Zakażenie zarodków danio pręgowanego wewnątrzkomórkowymi patogenami bakteryjnymi

Ogólnym celem tej procedury jest mikrowstrzyknięcie zarodków danio pręgowanego z bakteriami fluorescencyjnymi w celu obrazowania na żywo interakcji z komórkami odpornościowymi gospodarza. W tym celu należy najpierw przygotować i naładować igłę do wstrzykiwań zawiesinami bakteryjnymi. Następnie zarodki są klasyfikowane i ustawiane na płytce iniekcyjnej.

Następnie inokulum bakteryjne jest wstrzykiwane drogą prowadzącą do miejscowego lub ogólnoustrojowego zakażenia bakteryjnego. Na koniec zarodki są montowane i zarodki są obrazowane. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują wewnątrzkomórkową lokalizację patogenów bakteryjnych wewnątrz fluorescencyjnych fagocytów przezroczystego gospodarza embrionalnego danio pręgowanego za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i konfokalnej.

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii, ponieważ model zarodka danio pręgowanego jest bardzo skuteczny w obrazowaniu życia interakcji patogenów gospodarza, Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności, ponieważ wymaga to dużej praktyki Aby w powtarzalny sposób mikrowstrzykiwać bakterie do krążenia krwi zarodków danio pręgowanego w celu infekcji ogólnoustrojowej lub do określonych przedziałów w celu uzyskania lokalnych infekcji. Po wyciągnięciu szklanych igieł mikrokapilarnych i ukosowaniu końcówek pod kątem 45 stopni, zarodki danio pręgowanego należy ustawić w 28 godzinach po zapłodnieniu, sprawdzając stałe krążenie krwi. Początek pigmentacji w oku, prosty ogon i serce są ustawione tuż brzusznie do oka.

Po znieczuleniu zarodków za pomocą końcówki mikroładowarki załaduj igłę wcześniej przygotowanym inokulum bakteryjnym. Zamontuj załadowaną igłę na mikromanipulatorze podłączonym do stojaka i umieść ją pod mikroskopem stereoskopowym. Ustaw czas wtrysku na 0,2 sekundy, a ciśnienie kompensacyjne na 15 hektora paskala.

Wyreguluj ciśnienie iniekcji w zakresie od 700 do 900 hektorów paskala, aby uzyskać odpowiednią objętość wstrzyknięcia dla użytej igły. Ustawić mikromanipulator z załadowaną igłą we właściwej pozycji przed wstrzyknięciem. Umieść znieczulone zarodki na płaskiej 1% płytce do wstrzykiwań agarozy i usuń nadmiar wody jajecznej.

Następnie użyj narzędzia do pętli do włosów, aby wyrównać zarodki do każdego wstrzyknięcia. Podczas wstrzyknięć należy przesuwać płytkę ręcznie, aby ustawić zarodki tak, aby ich ogony były skierowane w stronę końcówki igły. Umieścić końcówkę igły bezpośrednio nad żyłą rozpieszczoną, w pobliżu ujścia układu moczowo-płciowego.

Przekłuć perydermę końcówką igły i wstrzyknąć żądaną dawkę bakterii znakowanych fluorescencyjnie. Używamy około 250 jednostek tworzących kolonie lub CFU salmonella typhimurium i około 120 CFU Mycobacterium marum. Wstrzyknięta zawiesina bakteryjna będzie podążać za przepływem krwi przez żyłę rozpieszczoną w kierunku monitora pracy serca, jeśli wstrzyknięcie zostało wykonane prawidłowo, sprawdzając, czy bezpośrednio po tętnie nie zwiększa się objętość układu naczyniowego.

Często sprawdzaj, czy objętość wstrzykniętego leku pozostaje taka sama podczas eksperymentu. Aby zapewnić kontrolę konsystencji wstrzyknięć przez cały czas trwania eksperymentu, wstrzyknij kroplę bakterii bezpośrednio na kroplę sterylnego PBS na pożywce bakteryjnej. Po około każdym 30 wstrzyknięciu zarodka należy usunąć tę kroplę i policzyć kolonie bakterii po inkubacji.

Aby określić jtk w objętości wstrzyknięcia, należy użyć fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego, aby obserwować poszczególne fluorescencyjne komórki styrii krążące w krwiobiegu bezpośrednio po wstrzyknięciu i odrzucić zarodki, które nie zostały prawidłowo wstrzyknięte. Agregaty fluorescencyjne bakterii M marum powinny być widoczne już po dwóch dniach od zakażenia i powiększać się z czasem. Aby wstrzyknąć do przewodu Cuvier, należy ustawić znieczulenie dwa do trzech dni po zapłodnieniu zarodki.

Jeśli chodzi o wstrzyknięcie żyły dorszowej pod kątem 45 stopni od grzbietowej strony zarodka, należy wprowadzić igłę w punkt początkowy przewodu Cuviera. Tylko grzbietowo do miejsca, w którym przewód zaczyna się rozszerzać nad woreczkiem żółtkowym w pozycji iniekcji do komory tylnej mózgu. Znieczulenie należy wykonać 32 godziny po zapłodnieniu zarodkami grzbietową stroną w kierunku końcówki igły.

Wbić igłę do komory tylnej części mózgu z pozycji przedniej, nie dotykając helu nerwowego, aby wstrzyknąć go w mięśnie ogona. Znieczulone zarodki należy umieścić od jednego do dwóch dni po zapłodnieniu z ogonem skierowanym w stronę końcówki igły i igłą pod kątem około 65 stopni, wstrzyknąć w mięsień powyżej otworu moczowo-płciowego w celu wstrzyknięcia pęcherzyków usznych. Znieczulenie należy zorientować dwa do trzech dni po zapłodnieniu zarodki z ogonami skierowanymi w stronę igły.

Wstrzyknąć pod kątem 65 stopni i pod niskim ciśnieniem, aby wstrzyknąć do przewodu węzłowego w ciągu jednego do dwóch dni. Zarodki po zapłodnieniu z ogonem skierowanym na zewnątrz igły. Wbić igłę przez tkankę mięśniową ogona do sznurka.

W celu wstrzyknięcia żółtka zarodkom w stadium od 16 do 1000 komórek, należy przebić igłę przez korion do środka żółtka, aby zobrazować infekcję. Znieczulij zakażone zarodki na 1% wróżbowej warstwowej szalce Petriego pokrytej wodą jajeczną zawierającą triki. Za pomocą pętli do włosów ustawiono zarodki w odpowiedniej pozycji do obrazowania pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym.

Poszczególne komórki fluorescencyjne można zaobserwować krążące w krwiobiegu bezpośrednio po wstrzyknięciu. Jeśli wymagana jest inna pozycja niż widok boczny. Zamontuj zarodki w 1,5% metylocelulozie i użyj narzędzia do pętli do włosów, aby zmanipulować zarodek do wymaganej pozycji, aby zobrazować infekcję za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego.

Umieść kroplę aeros o niskiej temperaturze topnienia na naczyniu ze szklanym dnem. Umieść znieczulony zarodek w kropli aerodynamicznej z ograniczoną ilością wody jajecznej i użyj narzędzia do pętli do włosów, aby manipulować zarodkiem na miejscu. Pozwól aerodynamice zestalić się i zanurz aero drop w wodzie jajecznej zawierającej trica.

Próbka jest teraz gotowa do obrazowania konfokalnego, we wstrzyknięcie bakterii Salmonella typhimurium lub Mycobacterium marum do wyspy krwi zarodków w ciągu jednego dnia. Po zapłodnieniu powoduje szybką fagocytozę przez makrofagi rozprzestrzenianie się stosunkowo dużego i jasno fluorescencyjnego DS. Znakowane na czerwono bakterie styryjskie można obrazować bezpośrednio za pomocą stereofluorescencji i obrazowania konfokalnego po dwóch godzinach. Po infekcji pokazuje, że wiele bakterii to fagocytozy przez fluorescencyjne makrofagi.

Dawka iniekcyjna 250 CFU styrii typu dzikiego wywoła silną reakcję prozapalną i jest śmiertelna w ciągu jednego dnia. Natomiast dożylne wstrzyknięcie erum prowadzi do uporczywej infekcji, w której zakażone makrofagi tworzą ciasne agregaty, które są uważane za początkowe stadia ziarniniaków, które są cechą charakterystyczną gruźlicy. Konfokalne obrazowanie takiego agregatu podobnego do ziarniniaka w transgenicznej linii EGFP EG w ciągu pięciu dni po zakażeniu pokazuje wewnątrzkomórkowy wzrost bakterii m num oznaczonych

Wewnątrz zielonych fluorescencyjnych makrofagów bakterie można wstrzykiwać do tylnej komory mózgu, która jest przedziałem pozbawionym makrofagów po 32 godzinach od zapłodnienia wstrzyknięcie 20 do 100 M wiśniowych bakterii M marum do tego przedziału prowadzi do szybkiej infiltracji przez makrofagi, które fagocytozą bakterie, jak pokazano tutaj. Za pomocą transgenicznego M-P-X-E-G-F-P wstrzyknięcie około 20 CFU ze Styrii do pęcherzyka usznego prowadzi do przyciągnięcia neutrofili w ciągu trzech godzin po zakażeniu. Chociaż tej odpowiedzi nie obserwuje się w iniekcjach kontrolnych PBS, struna grzbietowa, która wydaje się być odporna na infiltrację przez leukocyty, jest przedziałem permisywnym dla wzrostu mutantów erum, które są silnie osłabione po wstrzyknięciu do innych tkanek.

Po wstrzyknięciu jarzmem dawki 2240 CFU bakterie erum rozprzestrzeniają się w ciągu kilku dni do tkanek zarodkowych i tworzą agregaty przypominające ziarniniaki. Podobne do tych obserwowanych w przypadku konwencjonalnej metody wstrzykiwań dożylnych. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że właściwa ocena zarodków danio pręgowanego ma kluczowe znaczenie, ponieważ embrionalny układ odpornościowy staje się coraz bardziej kompetentny podczas rozwoju.

Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak profilowanie transkryptomu i immunohistochemia, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, jak wrodzony układ odpornościowy embrionalny reaguje na infekcje patogenne.