Wizualizacja śmierci komórek litycznych makrofagów podczas infekcji prątkami w zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii przyżyciowej

Protokół ten może wyraźnie różnicować tryby śmierci komórek makrofagów podczas infekcji prątkami. Obserwując wiele zarodków równolegle, znacznie zwiększa się prawdopodobieństwo uchwycenia całego procesu śmierci komórek litycznych makrofagów. Protokół ten może być również stosowany do obserwacji śmierci komórki i innych zachowań komórkowych w podobnych scenariuszach obejmujących infekcję lub sterylny stan zapalny.

Podczas przedłużonego obrazowania na żywo bardzo ważne jest, aby intensywność lasera była jak najniższa, aby uniknąć fotowybielania i toksyczności. Po zaszczepieniu zgodnie z manuskryptem, odwirować kulturę w temperaturze 3000 razy G przez 10 minut, aby zebrać Mycobacterium marinum w postaci osadu. Wyrzucić wszystko, z wyjątkiem 300 mikrolitrów supernatantu, i ponownie zawiesić osad.

Dodaj trzy mililitry pożywki 7H9 z 10% glicerolem, aby dalej zawiesić osad, a następnie poddać sonikę zawiesinie w łaźni wodnej o mocy 100 watów, z 15 sekundami włączenia i 15 sekundami przerwy, w sumie dwie minuty, aby uzyskać jednorodność pojedynczej komórki. Przenieś zawiesinę bakteryjną do 10-mililitrowej strzykawki i przepuść przez filtr o grubości pięciu mikronów, aby usunąć wszelkie grudki bakteryjne. Za pomocą spektrofotometru zmierzyć gęstość optyczną zawiesiny i rozcieńczyć ją pożywką 7H9 zawierającą 10% glicerolu do jednorazowego OD 600.

Podziel zawiesinę na 10 mikrolitrów porcji i przechowuj w zamrażarce o temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza do dalszego wykorzystania. Najpierw podgrzej agarozę w bloku grzewczym o temperaturze 95 stopni Celsjusza, aż całkowicie się rozpuści. Utrzymuj agarozę w postaci płynnej, umieszczając ją w bloku grzewczym o temperaturze 45 stopni Celsjusza.

Aby zamontować infekcję śródmięśniową w okolicy tułowia, utwórz dolną warstwę agarozy, wylewając równomiernie 0,5 mililitra agarozy o zawartości 1% wagowo na szklane szkiełko. Umieść szkiełko na zamrażalniku lub zimnej powierzchni na trzy minuty, aby stężało. Po znieczuleniu zarodków danio pręgowanego umieść do 60 zarodków danio pręgowanego na dolnej warstwie agarozy i ostrożnie ułóż je w dwóch rzędach.

Usuń pozostałą wodę z dolnej warstwy agarozy za pomocą bibuły, a następnie dodaj 0,3 mililitra agarozy o masie 0,5%, aby utworzyć górną warstwę. Upewnij się, że zarodki są całkowicie osadzone w agarozie. Ponownie włóż szklane szkiełko do zamrażalnika, aby zestalić agarozę.

Utrzymuj górną warstwę agarozy wilgotną, pokrywając powierzchnię dodatkową wodą jajeczną E3. Następnie ustaw mikrowtryskiwacz i mikromanipulator w odpowiedniej pozycji i ustawieniu do mikroiniekcji. Przenieś trzy mikrolitry przygotowanej kultury bakteryjnej do przygotowanej igły za pomocą mikroładowarki.

Pipetować powoli i ostrożnie, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza. Wstrzyknąć 100 jtk w okolicę tułowia. Po mikroiniekcji ostrożnie spłucz zarodki danio pręgowanego do świeżej wody z jaj za pomocą plastikowej pipety.

Aby zamontować infekcję śródmózgowia, użyj plastikowej pipety, aby przenieść od czterech do sześciu znieczulonych trikainą zarodków do agarozy. Ostrożnie ustaw głowę każdego zarodka do góry za pomocą igły o rozmiarze 10. Po ustaleniu pozycji wszystkich zarodków przenieś szklane szkiełko do zamrażalnika lub zimnej powierzchni, aby agaroza zastygła.

Wstrzyknij 500 CFU do śródmózgowia. Po mikroiniekcji ostrożnie spłucz zarodki danio pręgowanego do świeżej wody z jaj za pomocą plastikowej pipety. Gdy agaroza całkowicie stężeje, przykryj ją warstwą wody jajecznej.

Po ustawieniu komory środowiskowej umieść 35-milimetrowe szklane naczynie z dnem wraz z danio pręgowanym w komorze środowiskowej. Otwórz diodę 405, argon o mocy 20% i laser nanometrowy DPSS 561. Ustaw odpowiednią moc lasera w ustawieniach widma.

Wybierz tryb akwizycji skanowania sekwencyjnego XYZ i ustaw format obrazów na 512 na 512 pikseli. Przełącz się w tryb danych na żywo, wyceluj w pozycję pierwszego danio pręgowanego i zaznacz początkową i końcową pozycję Z. Powtórz ten proces dla każdego z pozostałych zarodków.

Dodaj pauzę na końcu programu. Zdefiniuj pętlę i cykl programu, a następnie zapisz plik. W tym badaniu wykorzystaliśmy wcześniej zgłoszone transgeniczne coro1a:eGFP; lyzDsRed2 i transgeniczny mpeg1loxP; DsRed:loxPeGFP; lyz:eGFP, w celu rozróżnienia makrofagów i neutrofili in vivo.

Makrofag silnie nabrzmiały bakteryjnie stawał się okrągły i wykazywał zmniejszoną ruchliwość, z ewentualnym obrzękiem cytoplazmatycznym, pęknięciem błony komórkowej i szybkim rozprzestrzenianiem się zawartości cytoplazmatycznej. Makrofagi napromieniowane promieniowaniem UV wykazywały typowe apoptotyczne fenotypy komórek, takie jak kurczenie się komórek, fragmentacja jądra i kondensacja chromatyny. Zaobserwowano również, że makrofagi aktywnie fagocytozują i rozprzestrzeniają M. merinum.

Jednak neutrofile miały ograniczoną zdolność fagocytarną i szybko ulegały śmierci komórek litycznych bez widocznego obrzęku bakteryjnego. W połączeniu z potężnymi narzędziami do edycji genów, protokół ten może stanowić skuteczną platformę do dalszego zrozumienia wpływu różnych czynników na interakcję gospodarz-patogen in vivo.