Name: Wizualizacja śmierci komórek litycznych makrofagów podczas infekcji prątkami w zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii przyżyciowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji śmierci komórek makrofagów podczas infekcji Mycobacterium marinum w zarodkach Danio rerio za pomocą mikroskopii przyżyciowej. Technika umożliwia obserwację dynamiki komórkowej in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. Zilong Wen za podzielenie się szczepami danio pręgowanego, Dr. Stefanowi Oehlersowi i Dr. Davidowi Tobinowi za podzielenie się zasobami związanymi z M. marinum, Yuepeng He za pomoc w przygotowaniu figury. Praca ta była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (81801977) (B.Y.), Wybitny Program Szkolenia Młodzieży Miejskiej Komisji Zdrowia w Szanghaju (2018YQ54) (B.Y.), Shanghai Sailing Program (18YF1420400) (B.Y.) oraz Open Fund of Shanghai Key Laboratory of Tuberculosis (2018KF02) (B.Y.).

Danio pręgowany były hodowane w standardowych warunkach, zgodnie z wytycznymi dla zwierząt laboratoryjnych dotyczących etycznego przeglądu dobrostanu zwierząt (GB/T 35823-2018). Wszystkie eksperymenty z danio pręgowanym w tym badaniu zostały zatwierdzone (2019-A016-01) i przeprowadzone w Centrum Klinicznym Zdrowia Publicznego w Szanghaju, Uniwersytet Fudan.
1. M. marinum Preparat inokulum jednokomórkowego (<silna klasa="xfig">Rysunek 1)
<ol>
	<li>Rozmrozić cykulańsko-fluorescencyjny bulion glicerolu M. marinum w temperaturze -80 °C i zaszczepić płytkę agarową 7H10 10% (v/v) OADC, 0,25% glicerolu i 50 μg/ml higromycyny. Inkubować płytkę w temperaturze 32 °C przez około 10 dni.</li>
	<li>Wybierz kolonię wykazującą dodatnią fluorescencję i zaszczep 3 ml pożywki 7H9 10% OADC, 0,5% glicerolu i 50 μg/ml higromycyny.
	<ol>
		<li>Inkubować inokulację w temperaturze 32 °C i 100 obrotach na minutę (obr./min) przez 4–6 dni, aż kultura osiągnie fazę logarytmiczną (OD600 = 0,6–1,0).</li>
		<li>Subkultura (1:100) w 30 ml świeżej pożywki 7H9 z 10% OADC, 0,5% glicerolu, 0,05% Tween-80 i 50 μg/ml, aż OD600 osiągnie ~1,0, 
		UWAGA: Aby uzyskać najwyższą jakość kultury, na tym etapie zalecany jest etap subkultury. Z naszego doświadczenia wynika, że dodanie klonu bezpośrednio do dużej objętości podłoża doprowadzi do powstania grudek bakteryjnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbierz komórki M. marinum zgodnie z poniższym opisem.
	<ol>
		<li>Wirować przy 3 000 x g przez 10 minut, aby zebrać M. marinum w postaci granulatu. Wyrzucić wszystko, z wyjątkiem 300 μl supernatantu i użyć go do ponownego wymieszania osadu.</li>
		<li>Dodać 3 ml pożywki 7H9 z 10% glicerolem w celu dalszego zawieszenia osadu, a następnie sonikować zawiesinę w łaźni wodnej o mocy 100 W przez 15 s ON, 15 s OFF, w sumie 2 min. 
		UWAGA: Celem sonikacji jest uzyskanie jednorodności pojedynczej komórki dla inokulum, co zapobiegnie zablokowaniu igły do mikroiniekcji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieś zawiesinę bakteryjną do strzykawki o pojemności 10 ml, a następnie przepuść przez filtr 5 μm w celu usunięcia wszelkich grudek bakteryjnych.</li>
	<li>Zmierzyć gęstość optyczną (OD) zawiesiny za pomocą spektrofotometru i rozcieńczyć ją do OD600 = 1,0 za pomocą pożywki 7H9 zawierającej 10% glicerolu. Podzielić zawiesinę na 10 μl porcji i przechowywać w temperaturze -80 °C w zamrażarce do wykorzystania w przyszłości.</li>
	<li>Potwierdzić stężenie bakteryjne inokulum (jtk/ml) przez seryjne rozcieńczanie i posiewanie materiału bakteryjnego na płytce agarowej 7H10 zawierającej 10% (v/v) OADC, 0,5% glicerolu i 50 μg/ml higromycyny.</li>
</ol>
2. Przygotowanie zarodków danio pręgowanego
<ol>
	<li>Na dzień przed tarłem należy ustawić pary lęgowe danio pręgowanego w komorze hodowlanej. 
	UWAGA: Dodaj tylko jedną parę do każdej komory hodowlanej.</li>
	<li>Zbierz zarodki następnego ranka w ciągu 1 godziny po zapłodnieniu (hpf). Ostrożnie umyć zarodki wodą destylowaną i przenieść do 100 zarodków na 100-milimetrową szalkę Petriego zawierającą 30 ml pożywki E3. Inkubować w temperaturze 28,5 °C.</li>
	<li>Po 12 godzinach obserwuj pod mikroskopem i wyrzuć niezapłodnione lub uszkodzone jaja.</li>
	<li>Przy 24 hpf zmień pożywkę na świeżą pożywkę E3 z N-fenylotiomocznikiem (PTU, stężenie końcowe 0,2 nM), aby zapobiec rozwojowi pigmentu. Inkubować zarodki w temperaturze 28,5 °C, aż zarodki będą gotowe do mikroiniekcji.</li>
</ol>
3. Zakażenie za pomocą mikroiniekcji bakteryjnej
<ol>
	<li>Przygotować igły do iniekcji mikrokapilarnych ze szkła borokrzemianowego zgodnie z wcześniejszym opisem w reference13.</li>
	<li>Zarodki danio pręgowanego montowane w celu zakażenia
	<ol>
		<li>Mikrofale 100 ml 1% (w/v) i 100 ml 0,5% (w/v) niskotopliwej agarozy w autoklawowanym podłożu E3, aż agaroza całkowicie się rozpuści. Podzielić na 1 ml podwielokrotnych probówek i przechowywać w temperaturze 4 °C do wykorzystania w przyszłości.</li>
		<li>Przed użyciem podgrzej agarozę w bloku grzewczym o temperaturze 95 °C, aż całkowicie się rozpuści. Utrzymuj agarozę w postaci płynnej, umieszczając ją w bloku grzewczym o temperaturze 45 °C (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
		<li>Montaż do infekcji śródmięśniowej w okolicy tułowia
		<ol>
			<li>Stwórz dolną warstwę agarozy, wylewając równomiernie 0,5 ml 1% (w/v) agarozy na szklane szkiełko. Umieść na pojemniku na lód lub zimnej powierzchni na 3 minuty do zestalenia.</li>
			<li>Znieczulenie zarodków danio pręgowanego (48–72 hpf) w wodzie z jajami z trikainą (200 μg/ml) i PTU przez 5 minut przed montażem. Umieść do 60 zarodków danio pręgowanego na dolnej warstwie agarozy i ułóż je ostrożnie w dwóch rzędach (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B).</li>
			<li>Usuń pozostałą wodę z dolnej warstwy agarozy bibułką przed dodaniem 0,3 ml 0,5% (w/v) agarozy, aby utworzyć górną warstwę. Upewnij się, że zarodki są całkowicie osadzone w agarozie. Ponownie włóż szklane szkiełko do pojemnika na lód, aby zestalić agarozę i zapobiec odwodnieniu.</li>
			<li>Utrzymuj górną warstwę agarozy wilgotną, pokrywając powierzchnię dodatkową wodą jajeczną E3.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Montaż w przypadku infekcji śródmózgowia
		<ol>
			<li>Przykryj rowek pojedynczego szkiełka mikroskopowego ze szkła wklęsłego 1% (w/v) agarozy, a następnie przenieś 4-6 znieczulonych trikainą zarodków do agarozy.</li>
			<li>Ostrożnie ustaw głowę każdego zarodka do góry za pomocą igły 10 G (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C).</li>
			<li>Gdy pozycje wszystkich zarodków zostaną ustalone, przenieś szklane szkiełko do pojemnika na lód lub zimnej powierzchni, aby agaroza zastygła. 
			UWAGA: Unikaj rozcieńczania agarozy o niskiej temperaturze topnienia, minimalizując objętość transferu wody jajowej z zarodkami.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparat bakteryjny na infekcję
	<ol>
		<li>Dodać 1 μl sterylnie przefiltrowanej czerwieni fenolowej (10x) do 10 μl podwielokrotności bulionu bakteryjnego (przygotowanego w kroku 1) i wymieszać przez krótkie wirowanie. 
		UWAGA: Końcowe stężenie można dostosować za pomocą sterylnego PBS.</li>
		<li>Sonikuj preparat za pomocą 100 W przez 10 s ON, 10 s OFF przez 1 min, aby rozbić wszelkie grudki, które mogły się utworzyć14.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zakażenie za pomocą mikroiniekcji
	<ol>
		<li>Ustaw mikrowtryskiwacz i mikromanipulator we właściwej pozycji i ustawieniu do mikroiniekcji, jak wcześniej raportowano13.</li>
		<li>Przenieść 3 μl preparatu bakteryjnego za pomocą mikroładowarki do przygotowanej igły (patrz krok 3.1). Pipetować powoli i ostrożnie, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>W przypadku infekcji okolicy tułowia wstrzyknij 100 jtk w obszar tułowia (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A). Unikaj wstrzykiwania bakterii do struny grzbietowej. 
		UWAGA: Jtk do wstrzykiwań szacuje się według wzoru cfu = stężenie podstawowe bakterii x współczynnik rozcieńczenia x objętość kropli iniekcji. Rzeczywisty jtk potwierdza się przez posiew jednej kropli inokulum bakteryjnego na płytce agarowej 7H10 zawierającej 10% (v/v) OADC, 0,5% glicerolu i 50 μg/ml higromycyny.</li>
		<li>W przypadku infekcji śródmózgowia wstrzyknij około 500 jtk w obszar śródmózgowia (<silna klasa="xfig">Ryc. 3B).</li>
		<li>Po mikroiniekcji ostrożnie przepłucz zarodki danio pręgowanego do świeżej wody z jaj za pomocą plastikowej pipety. 
		UWAGA: Zamontuj zarodki w naczyniu ze szklanym dnem tak szybko, jak to możliwe, aby zakryć obserwację bardzo wczesnej wrodzonej odpowiedzi komórek odpornościowych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Obrazowanie infekcji na żywo
<ol>
	<li>Montowanie ryb do obrazowania na żywo
	<ol>
		<li>Przenieś do 10 zarodków znieczulonych trikainą na środek naczynia o szklanym dnie 35 mm. Wyrzuć dodatkowe podłoże E3.</li>
		<li>Przykryj naczynie 1% agarozą o niskiej temperaturze topnienia i ostrożnie ustaw zarodki danio pręgowanego za pomocą igły 10 G. Inkubować naczynie ze szklanym dnem na lodzie przez 10 sekund, aby zestalić agarozę. 
		UWAGA: W przypadku iniekcji śródmózgowia zarodki powinny być osadzone w agarozie z głową skierowaną do góry (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A). W przypadku zakażenia śródmięśniowego okolicy tułowia zarodki powinny być zamontowane bocznie w agarozie (<klasa silna = "xfig" >Ryc. 4B).</li>
		<li>Po całkowitym zastygnięciu agaroza zalej warstwą wody jajecznej (plus 1 x trikaina i PTU).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trójkolorowa mikroskopia konfokalna poklatkowa o wysokiej rozdzielczości 
	UWAGA: Poniższe kroki są wykonywane na mikroskopii konfokalnej wyposażonej w soczewkę obiektywową UV 63.0x 1.40 oil.
	<ol>
		<li>Ustaw temperaturę komory środowiskowej na 28,5 °C. Umieść mokrą bibułkę w komorze, aby zapewnić wilgotność i zapobiec parowaniu wody z jaja (rysunek uzupełniający 1).</li>
		<li>Umieść naczynie ze szklanym dnem o średnicy 35 mm z danio pręgowanym w komorze środowiskowej.</li>
		<li>Otwórz oprogramowanie konfokalne i zainicjuj stolik. Przełącz się na obiektyw UV o wymiarach 63,0 x 1,40 i zlokalizuj danio pręgowanego za pomocą kanału jasnego pola z filtrem kontrastu różnicowego (DIC).</li>
		<li>Otwórz diodę 405, argon (20% mocy) i laser DPSS 561 nm. Ustaw odpowiednie ustawienia mocy i widma lasera. 
		UWAGA: Poniżej przedstawiono ustawienia widma dla Cerulean (wzbudzenie = 405 nm; emisja = ~456–499 nm), eGFP (wzbudzenie = 488 nm; emisja = ~500–550 nm), DsRed2 (wzbudzenie = 561 nm; emisja = ~575–645 nm) (Rysunek uzupełniający 2B).</li>
		<li>Wybierz tryb akwizycji "XYZ" "Skanowanie sekwencyjne" i ustaw format obrazów na "512 x 512 pikseli" (rysunek uzupełniający 2A).</li>
		<li>Przełącz na "Tryb danych na żywo". Wyceluj w pozycję pierwszego danio pręgowanego i zaznacz pozycję Z "Początek" i "Koniec". Powtórz ten proces dla każdego z pozostałych zarodków. Na końcu programu można dodać "Pauzę" (rysunek uzupełniający 2C).</li>
		<li>Zdefiniuj pętlę i cykl programu.</li>
		<li>Zapisz plik.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Promieniowanie UV pojedynczych komórek w celu wywołania apoptozy i obrazowania na żywo
<ol>
	<li>Zamontuj rybę zgodnie z opisem w kroku 4.1.</li>
	<li>Obrazowanie obszaru śródmózgowia 3 dni po zapłodnieniu (dpf) transgeniczny transgeniczny Tg(mfap4-eGFP) swoisty dla makrofagów zarodek15</li>
	<li>Wybierz obszar zainteresowania jednego pojedynczego fluorescencyjnie znakowanego makrofaga i skanuj z prędkością 400 Hz i mocą lasera UV 6% przez 50 s. 
	UWAGA: Szybkość i czas skanowania powinny być zoptymalizowane w zależności od indywidualnego mikroskopu. Czas skanowania powinien być zoptymalizowany, aby spowodować rozległe uszkodzenia DNA, które następnie spowodują apoptozę komórki docelowej, ale nie fotowybielają całej komórki.</li>
	<li>Powtórz powyższy krok, aby napromieniować więcej komórek docelowych.</li>
	<li>Wykonać obrazowanie poklatkowe obszaru śródmózgowia zgodnie z opisem w punkcie 4.</li>
</ol>
6. Przetwarzanie obrazu
<ol>
	<li>Wykonaj "Projekcję maksymalną" dla uzyskanych obrazów.</li>
	<li>Znajdź i zaznacz pozycję XY i czas komórek docelowych w widoku "Projekcja maksymalna".</li>
	<li>Wróć do widoku standardowego, aby znaleźć i zaznaczyć pozycję Z komórek docelowych.</li>
	<li>Przytnij jednowarstwowy obraz komórek docelowych.</li>
	<li>Eksportuj kanał nakładki i jasne pole jako filmy w formacie AVI.</li>
	<li>Przytnij obszar zainteresowania kanału nakładki i jasnego pola w obrazie ImageJ.</li>
	<li>Połącz dwa filmy w ostatnim kroku w pionie i zapisz jako jedno wideo w formacie AVI w ImageJ.</li>
</ol>

<ol><li>Behar, S. M., Divangahi, M., Remold, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evasion+of+innate+immunity+by+Mycobacterium+tuberculosis%3A+is+death+an+exit+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Evasion of innate immunity by Mycobacterium tuberculosis: is death an exit strategy.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 668-674 (2010).</li>
<li>Lamkanfi, M., Dixit, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+host+cell+death+pathways+during+microbial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Manipulation of host cell death pathways during microbial infections.</a> Cell Host Microbe. 8 (1), 44-54 (2010).</li>
<li>Crowley, L. C., Marfell, B. J., Scott, A. P., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+Apoptosis+and+Necrosis+by+Annexin+V+Binding%2C+Propidium+Iodide+Uptake%2C+and+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocol%22%5BJournal%5D)">Quantitation of Apoptosis and Necrosis by Annexin V Binding, Propidium Iodide Uptake, and Flow Cytometry.</a> Cold Spring Harbor Protocol. 2016 (11), (2016).</li>
<li>Crowley, L. C., Marfell, B. J., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+DNA+Fragmentation+in+Apoptotic+Cells+by+TUNEL%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocol%22%5BJournal%5D)">Detection of DNA Fragmentation in Apoptotic Cells by TUNEL.</a> Cold Spring Harbor Protocol. 2016 (10), (2016).</li>
<li>Chan, L. L., McCulley, K. J., Kessel, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Cell+Viability+with+Single-%2C+Dual-%2C+and+Multi-Staining+Methods+Using+Image+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Assessment of Cell Viability with Single-, Dual-, and Multi-Staining Methods Using Image Cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1601, 27-41 (2017).</li>
<li>Rathkey, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+visualization+of+gasdermin+D-driven+pyroptotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Live-cell visualization of gasdermin D-driven pyroptotic cell death.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (35), 14649-14658 (2017).</li>
<li>Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+for+the+study+of+neutrophil+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology.</a> Journal of Leukocyte Biology. 94 (4), 633-642 (2013).</li>
<li>Harvie, E. A., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+host+defense%3A+new+insights+from+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish.</a> Journal of Leukocyte Biology. 98 (4), 523-537 (2015).</li>
<li>Lesley, R., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+early+mycobacterial+pathogenesis+from+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish.</a> Current Opinion Microbiology. 11 (3), 277-283 (2008).</li>
<li>Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+pathogenesis+of+Mycobacterium+marinum+and+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis.</a> Cellular Microbiology. 10 (5), 1027-1039 (2008).</li>
<li>Clay, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dichotomous+role+of+the+macrophage+in+early+Mycobacterium+marinum+infection+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Dichotomous role of the macrophage in early Mycobacterium marinum infection of the zebrafish.</a> Cell Host Microbe. 2 (1), 29-39 (2007).</li>
<li>Davis, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+visualization+of+mycobacterium-macrophage+interactions+leading+to+initiation+of+granuloma+formation+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos.</a> Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).</li>
<li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), e3781(2012).</li>
<li>Maglione, P. J., Xu, J., Chan, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cells+moderate+inflammatory+progression+and+enhance+bacterial+containment+upon+pulmonary+challenge+with+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">cells moderate inflammatory progression and enhance bacterial containment upon pulmonary challenge with Mycobacterium tuberculosis.</a> Journal of Immunology. 178 (11), 7222-7234 (2007).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+plays+critical+role+during+Edwardsiella+piscicida+immersion+infection+in+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+Shellfish+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil plays critical role during Edwardsiella piscicida immersion infection in zebrafish larvae.</a> Fish Shellfish Immunology. 87, 565-572 (2019).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nlrc3-like+is+required+for+microglia+maintenance+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Nlrc3-like is required for microglia maintenance in zebrafish.</a> Journal of Genetics and Genomics. 46 (6), 291-299 (2019).</li>
<li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Developmental Biology. 7, 42(2007).</li>
<li>Xu, J., Wang, T., Wu, Y., Jin, W., Wen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+Colonization+of+Developing+Zebrafish+Midbrain+Is+Promoted+by+Apoptotic+Neuron+and+Lysophosphatidylcholine%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Microglia Colonization of Developing Zebrafish Midbrain Is Promoted by Apoptotic Neuron and Lysophosphatidylcholine.</a> Developmental Cell. 38 (2), 214-222 (2016).</li>
<li>Oehlers, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interception+of+host+angiogenic+signalling+limits+mycobacterial+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interception of host angiogenic signalling limits mycobacterial growth.</a> Nature. 517 (7536), 612-615 (2015).</li>
<li>Kulms, D., Schwarz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+UV-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Photodermatology%2C+Photoimmunology+and+Photomedicine%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of UV-induced apoptosis.</a> Photodermatology, Photoimmunology and Photomedicine. 16 (5), 195-201 (2000).</li>
<li>van Ham, T. J., Mapes, J., Kokel, D., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+apoptotic+cells+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Live imaging of apoptotic cells in zebrafish.</a> FASEB Journal. 24 (11), 4336-4342 (2010).</li>
<li>Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+changes+during+programmed+cell+deaths%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane changes during programmed cell deaths.</a> Cell Research. 28 (1), 9-21 (2018).</li>
<li>Lu, Z., Zhang, C., Zhai, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleoplasmin+regulates+chromatin+condensation+during+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Nucleoplasmin regulates chromatin condensation during apoptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 102 (8), 2778-2783 (2005).</li>
<li>Ashida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+and+infection%3A+a+double-edged+sword+for+host+and+pathogen+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell death and infection: a double-edged sword for host and pathogen survival.</a> Journal of Cell Biology. 195 (6), 931-942 (2011).</li>
<li>Traven, A., Naderer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+egress%3A+a+hitchhiker%27s+guide+to+freedom%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Microbial egress: a hitchhiker's guide to freedom.</a> PLoS Pathogens. 10 (7), 1004201(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten opisuje wizualizację śmierci makrofagów podczas infekcji prątkami. W oparciu o takie czynniki, jak integralność błony komórkowej, śmierć komórki spowodowaną infekcją można podzielić na apoptozę i śmierć komórki lityczną24,25. Śmierć komórek litycznych jest bardziej stresująca dla organizmu niż apoptoza, ponieważ wywołuje silną reakcję zapalną 24,25. Obserwacja śmierci komórek litycznych in vi...

Wykazano, że infekcja prątkowa powoduje śmierć komórek immunologicznych gospodarza1. Na przykład atenuowany szczep wywoła apoptozę w makrofagach i powstrzyma infekcję. Jednak zjadliwy szczep wywoła śmierć komórek litycznych, powodując rozprzestrzenianie się bakterii1,2. Biorąc pod uwagę wpływ tych różnych typów śmierci komórek na odpowiedź przeciwprątkową gospodarza, potrzebna jest szczegółowa obserwacja śmierci komórek makrofagów podczas infekcji prątkami in vivo.
Konwencjonalne metody pomiaru śmierci komórek polegają na użyciu barwienia martwych komórek, takich jak Annnexin V, TUNEL lub barwienie pomarańczą akrydynową/jodkiem propidyny3,4,5. Metody te nie są jednak w stanie rzucić światła na dynamiczny proces śmierci komórki in vivo. Obserwacja śmierci komórek in vitro została już ułatwiona dzięki obrazowaniu na żywo6. Jednak to, czy wyniki dokładnie naśladują warunki fizjologiczne, pozostaje niejasne.
Danio pręgowany był doskonałym modelem do badania reakcji antyprątkowych gospodarza. Ma wysoce konserwatywny układ odpornościowy podobny do ludzkiego, łatwy do manipulowania genom, a wczesne zarodki są przezroczyste, co pozwala na obrazowanie na żywo7,8,9. Po zakażeniu M. marinum dorosłe rybo pręgowany tworzą typowe dojrzałe struktury ziarniniaka, a embrionalny danio pręgowany tworzy wczesne struktury podobne do ziarniniaka9,10. Dynamiczny proces interakcji między komórkami odpornościowymi a bakteriami został już wcześniej zbadany w modelu zakażenia danio pręgowanego M. marinum11,12. Jednak ze względu na wysokie wymagania dotyczące rozdzielczości przestrzenno-czasowej, szczegóły dotyczące śmierci wrodzonych komórek odpornościowych pozostają w dużej mierze nieokreślone.
Tutaj opisujemy, jak zobrazować proces śmierci komórek litycznych makrofagów wywołany infekcją mykobakteryjną in vivo. Protokół ten może być również stosowany do wizualizacji zachowania komórek in vivo podczas rozwoju i stanu zapalnego.

<table><tbody><tr><td>0,05% Stostrzykawka Tween-80</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>10 ml</td><td>Solarbio</td><td>YA0552</td><td></td></tr><tr><td>10% OADC</td><td>BD</td><td>211886</td><td></td></tr><tr><td>kwas 3-aminobenzoesowy</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>5 &mu; m filtr</td><td>Mille X</td><td>SLSV025LS</td><td></td></tr><tr><td>50 &mu; l/ml higromycyny</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600230</td><td></td></tr><tr><td>7H10</td><td>BD</td><td>262710</td><td></td></tr><tr><td>7H9</td><td>BD</td><td>262310</td><td></td></tr><tr><td>Szklana dna 35 mm miska</td><td>In Vitro Scientific</td><td>D35-10-0-N</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Sangon Biotech</td><td>A60015</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Leica</td><td>TCS SP5 II</td><td></td></tr><tr><td>Komora środowiskowa</td><td>Pecon</td><td>temp control 37-2 cyfrowy</td><td></td></tr><tr><td>mikroładowarka</td><td>Eppendorf Eppendorf</td><td>No.5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko mikroskopowe</td><td>Bioland Scientific LLC</td><td>7105P</td><td></td></tr><tr>Inkubator <td>A100854</td><td></td><td>glicerol</td><td>Sangon Biotech</td></tr><tr><td></td><td>Keelrein</td><td>PH-140(A)</td><td></td></tr><tr><td>M.marinum</td><td></td><td></td><td>ATCC BAA-535</td></tr><tr><td>Igła do mikroiniekcji</td><td>World Precision Instruments</td><td>IB100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowtryskiwacz</td><td>Eppendorf</td><td>Femtojet</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>NARISHIGE</td><td>MN-151</td><td></td></tr><tr><td>msp12: cerulean</td><td></td><td></td><td>Ref.: PMID 25470057; 27760340</td></tr><tr><td>Czerwień fenolowa</td><td>Sigma</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>PTU</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko mikroskopowe z pojedynczą wklęsłością</td><td>Marka</td><td>żagla 7103</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>SCICNTZ</td><td>JY92-IIDN</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr (OD600)</td><td>Eppendorf AG</td><td>22331 Hamburski</td><td></td></tr><tr><td>mikroskop stereoskopowy</td><td>OLYMPUS</td><td>SZX10</td><td></td></tr><tr><td>Tg(mfap4:eGFP)</td><td></td><td></td><td>Ref.: PMID 30742890</td></tr><tr><td>Tg(coro1a:eGFP; lyzDsRed2)</td><td></td><td></td><td>Ref.: PMID 31278008</td></tr><tr><td>Tg(mpeg1:LRLG; lyz:eGFP)</td><td></td><td></td><td>Ref.: PMID 27424497; 17477879</td></tr></tbody></table>

wizualizacja śmierci komórek litycznych makrofagów podczas infekcji prątkami w zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii przyżyciowej

Visualization of Macrophage Lytic Cell Death During Mycobacterial Infection in Zebrafish Embryos via Intravital Microscopy

Danio pręgowany jest doskonałym organizmem modelowym do badania zachowania wrodzonych komórek odpornościowych, ze względu na swoją przezroczystość i poleganie wyłącznie na wrodzonym układzie odpornościowym we wczesnym okresie rozwoju. Model zakażenia Mycobacterium marinum (M. marinum) został dobrze ugruntowany w badaniu odpowiedzi immunologicznej gospodarza na zakażenie prątkami. Sugeruje się, że różne typy śmierci komórek makrofagów prowadzą do różnych wyników infekcji prątkami. W tym miejscu opisujemy protokół wykorzystujący mikroskopię przyżyteczną do obserwacji śmierci komórek makrofagów w zarodkach danio pręgowanego po zakażeniu M. marinum. Linie transgeniczne danio pręgowanego, które specyficznie znakują makrofagi i neutrofile, są zakażone poprzez domięśniowe mikrowstrzyknięcie fluorescencyjnie znakowanego M. marinum w śródmózgowie lub tułów. Zakażone zarodki danio pręgowanego są następnie umieszczane na niskotopliwej agarozie i obserwowane za pomocą mikroskopii konfokalnej w wymiarach X-Y-Z-T. Ponieważ długoterminowe obrazowanie na żywo wymaga użycia niskiej mocy lasera, aby uniknąć fotowybielania i fototoksyczności, zdecydowanie zaleca się stosowanie transgenicznego produktu o silnej ekspresji. Protokół ten ułatwia wizualizację dynamicznych procesów in vivo, w tym migracji komórek odpornościowych, interakcji z patogenem gospodarza i śmierci komórki.

Zakażenie prątkami z rodzaju Mycobacterium może wywołać różne odpowiedzi gospodarza w zależności od dróg zakażenia. W niniejszym protokole zarodki zebrafish są zakażane poprzez domięśniową mikroiniekcję bakterii znakowanych fluorescencyjnie do śródmózgowia lub tułowia (Rycina 3), a następnie obserwowane za pomocą konfokalnego obrazowania na żywo. Zakażenie tymi dwiema drogami ogranicza infekcję lokalnie, co powoduje rekrutację wrodzonych komórek odpornościowych i następującą po niej śmierć k...

Ten protokół opisuje technikę wizualizacji zachowania i śmierci makrofagów u embrionalnego danio pręgowanego podczas infekcji Mycobacterium marinum. Uwzględniono etapy przygotowania bakterii, zakażenia zarodków i mikroskopii przyżyciowej. Technika ta może być stosowana do obserwacji zachowania komórek i śmierci w podobnych scenariuszach obejmujących infekcję lub sterylny stan zapalny.

Wizualizacja śmierci komórek litycznych makrofagów podczas infekcji prątkami w zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii przyżyciowej

Zebrafish is an excellent model organism for studying innate immune cell behavior due to its transparent nature and reliance solely on its innate immune ...

Protokół ten może wyraźnie różnicować tryby śmierci komórek makrofagów podczas infekcji prątkami. Obserwując wiele zarodków równolegle, znacznie zwiększa się prawdopodobieństwo uchwycenia całego procesu śmierci komórek litycznych makrofagów. Protokół ten może być również stosowany do obserwacji śmierci komórki i innych zachowań komórkowych w podobnych scenariuszach obejmujących infekcję lub sterylny stan zapalny.Podczas przedłużonego obrazowania na żywo bardzo ważne jest, aby intensywność lasera była jak najniższa, aby uniknąć fotowybielania i toksyczności. Po zaszczepieniu zgodnie z manuskryptem, odwirować kulturę w temperaturze 3000 razy G przez 10 minut, aby zebrać Mycobacterium marinum w postaci osadu. Wyrzucić wszystko, z wyjątkiem 300 mikrolitrów supernatantu, i ponownie zawiesić osad.Dodaj trzy mililitry pożywki 7H9 z 10% glicerolem, aby dalej zawiesić osad, a następnie poddać sonikę zawiesinie w łaźni wodnej o mocy 100 watów, z 15 sekundami włączenia i 15 sekundami przerwy, w sumie dwie minuty, aby uzyskać jednorodność pojedynczej komórki. Przenieś zawiesinę bakteryjną do 10-mililitrowej strzykawki i przepuść przez filtr o grubości pięciu mikronów, aby usunąć wszelkie grudki bakteryjne. Za pomocą spektrofotometru zmierzyć gęstość optyczną zawiesiny i rozcieńczyć ją pożywką 7H9 zawierającą 10% glicerolu do jednorazowego OD 600.Podziel zawiesinę na 10 mikrolitrów porcji i przechowuj w zamrażarce o temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza do dalszego wykorzystania. Najpierw podgrzej agarozę w bloku grzewczym o temperaturze 95 stopni Celsjusza, aż całkowicie się rozpuści. Utrzymuj agarozę w postaci płynnej, umieszczając ją w bloku grzewczym o temperaturze 45 stopni Celsjusza.Aby zamontować infekcję śródmięśniową w okolicy tułowia, utwórz dolną warstwę agarozy, wylewając równomiernie 0,5 mililitra agarozy o zawartości 1% wagowo na szklane szkiełko. Umieść szkiełko na zamrażalniku lub zimnej powierzchni na trzy minuty, aby stężało. Po znieczuleniu zarodków danio pręgowanego umieść do 60 zarodków danio pręgowanego na dolnej warstwie agarozy i ostrożnie ułóż je w dwóch rzędach.Usuń pozostałą wodę z dolnej warstwy agarozy za pomocą bibuły, a następnie dodaj 0,3 mililitra agarozy o masie 0,5%, aby utworzyć górną warstwę. Upewnij się, że zarodki są całkowicie osadzone w agarozie. Ponownie włóż szklane szkiełko do zamrażalnika, aby zestalić agarozę.Utrzymuj górną warstwę agarozy wilgotną, pokrywając powierzchnię dodatkową wodą jajeczną E3. Następnie ustaw mikrowtryskiwacz i mikromanipulator w odpowiedniej pozycji i ustawieniu do mikroiniekcji. Przenieś trzy mikrolitry przygotowanej kultury bakteryjnej do przygotowanej igły za pomocą mikroładowarki.Pipetować powoli i ostrożnie, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza. Wstrzyknąć 100 jtk w okolicę tułowia. Po mikroiniekcji ostrożnie spłucz zarodki danio pręgowanego do świeżej wody z jaj za pomocą plastikowej pipety.Aby zamontować infekcję śródmózgowia, użyj plastikowej pipety, aby przenieść od czterech do sześciu znieczulonych trikainą zarodków do agarozy. Ostrożnie ustaw głowę każdego zarodka do góry za pomocą igły o rozmiarze 10. Po ustaleniu pozycji wszystkich zarodków przenieś szklane szkiełko do zamrażalnika lub zimnej powierzchni, aby agaroza zastygła.Wstrzyknij 500 CFU do śródmózgowia. Po mikroiniekcji ostrożnie spłucz zarodki danio pręgowanego do świeżej wody z jaj za pomocą plastikowej pipety. Gdy agaroza całkowicie stężeje, przykryj ją warstwą wody jajecznej.Po ustawieniu komory środowiskowej umieść 35-milimetrowe szklane naczynie z dnem wraz z danio pręgowanym w komorze środowiskowej. Otwórz diodę 405, argon o mocy 20% i laser nanometrowy DPSS 561. Ustaw odpowiednią moc lasera w ustawieniach widma.Wybierz tryb akwizycji skanowania sekwencyjnego XYZ i ustaw format obrazów na 512 na 512 pikseli. Przełącz się w tryb danych na żywo, wyceluj w pozycję pierwszego danio pręgowanego i zaznacz początkową i końcową pozycję Z. Powtórz ten proces dla każdego z pozostałych zarodków.Dodaj pauzę na końcu programu. Zdefiniuj pętlę i cykl programu, a następnie zapisz plik. W tym badaniu wykorzystaliśmy wcześniej zgłoszone transgeniczne coro1a:eGFP; lyzDsRed2 i transgeniczny mpeg1loxP; DsRed:loxPeGFP; lyz:eGFP, w celu rozróżnienia makrofagów i neutrofili in vivo.Makrofag silnie nabrzmiały bakteryjnie stawał się okrągły i wykazywał zmniejszoną ruchliwość, z ewentualnym obrzękiem cytoplazmatycznym, pęknięciem błony komórkowej i szybkim rozprzestrzenianiem się zawartości cytoplazmatycznej. Makrofagi napromieniowane promieniowaniem UV wykazywały typowe apoptotyczne fenotypy komórek, takie jak kurczenie się komórek, fragmentacja jądra i kondensacja chromatyny. Zaobserwowano również, że makrofagi aktywnie fagocytozują i rozprzestrzeniają M. merinum.Jednak neutrofile miały ograniczoną zdolność fagocytarną i szybko ulegały śmierci komórek litycznych bez widocznego obrzęku bakteryjnego. W połączeniu z potężnymi narzędziami do edycji genów, protokół ten może stanowić skuteczną platformę do dalszego zrozumienia wpływu różnych czynników na interakcję gospodarz-patogen in vivo.

visualization-macrophage-lytic-cell-death-during-mycobacterial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przezroczyste zarodki rybek danio-ostrolepisnych okazały się użytecznymi modelami gospodarzy do wizualizacji i funkcjonalnego badania oddziaływań między komórkami odporności wrodzonej a wewnątrzkomórkowymi patogenami bakteryjnymi, takimi jak Salmonella typhimurium oraz Mycobacterium marinum. Mikrowstrzykiwanie bakterii oraz wielobarwne obrazowanie fluorescencyjne to kluczowe techniki stosowane w modelach infekcji zarodków rybek danio-ostrolepisnych.

Zakażanie zarodków danio pręgowanego wewnątrzkomórkowymi patogenami bakteryjnymi

Szybki rozwój, niewielki rozmiar i przezroczystość danio pręgowanego stanowią ogromne zalety w badaniach nad wrodzonym immunologicznym kontrolowaniem infekcji1-4. W niniejszej pracy prezentujemy techniki zakażania larw danio pręgowanego grzybiczym patogenem Candida albicans za pomocą mikroiniekcji – metodologii wykorzystanej niedawno do wykazania roli aktywności NADPH oksydazy fagocytów w kontrolowaniu dimorfizmu grzybów5.

Nieinwazyjne obrazowanie rozsianej kandydozy u larw rybek danio

Źródło: Zhang, X., et al. Model zarodka danio pręgowanego do wizualizacji in vivo i analizy przyżyciowej zakażenia Staphylococcus aureus związanego z biomateriałem. J. Vis. Exp. (2019 rok)Film przedstawia obrazowanie fluorescencyjne zarodków danio pręgowanego, którym wstrzyknięto Staphylococcus aureus, umożliwiając ilościowe określenie progresji infekcji i rozmieszczenia bakterii w celu oceny wpływu mikrosfer biomateriału na interakcje gospodarz-patogen in vivo.

 Obrazowanie fluorescencyjne infekcji bakteryjnej związanej z biomateriałem w zarodkach danio pręgowanego

Źródło: Niu, L., et al., Wizualizacja śmierci komórek litycznych makrofagów podczas infekcji mykobakteryjnej w zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii przyżyciowej. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film przedstawia przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej Mycobacterium marinum z hodowli w późnej fazie logarytmicznej do konsekwentnego stosowania w testach infekcji i dalszych zastosowaniach.

Przygotowanie jednokomórkowego inokulum bakteryjnego

Źródło: Niu, L. i in. Wizualizacja śmierci limfocytów makrofagów podczas zakażenia mykobakteriami w zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii śródwitalnej. J. Vis. Exp. (2019)Ten film pokazuje zastosowanie mikroskopii konfokalnej wewnątrzżyciowej do wizualizacji litycznej śmierci komórek makrofagów u zarodków danio pręgowanego po zakażeniu Mycobacterium marinum .

Obrazowanie na żywo śmierci komórek makrofagów podczas infekcji mykobakterią w zarodkach danio dano pręgowanego

Źródło: Bernut, A. i inni. Rozszyfrowanie i obrazowanie patogenezy oraz układania rdzenia ropnia Mycobacterium absceptus w zarodkach danio dano dano. J. Vis. Exp. (2015)Ten film demonstruje protokół wykorzystujący transgeniczne zarodki danio danio ekspresyjne ekspresujące makrofagi fluorescencyjne i zakażone fluorescencyjnym szczepem Mycobacterium abscessus rough do wizualizacji interakcji żywiciel-patogen. Pokazuje, jak pozakomórkowe przewody umożliwiają unikanie odporności, wspierając...

Obrazowanie na żywo interakcji żywiciel-patogen w zarodkach danio dano zakażonych Mycobacterium abscessus

Optycznie przezroczyste embriony danio pręgowanego są szeroko stosowane do badania i wizualizacji w czasie rzeczywistym interakcji między patogennymi mikroorganizmami a wrodzonymi komórkami odpornościowymi. Mikroiniekcja Mycobacterium abscessus, w połączeniu z obrazowaniem fluorescencyjnym, służy do badania podstawowych cech chorobotwórczych, takich jak tworzenie się pępowiny w zarodkach danio pręgowanego.

Rozszyfrowywanie i obrazowanie patogenezy i sznurowania Mycobacterium abscessus w zarodkach danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół modelowania ludzkiej gruźlicy u dorosłego danio pręgowanego przy użyciu jego naturalnego patogenu Mycobacterium marinum. Wyekstrahowane DNA i RNA z narządów wewnętrznych zakażonego danio pręgowanego można wykorzystać do ujawnienia całkowitego obciążenia prątkami u ryb i odpowiedzi immunologicznej gospodarza za pomocą qPCR.

Modelowanie gruźlicy u dorosłych ryb pręgowanych zakażonych Mycobacterium marinum

Niniejsze badanie opisuje model zarodka danio pręgowanego do wizualizacji in vivo i analizy przyżyciowej infekcji związanej z biomateriałem w czasie na podstawie mikroskopii fluorescencyjnej. Model ten jest obiecującym systemem uzupełniającym modele zwierzęce ssaków, takie jak modele mysie, do badania zakażeń związanych z biomateriałem in vivo.

Model zarodka danio pręgowanego do wizualizacji in vivo i analizy przyżyciowej zakażenia Staphylococcus aureus związanego z biomateriałem

Tutaj prezentujemy protokół do ilościowego określania uszkodzeń mózgu, deficytów lokomotorycznych i zapalenia nerwowego po krwawieniu do mózgu u larw danio pręgowanego, w kontekście ludzkiego krwotoku śródmózgowego (ICH).

Wykorzystanie larw danio pręgowanego do badania patologicznych konsekwencji udaru krwotocznego

Pokazujemy metodę, która wykorzystuje szybką skaningową mikroskopię konfokalną do wykonywania na żywo obrazowania komórek mikrogleju w rozwijającym się tektum wzrokowym danio pręgowanego, umożliwiając analizę dynamiki tych komórek in vivo.

Obrazowanie na żywo i charakterystyka dynamiki mikrogleju w zarodku danio pręgowanego

Poznaj metodę wizualizacji śmierci komórek makrofagów podczas infekcji Mycobacterium marinum w zarodkach Danio rerio za pomocą mikroskopii przyżyciowej. Technika umożliwia obserwację dynamiki komórkowej in vivo.

Wizualizacja śmierci komórek litycznych makrofagów podczas infekcji prątkami w zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii przyżyciowej (Wideo) | JoVE Journal

Wizualizacja śmierci komórek litycznych makrofagów podczas infekcji prątkami w zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii przyżyciowej

Przeglądaj więcej filmów