Wykorzystanie larw danio pręgowanego do badania patologicznych konsekwencji udaru krwotocznego
June 5th, 2019
Tutaj prezentujemy protokół do ilościowego określania uszkodzeń mózgu, deficytów lokomotorycznych i zapalenia nerwowego po krwawieniu do mózgu u larw danio pręgowanego, w kontekście ludzkiego krwotoku śródmózgowego (ICH).
Metoda ta zapewnia uzupełniające podejście przedkliniczne do badania natychmiastowej odpowiedzi komórkowej na krew w mózgu po udarze krwotocznym, bardzo poważnym stanie, na który nie mamy dostępnych dla pacjentów konkretnych leków. W przeciwieństwie do modeli gryzoni, przezroczystość larw danio pręgowanego pozwala nam obserwować reakcje komórkowe w mózgach żywych, nienaruszonych zwierząt w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Na początek użyj sitka do herbaty, aby zebrać wszystkie zapłodnione zarodki z naturalnego tarła w skrzynkach hodowlanych wyprodukowanych z jednego samca i jednej do dwóch samic dorosłego danio pręgowanego.
Przenieść 100 zarodków na każdą szalkę Petriego zawierającą wzorcową pożywkę dla zarodków E3. Inkubować w temperaturze 28 stopni Celsjusza i etapować zgodnie ze standardowymi wytycznymi. Po sześciu godzinach od zapłodnienia usuń martwe i niezapłodnione zarodki z naczynia za pomocą pipety Pasteura i włóż szalki z powrotem do inkubatora.
Po 24 godzinach od zapłodnienia, pod mikroskopem stereoskopowym w jasnym polu, użyj ostrych, ultracienkich kleszczy preparacyjnych, aby ozdobić zarodki do leczenia atorwastatyną. Następnie dodaj 30 mililitrów pożywki zarodkowej E3 do dwóch czystych szalek Petriego, jednej do leczenia, a drugiej do kontroli. Usuń 60 mikrolitrów wody z zarodka z naczynia zabiegowego i dodaj 60 mikrolitrów 0,5 milimolowej atorwastatyny, aby uzyskać 80% krwotoków larw.
Za pomocą pipety Pasteura przenieś 100 zarodków do każdej płytki w jak najmniejszej ilości wody. Inkubuj obie szalki w temperaturze 28 stopni Celsjusza. W dowolnym momencie po 50 godzinach od zapłodnienia, pod mikroskopem użyj pipety Pasteura, aby ostrożnie oddzielić ryby z krwotokiem od populacji bez krwotoku i przenieść larwy do nowych szalek zawierających świeże podłoże E3.
Aby ułatwić oddzielenie larw z dodatnim wynikiem krwotoku, można użyć ryb bez pigmentu lub ryb, które wyrażają białko fluorescencyjne w czerwonych krwinkach. Trzeciego dnia pod mikroskopem fluorescencyjnym przesiewa larwy, aby zapewnić ekspresję białka fluorescencyjnego. Następnie napełnij komorę montażową arkusza świetlnego mediami E3 zawierającymi 0,2% MS-222 do znieczulenia.
Za pomocą pipety Pasteura przenieś pojedynczą kroplę zawierającą od jednej do sześciu larw na suchą powierzchnię szalki Petriego w celu zamontowania. Użyj pipety, aby usunąć jak najwięcej płynu. Dodaj kroplę 1,5% niskotopliwej agarozy z bloku grzewczego o temperaturze 45 stopni Celsjusza do larw i użyj kapilary montażowej o grubości 800 mikrometrów, aby przyciągnąć larwy głową do góry.
Jeśli pozycjonowanie nie jest dokładne, wyrzuć larwy z agarozy i ponownie zamontuj. Pozostaw kapilę do ostygnięcia, a następnie włóż do komory na jasny arkusz. W oprogramowaniu do obrazowania ZEN naciśnij przycisk Continue, aby zorientować larwy i naciśnij przycisk acquire, aby uzyskać obrazy z-stack głowy między soczewkami oka.
Na karcie przetwarzania wygeneruj obraz projekcji o maksymalnej intensywności z każdego stosu z. Aby losowo wybrać do testu ruchliwości, przenieś 24 larwy po znieczuleniu do świeżej pożywki E3 i pozwól zwierzętom dojść do siebie po znieczuleniu. Po tym, jak larwy w pełni wyzdrowieją ze znieczulenia, za pomocą pipety z nacięciem końcowym przenieś odzyskane larwy do podłoża E3 bez błękitu metylenowego.
Umieść jedną larwę w jednym mililitrze na studzienkę 24-dołkowej płytki. Załaduj płytkę do komory kamery. W oprogramowaniu śledzącym EthoVision XT dostosuj ustawienia eksperymentu, aby skonfigurować rutynę przestraszenia światłem białym, aby zwiększyć spontaniczne pływanie i ruch testowy przez 10 minut.
Powtórzyć test lokomocji po 96 i 120 godzinach od zapłodnienia. Ocena śmierci komórek mózgowych przy użyciu transgenicznej linii reporterowej żyły wydzielanej przez ubikwitynę Annexin V M skutkuje wyraźnymi, określonymi skupiskami umierających komórek w krwotocznych larwach, które są nieobecne we wszystkich larwach bez krwotoku, na co wskazuje zielona fluorescencja Obrazy w jasnym polu wskazują na obecność krwawień do mózgu. Umierające komórki obserwowano zarówno w modelach atorwastatyny, jak i bąbelkowych dla larw z krwotokiem.
Morfologia makrofagów MPEG1 dodatnich zmienia się u larw dodatnich w krwotoku śródmózgowym, gdy komórki przyjmują aktywny zaokrąglony kształt ameboidalny. Te aktywowane zaokrąglone komórki były monitorowane w czasie, aby wykazać zwiększoną odpowiedź fagocytarną na wydzielaną przez ubikwitynę aneksynę V M żyły wyrażającej umierające komórki u larw z dodatnim krwotokiem śródmózgowym. Krwotok mózgowy wiąże się ze znacznym spadkiem ruchliwości po 72 i 96 godzinach od zapłodnienia w porównaniu z krwotokiem śródmózgowym z ujemnymi kontrolami rodzeństwa.
Ruchliwość po 120 godzinach od zapłodnienia wraca do poziomu zbliżonego do wyjściowego. Najważniejszym aspektem tej procedury jest dokładne zbadanie larw pod kątem obecności lub braku krwotoków mózgowych przed przystąpieniem do testów fenotypowania. Model ten może być również wykorzystany do badań przesiewowych leków w celu określenia, czy nasilenie fenotypu może ulec poprawie po krwawieniu, co może doprowadzić nas do zidentyfikowania nowych kandydatów na leki w przyszłości.
Ta technika pozwala nam badać reakcje komórkowe natychmiast po krwawieniu w mózgu w punkcie czasowym, który do tej pory był tak trudny do zbadania. Chociaż żaden z odczynników lub instrumentów opisanych w tym protokole nie jest szczególnie niebezpieczny, należy zachować standardową ostrożność i środki ostrożności podczas korzystania z chemikaliów, ostrych narzędzi lub laserów.
Przegląd
To badanie przedstawia protokół ilościowego określania uszkodzeń mózgu, deficytów ruchowych i neurozapalenia u larw rybki zebra w następstwie krwotoku śródczaszkowego (ICH), która jest krytycznym ludzkim stanem medycznym. Wykorzystanie przejrzystej natury larw rybki zebra pozwala na obserwację reakcji komórkowych w czasie rzeczywistym w żywym modelu mózgu po krwotoku udarowym.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Neurozapalenie
- Odzyskiwanie po udarze
Tło
- Krwotocz śródczaszkowy (ICH) jest poważnym stanem medycznym, dla którego brakuje specyficznych metod leczenia.
- Larwy rybki zebra służą jako innowacyjny model do badania reakcji mózgu ze względu na ich przezroczystość.
- Wizerunki w czasie rzeczywistym dostarczają wglądu w dynamiki komórkowe po uszkodzeniu mózgu.
- Badanie wykorzystuje mikroskopia fluorescencyjną do oceny neurozapalenia i innych reakcji komórkowych w mózgu.
Cel badania
- Opracowanie modelu przedklinicznego do badania reakcji komórkowych na krwotok udarowy.
- Zbadanie wpływu ICH na ruch i neurozapalenie.
- Poszukiwanie potencjalnych kandydatów do leków łagodzących skutki ICH.
Stosowane metody
- Główną platformą stosowaną jest mikroskopia fluorescencyjna do wizerunków reakcji komórkowych.
- Larwy rybki zebra są modelem biologicznym, przy czym skupia się na uszkodzeniu mózgu wywołanym krwotokiem.
- Kluczowe terminy obejmują zbieranie zarodków, stosowanie leczenia i późniejsze wizerunki w określonych godzinach po zapłodnieniu.
- Krytyczne fazy obejmują monitorowanie ruchliwości i ocenę reakcji neurozapalnych przez kilka dni.
Główne wyniki
- Obserwowano znaczące reakcje komórkowe, w tym skupiska umierających komórek u larw z krwotokami.
- Zauważono spadek ruchliwości po krwotoku, ze częściowym powrótem do normy po 120 godzinach.
- Aktywowane makrofagi wykazywały zmiany morfologiczne związane z reakcją na ICH.
- Ten model umożliwia ocenę potencjalnych interwencji terapeutycznych w przypadku udaru.
Konkluzje
- To badanie ustanawia model rybki zebra do badania ICH i jego komórkowych implikacji.
- Podejście to może ułatwić wyszukiwanie leków w celu poprawy wyników po krwotoku mózgowym.
- Ogólnie, rozwija zrozumienie dynamiki komórkowej po uszkodzeniu mózgu i potencjalnych mechanizmów odzyskiwania.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Zebrafish larval models address a critical gap in hemorrhagic stroke research by enabling real-time visualization of cellular responses to intracerebral hemorrhage, a process difficult to capture in opaque mammalian systems. This approach supports early target validation and mechanistic de-risking by quantifying neuroinflammation, cell death, and functional deficits in a disease-relevant in vivo system. The model’s compatibility with live imaging and motility assays provides predictive confidence for screening therapeutic candidates aimed at mitigating hemorrhage-induced pathology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing immediate cellular responses to blood in the brain, supporting target validation in hemorrhagic stroke pathways.
- Operational Value: Facilitates biological de-risking through conserved pathological phenotypes such as dying cell clusters and macrophage activation, which mirror human ICH responses.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative readouts of locomotor dysfunction and neuroinflammation, enabling reliable compound evaluation in phenotypic screening.
- Operational Value: Supports assay reproducibility and scalability via staged larval populations and automated tracking (e.g., EthoVision XT), enhancing throughput for lead identification.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates translational continuity by recapitulating key ICH consequences—neuroinflammation, cell death, and motor deficits—enabling preclinical validation of mechanism-based interventions.
- Operational Value: Allows longitudinal assessment from 72 to 120 hours post-fertilization, supporting risk-adjusted advancement decisions based on phenotypic recovery or persistence.
Pipeline & Workflow Integration
The zebrafish larval ICH model fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, offering a bridge between mechanistic insight and preclinical efficacy testing.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling real-time imaging of Annexin V-positive dying cells and MPEG1 macrophage morphological shifts following hemorrhage.
- Screening: Delivers assay readiness through quantifiable motility assays at 96 and 120 hpf, providing scalable, reproducible behavioral endpoints for compound screening.
- Analytics: Yields measurable outputs including fluorescence intensity of cell death reporters, macrophage morphology changes, and locomotion tracking data, enabling comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by modeling conserved human ICH pathologies, supporting biomarker-aligned target engagement studies.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for mechanistic screening and target de-risking across multiple therapeutic modalities due to its non-terminal, quantifiable readouts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct observation of hemorrhage-induced neuroinflammation and cell death.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via defined staging (e.g., 24 hpf decoronation, Atorvastatin treatment) and blinded hemorrhage sorting before phenotypic assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early efficacy signals in a disease-relevant system, reducing late-stage biological risk in stroke drug development.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying compounds that improve hemorrhage phenotypes, informing advancement based on functional recovery and cellular rescue.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish husbandry, embryonic staging, and fluorescent microscopy for live imaging.
- Dependent on instrumentation including light sheet or fluorescence microscopes, agarose mounting systems, and automated behavior tracking tools (e.g., EthoVision XT).
- Necessitates cross-team standardization in hemorrhage scoring and larval separation to ensure phenotypic assay validity.
- Involves adaptation considerations for pigment-free or transgenic reporter lines to enhance hemorrhage detection and signal clarity.
- Limited by larval size and throughput constraints compared to higher vertebrates, though offset by rapid generation times and optical accessibility.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:35
Day 0: Egg Production and Collection
1:11
Day 1 - 2: Atorvastatin Treatment and ICH- and ICH+ Populations Separation
2:22
Day 3 - 5: Cell Death, Leukocyte Analysis and Motility Assay
4:24
Results: Intracerebral Hemorrhage (ICH) in Zebrafish Larvae
5:39
Conclusion
