Standardy ilościowej analizy metaloproteomicznej z wykorzystaniem wykluczenia wielkości ICP-MS

Chromatografia wykluczania wielkości z łącznikiem plazmy sprzężonej indukcyjnie - spektrometria mas (ICP-MS) to potężne narzędzie do pomiaru zmian w obfitości metaloprotein bezpośrednio z próbek biologicznych. W tym miejscu opisujemy zestaw wzorców metaloprotein używanych do szacowania masy cząsteczkowej i ilości metalu związanego z nieznanymi białkami.

Ogólnym celem tej techniki jest możliwość ilościowego określenia różnych metaloprotein w złożonych wzorcach w oparciu o zastosowanie znanych wzorców metaloprotein. Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące roli metali w biologii. Na przykład, w jaki sposób zmienia się status metalu w białku w chorobie?

Kluczową zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na pomiar statusu metalu w białku w jego stanie naturalnym. Technikę zademonstruje Amber Lothian, doktorantka z mojego laboratorium. Na początek homogenizowane próbki tkanek lub kultur komórkowych przez ręczne zmniejszanie lub sonikację przez pięć minut przy użyciu buforowanej soli fizjologicznej Tris.

Klarować homogenaty przez odwirowanie w ilości 16 000 razy G przez pięć minut. Po zebraniu otrzymanego supernatantu należy znormalizować całkowitą ilość białka, określając stężenia białka zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Rozgrzej i dostrój maspektrometror plazmy sprzężonej indukcyjnie, korzystając z protokołów producenta.

Rozcieńczyć wzorce metaloproteiny, aby cieszyć się spadkiem w zakresie od zera do 500 mikrogramów na litr, używając jednego procenta kwasu azotowego. Aby osiągnąć normy w tym zakresie, nie należy stosować rozcieńczeń przekraczających 1 i 20. Ustaw kolejność wstrzyknięć, najpierw analizując siedem poziomów kalibracji.

Stężenia od zera do 500 mikrogramów na litr, a następnie wzorce metaloprotein. Siedem poziomów kalibracji to zero, jeden, pięć, dziesięć, 50, 100 i 500 mikrogramów na litr. Następnie wybierz interesujące Cię elementy.

Tutaj użyj żelaza, miedzi,, kobaltu i jodu. Ponieważ są to pierwiastki, z którymi związane są wzorce białkowe. Wybierz pierwiastki w metodzie akwizycji, otwierając zakładkę selektora elementów i dodając pierwiastki oraz odpowiadające im masy izotopowe, które mają być analizowane.

Następnie wykonaj analizę próbki za pomocą urządzenia. Oprogramowanie przyrządu automatycznie tworzy krzywe kalibracyjne dla każdego z analizowanych elementów. Użyj krzywych kalibracyjnych, aby określić stężenie metalu w nieznanych próbkach.

Na podstawie wyników analizy masowej wygeneruj wzorce metaloprotein, które zawierają trzy najobficiej występujące pierwiastki śladowe w tkankach ssaków, używając mieszaniny miedzi, dysmutazy ponadtlenkowej i ferrytyny. Przedmuchić szybką chromatografię hipoperformance lub pompy HPLC 200-milimolowym buforem azotanu amonu przez pięć minut przy natężeniu przepływu pięciu mililitrów na minutę. Po oczyszczeniu systemu ustaw natężenie przepływu na punkt zerowy, jeden mililitr na minutę.

I podłącz kolumnę wykluczeń po stronie. Podłącz przeciwległy koniec kolumny do detektora UV, ustaw absorbancję pomiaru na 280 nanometrów za pomocą rurki szczytowej. Stopniowo zwiększaj natężenie przepływu kolumny w krokach co punkt zerowy jeden mililitr na minutę, aż do osiągnięcia końcowego natężenia przepływu punktu zerowego czterech mililitrów na minutę.

W tym czasie sprawdź połączenia przewodów z kolumną pod kątem wycieków. Monitoruj ciśnienie w tym systemie, aby upewnić się, że nie przekracza ono wymagań kolumny, obserwując ślad ciśnienia na chromatogramie w oprogramowaniu. Pozostaw kolumnę do zrównoważenia przy wymaganym natężeniu przepływu przez pięć do 10 objętości kolumny.

Po zrównoważeniu podłącz przyrządy, aby umożliwić analizę próbki. Ustaw metodę HPLC tak, aby pompować bufor A przez kolumnę w punkcie zerowym cztery mililitry na minutę przez 15 minut. Przełącz ICPMS w tryb czuwania przed zmianą ustawień sprzętowych.

W trybie czuwania wyłącz komunikację dla automatycznego samplera i zmień wprowadzenie próbki na inne. Użyj rurki PEEK, aby podłączyć odpływ z detektora UV bezpośrednio do nebulizatora na ICPMS. Włącz ICPMS i pozwól instrumentowi rozgrzać się przez 10 do 20 minut.

Po zapaleniu się plazmy podłącz zdalny od ICPMS do tylnej części automatycznego samplera HPLC. Zrób to, gdy plazma się zapali. W przeciwnym razie system HPLC zostanie automatycznie wyłączony, ponieważ ICPMS nie jest włączony.

Zmień metodę ICPMS w celu zbierania danych dla LC ICPMS, najpierw zmieniając metodę akwizycji z widma na akwizycję rozdzielczości czasowej. Następnie wybierz elementy, które mają być analizowane. Żelazo, miedź,, kobalt, jod, a także wszelkie inne interesujące pierwiastki i ustalone czasy integracji.

Po wybraniu interesujących elementów dostosuj czas akwizycji do czasu trwania chromatografii. Ręcznie dostrój ICPMS pod kątem czułości i szybkości przepływu helu w komórce zderzeniowej za pomocą buforu chromatograficznego przepływającego z cezem i antymonem zawartymi w buforze. Gdy liczba jonów metalu ustabilizuje się, a względne wartości odchylenia standardowego spadną poniżej pięciu procent, system jest gotowy do użycia.

Twórz przykładowe listy przebiegów zarówno w programach HPLC, jak i ICPMS. Lista próbnych przebiegów zawiera kolejność, w jakiej każda z próbek ma być wstrzykiwana. A także nazwę, pod którą dane będą zapisywane.

Sprawdź, czy łączna liczba próbek na liście jest zgodna między tymi dwoma programami. Rozpocznij partię próbki dla ICPMS przed HPLC, ponieważ wstrzyknięcie próbki przez HPLC spowoduje, że ICPMS rozpocznie zbieranie danych. Jeśli nie zostanie to zrobione we właściwej kolejności, spowoduje to brak danych.

Generowanie punktów krzywej kalibracyjnej poprzez wstrzykiwanie różnych objętości mieszaniny dysmutazy ponadtlenkowej i ferrytyny. Objętości wtrysku wahają się od jednego mikrolitra do 30 mikrolitrów. Na koniec przeanalizuj każdą z nieznanych próbek, takich jak tkanka, osocze lub hodowla komórkowa, przed przeanalizowaniem danych zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Pokazane jest złudzenie ferrytyny w zakresie od 2000 do 60 000 pikogramów żelaza wstrzykiwanego na kolumnę. Analizę regresji przeprowadzono przy użyciu obszaru piku. Profile iluzji dla miedzi,, dysmutazy ponadtlenkowej są pokazane zarówno dla miedzi, jak i.

Pokazane są również analizy regresji wygenerowane przy użyciu obszarów pików. Wyniki analizy regresji są wykorzystywane do konwersji surowych danych w liczbach na sekundę na pikogramy na sekundę. Dzięki temu ilość metalu związanego z białkiem można określić ilościowo.

Technika ta może być stosowana do identyfikacji metaloprotein w złożonych próbkach biologicznych. Tutaj pokazany jest ludzki mózg oddzielony przez SEC ICPMS. Każdy z nich reprezentuje inny metal będący przedmiotem zainteresowania.

Mianowicie miedź, lub żelazo. Pokazane są tutaj ślady uzyskane podczas poddawania ludzkiej technice osocza ludzkiego. Złożoność i obfitość próbki będzie miała wpływ na liczbę obserwowanych pików.

Zgodnie z oczekiwaniami, osocze jest zdominowane przez kilka metaloprotein, w tym ceruloplazminę i transferynę. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skonfigurować przyrząd do pomiaru natywnego stanu metaloprotein w złożonych próbkach. Po opanowaniu tej techniki można z powodzeniem zastosować w ciągu trzech do czterech godzin.

Pozwala to na analizę od 20 do 36 próbek w ciągu jednego dnia. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby użyć odpowiednich wzorców metaloprotein, takich jak miedź SOD, jeśli interesujesz się miedzią i. A także wewnętrzne wzorce w buforze, takie jak cez, który pozwala skorygować wszelkie dryfty w instrumencie w czasie.

Postępując zgodnie z tą procedurą, można również wdrożyć inne formy spektrometrii mas, aby uzyskać odpowiedzi na ważne pytania. Na przykład, jakie metaloproteiny są obecne w mojej próbce? Można to osiągnąć poprzez standardowe wycieczki w trawieniu i sekwencjonowaniu peptydów białkowych o specyfikacji masy.

Lub, analizując białka w takcie, w ich stanie naturalnym. Po opracowaniu technika ta może utorować drogę naukowcom zajmującym się proteomiką do zrozumienia roli metaloprotein w chorobach, takich jak choroba Alzheimera. Nie zapominaj, że praca ze stężonym kwasem azotowym i próbkami klinicznymi.

Należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.