek, które zawierają tylko oczyszczone białka, maksymalny zakres krzywej powinien być odpowiednio dostosowany. Ponieważ ilość metalu związanego z białkiem może wymagać mniejszego lub większego zakresu, ponieważ w próbce jest mniej zanieczyszczeń spowodowanych innymi czynnikami.</li>
	<li>Przeanalizuj każdą z nieznanych próbek tkanki, osocza lub hodowli komórkowej.</li>
</ol>
5. Analiza, manipulacja i wizualizacja danych
<ol>
	<li>Zapisz dane w formacie pliku z wartościami rozdzielanymi przecinkami (csv) i załaduj je do programów przetwarzania zgodnie z wymaganiami.</li>
	<li>Aby kontrolować dryft instrumentu, podziel liczbę na sekundę dla każdego elementu przez liczbę na sekundę dla Cs lub Sb.</li>
	<li>Wygeneruj krzywe kalibracyjne dla każdego z elementów.
	<ol>
		<li>Określ obszar pod pikiem metalu, który odpowiada metaloproteinie, z którą jest związany dla każdego z wstrzyknięć, wykonując integrację piku w preferowanym oprogramowaniu do analizy danych.</li>
		<li>Wykreślić obszar pod pikiem metalu w stosunku do całkowitej ilości metalu, który został wstrzyknięty do kolumny w każdym przebiegu, 200 - 6 000 μg/L dla Cu i Zn i 2 000 - 60 000 μg/L dla Fe. Wykonaj analizę regresji liniowej zgodnie z protokołem oprogramowania.</li>
		<li>Użyj wyników nachylenia z analizy regresji liniowej jako czynnika do przeliczenia liczb na sekundę na pg/s. Podziel każdy z punktów danych zliczeń na sekundę na chromatogramie przez gradient wartości linii.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykres danych w pg/s w stosunku do czasu chromatogramu. Określ obszar pod szczytami zainteresowania. Obszar pod pikiem reprezentuje całkowitą ilość metalu, z którą białko jest związane, w pg.</li>
	<li>Wygeneruj kalibrację na podstawie masy cząsteczkowej znanych metaloprotein i czasu, w którym eluują. Użyj tego, aby oszacować wielkość pików białka w złożonych próbkach.</li>
</ol>

<ol><li>Holm, R. H., Kennepohl, P., Solomon, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+Functional+Aspects+of+Metal+Sites+in+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Structural and Functional Aspects of Metal Sites in Biology.</a> Chem Rev. 96, 2239-2314 (1996).</li>
<li>Andreini, C., Bertini, I., Cavallaro, G., Holliday, G., Thornton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+ions+in+biological+catalysis%3A+from+enzyme+databases+to+general+principles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Inorg+Chem%22%5BJournal%5D)">Metal ions in biological catalysis: from enzyme databases to general principles.</a> J Biol Inorg Chem. 13, 1205-1218 (2008).</li>
<li>Roberts, B. R., Ryan, T. M., Bush, A. I., Masters, C. L., Duce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+metallobiology+and+amyloid-beta+peptides+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of metallobiology and amyloid-beta peptides in Alzheimer's disease.</a> J Neurosci. 120 (Suppl 1), 149-166 (2012).</li>
<li>Roberts, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+Treatment+with+CuII+%28atsm%29+Increases+Mutant+SOD1+In+Vivo+but+Protects+Motor+Neurons+and+Improves+the+Phenotype+of+a+Transgenic+Mouse+Model+of+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Oral Treatment with CuII (atsm) Increases Mutant SOD1 In Vivo but Protects Motor Neurons and Improves the Phenotype of a Transgenic Mouse Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> J Neurosci. 34, 8021-8031 (2014).</li>
<li>Hare, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+plasma+iron+in+Alzheimer%27s+disease+is+due+to+transferrin+desaturation%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+CHEM+NEUROSCI%22%5BJournal%5D)">Decreased plasma iron in Alzheimer's disease is due to transferrin desaturation.</a> ACS CHEM NEUROSCI. , (2015).</li>
<li>Cvetkovic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+metalloproteomes+are+largely+uncharacterized%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microbial metalloproteomes are largely uncharacterized.</a> Nature. 466, 779-782 (2010).</li>
<li>Barnett, J., Scanlan, D., Blindauer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+fractionation+and+detection+for+metalloproteomics%3A+challenges+and+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein fractionation and detection for metalloproteomics: challenges and approaches.</a> Anal Bioanal Chem. 402, 3311-3322 (2012).</li>
<li>Fernandez Sanchez, L., Szpunar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speciation+analysis+for+iodine+in+milk+by+size-exclusion+chromatography+with+inductively+coupled+plasma+mass+spectrometric+detection%28SEC-ICP+MS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anal.+At.+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Speciation analysis for iodine in milk by size-exclusion chromatography with inductively coupled plasma mass spectrometric detection(SEC-ICP MS).</a> J. Anal. At. Spectrom. 14, 1697-1702 (1999).</li>
<li>Manley, S., Byrns, S., Lyon, A., Brown, P., Gailer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Cu-%2C+Fe-%2C+and+Zn-specific+detection+of+metalloproteins+contained+in+rabbit+plasma+by+size-exclusion+chromatography-inductively+coupled+plasma+atomic+emission+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Inorg+Chem%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Cu-, Fe-, and Zn-specific detection of metalloproteins contained in rabbit plasma by size-exclusion chromatography-inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy.</a> J Biol Inorg Chem. 14, 61-74 (2009).</li>
<li>Richarz, A. N., Brätter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speciation+analysis+of+trace+elements+in+the+brains+of+individuals+with+Alzheimer%27s+disease+with+special+emphasis+on+metallothioneins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Speciation analysis of trace elements in the brains of individuals with Alzheimer's disease with special emphasis on metallothioneins.</a> Anal Bioanal Chem. 372, 412-417 (2002).</li>
<li>Hare, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+the+iron%2C+copper+and+zinc+content+in+primary+neuron+and+astrocyte+cultures+by+rapid+online+quantitative+size+exclusion+chromatography-inductively+coupled+plasma-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Metallomics%22%5BJournal%5D)">Profiling the iron, copper and zinc content in primary neuron and astrocyte cultures by rapid online quantitative size exclusion chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry.</a> Metallomics. 5, 1656-1662 (2013).</li>
<li>Balkhi, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Plasma+Copper+Proteins+Speciation+by+Size+Exclusion+Chromatography+Coupled+to+Inductively+Coupled+Plasma+Mass+Spectrometry.+Solutions+for+Columns+Calibration+by+Sulfur+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Human Plasma Copper Proteins Speciation by Size Exclusion Chromatography Coupled to Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry. Solutions for Columns Calibration by Sulfur Detection.</a> Anal Chem. 82, 6904-6910 (2010).</li>
<li>Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvolume+Protein+Concentration+Determination+using+the+NanoDrop+2000c+Spectrophotometer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer.</a> J Vis Exp. , e1610(2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Zapewnienie natywnego stanu białka oznacza konieczność zwrócenia szczególnej uwagi na stosowane i przechowywanie próbki. Nie wszystkie techniki chromatografii lub techniki przygotowania próbek mogą być stosowane. Ważne jest, aby stosowane podczas przygotowywania próbek i chromatografii były pozbawione chelatorów metali i wykorzystywały, które naśladują fizjologiczne pH i stężenia soli. Inne warunki, których należy unikać, obejmują podgrzewanie próbki lub dodawanie denaturantów białkowych (np. mocznika). Bardzo ważne jest, aby zminimalizować liczbę cykli zamrażania i rozmrażania. Zdolność wybranego buforu do wiązania metali dwuwartościowych jest również ważna i jest powodem, dla którego wybiera się Tris lub azotanu amonu zamiast na bazie fosforanów.
Niska rozdzielczość i szczytowa zdolność chromatografii wykluczającej wielkość w porównaniu z innymi formami chromatografii jest głównym ograniczeniem tej techniki. Jednak łagodny charakter chromatografii wykluczającej wielkość jest ważny dla utrzymania natywnego stanu białka, a tym samym zachowania stosunkowo słabych wiązań metal-białko. Wymóg utrzymania stanu natywnego białek wymaga zwrócenia szczególnej uwagi na obróbkę próbek, w tym ograniczenie liczby cykli zamrażania i rozmrażania, unikanie chelatorów metali (np. EDTA) lub soli chaotropowych i detergentów.
Ta niska rozdzielczość tej techniki wpływa na zdolność do ilościowego określenia ilości metalu związanego z określonym białkiem, jeśli znajduje się ono w złożonej próbce, ponieważ obserwowane piki będą zawierać więcej niż jedno białko. W związku z tym ilość metalu określona za pomocą integracji pików byłaby wskaźnikiem całkowitej ilości metalu związanego ze wszystkimi białkami eluującymi w tym punkcie czasowym, a nie tylko z jednym konkretnym białkiem. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, białko będące przedmiotem zainteresowania musiałoby zostać dodatkowo oczyszczone w warunkach rodzimych. Pozwoliłoby to na ilościowe określenie metalu związanego z tym białkiem z większą pewnością. Innym potencjalnym ograniczeniem tej techniki byłaby utrata białka z powodu nieodwracalnego wiązania z kolumną. W celu ustalenia, czy tak się dzieje, należy przeprowadzić eksperyment odzysku, w którym analizuje się ilość białka uwalniającego się z kolumny w celu określenia, czy odpowiada ona ilości wstrzykniętej. To samo można zrobić, mierząc zawartość metalu w materiale elucyjnym i materiale wyjściowym za pomocą ICP-MS luzem. Odzysk kolumny może się różnić w zależności od zastosowanych warunków, ale wykazano, że możliwe jest całkowite odzyskanie białek z kolumny wykluczającej wielkość9. Dlatego ważne jest, aby sprawdzić, czy w użytkowanych warunkach pracy nie występują żadne straty.
Modyfikacje protokołu mogą być związane z stosowanymi wzorcami metaloprotein, a także analizowanymi pierwiastkami. Rodzaj zastosowanego wzorca metaloproteiny będzie się różnił w zależności od interesujących pierwiastków. Do pierwiastków takich jak białka Cu, Fe i Zn stosuje się SOD i ferrytynę. Można również użyć każdej innej metaloproteiny, która ma znane stoichometry, a kilka przykładów pokazano tutaj.
Jedną z głównych komplikacji, które mogą wyniknąć z zastosowania tej techniki, jest gromadzenie się kryształów soli w palniku ICP-MS. Aby zapobiec gromadzeniu się kryształków soli, pochodnia jest myta wodą destylowaną po każdych 500 - 1 000 ml buforu, który przeszedł przez system lub gdy na podstawie oględzin stwierdzono, że pochodnia powinna zostać umyta. Innym problemem, który może się pojawić, jest szybszy spadek czystości próbki i stożków ekstrakcyjnych. Należy je regularnie czyścić zgodnie z protokołami producenta.
Wstępne przygotowanie próbki jest najbardziej krytycznym krokiem w protokole. Jeśli wystąpią jakiekolwiek zmiany w kompleksie białko - metal, wygenerowane informacje nie będą ważne. Jest to jedno z głównych ograniczeń tej techniki; Ponadto użycie kolumny o niskiej rozdzielczości i wykluczeniu rozmiaru daje ograniczony szczegółowy obraz prawdziwej złożoności metaloprotein w biologii.
Opisana tu technika pozwala na poszerzenie wiedzy na temat metaloproteomu organizmu. Analiza masowa daje jedynie przybliżone wskazanie zmian ilości metalu w próbce. Oprócz ogólnych rozważań, które należy wziąć pod uwagę, technika ta zapewnia narzędzie, które można wykorzystać do ilościowego określenia ilości metalu związanego z białkami, a także do identyfikacji metaloprotein, które różnią się od siebie, porównując uzyskane ślady. Zastosowanie tej techniki może być wykorzystane do identyfikacji różnic między stanami chorobowymi. Zidentyfikowane metaloproteiny mogą być następnie dalej badane, aby pomóc w określeniu roli, jaką odgrywają w procesach chorobowych. Zastosowanie ICP-MS z łącznikiem ma coraz większą przyszłość w celu określenia roli leków, które mają heteroatom, takich jak platyna, jod lub miedź, ponieważ ICP-MS można wykorzystać do identyfikacji białek, które wiąże lek.

Niezbędne metale odgrywają istotną rolę w normalnych funkcjach biologicznych, w tym drugorzędnych szlakach przekaźnikowych, szlakach metabolicznych i funkcjach organelli. Uważa się, że 30% wszystkich białek to metaloproteiny1, a 50% wszystkie enzymy2. Metaloenzymy wykorzystują te metale śladowe jako kofaktory do katalizowania reakcji chemicznych, stabilizacji struktury białek oraz do ról regulacyjnych, takich jak wtórni przekaźniki. Niektóre z najlepiej przebadanych pierwiastków śladowych w odniesieniu do neurodegeneracji to miedź, żelazo i3. Uważa się, że są one zaangażowane w wiele szlaków chorobowych, w których dyshomeostaza może mieć niekorzystne skutki. Na przykład status metaliczny dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) bezpośrednio wpływa na długość życia i fenotyp transgenicznych modeli myszy rodzinnych typu stwardnienia zanikowego bocznego (ALS)4. W chorobie Alzheimera techniki metaloproteomiczne zostały wykorzystane do odkrycia spadku statusu metalicznego transferyny w osoczu5. Badania te podkreślają ważną rolę, jaką metaloproteiny mogą odgrywać w chorobach.
Badanie metaloprotein bezpośrednio z tkanek biologicznych to rozwijająca się dziedzina. Chociaż niektóre metaloenzymy zostały scharakteryzowane, większość nadal pozostaje niescharakteryzowana lub nieznana6. Jednym z głównych wyzwań w pomiarze metaloprotein jest wymóg utrzymania natywnego stanu białka7. Klasyczne techniki proteomiczne typu bottom-up polegają na trawieniu białek do peptydów. Proces ten zaburza niekowalencyjne oddziaływanie metali i ich białek. W ten sposób nie uzyskuje się żadnych informacji o statusie metalicznym białka.
Jednym ze sposobów na pokonanie tego problemu jest użycie chromatografii wykluczania wielkości w połączeniu z plazmą sprzężoną indukcyjnie - spektrometriamas 8,9 (SEC-ICP-MS). W ten sposób generowane są informacje o przybliżonej wielkości białka, a także o wszelkich metalach, które są z nim związane10. Co więcej, wykluczenie wielkości jest delikatną techniką chromatograficzną, która może zachować natywny stan enzymu lub kompleksu białko-białko. Jedną z zalet stosowania plazmy sprzężonej indukcyjnie - spektrometrii mas (ICP-MS) jest ilościowy charakter tej technologii. Korzystając z zestawu wzorców metaloprotein, możliwe jest zapewnienie bezwzględnej kwantyfikacji metaloprotein z próbek biologicznych9,11. Osiąga się to poprzez wygenerowanie krzywej standardowej poprzez wstrzyknięcie znanych metaloprotein w zakresie stężeń metali.
Ten protokół pokazuje przykład, jak można to osiągnąć dla różnych standardów metaloprotein. W tym artykule staramy się stworzyć standardowe krzywe dla metali, które są w dużej mierze badane w dziedzinach biologicznych, w tym żelaza (Fe), miedzi (Cu), (Zn), jodu (I) i kobaltu (Co).

<table><tbody><tr><td>Pompa binarna Agilent 1290 Infinity</td><td>Agilent</td><td>G4220A</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny podajnik próbek Agilent 1290 Infinity</td><td>Agilent</td><td>G4226A</td><td></td></tr><tr><td>Termostat automatycznego podajnika próbek Agilent serii 1200</td><td>Agilent</td><td>G1330B</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 1290 Nieskończoność Termostatowana komora kolumny</td><td>Agilent</td><td>G1316C</td><td></td></tr><tr><td>Detektor zmiennej długości fali Agilent 1290 Infinity</td><td>Agilent</td><td>G1314E</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 7700 ICP-MS</td><td>Agilent</td><td>G3282A</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Wodorotlenek amonu na bazie metali śladowych&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>338818</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Azotan amonu&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>256064</td><td>Przygotuj świeży roztwór 200 mM w dniu eksperymentu</td></tr><tr><td>&nbsp; Antynomia&nbsp;</td><td>Wybór analityczny&nbsp;</td><td>10002-3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Ceruloplazmina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Cez&nbsp;</td><td>Wybór analityczny&nbsp;</td><td>100011-1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Kompletne inhibitory proteazy wolne od EDTA&nbsp; &nbsp;</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Konalbumina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C7786</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Concanavalin A z Canavalia ensiformis (fasola Jack)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>L7647</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Cu, Zn dysmutaza ponadtlenkowa&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9697</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Ferrytyna&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F4503</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Wieloelementowe wzorce kalibracyjne ICP-MS&nbsp;</td><td>AccuStandard</td><td></td><td>Wykonany do wymaganych stężeń w 1% kwasie azotowym</td></tr><tr><td>&nbsp; Spektrofotometr UV mikroobjętościowy&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 65% Kwas azotowy&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>100441</td><td>Rozcieńczony do 1% do użycia</td></tr><tr><td>&nbsp; Rurki Peek&nbsp; &nbsp;</td><td>Agilent</td><td>5042-6461</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Kolumna wykluczająca rozmiar BioSEC-3 Kolumna PLC., 4,6 x 300 mm, 3 &mu; m, 150 & Aring; &nbsp;</td><td>Agilent</td><td>5190-2508</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Chlorek sodu&nbsp;</td><td>Dostawa chemiczna</td><td>SA046</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Chlorowodorek tris&nbsp;</td><td>ICN Biomedicals inc.&nbsp;</td><td>Numer katalogowy 103130</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Tyreoglobulina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T9145</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Witamina B12&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>V2876</td><td></td></tr></tbody></table>

standardy ilościowej analizy metaloproteomicznej z wykorzystaniem wykluczenia wielkości icp-ms

Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS

Metale są niezbędne do funkcjonowania białek jako kofaktory katalizujące reakcje chemiczne. Zakłócenie homeostazy metali jest związane z wieloma chorobami, w tym chorobą Alzheimera i Parkinsona, ale dokładna rola, jaką odgrywają te metale, nie została jeszcze w pełni wyjaśniona. Identyfikacja metaloprotein napotyka na wiele wyzwań i trudności. W tym miejscu przedstawiamy podejście, które umożliwia ilościowe określenie metaloprotein w złożonych próbkach. Osiąga się to za pomocą chromatografii wykluczania wielkości sprzężonej ze spektrometrią mas plazmy sprzężonej indukcyjnie (SEC-ICP-MS). Korzystając z sześciu znanych metaloprotein, kolumnę wykluczającą wielkość można skalibrować, a odpowiednie pierwiastki śladowe (żelazo, miedź,, kobalt, jod) można wykorzystać do oceny ilościowej. Przedstawiono ślady SEC-ICP-MS ludzkiego mózgu i osocza. Zastosowanie tych wzorców metaloprotein zapewnia środki do ilościowego porównania obfitości metaloprotein między próbkami biologicznymi. Technika ta może pomóc rzucić światło na rolę metaloprotein w chorobach neurodegeneracyjnych, a także w innych chorobach, w których występuje brak równowagi pierwiastków śladowych.

Zastosowanie wzorców metaloprotein pozwala na kalibrację kolumny do chromatografii wykluczania rozmiarowego. Rysunek 1A przedstawia profil elucji dla wzorców: tyreoglobuliny, ferrytyny, ceruloplazminy, Cu/Zn SOD oraz witaminy B12 w zależności od związanych z nimi metali (Fe, Co, Cu, Zn i I). Rysunek 1B przedstawia krzywą kalibracyjną kolumny do wykluczania rozmiarowego w zależności od masy cząsteczkowej wzorców białkowych i czasu ich elucji, przedstawioną w formie objętości elucji (Ve) podzielonej przez objętość martwą kolumny (Vo). Białka wykorzystane do wygenerowania tej krzywej wzorcowej to konkawalina A, konalbumina, ceruloplazmina, ferrytyna, SOD i tyreoglobulina.
Rysunek 2A przedstawia elucję ferrytyny w zakresie od 2,000 do 60,000 pg Fe naniesionych na kolumnę, a Rysunek 2D to analiza regresji przeprowadzona z wykorzystaniem pola powierzchni piku. Rysunki 2B i 2C przedstawiają profile elucji dla Cu/Zn SOD w odniesieniu do Cu i Zn, natomiast 2E i 2F to analizy regresji wygenerowane na podstawie pól powierzchni pików. Wyniki analizy regresji są wykorzystywane do przeliczenia surowych danych z counts/sec na pg/sec, aby można było ilościowo określić zawartość metalu związanego z białkiem. Przeliczenie odbywa się poprzez podzielenie wartości counts/sec przez nachylenie regresji liniowej (np. 334,6 (counts/sec) x (sec/pg) dla miedzi).
Jak wspomniano, technika ta może być wykorzystywana do identyfikacji metaloprotein w złożonych próbkach biologicznych. Metodą tą poddano analizie ludzki mózg oraz osocze, a uzyskane wyniki przedstawiono odpowiednio na Rysunku 3 i 4. Próbki ludzkiego mózgu rozdzielone za pomocą SEC-ICP-MS pokazano na Rysunkach 3A-3C, z których każdy reprezentuje inny analizowany metal (Cu, Zn lub Fe). Rysunki 4A-4C przedstawiają chromatogramy otrzymane po poddaniu tej technice ludzkiego osocza. Złożoność i zawartość składników próbki wpływają na liczbę widocznych pików. Zgodnie z oczekiwaniami, w osoczu dominują kilka metaloprotein, w tym ceruloplazmina i transferyna.
<img alt="Chromatografia wykluczania z analizą metali; chromatogram i wykres logarytmicznej masy cząsteczkowej." src="/files/ftp_upload/53737/53737fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Kalibracja chromatografii wykluczania z masową spektrometrią plazmy sprzężonej indukcyjnie przy użyciu znanych metaloprotein. (A) Profil elucji dla standardów metaloprotein w zależności od ich odpowiednich metali. (B) Krzywa kalibracyjna masy cząsteczkowej dla standardów białkowych: tyroglobuliny (i), ferrytyny (ii), ceruloplazminy (iii), konalbuminy (iv), Cu/Zn SOD (v) oraz konkawalin A (vi). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53737/53737fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wyniki chromatografii; wykresy piku pierwiastków (A-C) i krzywe kalibracyjne (D-F); analiza pików." src="/files/ftp_upload/53737/53737fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Wykorzystanie ferrytyny i Cu/Zn SOD jako standardów metaloprotein do oznaczenia ilości Cu, Fe lub Zn związanych z metaloproteinami w złożonej próbce biologicznej. (A) Profil elucji dla ferrytyny w zakresie wtrysku od 2 000 do 60 000 µg/L żelaza. (B) i (C) Profil elucji dla Cu/Zn SOD w zakresie wtrysku odpowiednio od 200 do 6 000 µg/L miedzi i cynku. (D), (E) i (F) przedstawiają wyniki analizy regresji odpowiednio dla żelaza, miedzi i cynku. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53737/53737fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres chromatograficzny przedstawiający wzorce masy cząsteczkowej w porównaniu z ludzkim mózgiem dla Cu63, Fe56, Zn66." src="/files/ftp_upload/53737/53737fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Metaloproteom Cu, Fe i Zn ludzkiego mózgu. (A) Ślad miedzi (B) Ślad żelaza (C) Ślad cynku. Elucja wzorców białkowych dla każdego metalu jest przedstawiona czarnym śladem, a ich masa cząsteczkowa jest wskazana pod wykresem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53737/53737fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wyniki chromatografii filtracyjnej żelowej wykazujące rozdział białek w ludzkiej plazmie; wykresy A, B, C." src="/files/ftp_upload/53737/53737fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Metaloproteom Cu, Fe i Zn dla ludzkiej plazmy. (A) Profil miedzi (B) Profil żelaza (C) Profil cynku. Elucja wzorców białkowych dla każdego metalu jest przedstawiona czarną linią, a ich masa cząsteczkowa jest wskazana pod wykresem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53737/53737fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Chromatografia wykluczania wielkości z łącznikiem plazmy sprzężonej indukcyjnie - spektrometria mas (ICP-MS) to potężne narzędzie do pomiaru zmian w obfitości metaloprotein bezpośrednio z próbek biologicznych. W tym miejscu opisujemy zestaw wzorców metaloprotein używanych do szacowania masy cząsteczkowej i ilości metalu związanego z nieznanymi białkami.

Standardy ilościowej analizy metaloproteomicznej z wykorzystaniem wykluczenia wielkości ICP-MS

Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of ...

Ogólnym celem tej techniki jest umożliwienie ilościowego oznaczenia różnych metaloprotein w złożonych wzorcach w oparciu o wykorzystanie znanych standardów metaloprotein. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące roli metali w biologii. Na przykład: jak zmienia się status metaliczny białka w przebiegu choroby?Kluczową zaletą tej techniki jest możliwość pomiaru stanu metalicznego białka w jego naturalnym stanie. Technikę zaprezentuje Amber Lothian, doktorantka z mojego laboratorium. Na początek należy zhomogenizować tkankę lub próbki hodowli komórkowej poprzez ręczne rozdrabnianie lub sonikację przez pięć minut z użyciem soli buforowej Tris.Homogenaty należy sklarować poprzez wirowanie przy 16 000 ×g przez pięć minut. Po zebraniu otrzymanego supernatantu należy znormalizować całkowitą ilość białka, określając stężenia białek zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie należy rozgrzać i skalibrować spektrometr mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie, stosując protokoły producenta.Rozcień wzorce metaloprotein w 1% kwasie azotowym, aby uzyskać stężenia w zakresie od 0 do 500 µg/L. W celu przygotowania wzorców w tym zakresie nie stosuj rozcieńczeń przekraczających 1:20. Ustal kolejność wtrysków, zaczynając od analizy siedmiu poziomów kalibracyjnych.Stężenia od zera do 500 µg/L, a następnie wzorce metaloprotein. Siedem poziomów kalibracji to 0, 1, 5, 10, 50, 100 i 500 µg/L. Następnie należy wybrać interesujące elementy.W tym przypadku należy użyć żelaza, miedzi, cynku, kobaltu i jodu, ponieważ są to pierwiastki, do których przyłączone są standardy białkowe. Wybierz pierwiastki w metodzie akwizycji, otwierając kartę wyboru pierwiastków i dodając analizowane pierwiastki oraz odpowiadające im masy izotopowe.Następnie przeprowadź analizę próbek za pomocą urządzenia. Oprogramowanie urządzenia automatycznie tworzy krzywe kalibracyjne dla każdego z analizowanych pierwiastków. Wykorzystaj krzywe kalibracyjne do oznaczenia stężenia metalu w nieznanych próbkach.Na podstawie wyników analizy zbiorczej przygotuj standardy metaloprotein zawierające trzy najliczniejsze pierwiastki śladowe w tkankach ssaków, wykorzystując mieszankę miedzi, dysmutazy ponadtlenkowej cynkowej oraz ferrytyny. Przepłucz pompy wysokosprawnej szybkiej chromatografii cieczowej (HPLC) buforem azotanu amonu o stężeniu 200 mM przez pięć minut przy szybkości przepływu 5 ml/min. Po przepłukaniu układu ustaw szybkość przepływu na 0,1 ml/min.Następnie podłącz kolumnę do wykluczania. Połącz przeciwległy koniec kolumny z detektorem UV, ustawiając pomiar absorbancji na 280 nanometrów, używając odpowiedniego przewodu. Stopniowo zwiększaj szybkość przepływu przez kolumnę w przyrostach o 0,1 ml/min, aż do osiągnięcia końcowej szybkości przepływu 0,4 ml/min.W tym czasie należy sprawdzić szczelność połączeń przewodów z kolumną. Monitoruj ciśnienie w systemie, obserwując przebieg ciśnienia na chromatogramie w oprogramowaniu, aby upewnić się, że nie przekracza ono wymagań kolumny. Pozostaw kolumnę do wyrównania przy wymaganym przepływie przez okres od pięciu do 10 objętości kolumny.Po przeprowadzeniu równoważenia podłącz urządzenia, aby umożliwić analizę próbek. Skonfiguruj metodę HPLC tak, aby pompa tłoczyła bufor A przez kolumnę z prędkością 0,4 ml/min przez 15 minut. Przed zmianą ustawień sprzętowych przełącz ICPMS w tryb czuwania.Po przejściu w tryb czuwania wyłącz komunikację dla autoprobnika i zmień wprowadzanie próbek na opcję „other”. Użyj rurki PEEK, aby połączyć odpływ z detektora UV bezpośrednio z nebulizatorem w ICPMS. Włącz urządzenie ICPMS i pozwól instrumentowi rozgrzać się przez 10 do 20 minut.Po zapłonie plazmy podłącz kabel zdalny z ICPMS do tylnej części autosamplera HPLC. Należy to zrobić dopiero po zapłonie plazmy. W przeciwnym razie system HPLC automatycznie się wyłączy, ponieważ ICPMS nie jest włączony.Zmień metodę ICPMS w celu zbierania danych dla LC ICPMS, zmieniając najpierw metodę akwizycji ze spektrum na akwizycję rozdzielczą w czasie. Następnie wybierz pierwiastki do analizy: żelazo, miedź, cynk, kobalt, jod oraz wszelkie inne interesujące pierwiastki i ustaw czasy całkowania.Po wybraniu interesujących elementów należy dostosować czas akwizycji do czasu analizy chromatograficznej. Ręcznie zoptymalizować czułość ICPMS oraz szybkość przepływu helu w komorze kolizyjnej, przepuszczając bufor chromatograficzny zawierający cez i antymon. Gdy liczba zliczeń jonów metali ustabilizuje się, a wartości względnego odchylenia standardowego spadną poniżej pięciu procent, system jest gotowy do użycia.Utwórz listy przebiegów próbek w programach sterujących HPLC oraz ICPMS. Lista przebiegów próbek zawiera kolejność, w jakiej każda z próbek ma zostać wstrzyknięta, a także nazwę, pod którą zostaną zapisane dane.Upewnij się, że całkowita liczba próbek na liście jest zgodna w obu programach. Uruchom partię próbek dla ICPMS przed uruchomieniem HPLC, ponieważ wtrysk próbki przez HPLC wywoła rozpoczęcie zbierania danych przez ICPMS. Jeśli nie zostanie to wykonane w odpowiedniej kolejności, doprowadzi to do utraty danych.Wyznacz punkty krzywej kalibracyjnej, wstrzykując różne objętości mieszanego standardu dysmutazy ponadtlenkowej i ferrytyny. Objętości wstrzykiwania wynoszą od 1 µL do 30 µL. Na koniec przeanalizuj każdą z nieznanych próbek, takich jak tkanka, osocze lub hodowla komórkowa, a następnie przeanalizuj dane zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Przedstawiono elucję ferrytyny w zakresie od 2000 do 60 000 pikogramów żelaza wstrzykniętego na kolumnę. Analiza regresji została przeprowadzona z wykorzystaniem pola powierzchni piku. Profile elucji miedzi, cynku oraz dysmutazy ponadtlenkowej są pokazane zarówno dla miedzi, jak i cynku.Przedstawiono również analizy regresji wygenerowane na podstawie pól pików. Wyniki analizy regresji służą do przeliczenia surowych danych z liczby zliczeń na sekundę na pikogramy na sekundę, aby można było ilościowo określić zawartość metalu związanego z białkiem.Tę technikę można wykorzystać do identyfikacji metaloprotein w złożonych próbkach biologicznych. Przedstawiono tutaj ludzki mózg rozdzielony za pomocą SEC ICPMS. Każdy z nich reprezentuje inny interesujący nas metal.Mianowicie miedź, cynk lub żelazo. Przedstawiono tutaj ślady uzyskane po poddaniu osocza ludzkiego tej technice. Złożoność i zawartość próbki wpłyną na liczbę widocznych pików.Zgodnie z oczekiwaniami, w osoczu dominują nieliczne metaloproteiny, w tym ceruloplazmina i transferyna. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć sposób konfiguracji urządzenia do pomiaru stanu natywnego metaloprotein w złożonych próbkach. Po opanowaniu tej techniki można ją z powodzeniem zastosować w ciągu trzech do czterech godzin.Pozwala to na analizę od 20 do 36 próbek w ciągu jednego dnia. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest zastosowanie odpowiednich standardów metaloprotein, takich jak miedziowo-cynkowa SOD, jeśli przedmiotem zainteresowania są miedź i cynk. Należy również zastosować standardy wewnętrzne w buforze, takie jak cez, co pozwala na korektę ewentualnego dryftu instrumentu w czasie.Po zastosowaniu tej procedury można wdrożyć również inne formy spektrometrii mas w celu udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania, takie jak: jakie metaloproteiny znajdują się w mojej próbce? Można to osiągnąć poprzez standardowe trawienie trypsyną oraz sekwencjonowanie peptydów białkowych metodą spektrometrii mas.Lub poprzez analizę nienaruszonych białek w ich stanie natywnym. Po opracowaniu technika ta może utorować drogę badaczom w dziedzinie proteomiki do zrozumienia roli metaloprotein w chorobach, takich jak choroba Alzheimera. Należy pamiętać o zasadach pracy z zagęszczonym kwasem azotowym oraz próbkami klinicznymi.Należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej.

standards-for-quantitative-metalloproteomic-analysis-using-size

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Metoda SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies) łączy wzbogacanie peptydów metodą powinowactwa z masową spektrometrią z rozcieńczeniem izotopem stabilnym (MRM-MS), aby zapewnić ilościowe pomiary peptydów jako substytutów odpowiadających im białek. W niniejszym opracowaniu opisujemy protokół z wykorzystaniem cząstek magnetycznych w formacie częściowo zautomatyzowanym.

Ilościowe oznaczanie białek z wykorzystaniem immunoafinityjnego wzbogacania peptydów sprzężonego ze spektrometrią mas

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzać bezwzględne testy kwantyfikacyjne docelowych białek w złożonych próbkach biologicznych przy użyciu monitorowania wybranych reakcji. Wykorzystano go do dokładnego ilościowego określenia białek szlaku sygnałowego chemotaksji makrofagów myszy. Szczegółowo opisano wybór peptydów docelowych, opracowywanie testów oraz testy jakościowe i ilościowe.

Spektrometria mas do monitorowania wybranych reakcji do bezwzględnej kwantyfikacji białek

Tutaj opisujemy test chromatograficzny połączony z separacją ruchliwości jonów prekursorów peptydów, po której następuje detekcja MS w wysokiej rozdzielczości (~30 000) MS dla kwantyfikacji wzorców peptydów wzbogaconych w trawieniu przeciwciał monoklonalnych.

Test HS-MRM do oznaczania ilościowego białek komórek gospodarza w biofarmaceutykach białkowych za pomocą chromatografii cieczowej Mobilność jonów Spektrometria mas QTOF

Przedstawiono protokół kwantyfikacji białek w złożonych płynach biologicznych przy użyciu technologii automatycznego immuno-MALDI (iMALDI).

Kwantyfikacja peptydów i białek przy użyciu zautomatyzowanego immuno-MALDI (iMALDI)

Przedstawiamy protokół do dokładnego oznaczania ilościowego białek za pomocą znakowania izobarycznego, intensywnego frakcjonowania, narzędzi bioinformatycznych i etapów kontroli jakości w połączeniu z chromatografią cieczową połączoną ze spektrometrem masowym o wysokiej rozdzielczości.

Głębokie profilowanie proteomu za pomocą znakowania izobarycznego, rozległej chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i kwantyfikacji wspomaganej programowo

Ten protokół opisuje użycie chromatografii jonowymiennej o wysokiej specyficzności z wielokątowym rozpraszaniem światła do dokładnego wyznaczania masy molowej białek, kompleksów białkowych i peptydów w heterogenicznej próbce. Metoda ta jest cenna dla oceny jakości, a także dla scharakteryzowania natywnych oligomerów, wariantów ładunku i próbek białek mieszanych.

Chromatografia jonowymienna (IEX) sprzężona z wielokątowym rozpraszaniem światła (MALS) w celu separacji i charakterystyki białek

Prezentujemy test do łatwej kwantyfikacji metali wprowadzonych do próbek przygotowanych za pomocą chromatografii powinowactwa do metali unieruchomionych. Metoda wykorzystuje błękit hydroksynaftolowy jako kolorymetryczny wskaźnik metalu i spektrofotometr UV-Vis jako detektor.

Kwantyfikacja wymywania metali w chromatografii powinowactwa do unieruchomionych metali

Ten przepływ pracy opisuje wydajność efektywnego czasowo i kosztowo wzbogacania wielu modyfikacji potranslacyjnych białek (PTM) jednocześnie dla ilościowej globalnej analizy proteomicznej. Protokół wykorzystuje wzbogacanie PTM na poziomie peptydów wieloma sprzężonymi przeciwciałami, a następnie niezależną od danych analizę spektrometrii mas w celu uzyskania biologicznego wglądu w przesłuchy PTM.

Jednoczesne wzbogacenie powinowactwa dwóch modyfikacji potranslacyjnych do kwantyfikacji i lokalizacji miejsca

Ta metoda specjacji żelaza redoks opiera się na elektroforezie kapilarnej - spektrometrii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie z układaniem próbek połączonym z krótką analizą w jednym przebiegu. Metoda szybko analizuje i zapewnia niskie limity oznaczalności dla form redoks żelaza w różnych próbkach tkanek i płynów biologicznych.

Konfiguracja spektrometrii mas z elektroforezą kapilarną i indukcyjnie sprzężoną plazmą (CE-ICP-MS) do oznaczania ilościowego gatunków redoks żelaza (Fe(II), Fe(III))

Tutaj prezentujemy protokół do scharakteryzowania kompletnej korony biomolekularnej, białek i metabolitów, uzyskanych przez nanomateriały z biopłynów przy użyciu elektroforezy kapilarnej - podejścia spektrometrii mas.

Metody spektrometrii mas elektroforezy kapilarnej do charakteryzowania korony białkowej i metabolitowej uzyskanej przez nanomateriały

Obecny protokół zawiera szczegółowe opisy skutecznego izolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych moczu za pomocą funkcjonalizowanych kulek magnetycznych. Ponadto obejmuje kolejne analizy, w tym western blotting, proteomikę i fosfoproteomikę.

Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z biofluidów na podstawie powinowactwa chemicznego do analizy proteomicznej i fosfoproteomicznej

Poznaj metodę ilościowej analizy metaloprotein z wykorzystaniem chromatografii wykluczenia wielkościowego sprzężonej z ICP-MS. Technika ta pozwala mierzyć zawartość metali w białkach w ich stanie natywnym, dostarczając cennych informacji o roli metali w procesach biologicznych i chorobach.

Standardy ilościowej analizy metaloproteomicznej z wykorzystaniem wykluczenia wielkości ICP-MS

Przeglądaj więcej filmów