Name: Zakażenie zarodków danio pręgowanego wewnątrzkomórkowymi patogenami bakteryjnymi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
Description: Poznaj metodę mikroinjekcji bakterii fluorescencyjnych do zarodków Danio rerio w celu obrazowania interakcji patogenów z komórkami układu odpornościowego. Technika ta umożliwia badanie fagocytozy i odpowiedzi immunologicznej w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Chao Cui, Floor de Kort, Esther Stoop i Ralphowi Carvalho za obrazy zamieszczone na Rysunku 4, Ulrike Nehrdich i Davy’emu de Wittowi za opiekę nad rybami, a pozostałym członkom zespołu laboratoryjnego za pomocne dyskusje. Praca ta była wspierana przez program Smart Mix holenderskiego Ministerstwa Gospodarki oraz Ministerstwa Edukacji, Kultury i Nauki, projekt ZF-HEALTH (HEALTH-F4-2010-242048) w ramach 7. programu ramowego Komisji Europejskiej, europejską sieć szkoleniową Marie-Curie FishForPharma (PITN-GA-2011-289209) oraz przez australijski NHMRC (637394). Australian Regenerative Medicine Institute jest wspierany przez granty rządu stanu Wiktoria oraz rządu Australii.

<ol><li>Meijer, A. H., Spaink, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-pathogen+interactions+made+transparent+with+the+zebrafish+model%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model.</a> Curr. Drug Targets. 12, 1000-1017 (2011).</li>
<li>Davis, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+visualization+of+mycobacterium-macrophage+interactions+leading+to+initiation+of+granuloma+formation+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos.</a> Immunity. 17, 693-702 (2002).</li>
<li>vander Sar, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+embryos+as+a+model+host+for+the+real+time+analysis+of+Salmonella+typhimurium+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish embryos as a model host for the real time analysis of Salmonella typhimurium infections.</a> Cell Microbiol. 5, 601-611 (2003).</li>
<li>Zakrzewska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage-specific+gene+functions+in+Spi1-directed+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Macrophage-specific gene functions in Spi1-directed innate immunity.</a> Blood. 116, 1-11 (2010).</li>
<li>Le Guyader, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+unconventional+behavior+of+neutrophils+in+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish.</a> Blood. 111, 132-141 (2008).</li>
<li>Herbomel, P., Thisse, B., Thisse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+and+behaviour+of+early+macrophages+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo.</a> Development. 126, 3735-3745 (1999).</li>
<li>Alibaud, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mycobacterium+marinum+TesA+mutant+defective+for+major+cell+wall-associated+lipids+is+highly+attenuated+in+Dictyostelium+discoideum+and+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A Mycobacterium marinum TesA mutant defective for major cell wall-associated lipids is highly attenuated in Dictyostelium discoideum and zebrafish embryos.</a> Mol. Microbiol. 80, 919-934 (2011).</li>
<li>Carvalho, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+screen+for+tuberculosis+progression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A high-throughput screen for tuberculosis progression.</a> PLoS One. 6, 16779-16779 (2011).</li>
<li>van der Sar, A. M., Spaink, H. P., Zakrzewska, A., Bitter, W., Meijer, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+the+zebrafish+host+transcriptome+response+to+acute+and+chronic+mycobacterial+infection+and+the+role+of+innate+and+adaptive+immune+components%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Specificity of the zebrafish host transcriptome response to acute and chronic mycobacterial infection and the role of innate and adaptive immune components.</a> Mol. Immunol. 46, 2317-2332 (2009).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115-e1115 (2009).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Westerfield, M. The Zebrafish Book. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Brachydanio+rerio%29%22">A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio)</a>. , The University of Oregon Press. Eugene. (1993).</li>
<li>Gutzman, J. H., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Brain+Ventricle+Injection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Brain Ventricle Injection.</a> J. Vis. Exp. (26), e1218-e1218 (2009).</li>
<li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117, 49-56 (2011).</li>
<li>Stockhammer, O. W., Zakrzewska, A., Hegedus, Z., Spaink, H. P., Meijer, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+profiling+and+functional+analyses+of+the+zebrafish+embryonic+innate+immune+response+to+Salmonella+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transcriptome profiling and functional analyses of the zebrafish embryonic innate immune response to Salmonella infection.</a> J. Immunol. 182, 5641-5653 (2009).</li>
<li>Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108, 3976-3978 (2006).</li>
<li>Stoop, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+embryo+screen+for+mycobacterial+genes+involved+in+the+initiation+of+granuloma+formation+reveals+a+newly+identified+ESX-1+component%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component.</a> Dis. Model Mech. 4, 526-536 (2011).</li>
<li>Levraud, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+zebrafish+IFN+receptor%3A+implications+for+the+origin+of+the+vertebrate+IFN+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Identification of the zebrafish IFN receptor: implications for the origin of the vertebrate IFN system.</a> Journal of Immunology. 178, 4385-4394 (2007).</li>
<li>Levraud, J. P., Colucci-Guyon, E., Redd, M. J., Lutfalla, G., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+zebrafish+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of zebrafish innate immunity.</a> Methods Mol. Biol. 415, 337-363 (2008).</li>
<li>Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+disseminated+candidiasis+in+zebrafish+reveals+role+of+phagocyte+oxidase+in+limiting+filamentous+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth.</a> Eukaryot. Cell. 10, 932-944 (2011).</li>
<li>Colucci-Guyon, E., Tinevez, J. Y., Renshaw, S. A., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+of+professional+phagocytes+in+vivo%3A+unlike+macrophages%2C+neutrophils+engulf+only+surface-associated+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Strategies of professional phagocytes in vivo: unlike macrophages, neutrophils engulf only surface-associated microbes.</a> J. Cell Sci. 124, 3053-3059 (2011).</li>
<li>van Soest, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+static+immersion+and+intravenous+injection+systems+for+exposure+of+zebrafish+embryos+to+the+natural+pathogen+Edwardsiella+tarda%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunology%22%5BJournal%5D)">Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda.</a> BMC Immunology. 12, 58-58 (2011).</li>
<li>Adams, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+tolerance+in+replicating+mycobacteria+mediated+by+a+macrophage-induced+efflux+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Drug tolerance in replicating mycobacteria mediated by a macrophage-induced efflux mechanism.</a> Cell. 145, 39-53 (2011).</li>
<li>Ellett, F. L., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+quantification+of+fluorescent+leukocyte+numbers+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Computational quantification of fluorescent leukocyte numbers in zebrafish embryos.</a> Methods in Enzymology. , (2011).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+mRNA+and+Morpholino+Antisense+Oligonucleotides+in+Zebrafish+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.</a> J. Vis. Exp. (27), e1113-e1113 (2009).</li>
<li>Mathias, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+inflammation+by+retrograde+chemotaxis+of+neutrophils+in+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Resolution of inflammation by retrograde chemotaxis of neutrophils in transgenic zebrafish.</a> J. Leukoc. Biol. 80, 1281-1288 (2006).</li>
<li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Dev. Biol. 7, 42-42 (2007).</li>
<li>Gray, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+intravital+imaging+of+macrophage+and+neutrophil+behaviour+during+inflammation+using+a+novel+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb.+Haemost%22%5BJournal%5D)">Simultaneous intravital imaging of macrophage and neutrophil behaviour during inflammation using a novel transgenic zebrafish.</a> Thromb. Haemost. 105, 811-819 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie wykazali żadnych konfliktów interesów.

Metody infekcji opisane w tym artykule są często stosowane do badania funkcji genów odporności wrodzonej gospodarza lub genów wirulencji bakterii1. Metody mikroiniekcji dożylnej (protokoły 5 i 6.1) są najczęściej wykorzystywane w tego typu badaniach. Żyła ogonowa w tylnej wyspie krwi jest najwygodniejszym miejscem do iniekcji dożylnej w przypadku 1-dniowych embrionów. Ponieważ w późniejszych etapach żyła ogonowa staje się trudniejsza do nakłucia, w przypadku embrionów w wieku 2-3 dpf preferujemy przewód Cuviera jako miejsce iniekcji dożylnej. W każdym przypadku kluczowe jest wstrzykiwanie embrionom spójnej liczby bakterii, co powinno być weryfikowane poprzez wysiewanie inokulum iniekcyjnego w celu obliczenia cfu. Aby uzyskać powtarzalne iniekcje, należy wziąć pod uwagę następujące aspekty. Po pierwsze, niezbędne jest zastosowanie wysokiej jakości szklanych mikrokapilarnych igieł iniekcyjnych. Jeśli końcówka igły jest zbyt duża, iniekcja spowoduje powstanie otworu wystarczająco dużego, by doszło do krwawienia, a wstrzyknięte bakterie wypłyną z krwiobiegu. Po drugie, bakterie muszą być wstrzykiwane bezpośrednio do krwiobiegu. Jeśli końcówka igły nie znajduje się wewnątrz żyły lub jeśli płyn iniekcyjny rozprzestrzeni się do rozszerzenia pęcherzyka żółtkowego, embrion musi zostać wykluczony z eksperymentu. Po trzecie, zastosowanie PVP40 jako nośnika do iniekcji M. marinum pomoże zapobiec opadaniu bakterii w szklanej igle. PVP40 poprawia homogeniczność zawiesiny, co skutkuje bardziej powtarzalnymi inokulami przez cały czas trwania iniekcji. PVP40 może być również stosowane do iniekcji S. typhimurium, jednak w tym przypadku jest to mniej istotne, ponieważ większy rozmiar i silna fluorescencja bakterii pozwalają na wizualną kontrolę inokulum iniekcyjnego podczas eksperymentów. Do ćwiczenia iniekcji zalecamy stosowanie barwnika czerwieni fenolowej (1% v/v) lub 1 μm fluorescencyjnych kulek dostępnych w różnych kolorach (Invitrogen). Po opanowaniu techniki iniekcja 50-100 embrionów zajmuje około 30 minut, wliczając w to czas potrzebny na ustawienie embrionów na płytkach agarozy i dostosowanie objętości iniekcji bakteryjnej.
Choć najczęściej stosuje się iniekcje dożylne do wyspy krwi (protokół 5) lub do przewodu Cuviera (protokół 6.1), alternatywne drogi zakażenia opisane w tym artykule wideo okazały się przydatne w badaniu chemotaksji makrofagów i neutrofili (protokoły 6.2, 6.3 i 6.4), badaniu wzrostu atenuowanych szczepów bakteryjnych (protokół 6.5) oraz w adaptacji modelu zakażeń zebrafish do zastosowań wysokoprzepustowych (protokół 6.6) 4-8. Opisane metody mikroiniekcji można również zastosować do iniekcji wirusów 18, 19, zarodników grzybów 14, 20 lub pierwotniaków (Maria Forlenza, komunikacja osobista). Przydatnym uzupełnieniem procedur iniekcyjnych opisanych w tym artykule wideo jest niedawno opisana procedura podskórnego wstrzykiwania bakterii do embrionów zebrafish 21. Procedurę tę zastosowano do badania fagocytozy bakterii przez neutrofile, które, jak stwierdzono, efektywnie pochłaniają bakterie na powierzchni tkanek, ale w przeciwieństwie do makrofagów są praktycznie niezdolne do fagocytozy bakterii po wstrzyknięciu ich do krwi lub do wypełnionych płynem jam ciała. W przypadku iniekcji podskórnych embriony ustawia się podobnie jak przy iniekcjach do mięśni ogonowych opisanych w tym artykule wideo, jednak igłę wprowadza się tuż pod skórę, aby wstrzyknąć bakterie nad somitem.
Należy wziąć pod uwagę, że mikroiniekcja jest w istocie sztuczną drogą zakażenia. Jednakże wczesne embriony są wysoce odporne na zewnętrzną ekspozycję na patogeny bakteryjne. W rzeczywistości testy immersyjne, w których embriony są kąpane w zawiesinie bakteryjnej, nie są w naszych warunkach powtarzalne 22. Chociaż niektóre embriony mogą ulec zakażeniu podczas immersji, zaobserwowaliśmy w takich testach duże zróżnicowanie w stopniu śmiertelności oraz w ekspresji genów markerów zapalnych między poszczególnymi embrionami. Metody mikroiniekcji opisane w niniejszym artykule pozwalają na uzyskanie powtarzalnych zakażeń i są szczególnie użyteczne w badaniu interakcji bakterii z komórkami wrodzonej odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Efektywnym podejściem do ilościowego określenia zakażenia bakteryjnego w poszczególnych embrionach jest analiza obrazów fluorescencyjnych zakażonych embrionów przy użyciu dedykowanego, specjalistycznego oprogramowania do kwantyfikacji pikseli 17, 23. Wykazano, że podejście to dobrze koreluje z wynikami liczenia cfu po wysianiu zakażonych embrionów. Podobnie, względne zmiany w liczbie leukocytów na embrion zostały określone ilościowo poprzez cyfrową analizę obrazu w transgenicznych liniach reporterowych fluoroforów leukocytów; podejście to byłoby możliwe do zastosowania w celu ilościowego określenia leukopoetycznej odpowiedzi gospodarza na zakażenie24.
Funkcję genów odporności wrodzonej gospodarza można efektywnie badać in vivo, łącząc opisane modele infekcji z wyciszaniem za pomocą morfolino. Morfolino są syntetycznymi oligonukleotydami antysensownymi, które celują w specyficzne RNA i redukują ekspresję produktów genów po wstrzyknięciu do zarodków danio pręgowanego w stadium jednego komórki, co pokazano w innych artykułach wideo w tym czasopiśmie 10, 25. W badaniach nad wyciszaniem za pomocą morfolino niezwykle ważne jest, aby wszystkie porównywane grupy zarodków były prawidłowo stadiowane przed wstrzyknięciem bakterii. Jest to szczególnie istotne, ponieważ zarodki posiadają rozwijający się układ odpornościowy, który z czasem staje się coraz bardziej kompetentny.
Obecnie dostępnych jest kilka transgenicznych linii reporterowych pozwalających na rozróżnienie głównych podzbiorów odporności wrodzonej — makrofagów i neutrofili — w embrionach rybek zebrafish. Promotory mpx i lyz zostały wykorzystane do wytworzenia linii reporterowych dla neutrofili 16, 26, 27, natomiast promotory csf1r (fms) i mpeg1 posłużyły do stworzenia reporterów dla makrofagów 14, 28 . Podczas gdy csf1r (fms) jest dodatkowo ekspresowany w ksantoforach, ekspresja mpeg1 występuje wyłącznie w makrofagach. Jak pokazano w niniejszym artykule wideo, niedawno opracowane linie reporterowe mpeg1 są niezwykle użyteczne do obrazowania fagocytozy bakterii przez makrofagi.

<table><tbody><tr><td>Czerwony fenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>228210</td><td></td></tr><tr><td>agar Difco Middlebrook 7H10</td><td>BD Biosciences</td><td>262710</td><td></td></tr><tr><td>Wzbogacenie BBL Middlebrook OADC</td><td>BD Biosciences</td><td>211886</td><td></td></tr><tr><td>Bulion Difco Middlebrook 7H9</td><td>BD Biosciences</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>Wzbogacanie na podłożu BBL Middlebrook ADC</td><td>BD Biosciences</td><td>211887</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>Poliwinylo 원하는 pyrrolidon (PVP40)</td><td>Calbiochem</td><td>529504</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;fenylotiomocznik (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Metanosulfonian etylu 3-aminobenzoesanu (trykaina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Metyloceluloza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza SeaPlaque (agaroza o niskiej temperaturze topnienia)</td><td>Lonza Inc.</td><td>50100</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres (1,0 &amp;mu;m, czerwona fluorescencja (580/605))</td><td>Invitrogen</td><td>F8821</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres (1,0 &amp;mu;m, żółto-zielony fluorescencyjny (505/515))</td><td>Invitrogen</td><td>F8823</td><td></td></tr></tbody></table>

zakażanie zarodków danio pręgowanego wewnątrzkomórkowymi patogenami bakteryjnymi

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Zarodki danio pręgowanego (Danio rerio) są coraz częściej wykorzystywane jako model do badania funkcji wrodzonego układu odpornościowego kręgowców w interakcjach gospodarz-patogen 1. Główne typy komórek wrodzonego układu odpornościowego, makrofagi i neutrofile, rozwijają się podczas pierwszych dni embriogenezy, przed dojrzewaniem limfocytów niezbędnych do odpowiedzi odpornościowej adaptacyjnej. Łatwość pozyskiwania dużych liczb zarodków, ich dostępność dzięki rozwojowi zewnętrznemu, przeźroczystość optyczna stadiów embrionalnych i larwalnych, szeroka gama narzędzi genetycznych, obszerne zasoby mutantów oraz kolekcje transgenicznych linii reporterowych – wszystko to zwiększa wszechstronność modelu danio pręgowanego. Salmonella enterica serowar Typhimurium (S. typhimurium) oraz Mycobacterium marinum mogą bytować wewnątrzkomórkowo w makrofagach i są często używane do badania interakcji gospodarz-patogen w zarodkach danio pręgowanego. Procesy infekcji tych dwóch patogenów bakteryjnych są interesujące do porównania, ponieważ infekcja S. typhimurium jest ostra i śmiertelna w ciągu jednego dnia, podczas gdy infekcja M. marinum ma charakter przewlekły i może być obrazowana aż do stadium larwalnego 2, 3. Miejsce mikroiniekcji bakterii do zarodka (Rysunek 1) determinuje, czy infekcja szybko stanie się systemiczna, czy początkowo pozostanie zlokalizowana. Szybką infekcję systemiczną można wywołać poprzez mikroiniekcję bakterii bezpośrednio do krwiobiegu poprzez żyłę ogonową w tylnej wyspie krwi lub poprzez kanał Cuviera, szeroki kanał krążenia w worku żółtkowym łączący serce z naczyniami tułowia. W 1 dpf, kiedy zarodki na tym etapie posiadają fagocytycznie aktywne makrofagi, ale neutrofile nie dojrzały jeszcze, preferowana jest iniekcja do wyspy krwi. Dla iniekcji w 2-3 dpf, gdy zarodki posiadają również rozwinięte funkcjonalne (produkujące mieloperoksydazę) neutrofile, jako miejsce iniekcji preferowany jest kanał Cuviera. Aby badać ukierunkowaną migrację komórek mieloidalnych w kierunku lokalnych infekcji, bakterie można wstrzyknąć do mięśnia ogonowego, pęcherzyka słuchowego lub komory tylnomózgowia 4-6. Ponadto notochorda, struktura, która wydaje się być normalnie niedostępna dla komórek mieloidalnych, jest wysoce podatna na lokalną infekcję 7. Użyteczną alternatywą dla zastosowań wysokoprzepustowych jest iniekcja bakterii do żółtka zarodków w ciągu pierwszych godzin po zapłodnieniu 8. Połączenie fluorescencyjnych bakterii i transgenicznych linii danio pręgowanego z fluorescencyjnymi makrofagami lub neutrofilami tworzy idealne warunki do wielokolorowego obrazowania interakcji gospodarz-patogen. Niniejszy artykuł wideo opisze szczegółowe protokoły dożylnej i lokalnej infekcji zarodków danio pręgowanego bakteriami S. typhimurium lub M. marinum oraz późniejszego obrazowania fluorescencyjnego interakcji z komórkami wrodzonego układu odpornościowego.

Przezroczyste zarodki rybek danio-ostrolepisnych okazały się użytecznymi modelami gospodarzy do wizualizacji i funkcjonalnego badania oddziaływań między komórkami odporności wrodzonej a wewnątrzkomórkowymi patogenami bakteryjnymi, takimi jak Salmonella typhimurium oraz Mycobacterium marinum. Mikrowstrzykiwanie bakterii oraz wielobarwne obrazowanie fluorescencyjne to kluczowe techniki stosowane w modelach infekcji zarodków rybek danio-ostrolepisnych.

Zakażanie zarodków danio pręgowanego wewnątrzkomórkowymi patogenami bakteryjnymi

Zarodki rybki danio (*Danio rerio*) są coraz częściej wykorzystywane jako model do badania funkcji wrodzonego układu odpornościowego kręgowców w interakcjach gospodarz-patogen...

Ogólnym celem tej procedury jest mikroiniekcja zarodków rybek danio-ostrobramowych fluorescencyjnymi bakteriami w celu obrazowania na żywo ich interakcji z komórkami odpornościowymi gospodarza. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie i napełnienie igły iniekcyjnej zawiesinami bakteryjnymi. Następnie zarodki są klasyfikowane pod względem stadium rozwoju i ustawiane na płytce do iniekcji.Następnie inokulum bakteryjne jest wstrzykiwane wybraną drogą w celu wywołania miejscowej lub systemowej infekcji bakteryjnej. Na koniec embriony zostają zamocowane i poddane obrazowaniu. W rezultacie można uzyskać obrazy wykazujące wewnątrzkomórkową lokalizację patogenów bakteryjnych wewnątrz fluorescencyjnych fagocytów w przezroczystym embrionie gospodarza – rybki zebrafish – przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej i konfokalnej.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny immunologii, ponieważ model zarodka danio pręgowanego jest niezwykle skutecznym narzędziem do obrazowania na żywo interakcji między gospodarzem a patogenem. Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie będą napotykać trudności, gdyż wymaga ona wprawy w celu powtarzalnego mikrowstrzykiwania bakterii do krwiobiegu zarodków danio pręgowanego w celu wywołania infekcji systemowej lub do konkretnych przedziałów w celu wywołania infekcji miejscowych. Po wyciągnięciu szklanych mikrokapilar i ścięciu ich końcówek pod kątem 45 stopni, należy przygotować zarodki danio pręgowanego w 28 godzinach po zapłodnieniu, sprawdzając obecność prawidłowego krążenia krwi. Sygnałami są: początek pigmentacji oka, wyprostowany ogon oraz serce położone bezpośrednio brzusznie względem oka.Po znieczuleniu embrionów należy użyć końcówki mikroladowarki, aby napełnić igłę wcześniej przygotowanym inokulum bakteryjnym. Zamocuj napełnioną igłę w mikromanipulatorze połączonym ze statywem i ustaw go pod stereo-mikroskopem. Ustaw czas wstrzyknięcia na 0,2 seconds oraz ciśnienie kompensacyjne na 15 Hector Pascals.Dostosuj ciśnienie wtrysku w zakresie od 700 do 900 Hector Pascals, aby uzyskać odpowiednią objętość wtrysku dla użytej igły. Przed przystąpieniem do wstrzykiwania ustaw mikromanipulator z załadowaną igłą w odpowiedniej pozycji. Umieść znieczulone zarodki na płaskiej płytce do wtryskiwania z 1% agarozy i usuń nadmiar wody z jaj.Następnie, używając pętli z włosia, ustaw embriony do każdego wstrzyknięcia. Przesuwaj płytkę ręcznie podczas iniekcji, aby zorientować embriony tak, by ich ogony były skierowane w stronę końcówki igły. Umieść końcówkę igły bezpośrednio nad żyłą ogonową, w pobliżu otworu urogenitalnego.Przebij perydermę końcówką igły i wstrzyknij pożądaną dawkę bakterii znakowanych fluorescencyjnie. Stosujemy około 250 jednostek tworzących kolonie (CFU) salmonella typhimurium oraz około 120 CFU mycobacterium marum. Wstrzyknięta zawiesina bakteryjna będzie podążać zgodnie z przepływem krwi przez żyłę kądielną w kierunku serca; jeśli iniekcja została wykonana prawidłowo, można to zweryfikować, obserwując zwiększającą się objętość układu naczyniowego bezpośrednio po impulsie.Często sprawdzaj, czy objętość iniekcji pozostaje taka sama w trakcie eksperymentu. Aby zapewnić kontrolę spójności iniekcji w całym przebiegu doświadczenia, nanieś kroplę bakterii bezpośrednio na kroplę sterylnego PBS na pożywce do wzrostu bakterii. Po około każdych 30 iniekcjach embrionów, wysiej tę kroplę na płytkę i policz kolonie bakteryjne po inkubacji.Aby określić liczbę CFU w objętości iniekcji, należy użyć fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego do obserwacji pojedynczych fluorescencyjnych komórek styria krążących w krwiobiegu bezpośrednio po iniekcji i odrzucić embriony, które nie zostały prawidłowo zainfekowane. Fluorescencyjne agregaty bakterii M marum powinny być widoczne do drugiego dnia po infekcji i z czasem zwiększać swoje rozmiary. Aby wykonać iniekcję do przewodu Cuviera, należy ustawić znieczulone embriony w drugim lub trzecim dniu po zapłodnieniu.W przypadku wtryskiwania do żyły przedniej (duct of cuvier) pod kątem 45 stopni od strony grzbietowej zarodka, należy wprowadzić igłę w miejsce początku naczynia. W celu wstrzyknięcia do komory tylnego mózgu, igłę należy wprowadzić nieco grzbietowo względem miejsca, w którym naczynie zaczyna rozszerzać się nad pęcherzykiem żółtkowym. Zarodki w 32 godzinie po zapłodnieniu należy znieczulić, ustawiając ich stronę grzbietową w stronę czubka igły.Wprowadź igłę do komory tylnego mózgowia z pozycji przedniej, nie dotykając neurohelium, aby wykonać wtrysk do mięśni ogonowych. Umieść znieczulone embriony z pierwszego lub drugiego dnia po zapłodnieniu tak, aby ich ogony były skierowane w stronę końcówki igły; pod kątem około 65 stopni wykonaj wtrysk do mięśnia nad otworem urogenitalnym w celu wstrzyknięcia do pęcherzyka słuchowego. Ustaw znieczulone embriony z drugiego lub trzeciego dnia po zapłodnieniu tak, aby ich ogony były skierowane w stronę igły.Wstrzyknij pod kątem 65 stopni i pod niskim ciśnieniem do sznura węzłowego w pierwszym lub drugim dniu po zapłodnieniu. Ustaw embriony tak, aby ogon był skierowany w stronę przeciwną do igły. Wprowadź igłę przez tkankę mięśniową ogona do sznura.W przypadku wstrzykiwania do żółtka embrionów na etapie od 16 do 1000 komórek, przebij igłą chorion, wbijając ją w środek żółtka, aby obrazować infekcję. Zanurz zainfekowane embriony w warstwie 1% augurous w płytce Petri pokrytej wodą jajeczną z dodatkiem trica w celu znieczulenia. Za pomocą pętelki z włosia ustaw embriony w odpowiedniej pozycji do obrazowania pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym.Poszczególne fluorescencyjne komórki t szczepów można obserwować krążące w krwiobiegu bezpośrednio po wstrzyknięciu. Jeśli wymagana jest inna pozycja niż widok boczny, należy zamocować embriony w 1,5% metylocelulozie i za pomocą narzędzia z pętli z włosa ustawić embrion w pozycji niezbędnej do zobrazowania infekcji przy użyciu odwróconego mikroskopu konfokalnego.Nanieś kroplę agarozy o niskiej temperaturze topnienia na szalkę z szklanym dnem. Umieść znieczulony embrion w kropli agarozy z niewielką ilością wody z jaj, a następnie za pomocą pętelki z włosa ustaw embrion w odpowiedniej pozycji. Pozostaw agarozę do zastygnięcia, a następnie zanurz kroplę agarozy w wodzie z jaj zawierającej trica.Próbka jest teraz gotowa do obrazowania konfokalnego. Iniekcja bakterii Salmonella typhimurium lub Mycobacterium marinum do wyspy krwi embrionów w pierwszej dobie po zapłodnieniu skutkuje szybką fagocytozą przez makrofagi. Rozprzestrzenianie się stosunkowo dużych i silnie fluorescencyjnych bakterii znakowanych Ds.Red można obrazować bezpośrednio za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego oraz obrazowania konfokalnego w drugiej godzinie po infekcji, co wykazuje, że wiele bakterii zostaje sfagocytowanych przez fluorescencyjne makrofagi.Dawka wstrzyknięta wynosząca 250 CFU szczepu dzikiego styria wywoła silną odpowiedź prozapalną i jest śmiertelna w ciągu doby. W przeciwieństwie do tego, dożylne wstrzyknięcie erum prowadzi do przetrwałej infekcji, w której zainfekowane makrofagi tworzą ciasne agregaty uznawane za wczesne stadia ziarniniaków, które są charakterystyczne dla gruźlicy. Obrazowanie konfokalne takiego agregatu przypominającego ziarniniak w linii transgenicznej EG one EGFP w piątym dniu po infekcji wykazuje wewnątrzkomórkowy wzrost bakterii M num znakowanych m cherry.Wewnątrz makrofagów wykazujących zieloną fluorescencję bakterie mogą zostać wstrzyknięte do komory tylnego mózgowia, która w 32. godzinie po zapłodnieniu jest obszarem pozbawionym makrofagów. Wstrzyknięcie od 20 do 100 M bakterii M marum znakowanych mCherry do tej komory prowadzi do szybkiej infiltracji przez makrofagi, które fagocytują bakterie, co pokazano tutaj. Przy użyciu transgenicznej linii M-P-X-E-G-F-P wstrzyknięcie około 20 CFU Styria do pęcherzyka słuchowego prowadzi do przyciągnięcia neutrofili w trzeciej godzinie po infekcji. Podczas gdy odpowiedź ta nie jest obserwowana przy wstrzyknięciach kontrolnych z PBS, struna grzbietowa, która wydaje się być odporna na infiltrację leukocytów, stanowi dopuszczalny obszar wzrostu mutantów erum, które są silnie osłabione po wstrzyknięciu do innych tkanek.Po wstrzyknięciu do żółtka dawki 2240 CFU bakterii erum, rozprzestrzeniają się one przez kilka dni w tkankach embrionalnych i tworzą agregaty przypominające ziarniniaki. Jest to podobne do wyników obserwowanych przy zastosowaniu konwencjonalnej metody wstrzykiwania dożylnego. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest pamiętać, że prawidłowe określenie stadium rozwoju embrionów zebrafish jest krytyczne, ponieważ embrionalny układ odpornościowy staje się coraz bardziej kompetentny w miarę rozwoju.Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak profilowanie transkryptomu i immunohistochemia, w celu znalezienia odpowiedzi na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące tego, jak zarodkowy wrodzony układ odpornościowy reaguje na infekcje patogenne.

infection-of-zebrafish-embryos-with-intracellular-bacterial-pathogens

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Infekcja zarodków rybki zebra z wewnątrzkomórkowymi patogenami bakteryjnymi

Szybki rozwój, niewielki rozmiar i przezroczystość danio pręgowanego stanowią ogromne zalety w badaniach nad wrodzonym immunologicznym kontrolowaniem infekcji1-4. W niniejszej pracy prezentujemy techniki zakażania larw danio pręgowanego grzybiczym patogenem Candida albicans za pomocą mikroiniekcji – metodologii wykorzystanej niedawno do wykazania roli aktywności NADPH oksydazy fagocytów w kontrolowaniu dimorfizmu grzybów5.

Nieinwazyjne obrazowanie rozsianej kandydozy u larw rybek danio

Ten film opisuje technikę iniekcji dootrzewnowej, metodę dostarczania roztworów do jamy brzusznej dorosłego danio pręgowanego.

Wstrzyknięcie dootrzewnowe: metoda dostarczania roztworu do jamy brzusznej dorosłego danio pręgowanego

Źródło: Zhang, X., et al. Model zarodka danio pręgowanego do wizualizacji in vivo i analizy przyżyciowej zakażenia Staphylococcus aureus związanego z biomateriałem. J. Vis. Exp. (2019 rok)Film przedstawia obrazowanie fluorescencyjne zarodków danio pręgowanego, którym wstrzyknięto Staphylococcus aureus, umożliwiając ilościowe określenie progresji infekcji i rozmieszczenia bakterii w celu oceny wpływu mikrosfer biomateriału na interakcje gospodarz-patogen in vivo.

 Obrazowanie fluorescencyjne infekcji bakteryjnej związanej z biomateriałem w zarodkach danio pręgowanego

Źródło: Zhang, X. i wsp., Model zarodka danio pręgowanego do wizualizacji in vivo i analizy przyżyciowej zakażenia Staphylococcus aureus związanego z biomateriałem. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film przedstawia model zarodka danio pręgowanego do badania infekcji związanych z wszczepionymi biomateriałami. Wstrzykiwanie Staphylococcus aureus mikrosferom polistyrenowym zwiększa przeżywalność bakterii, potwierdzając rolę wszczepionych materiałów w promowaniu infekcji.

Analiza in vivo zakażeń bakteryjnych związanych z implantami przy użyciu zarodków danio pręgowanego

Źródło: Shi, J. i in., Przesiewowe i identyfikacja supresorów wyciszających RNA z wydzielanych efektorów patogenów roślinnych. J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje procedurę przygotowania hodowli Agrobacterium tumefaciens poprzez indukowanie ekspresji genów za pomocą acetosyringonu, a następnie usunięcie antybiotyku poprzez płukanie i ponowną zawiesinę, aby wygenerować zawieszenie gotowe do transformacji do dostarczania genów do tkanek roślinnych.

Mikrowstrzykiwanie bakterii do żyły ogonowo zarodków danio pręgowanego

Źródło: Bernut, A. i in., Rozszyfrowanie i obrazowanie patogenezy oraz układania korzeni Mycobacterium abscessus w embrionach danio pręgowanego. J. Vis. Exp. (2015).Ten film pokazuje protokół izolowania i ilościowego określania ropnia Mycobacterium z zakażonego zarodka danio pręgowanego. Procedura obejmuje eutanazję zarodków, lizę tkanek oraz homogenizację w celu uwolnienia bakterii, a następnie wirowanie i ponowną zawiesinę w buforze powierzchniowo czynnym. Na koniec zawiesina bakteryjna jest...

Izolacja i hodowla bakterii z zarodków danio dano w celu oceny obciążenia infekcją

Źródło: Flores, E. i inni. Wykorzystanie pierwotniaka Paramecium caudatum jako nośnika infekcji pokarmowych u larw danio danio. J. Vis. Exp. (2019).Ten film demonstruje metodę ustalania modelu bakteryjnego zakażenia jelit przenoszonego przez żywność u larw danio pręgowanego poprzez karmienie ich paramecjami zakażonymi fluorescencyjnym E. coli.

Modelowanie infekcji jelit u larw danio pręgowanego przy użyciu bakterii przenoszonych przez żywność

Optycznie przezroczyste embriony danio pręgowanego są szeroko stosowane do badania i wizualizacji w czasie rzeczywistym interakcji między patogennymi mikroorganizmami a wrodzonymi komórkami odpornościowymi. Mikroiniekcja Mycobacterium abscessus, w połączeniu z obrazowaniem fluorescencyjnym, służy do badania podstawowych cech chorobotwórczych, takich jak tworzenie się pępowiny w zarodkach danio pręgowanego.

Rozszyfrowywanie i obrazowanie patogenezy i sznurowania Mycobacterium abscessus w zarodkach danio pręgowanego

Niniejsze badanie opisuje model zarodka danio pręgowanego do wizualizacji in vivo i analizy przyżyciowej infekcji związanej z biomateriałem w czasie na podstawie mikroskopii fluorescencyjnej. Model ten jest obiecującym systemem uzupełniającym modele zwierzęce ssaków, takie jak modele mysie, do badania zakażeń związanych z biomateriałem in vivo.

Model zarodka danio pręgowanego do wizualizacji in vivo i analizy przyżyciowej zakażenia Staphylococcus aureus związanego z biomateriałem

Ten protokół opisuje technikę wizualizacji zachowania i śmierci makrofagów u embrionalnego danio pręgowanego podczas infekcji Mycobacterium marinum. Uwzględniono etapy przygotowania bakterii, zakażenia zarodków i mikroskopii przyżyciowej. Technika ta może być stosowana do obserwacji zachowania komórek i śmierci w podobnych scenariuszach obejmujących infekcję lub sterylny stan zapalny.

Wizualizacja śmierci komórek litycznych makrofagów podczas infekcji prątkami w zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii przyżyciowej

Obecnie brakuje modeli in vivo , które można by poddać badaniom przesiewowym w kierunku przewlekłych zakażeń bakteryjnych. W tym miejscu opisujemy protokół zakażenia rany za pomocą izolatu klinicznego Pseudomonas aeruginosa w celu wywołania trwałej infekcji u larw danio pręgowanego.

Modelowanie uporczywego zakażenia Pseudomonas aeruginosa u zranionych larw danio pręgowanego

Poznaj metodę mikroinjekcji bakterii fluorescencyjnych do zarodków Danio rerio w celu obrazowania interakcji patogenów z komórkami układu odpornościowego. Technika ta umożliwia badanie fagocytozy i odpowiedzi immunologicznej w czasie rzeczywistym.

Zakażanie zarodków danio pręgowanego wewnątrzkomórkowymi patogenami bakteryjnymi

Przeglądaj więcej filmów