Wykorzystanie larw danio pręgowanego do badania patologicznych konsekwencji udaru krwotocznego

Metoda ta zapewnia uzupełniające podejście przedkliniczne do badania natychmiastowej odpowiedzi komórkowej na krew w mózgu po udarze krwotocznym, bardzo poważnym stanie, na który nie mamy dostępnych dla pacjentów konkretnych leków. W przeciwieństwie do modeli gryzoni, przezroczystość larw danio pręgowanego pozwala nam obserwować reakcje komórkowe w mózgach żywych, nienaruszonych zwierząt w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Na początek użyj sitka do herbaty, aby zebrać wszystkie zapłodnione zarodki z naturalnego tarła w skrzynkach hodowlanych wyprodukowanych z jednego samca i jednej do dwóch samic dorosłego danio pręgowanego.

Przenieść 100 zarodków na każdą szalkę Petriego zawierającą wzorcową pożywkę dla zarodków E3. Inkubować w temperaturze 28 stopni Celsjusza i etapować zgodnie ze standardowymi wytycznymi. Po sześciu godzinach od zapłodnienia usuń martwe i niezapłodnione zarodki z naczynia za pomocą pipety Pasteura i włóż szalki z powrotem do inkubatora.

Po 24 godzinach od zapłodnienia, pod mikroskopem stereoskopowym w jasnym polu, użyj ostrych, ultracienkich kleszczy preparacyjnych, aby ozdobić zarodki do leczenia atorwastatyną. Następnie dodaj 30 mililitrów pożywki zarodkowej E3 do dwóch czystych szalek Petriego, jednej do leczenia, a drugiej do kontroli. Usuń 60 mikrolitrów wody z zarodka z naczynia zabiegowego i dodaj 60 mikrolitrów 0,5 milimolowej atorwastatyny, aby uzyskać 80% krwotoków larw.

Za pomocą pipety Pasteura przenieś 100 zarodków do każdej płytki w jak najmniejszej ilości wody. Inkubuj obie szalki w temperaturze 28 stopni Celsjusza. W dowolnym momencie po 50 godzinach od zapłodnienia, pod mikroskopem użyj pipety Pasteura, aby ostrożnie oddzielić ryby z krwotokiem od populacji bez krwotoku i przenieść larwy do nowych szalek zawierających świeże podłoże E3.

Aby ułatwić oddzielenie larw z dodatnim wynikiem krwotoku, można użyć ryb bez pigmentu lub ryb, które wyrażają białko fluorescencyjne w czerwonych krwinkach. Trzeciego dnia pod mikroskopem fluorescencyjnym przesiewa larwy, aby zapewnić ekspresję białka fluorescencyjnego. Następnie napełnij komorę montażową arkusza świetlnego mediami E3 zawierającymi 0,2% MS-222 do znieczulenia.

Za pomocą pipety Pasteura przenieś pojedynczą kroplę zawierającą od jednej do sześciu larw na suchą powierzchnię szalki Petriego w celu zamontowania. Użyj pipety, aby usunąć jak najwięcej płynu. Dodaj kroplę 1,5% niskotopliwej agarozy z bloku grzewczego o temperaturze 45 stopni Celsjusza do larw i użyj kapilary montażowej o grubości 800 mikrometrów, aby przyciągnąć larwy głową do góry.

Jeśli pozycjonowanie nie jest dokładne, wyrzuć larwy z agarozy i ponownie zamontuj. Pozostaw kapilę do ostygnięcia, a następnie włóż do komory na jasny arkusz. W oprogramowaniu do obrazowania ZEN naciśnij przycisk Continue, aby zorientować larwy i naciśnij przycisk acquire, aby uzyskać obrazy z-stack głowy między soczewkami oka.

Na karcie przetwarzania wygeneruj obraz projekcji o maksymalnej intensywności z każdego stosu z. Aby losowo wybrać do testu ruchliwości, przenieś 24 larwy po znieczuleniu do świeżej pożywki E3 i pozwól zwierzętom dojść do siebie po znieczuleniu. Po tym, jak larwy w pełni wyzdrowieją ze znieczulenia, za pomocą pipety z nacięciem końcowym przenieś odzyskane larwy do podłoża E3 bez błękitu metylenowego.

Umieść jedną larwę w jednym mililitrze na studzienkę 24-dołkowej płytki. Załaduj płytkę do komory kamery. W oprogramowaniu śledzącym EthoVision XT dostosuj ustawienia eksperymentu, aby skonfigurować rutynę przestraszenia światłem białym, aby zwiększyć spontaniczne pływanie i ruch testowy przez 10 minut.

Powtórzyć test lokomocji po 96 i 120 godzinach od zapłodnienia. Ocena śmierci komórek mózgowych przy użyciu transgenicznej linii reporterowej żyły wydzielanej przez ubikwitynę Annexin V M skutkuje wyraźnymi, określonymi skupiskami umierających komórek w krwotocznych larwach, które są nieobecne we wszystkich larwach bez krwotoku, na co wskazuje zielona fluorescencja Obrazy w jasnym polu wskazują na obecność krwawień do mózgu. Umierające komórki obserwowano zarówno w modelach atorwastatyny, jak i bąbelkowych dla larw z krwotokiem.

Morfologia makrofagów MPEG1 dodatnich zmienia się u larw dodatnich w krwotoku śródmózgowym, gdy komórki przyjmują aktywny zaokrąglony kształt ameboidalny. Te aktywowane zaokrąglone komórki były monitorowane w czasie, aby wykazać zwiększoną odpowiedź fagocytarną na wydzielaną przez ubikwitynę aneksynę V M żyły wyrażającej umierające komórki u larw z dodatnim krwotokiem śródmózgowym. Krwotok mózgowy wiąże się ze znacznym spadkiem ruchliwości po 72 i 96 godzinach od zapłodnienia w porównaniu z krwotokiem śródmózgowym z ujemnymi kontrolami rodzeństwa.

Ruchliwość po 120 godzinach od zapłodnienia wraca do poziomu zbliżonego do wyjściowego. Najważniejszym aspektem tej procedury jest dokładne zbadanie larw pod kątem obecności lub braku krwotoków mózgowych przed przystąpieniem do testów fenotypowania. Model ten może być również wykorzystany do badań przesiewowych leków w celu określenia, czy nasilenie fenotypu może ulec poprawie po krwawieniu, co może doprowadzić nas do zidentyfikowania nowych kandydatów na leki w przyszłości.

Ta technika pozwala nam badać reakcje komórkowe natychmiast po krwawieniu w mózgu w punkcie czasowym, który do tej pory był tak trudny do zbadania. Chociaż żaden z odczynników lub instrumentów opisanych w tym protokole nie jest szczególnie niebezpieczny, należy zachować standardową ostrożność i środki ostrożności podczas korzystania z chemikaliów, ostrych narzędzi lub laserów.