Rozszyfrowywanie i obrazowanie patogenezy i sznurowania Mycobacterium abscessus w zarodkach danio pręgowanego

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie i porównanie zjadliwości szczepów Mycobacterium abscessus oraz opisanie interakcji między tymi bakteriami a wrodzonym układem odpornościowym gospodarza in vivo przy użyciu przezroczystych zarodków danio pręgowanego. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie jednorodnej inokulki bakteryjnej. Następnie zarodkom wstrzykuje się dożylnie zawiesiny bakteryjne po 30 godzinach od zapłodnienia.

Dodatkowo, aby dokładniej zbadać rolę makrofagów w kontroli zakażeń, stosuje się procedurę iniekcji opartą na lipo choinie do generowania zarodków zubożonych w makrofagi. Na koniec zakażone zarodki są przygotowywane i obrazowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i konfokalnej w celu monitorowania postępu infekcji. Ostatecznie wyniki, które można uzyskać, pokazują specyficzne interakcje między fluorescencyjnymi komórkami fagocytarnymi a M abscessus, zarówno jako pojedyncze podstawki, jak i jako serpentynowe sznury wewnątrz przezroczystego zarodka.

Główną zaletą stosowania danio pręgowanego w porównaniu z innymi modelami zwierzęcymi, takimi jak myszy, jest to, że pozwala to na dokładne zbadanie procesu infekcji w czasie rzeczywistym i zbadanie obrazu konkretnych interakcji między ropniami mikrobakterii a mikrofagami lub neutrofilami. Ten etap ma kluczowe znaczenie dla późniejszego ciśnienia wtrysku u danio pręgowanego. Ze względu na dużą skłonność szorstkich prątków do tworzenia dużych agregatów i wytwarzania kodów, konieczne jest zatem specjalne leczenie w celu przygotowania jednorodnego i kontrolowanego ilościowo inokularnego produktu przed mikroiniekcją.

Aby przygotować ropień, inokularnie zbieraj wykładniczo rosnące kultury z kolb do kultur tkankowych o powierzchni 150 centymetrów kwadratowych do 50-mililitrowych sterylnych plastikowych probówek i wiruj w temperaturze 4000 razy G i temperaturze pokojowej przez 15 minut. Użyj jednego mililitra pożywki Middlebrook seven H dziewięć, uzupełnionej wzbogaceniem OADC, oraz pożywki tween 80, zwanej dalej pożywką seven H 9, aby ponownie zawiesić osad i Eloqua. 200 mikrolitrów zawiesin bakteryjnych w 1,5-mililitrowych probówkach z igłą o rozmiarze 26 homogenizuje każdy quad ALI zawiesiny bakteryjnej 15 razy.

Następnie, używając kąpieli wodnej, sonikuj sonikację trzy razy przez 10 sekund każdy, z dziesięciosekundowymi przerwami. W międzyczasie dodaj jeden mililitr siedmiu H dziewięć, pożywkę i krótko wirować, a następnie odwirować przy 100 razy G przez trzy minuty. Ostrożnie zebrać prątki zawierające supernatanty, aby uniknąć grudek i wyciągnąć jednorodne zawiesiny do 50-mililitrowej sterylnej plastikowej probówki.

Odwirować zawiesinę w temperaturze 4 000 razy G przez pięć minut i użyć 200 mikrolitrów pożywki o stężeniu siedmiu H dziewięć do ponownego zawieszenia osadu, ocenić końcowe inokulum bakteryjne. Zgodnie z protokołem tekstowym, wizualna demonstracja tej metody, ma ona kluczowe znaczenie, ponieważ kroki są trudne do nauczenia, ponieważ precyzyjna, delikatna manipulacja wstrzyknięciem w zarodkach danio pręgowanego pod mikroskopem, a także nabycie techniki mikroiniekcji wymagały czasu Aby przeprowadzić mikroiniekcję ropnia M po około 24 godzinach. Po zapłodnieniu lub HPF użyj pęsety, aby pokryć zarodki na 100-milimetrowej szalce Petriego i utrzymuj je w temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza.

Przenieś 30 48 zarodków HPF do komory pozycjonującej w kształcie litery V wypełnionej 25 mililitrami wody rybnej zawierającej 270 miligramów na litr trica z przyciętą końcówką mikroładowarki. Ułóż zarodki odpowiednio w kanałach, aby ułatwić manipulację. Użyj PBST z 0,05% między 80, aby rozcieńczyć inokulum mikrobakteryjne do pożądanego CFU, który ma zostać dostarczony i dodaj 10% czerwieni fenolowej, aby sprawdzić prawidłowe wstrzyknięcie za pomocą końcówki mikroładowarki.

Załadować igłę do mikroiniekcji z pięcioma do 10 mikrolitrami inokulum bakteryjnego. Podłącz igłę do mikroiniekcji do uchwytu mikromanipulatora podłączonego do wtryskiwacza i za pomocą cienkiej pęsety odłam górną część igły. Aby uzyskać średnicę otworu od pięciu do 10 mikrometrów.

Skalibruj objętość wtrysku, regulując ciśnienie i czas mikroiniekcji. Następnie, aby uzyskać wymaganą objętość wstrzyknięcia, należy zmierzyć średnicę kropelki wydalonej do żółtka jednego zarodka w celu mikrowstrzyknięcia do żyły dorszowej. Ustawić zarodek stroną brzuszną skierowaną w stronę igły i umieścić końcówkę igły blisko otworu moczowo-płciowego.

I delikatnie wepchnij końcówkę igły w zarodek, aż przebije obszar żyły rozpieszczonej. Następnie podaj żądaną objętość zawiesiny bakteryjnej, zwykle od jednego do trzech nanolitrów zawierających około 100 CFU na nanolitr. Inkubować i monitorować zarodki zgodnie z protokołem tekstowym w celu przeprowadzenia lipo Choate, zubożenia makrofagów i zarodków w temperaturze 24 HP. Los, zarodki i przenieś je do naczynia iniekcyjnego wypełnionego wodą rybną z trica.

Następnie ustaw je grzbietem strony w dół. Po zawirowaniu roztworu klodronianu w kapsułkach liposomowych, załadować igłę mikrokapilarną i skalibrować objętość wstrzyknięcia. Przekłuć obszar żyły rozpieszczonej, jak pokazano wcześniej, i wstrzyknąć dwa do trzech litrów roztworu.

Powtórzyć wstrzyknięcie trzy razy. Inkubuj zarodki w temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza i użyj mikroskopii fluorescencyjnej, aby kontrolować prawidłowe zubożenie makrofagów przed zakażeniem. Jak pokazano wcześniej w tym filmie, aby wyliczyć jednostki tworzące kolonie lub CFU w żądanym punkcie czasowym.

Zbierz pięć zarodków na stan infekcji i przenieś każdy zarodek do 1,5-mililitrowej mikroprobówki wirówkowej. Krioznieczulenie zarodków przez inkubację na lodzie przez 10 minut po eutanazji zarodków w dawce od 300 do 500 miligramów na litr. Trica. Użyj sterylnej wody, aby dwukrotnie umyć zarodki w nowej probówce.

Następnie, po usunięciu wody w 2% Triton X 100 w jednym XPBS do każdego zarodka i użyj igły o rozmiarze 26 do homogenizacji tkanki w celu całkowitej lizy. Po odwirowaniu zawiesiny należy użyć jednego X-P-B-S-T do ponownego zawieszenia osadu. Następnie szeregowe rozcieńczanie płytki jednorodnej na Middlebrook seven H 10 OADC.

Uzupełniony B-B-L-M-G-I-T Panta, inkubuje płytki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez cztery dni przed zliczeniem kolonii w celu obrazowania na żywo infekcji M abscessus, montuje trica znieczulone zarodki w 1% niskiej temperaturze topnienia na 35-milimetrowej szklanej szalce Petriego do mikroskopu odwróconego lub na szkiełku z pojedynczym wgłębieniem wnęki do pionowej mikroskopii konfokalnej. Ustaw zarodek w żądanej pozycji i przykryj zestalony aros wodą rybną zawierającą triki w celu utrwalenia obrazowania zakażenia M abscessus. Po eutanazji zarodków przenieś je do 1,5 mililitrowych mikroprobówek wirówkowych i utrwal zarodki w 4% aldehydzie Paraform w jednym X-P-B-S-T przez dwie godziny.

W temperaturze pokojowej usuń aldehyd paraformowy, myjąc zarodki dwukrotnie jednym X-P-B-S-T przez 10 minut, aby zachować integralność tkanek i kolejno fluorescencję. Inkubować zarodki w rosnącym stężeniu roztworu glicerolu przez 10 minut na warunek. Połóż zarodek zanurzony w 50% glicerolu w komorze obserwacyjnej.

Na koniec użyj mikroskopu fluorescencyjnego z obiektywem 10x lub fluorescencyjnego mikroskopu konfokalnego z obiektywami 40x lub 63x do sekwencyjnego obrazowania fluorescencji i transmisji zarodka. Aby zbadać i porównać zjadliwość szorstkich i gładkich wariantów M abscessus, bakterie fluorescencyjne wstrzyknięto dożylnie do 30 zarodków biegłych w HPFC. W przeciwieństwie do wariantu gładkiego, szorstki wywołuje bardziej intensywną i śmiertelną infekcję z rozwojem ropni w ośrodkowym układzie nerwowym.

Różnice w zjadliwości określono ilościowo albo przez zliczenie CFU, albo przez określenie liczby pikseli fluorescencyjnych, które są skorelowane. Wskazuje to na wyższe obciążenia bakteryjne dla wariantu szorstkiego Jak widać na tym rysunku, kinetyka tworzenia się rdzenia może być monitorowana i obrazowana za pomocą mikroskopii wideo w sposób nieinwazyjny, wykazując skłonność wariantu szorstkiego do replikacji zewnątrzkomórkowej, jak pokazano tutaj. Zakażenie zarodków zubożonych w makrofagi szorstkim ropniem M prowadzi do ogromnego wzrostu obciążenia bakteryjnego i produkcji pępowiny oraz do szybkiej śmierci larw.

To wyraźnie wskazuje, że makrofagi są niezbędne do kontrolowania infekcji M abscessus, aby obserwować w czasie rzeczywistym interakcje między makrofagami a M abscessus. Można zastosować transgeniczną linię wiśni EG one M, która wytwarza makrofagi czerwonej fluorescencji. Infekcje indukują wyraźną rekrutację makrofagów z wydajną fagocytozą poszczególnych bakterii, podczas gdy sznury prątkowe reprezentują strategię wyewoluowaną przez ropnie, aby uniknąć fagocytozy po jej rozwoju.

Technika ta utorowała drogę do zbadania ważnej roli kodowania jako nowego mechanizmu unikania odporności. Dzięki kretowi danio pręgowanego możliwe staje się teraz obserwowanie i opisywanie in vivo udziału kodów w patogenezie ropni prątków.