Transport aksonalny organelli w kulturach neuronów ruchowych z wykorzystaniem systemu komór mikroprzepływowych

Transport aksonalny ma zasadnicze znaczenie dla zdrowia i żywotności neuronów. Nasz protokół opisuje elegancką metodę monitorowania i analizowania transportu aksonalnego. I może być dostosowany do różnych modeli chorób neuronalnych.

Zastosowanie komór mikroprzepływowych umożliwia precyzyjną kontrolę przestrzenną czasową, co jest kluczowe dla badania biologii aksonalnej. Nieprawidłowości w transporcie aksonalnym są związane z kilkoma chorobami neurodegeneracyjnymi, takimi jak ALS. Platforma mikroprzepływowa umożliwia badanie podstawowych mechanizmów, a także testowanie terapii naprawczych defektów transportu aksonalnego.

Platformę komory mikroprzepływowej można łatwo dostosować do różnych aspektów badań aksonalnych, w tym wzrostu aksonów i degeneracji różnych podtypów neuronalnych. Ta metoda jest złożona i zwykle nauczana w praktyce. Demonstracja wizualna zwiększy dostępność tej procedury dla każdego naukowca zainteresowanego badaniem transportu aksonalnego.

Zacznij od odlewania PDMS w formach pierwotnych. Użyj sprężonego powietrza, aby usunąć wszelkie zabrudzenia z platformy wafla, upewniając się, że wafle wyglądają gładko i przejrzyście przed kontynuowaniem. Następnie napełnij pojemnik ciekłym azotem i przygotuj 10-mililitrową strzykawkę z igłą o rozmiarze 23.

W okapie oparowym umieścić płytkę zawierającą wafel w zamykanym pojemniku i napełnić strzykawkę dwoma mililitrami ciekłego azotu na każdą płytkę zawierającą płytkę. Otwórz butelkę z chlorotrimetylosilanem. Przekłuć gumową nasadkę strzykawką i wstrzyknąć azot do butelki.

Nie wyciągając igły, odwróć butelkę do góry dnem i cofnij dwa mililitry chlorotrimetylosilanu na każdą płytkę zawierającą wafel. Rozprowadzić chlorotrimetylosilan w pojemniku, ale nie bezpośrednio na płytce zawierającej wafel. Zamknij pojemnik.

I inkubuj go przez pięć minut na płytkę. Następnie zważ 47,05 grama zasady PDMS w 50-mililitrowej tubie i dodaj utwardzacz PDMS w stosunku 16 do 1 bazy do utwardzacza, co daje łącznie 50 gramów. Mieszaj PDMS przez 10 minut na rotatorze o niskiej prędkości, a następnie wlej go do każdej płytki zawierającej wafel na żądaną wysokość.

Umieścić płytki w eksykatorze próżniowym na dwie godziny. Który usunie powietrze uwięzione w PDMS i utworzy przezroczystą, jednolitą pleśń. Następnie inkubuj płytki w piekarniku przez trzy godziny lub przez noc w temperaturze 70 stopni Celsjusza.

Aby stworzyć komorę mikroprzepływową lub MFC. Wytnij i usuń foremki PDMS z płytki za pomocą skalpela, uważając, aby nie naciskać na foremki, ponieważ są delikatne. Postępuj zgodnie z instrukcjami zawartymi w rękopisie tekstowym, aby przebić i przeciąć komory, w zależności od konfiguracji eksperymentalnej.

W przypadku hodowli eksplantatów rdzenia kręgowego należy przebić dwie siedmiomilimetrowe studzienki w dystalnej stronie dużego MFC, upewniając się, że będą one zachodzić na krawędzie kanału. Po stronie proksymalnej przebij jedną siedmiomilimetrową studzienkę w środku kanału z minimalnym zachodzeniem na siebie, tak aby pozostało wystarczająco dużo miejsca na eksplantaty. Wykonaj dwa dodatkowe otwory o średnicy jednego milimetra w dwóch krawędziach kanału proksymalnego.

I pokrój PDMS na pojedyncze komory. Następnie obróć MFC do góry i użyj igły o rozmiarze 20, aby wyrzeźbić trzy małe jaskinie eksplantacji na wybitej siedmiomilimetrowej studni. Aby uzyskać zdysocjowaną hodowlę neuronów ruchowych, przebij cztery sześciomilimetrowe studzienki w krawędziach dwóch kanałów małego MFC i pokrój PDMS na pojedyncze komory.

Aby wysterylizować płytę melaminowaną, rozłóż na ławce taśmy klejące o długości 50 centymetrów. Następnie dociśnij obie powierzchnie komory do taśmy i pociągnij ją do tyłu. Umieść czyste komory na nowej płytce i inkubuj je w klasie analitycznej 70% etanolu przez 10 minut na wytrząsarce orbitalnej.

Wyrzuć etanol i wysusz komory w okapie do hodowli tkanek lub w piekarniku w temperaturze 70 stopni Celsjusza. Następnie umieść komorę w środku rowu ze szklanym dnem do hodowli tkankowych i przyłóż niewielką siłę do krawędzi, aby przymocować PDMS do dna naczynia. Inkubuj naczynie przez 10 minut w temperaturze 70 stopni Celsjusza.

Następnie naciśnij komory, aby wzmocnić przyczepność. Inkubuj naczynie w promieniowaniu UV przez 10 minut, a następnie przystąp do kodowania MFC. Dodaj 1,5 nanograma na mililitr PLO do obu komór.

Upewnienie się, że PLO działa przez kanały. Poprzez pipetowanie materiału powlekającego bezpośrednio w wejściu do kanału. Zbadaj MFC pod mikroskopem świetlnym, aby sprawdzić, czy nie ma pęcherzyków.

Jeśli pęcherzyki powietrza blokują mikrorowki, umieść MFC w eksykatorze próżniowym na dwie minuty. Usuń nadmiar powietrza z kanałów MFC. Następnie inkubuj go przez noc za pomocą PLO.

Zastąp PLO lamininą i inkubuj MFC przez dodatkową noc. Przed posiewem umyj lamininę pożywką hodowlaną. Przeprowadź sekcję ciężarnej myszy ICR E12.5 i oddziel zarodki od worka owodniowego.

Umieść zarodek w silikonowym naczyniu HBSS. Usuń głowę i ogon i przełóż je na brzuch. Delikatnie złudź powierzchowną skórę z zarodków z powrotem, odsłaniając rdzeń kręgowy.

Oddziel rdzeń kręgowy od ciała od głowy do ogona za pomocą delikatnej pęsety. Usuń opony mózgowe, a następnie usuń rogi grzbietowe i przetnij rdzeń kręgowy na odcinki poprzeczne o grubości jednego milimetra. Usunąć całe podłoże z proksymalnej komory MFC.

Pobrać pojedynczy eksplant rdzenia kręgowego za pomocą pipety o łącznej objętości czterech mikrolitrów. I wstrzyknij go jak najbliżej jaskini. Wyciągnij nadmiar płynu z dołu proksymalnego przez boczne wyloty.

Powtórz poprzedni krok jeszcze dwa razy i upewnij się, że eksplantaty są osadzone w kanale proksymalnym. Powoli dodaj 150 mikrolitrów pożywki SCEX do studzienki proksymalnej. Jeden dzień po poszyciu.

Wymieniono pożywkę SCEX w komorze proksymalnej i dodano bogatą pożywkę SCEX do komory dystalnej. Utrzymanie gradientu objętości wynoszącego co najmniej 15 mikrolitrów na studzienkę między studzienką dystalną i proksymalną. Po czterech do sześciu dniach aksony powinny przejść do dystalnego przedziału i być gotowe do obrazowania transportu aksonalnego.

Aby oznaczyć mitochondria i przedziały kwasowe, przygotuj świeżą pożywkę SCEX ze 100 nanomolowymi MitoTracker Deep Red FM i 100 nanomolowymi LysoTracker Red. I dodaj go do komór mikroprzepływowych. Inkubuj je przez 30 do 60 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie umyj trzy razy ciepłym podłożem SCEX. Kontynuuj obrazowanie na żywo transportu aksonalnego. Wykonanie serii 100 zdjęć poklatkowych w trzysekundowych odstępach.

W sumie pięć minut na film. Po siedmiu dniach w komorach mikroprzepływowych. Mysi embrionalny eksplantat rdzenia kręgowego HB9 GFP.

Jesteśmy zabarwieni barwnikami MitoTracker Deep Red i LysoTracker Red. Aby oznaczyć mitochondria i przedziały kwasowe. Aksony w dystalnych rowkach zostały zobrazowane, a analiza kymograficzna została wykorzystana do określenia ogólnego rozkładu ruchu.

Ujawniło to odchylenie w kierunku wstecznym tylko w kwaśnych przedziałach miejskich, ale nie w transporcie mitochondrialnym. Określono również ilościowo gęstość cząstek, ujawniając większą liczbę cząstek mitochondrialnych w porównaniu z kwaśnymi przedziałami w aksonach eksplantacji rdzenia kręgowego HB9 GFP. Następnie przeprowadzono analizę transportu pojedynczych cząstek za pomocą półautomatycznego oprogramowania, a następnie własnego kodu.

Analiza ta wykazała, że składniki kwasowe i mitochondria mają podobne prędkości cząstek. Ale tylko przedziały kwasowe wykazują skłonność do ruchu wstecznego. Izolacja zarodka rdzenia kręgowego może być na początku trudna.

Przećwicz tę procedurę kilka razy, upewniając się, że używasz odpowiedniego wieku zarodka i odpowiednich narzędzi preparacyjnych. Zastosowanie komór mikroprzepływowych zmienia sposób, w jaki badamy biologię aksonalną. Pozwala nam to na wizualizację zlokalizowanych procesów aksonalnych, które kiedyś przypuszczaliśmy, że zachodzą tylko w ciele komórki.