Name: Transport aksonalny organelli w kulturach neuronów ruchowych z wykorzystaniem systemu komór mikroprzepływowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Poznaj metodę śledzenia transportu aksonalnego organelli w neuronach ruchowych z wykorzystaniem komór mikroprzepływowych. Ta technika umożliwia badanie mechanizmów neurodegeneracyjnych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Izraelskiej Fundacji Naukowej (ISF, 561/11) i Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (ERC, 309377).

<ol><li>Misgeld, T., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitostasis+in+Neurons%3A+Maintaining+Mitochondria+in+an+Extended+Cellular+Architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mitostasis in Neurons: Maintaining Mitochondria in an Extended Cellular Architecture.</a> Neuron. 96, 651-666 (2017).</li>
<li>Devine, M. J., Kittler, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+at+the+neuronal+presynapse+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mitochondria at the neuronal presynapse in health and disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 19, 63-80 (2018).</li>
<li>Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+axonal+transport+in+murine+motor+and+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).</li>
<li>Mandal, A., Drerup, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+Transport+and+Mitochondrial+Function+in+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Axonal Transport and Mitochondrial Function in Neurons.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 373(2019).</li>
<li>Magrané, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+mitochondrial+transport+and+morphology+are+common+pathological+denominators+in+SOD1+and+TDP43+ALS+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models.</a> Human Molecular Genetics. 23, 1413-1424 (2014).</li>
<li>Anderson, R. G. W., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+view+of+acidic+intracellular+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A view of acidic intracellular compartments.</a> Journal of Cell Biology. 106, 539-543 (1988).</li>
<li>Kiral, F. R., Kohrs, F. E., Jin, E. J., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab+GTPases+and+Membrane+Trafficking+in+Neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Rab GTPases and Membrane Trafficking in Neurodegeneration.</a> Current Biology. 28, R471-R486 (2018).</li>
<li>Ya-Cheng Liao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Granules+Hitchhike+on+Lysosomes+for+Long-Distance+Transport%2C+Using+Annexin+A11+as+a+Molecular+Tether%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RNA Granules Hitchhike on Lysosomes for Long-Distance Transport, Using Annexin A11 as a Molecular Tether.</a> Cell. 179, 147-164 (2019).</li>
<li>Gluska, S., Chein, M., Rotem, N., Ionescu, A., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+Quantum-Dot+labeled+neurotropic+factors+transport+along+primary+neuronal+axons+in+compartmental+microfluidic+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tracking Quantum-Dot labeled neurotropic factors transport along primary neuronal axons in compartmental microfluidic chambers.</a> Methods in Cell Biology. 131, 365-387 (2016).</li>
<li>Gershoni-Emek, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+RNAi+Machinery+to+Axonal+Branch+Points+and+Growth+Cones+Is+Facilitated+by+Mitochondria+and+Is+Disrupted+in+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Localization of RNAi Machinery to Axonal Branch Points and Growth Cones Is Facilitated by Mitochondria and Is Disrupted in ALS.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 311(2018).</li>
<li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalized+Microfluidic+Platforms%3A+The+Unrivaled+Breakthrough+of+In+Vitro+Tools+for+Neurobiological+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research.</a> Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).</li>
<li>Ionescu, A., Zahavi, E. E., Gradus, T., Ben-Yaakov, K., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmental+microfluidic+system+for+studying+muscle-neuron+communication+and+neuromuscular+junction+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Compartmental microfluidic system for studying muscle-neuron communication and neuromuscular junction maintenance.</a> European Journal of Cell Biology. 95, 69-88 (2016).</li>
<li>Zahavi, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+compartmentalized+microfluidic+neuromuscular+co-culture+system+reveals+spatial+aspects+of+GDNF+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">A compartmentalized microfluidic neuromuscular co-culture system reveals spatial aspects of GDNF functions.</a> Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).</li>
<li>Altman, T., Geller, D., Kleeblatt, E., Gradus-Perry, T., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+compartmental+system+underlines+the+contribution+of+mitochondrial+immobility+to+the+ATP+supply+in+the+NMJ%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">An in vitro compartmental system underlines the contribution of mitochondrial immobility to the ATP supply in the NMJ.</a> Journal of Cell Science. 132 (23), (2019).</li>
<li>Schaller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+combinatorial+screening+identifies+neurotrophic+factors+for+selective+classes+of+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114, E2486-E2493 (2017).</li>
<li>Ionescu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+Sigma-1+Receptor+via+Pridopidine+Ameliorates+Central+Features+of+ALS+Pathology+in+a+SOD1G93A+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Targeting the Sigma-1 Receptor via Pridopidine Ameliorates Central Features of ALS Pathology in a SOD1G93A Model.</a> Cell Death & Disease. 10 (3), 210(2019).</li>
<li>Zahavi, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+compartmentalized+microfluidic+neuromuscular+coculture+system+reveals+spatial+aspects+of+GDNF+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">A compartmentalized microfluidic neuromuscular coculture system reveals spatial aspects of GDNF functions.</a> Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).</li>
<li>Maimon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mir126-5p+downregulation+facilitates+axon+degeneration+and+nmj+disruption+via+a+non-cell-autonomous+mechanism+in+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mir126-5p downregulation facilitates axon degeneration and nmj disruption via a non-cell-autonomous mechanism in ALS.</a> Journal of Neuroscience. 38, 5478-5494 (2018).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

W tym protokole opisujemy system śledzenia transportu aksonalnego mitochondriów i kwaśnych przedziałów w neuronach ruchowych. Ta uproszczona platforma in vitro umożliwia precyzyjną kontrolę, monitorowanie i manipulację subkomórkowymi przedziałami neuronalnymi, umożliwiając eksperymentalną analizę lokalnych funkcji neuronów ruchowych. Protokół ten może być przydatny do badania chorób MN, takich jak ALS, aby skupić się na zrozumieniu mechanizmu leżącego u podstaw dysfunkcji transportu aksonalnego w chorobie<sup class="xref...

MN to wysoce spolaryzowane komórki z długimi aksonami, osiągającymi do jednego metra długości u dorosłych ludzi. Zjawisko to stanowi krytyczne wyzwanie dla utrzymania łączności i funkcji MN. W związku z tym MN zależą od prawidłowego transportu informacji, organelli i materiałów wzdłuż aksonów z ich ciała komórkowego do synapsy iz powrotem. Różne składniki komórkowe, takie jak białka, RNA i organelle, są regularnie transportowane przez aksony. Mitochondria są ważnymi organellami, które są rutynowo transportowane w MN. Mitochondria są niezbędne do prawidłowej aktywności i funkcji MN, odpowiedzialne za dostarczanie ATP, buforowanie wapnia i procesy sygnalizacyjne1,2. Axonalny transport mitochondriów jest dobrze zbadanym procesem3,4. Co ciekawe, stwierdzono, że defekty w transporcie mitochondrialnym są zaangażowane w kilka chorób neurodegeneracyjnych, a w szczególności w choroby MN5. Przedziały kwasowe służą jako kolejny przykład wewnętrznych organelli, które poruszają się wzdłuż aksonów MN. Przedziały kwasowe obejmują lizosomy, endosomy, aparat trans-Golgiego i niektóre pęcherzyki wydzielnicze6. Defekty w transporcie aksonalnym kompartmentów kwasowych stwierdzono również w kilku chorobach neurodegeneracyjnych7, a ostatnie prace podkreślają ich znaczenie w chorobach MN8.
Aby efektywnie badać transport aksonalny, często stosuje się komory mikroprzepływowe, które oddzielają przedziały somatyczne i aksonalne9,10. Dwie istotne zalety układu mikroprzepływowego oraz podział na kompartmenty i izolację aksonów sprawiają, że jest on idealny do badania procesów subkomórkowych11. Przestrzenna separacja między ciałami komórek neuronalnych a aksonami może być wykorzystana do manipulowania środowiskami zewnątrzkomórkowymi różnych przedziałów neuronalnych (np. aksony vs. soma). Testy biochemiczne, wzrostu/degeneracji neuronów i immunofluorescencji czerpią korzyści z tej platformy. MFC mogą również pomóc w badaniu komunikacji międzykomórkowej poprzez kokulturację neuronów z innymi typami komórek, takimi jak mięśnie szkieletowe12,13,14.
Tutaj opisujemy prosty, ale precyzyjny protokół monitorowania mitochondriów i kwaśnego transportu kompartmentów w neuronach ruchowych. Dalej pokazujemy zastosowanie tej metody, porównując względny procent ruchomych organelli poruszających się wstecz i następczo, a także rozkład prędkości transportu.

<table><tbody><tr><td>35mm Fluodish &ndash; szklane dno</td><td>talerz World Precision Instruments WPI</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>50mm Fluodish &ndash; szklana podstawka</td><td>Świat Precision Instruments WPI</td><td>FD5040-100</td><td></td></tr><tr><td>Andor iXon DU-897 Kamera EMCCD</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ARA-C (Cytozyna &beta;-D-arabinofuranozyd)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768</td><td>zapas 2mM w filtrowanym DDW</td></tr><tr><td>B-27 Suplement (50X)</td><td>Thermo Fisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Alomone Labs</td><td>B-250</td><td>Rozcieńczony do 10 &mikro; g / ml w filtrowanym ddw z 0,01% BSA)</td></tr><tr><td>Dziurkacz do biopsji 1,25 mm</td><td>World Precision Instruments WPI</td><td>504530</td><td>Do przygotowania dużego</td></tr><tr><td>stempla do biopsji MFC 6mm</td><td>World Precision Instruments WPI</td><td>504533</td><td>Do przygotowania małego stempla do</td></tr><tr><td>biopsji MFC 7mm</td><td>World Precision Instruments WPI</td><td>504534</td><td>Do przygotowania dużego MFC</td></tr><tr><td>Bitplane Oprogramowanie Imaris - wersja 8.4.1</td><td>Imaris</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#A3311-100G</td><td>5% w/v w ddw</td></tr><tr><td>Chlorotrimetylsilane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#386529-100ML</td><td></td></tr><tr><td>CNTF</td><td>Alomone Labs</td><td>C-240</td><td>Rozcieńczony do 10 i mikro; g / ml w przefiltrowanym ddw z 0,01% BSA)</td></tr> <tr><td>Gradient gęstości Medium - Optiprep</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>Deoksyrybonukleaza I (DNAse) z trzustki bydła</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN-25</td><td>stock 10mg/mL w neurobasenie</td></tr><tr><td>Dow Corning Wysokopróżniowy smar silikonowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273554-1EA</td><td>Do przygotowania formy epoksydowej</td></tr><tr><td>DPBS 10X</td><td>Thermo Fisher</td><td>#14200-067</td><td>Rozcieńczyć 1:10 w DDW</td></tr><tr><td>Drobne kleszcze Dumont #55 0,05 i razy; 0,02 mm</td><td>FST</td><td></td><td></td></tr> 1125520 <tr><td>Utwardzacz epoksydowy</td><td>Trias Chem S.R.L</td><td>IPE 743</td><td>Do przygotowania formy epoksydowej</td></tr><tr><td>Żywica epoksydowa</td><td>Trias Chem S.R.L</td><td>RP 026UV</td><td>Do przygotowania formy epoksydowej</td></tr><tr><td>Oprogramowanie FIJI</td><td>ImageJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Alomone Labs</td><td>G-240</td><td>Rozcieńczony do 10 i mikro; g/mL w filtrowanym ddw z 0,01% BSA)</td></tr><tr><td>Glutamax 100X</td><td>Thermo Fisher</td><td>#35050-038</td><td></td></tr><tr><td>HB9:GFP szczep myszy</td><td>Jackson Laboratories</td><td>005029</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 10X</td><td>Thermo Fisher</td><td>#14185-045</td><td>Rozcieńczyć 1:10 w ddw z dodatkiem 1% P/S i filtrem</td></tr><tr><td>iQ software</td><td>Nożyczki Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iris, zakrzywione, 10 cm</td><td>AS Medizintechnik</td><td>11-441-10</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do przysłony, proste, 9 cm</td><td>AS Medizintechnik</td><td>11-440-09</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#L-2020</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium</td><td>Thermo Fisher</td><td>11415064</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Red</td><td>Thermo Fisher</td><td>L7528</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Deep-Red FM</td><td>Thermo Fisher</td><td>M22426</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże neuropodstawowe</td><td>Thermo Fisher</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>mikorskop Nikon Eclipse Ti</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (P/S) Rozwiązanie</td><td>Przemysł biologiczny</td><td>03-031-1</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Ornityna (PLO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P8638</td><td>Rozcieńczyć 1:1000 w roztworze 1X PBS</td></tr><tr><td>Sylgard 184 zestaw elastomerów silikonowych</td><td>DOW Corning Corporation</td><td>#3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna z trzustki bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1426</td><td>zapas 25 mg / ml w 1XPBS</td></tr><tr><td>Vannas sprężynowe nożyczki do mikrodysekcji, ostrze 3 mm</td><td>FST</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Yokogawa CSU X-1</td><td>Yokogawa</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

transport aksonalny organelli w kulturach neuronów ruchowych z wykorzystaniem systemu komór mikroprzepływowych

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

Neurony ruchowe (MN) to wysoce spolaryzowane komórki z bardzo długimi aksonami. Transport aksonalny jest kluczowym mechanizmem dla zdrowia MN, przyczyniając się do wzrostu, rozwoju i przeżycia neuronów. Opisano szczegółową metodę wykorzystania komór mikroprzepływowych (MFC) do śledzenia transportu aksonalnego organelli znakowanych fluorescencyjnie w aksonach MN. Ta metoda jest szybka, stosunkowo niedroga i pozwala na monitorowanie sygnałów wewnątrzkomórkowych w przestrzeni i czasie. Opisujemy krok po kroku protokół dla: 1) Wytwarzania MFC z polidimetylosiloksanu (PDMS); 2) Posiewanie eksplantatów brzusznego rdzenia kręgowego i hodowla zdysocjowana MN w MFC; 3) Znakowanie mitochondriów i przedziałów kwasowych, a następnie obrazowanie konfokalne na żywo; 4) Ręczna i półautomatyczna analiza transportu aksonalnego. Na koniec wykazujemy różnicę w transporcie mitochondriów i kwaśnych przedziałów HB9::GFP z eksplantacji brzusznego rdzenia kręgowego jako dowód ważności systemu. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten zapewnia skuteczne narzędzie do badania transportu aksonalnego różnych komponentów aksonalnych, a także uproszczony podręcznik użytkowania MFC, który pomaga odkryć przestrzenne możliwości eksperymentalne.

Zgodnie z opisanym protokołem, eksplanty rdzenia kręgowego myszy zarodkowej HB9::GFP hodowano w MFC (Rycina 4A). Eksplanty hodowano przez 7 dni, do czasu całkowitego przerostu aksonów do przedziału dystalnego. Do przedziałów dystalnego i proksymalnego dodano barwniki Mitotracker Deep Red oraz Lysotracker Red w celu oznakowania mitochondriów i przedziałów kwaśnych (Rysunek 4C). Obrazowano aksony w...

Transport aksonalny jest kluczowym mechanizmem dla zdrowia neuronów ruchowych. W tym protokole przedstawiamy szczegółową metodę śledzenia transportu aksonalnego przedziałów kwasowych i mitochondriów w aksonach neuronów ruchowych za pomocą komór mikroprzepływowych.

Transport aksonalny organelli w kulturach neuronów ruchowych z wykorzystaniem systemu komór mikroprzepływowych

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

Transport aksonalny ma zasadnicze znaczenie dla zdrowia i żywotności neuronów. Nasz protokół opisuje elegancką metodę monitorowania i analizowania transportu aksonalnego. I może być dostosowany do różnych modeli chorób neuronalnych.Zastosowanie komór mikroprzepływowych umożliwia precyzyjną kontrolę przestrzenną czasową, co jest kluczowe dla badania biologii aksonalnej. Nieprawidłowości w transporcie aksonalnym są związane z kilkoma chorobami neurodegeneracyjnymi, takimi jak ALS. Platforma mikroprzepływowa umożliwia badanie podstawowych mechanizmów, a także testowanie terapii naprawczych defektów transportu aksonalnego.Platformę komory mikroprzepływowej można łatwo dostosować do różnych aspektów badań aksonalnych, w tym wzrostu aksonów i degeneracji różnych podtypów neuronalnych. Ta metoda jest złożona i zwykle nauczana w praktyce. Demonstracja wizualna zwiększy dostępność tej procedury dla każdego naukowca zainteresowanego badaniem transportu aksonalnego.Zacznij od odlewania PDMS w formach pierwotnych. Użyj sprężonego powietrza, aby usunąć wszelkie zabrudzenia z platformy wafla, upewniając się, że wafle wyglądają gładko i przejrzyście przed kontynuowaniem. Następnie napełnij pojemnik ciekłym azotem i przygotuj 10-mililitrową strzykawkę z igłą o rozmiarze 23.W okapie oparowym umieścić płytkę zawierającą wafel w zamykanym pojemniku i napełnić strzykawkę dwoma mililitrami ciekłego azotu na każdą płytkę zawierającą płytkę. Otwórz butelkę z chlorotrimetylosilanem. Przekłuć gumową nasadkę strzykawką i wstrzyknąć azot do butelki.Nie wyciągając igły, odwróć butelkę do góry dnem i cofnij dwa mililitry chlorotrimetylosilanu na każdą płytkę zawierającą wafel. Rozprowadzić chlorotrimetylosilan w pojemniku, ale nie bezpośrednio na płytce zawierającej wafel. Zamknij pojemnik.I inkubuj go przez pięć minut na płytkę. Następnie zważ 47,05 grama zasady PDMS w 50-mililitrowej tubie i dodaj utwardzacz PDMS w stosunku 16 do 1 bazy do utwardzacza, co daje łącznie 50 gramów. Mieszaj PDMS przez 10 minut na rotatorze o niskiej prędkości, a następnie wlej go do każdej płytki zawierającej wafel na żądaną wysokość.Umieścić płytki w eksykatorze próżniowym na dwie godziny. Który usunie powietrze uwięzione w PDMS i utworzy przezroczystą, jednolitą pleśń. Następnie inkubuj płytki w piekarniku przez trzy godziny lub przez noc w temperaturze 70 stopni Celsjusza.Aby stworzyć komorę mikroprzepływową lub MFC. Wytnij i usuń foremki PDMS z płytki za pomocą skalpela, uważając, aby nie naciskać na foremki, ponieważ są delikatne. Postępuj zgodnie z instrukcjami zawartymi w rękopisie tekstowym, aby przebić i przeciąć komory, w zależności od konfiguracji eksperymentalnej.W przypadku hodowli eksplantatów rdzenia kręgowego należy przebić dwie siedmiomilimetrowe studzienki w dystalnej stronie dużego MFC, upewniając się, że będą one zachodzić na krawędzie kanału. Po stronie proksymalnej przebij jedną siedmiomilimetrową studzienkę w środku kanału z minimalnym zachodzeniem na siebie, tak aby pozostało wystarczająco dużo miejsca na eksplantaty. Wykonaj dwa dodatkowe otwory o średnicy jednego milimetra w dwóch krawędziach kanału proksymalnego.I pokrój PDMS na pojedyncze komory. Następnie obróć MFC do góry i użyj igły o rozmiarze 20, aby wyrzeźbić trzy małe jaskinie eksplantacji na wybitej siedmiomilimetrowej studni. Aby uzyskać zdysocjowaną hodowlę neuronów ruchowych, przebij cztery sześciomilimetrowe studzienki w krawędziach dwóch kanałów małego MFC i pokrój PDMS na pojedyncze komory.Aby wysterylizować płytę melaminowaną, rozłóż na ławce taśmy klejące o długości 50 centymetrów. Następnie dociśnij obie powierzchnie komory do taśmy i pociągnij ją do tyłu. Umieść czyste komory na nowej płytce i inkubuj je w klasie analitycznej 70% etanolu przez 10 minut na wytrząsarce orbitalnej.Wyrzuć etanol i wysusz komory w okapie do hodowli tkanek lub w piekarniku w temperaturze 70 stopni Celsjusza. Następnie umieść komorę w środku rowu ze szklanym dnem do hodowli tkankowych i przyłóż niewielką siłę do krawędzi, aby przymocować PDMS do dna naczynia. Inkubuj naczynie przez 10 minut w temperaturze 70 stopni Celsjusza.Następnie naciśnij komory, aby wzmocnić przyczepność. Inkubuj naczynie w promieniowaniu UV przez 10 minut, a następnie przystąp do kodowania MFC. Dodaj 1,5 nanograma na mililitr PLO do obu komór.Upewnienie się, że PLO działa przez kanały. Poprzez pipetowanie materiału powlekającego bezpośrednio w wejściu do kanału. Zbadaj MFC pod mikroskopem świetlnym, aby sprawdzić, czy nie ma pęcherzyków.Jeśli pęcherzyki powietrza blokują mikrorowki, umieść MFC w eksykatorze próżniowym na dwie minuty. Usuń nadmiar powietrza z kanałów MFC. Następnie inkubuj go przez noc za pomocą PLO.Zastąp PLO lamininą i inkubuj MFC przez dodatkową noc. Przed posiewem umyj lamininę pożywką hodowlaną. Przeprowadź sekcję ciężarnej myszy ICR E12.5 i oddziel zarodki od worka owodniowego.Umieść zarodek w silikonowym naczyniu HBSS. Usuń głowę i ogon i przełóż je na brzuch. Delikatnie złudź powierzchowną skórę z zarodków z powrotem, odsłaniając rdzeń kręgowy.Oddziel rdzeń kręgowy od ciała od głowy do ogona za pomocą delikatnej pęsety. Usuń opony mózgowe, a następnie usuń rogi grzbietowe i przetnij rdzeń kręgowy na odcinki poprzeczne o grubości jednego milimetra. Usunąć całe podłoże z proksymalnej komory MFC.Pobrać pojedynczy eksplant rdzenia kręgowego za pomocą pipety o łącznej objętości czterech mikrolitrów. I wstrzyknij go jak najbliżej jaskini. Wyciągnij nadmiar płynu z dołu proksymalnego przez boczne wyloty.Powtórz poprzedni krok jeszcze dwa razy i upewnij się, że eksplantaty są osadzone w kanale proksymalnym. Powoli dodaj 150 mikrolitrów pożywki SCEX do studzienki proksymalnej. Jeden dzień po poszyciu.Wymieniono pożywkę SCEX w komorze proksymalnej i dodano bogatą pożywkę SCEX do komory dystalnej. Utrzymanie gradientu objętości wynoszącego co najmniej 15 mikrolitrów na studzienkę między studzienką dystalną i proksymalną. Po czterech do sześciu dniach aksony powinny przejść do dystalnego przedziału i być gotowe do obrazowania transportu aksonalnego.Aby oznaczyć mitochondria i przedziały kwasowe, przygotuj świeżą pożywkę SCEX ze 100 nanomolowymi MitoTracker Deep Red FM i 100 nanomolowymi LysoTracker Red. I dodaj go do komór mikroprzepływowych. Inkubuj je przez 30 do 60 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnie umyj trzy razy ciepłym podłożem SCEX. Kontynuuj obrazowanie na żywo transportu aksonalnego. Wykonanie serii 100 zdjęć poklatkowych w trzysekundowych odstępach.W sumie pięć minut na film. Po siedmiu dniach w komorach mikroprzepływowych. Mysi embrionalny eksplantat rdzenia kręgowego HB9 GFP.Jesteśmy zabarwieni barwnikami MitoTracker Deep Red i LysoTracker Red. Aby oznaczyć mitochondria i przedziały kwasowe. Aksony w dystalnych rowkach zostały zobrazowane, a analiza kymograficzna została wykorzystana do określenia ogólnego rozkładu ruchu.Ujawniło to odchylenie w kierunku wstecznym tylko w kwaśnych przedziałach miejskich, ale nie w transporcie mitochondrialnym. Określono również ilościowo gęstość cząstek, ujawniając większą liczbę cząstek mitochondrialnych w porównaniu z kwaśnymi przedziałami w aksonach eksplantacji rdzenia kręgowego HB9 GFP. Następnie przeprowadzono analizę transportu pojedynczych cząstek za pomocą półautomatycznego oprogramowania, a następnie własnego kodu.Analiza ta wykazała, że składniki kwasowe i mitochondria mają podobne prędkości cząstek. Ale tylko przedziały kwasowe wykazują skłonność do ruchu wstecznego. Izolacja zarodka rdzenia kręgowego może być na początku trudna.Przećwicz tę procedurę kilka razy, upewniając się, że używasz odpowiedniego wieku zarodka i odpowiednich narzędzi preparacyjnych. Zastosowanie komór mikroprzepływowych zmienia sposób, w jaki badamy biologię aksonalną. Pozwala nam to na wizualizację zlokalizowanych procesów aksonalnych, które kiedyś przypuszczaliśmy, że zachodzą tylko w ciele komórki.

axonal-transport-organelles-motor-neuron-cultures-using-microfluidic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W tym filmie prezentujemy technikę soft lithography z wykorzystaniem polidimetylosiloksanu (PDMS), której używamy do wykonania urządzenia mikroprzepływowego do hodowli neuronów.

Wytwarzanie urządzenia mikroprzepływowego do kompartymentacji somy i aksonów neuronów

W niniejszym opracowaniu opisujemy technikę przygotowywania i utrzymywania komór przedzielonych do hodowli neuronów sensorycznych z zwojów korzeni grzbietowych.

Przygotowanie i utrzymanie neuronów z zwojów korzeni grzbietowych w hodowlach przedzielonych

Opracowaliśmy nowatorską wielokomorową platformę mikrosystemową do kokultury neuronów, przeznaczoną do badań nad oddziaływaniami aksonów i gleju w OUN in vitro. Platforma ta umożliwia prowadzenie do sześciu niezależnych eksperymentów równolegle i została wykonana przy użyciu nowo opracowanej hybrydowej metody fabrykacji makro/mikro.

Wielokomorowa mikrofluidyczna platforma do kokultury neuronów i gleju ośrodkowego układu nerwowego

Ten film demonstruje metodę śledzenia transportu aksonalnego w neuronach ruchowych za pomocą systemu komór mikroprzepływowych. Polega na hodowli tkanek embrionalnych rdzenia kręgowego myszy w studzienkach pokrytych polimerem z pożywką w celu wywołania wzrostu aksonów. Ruch organelli barwionych barwnikiem fluorescencyjnym w obrazowaniu na żywo potwierdza dwukierunkowy transport aksonalny.

Śledzenie transportu aksonalnego organelli w neuronach ruchowych za pomocą urządzenia mikroprzepływowego

Komórki S2 Drosophila i hodowane neurony są świetnymi systemami do obrazowania transportu organelli napędzanych motorycznie in vivo. Tutaj opisujemy szczegółowe protokoły hodowli obu typów komórek, ich obrazowania i analizy transportu.

Transport organelli w hodowanych komórkach Drosophila: linia komórkowa S2 i neurony pierwotne.

Opisane są protokoły dla układu mikroprzepływowego pojedynczego neuronu i maskowania wody dla wbudowanego w układ plazmowy wzór powłok biomateriałowych. Wysoce powiązane ze sobą kokultury można przygotować przy użyciu minimalnego wkładu komórek.

Przygotowanie kokultur neuronalnych z precyzją pojedynczej komórki

Wewnątrzkomórkowy transport ładunków, takich jak pęcherzyki czy organelle, odbywa się za pomocą molekularnych białek motorycznych, które śledzą na spolaryzowanych mikrotubulach. Protokół ten opisuje korelację kierunkowości transportu pojedynczych cząstek ładunku poruszających się wewnątrz neuronów, do względnej ilości i rodzaju związanych z nimi białek motorycznych.

Charakterystyka składu silników molekularnych na ruchomym ładunku aksonalnym za pomocą analizy "mapowania ładunku"

Ten protokół zapewnia kompleksową procedurę wytwarzania ludzkiego organoidu nerwu ruchowego pochodzącego z komórek iPS poprzez spontaniczne składanie solidnego pakietu aksonów przedłużonego z sferoidy w chipie do hodowli tkankowej.

Trójwymiarowe generowanie organoidów nerwów ruchowych

Opisujemy metodę generowania ludzkich jednostek motorycznych w komercyjnie dostępnych urządzeniach mikroprzepływowych poprzez kokulturację ludzkich indukowanych pluripotencjalnych neuronów ruchowych pochodzących z komórek macierzystych z ludzkimi pierwotnymi miotubami pochodzącymi z mezoangioblastów, co prowadzi do powstania funkcjonalnie aktywnych połączeń nerwowo-mięśniowych.

Generacja jednostek motorycznych człowieka z funkcjonalnymi połączeniami nerwowo-mięśniowymi w urządzeniach mikroprzepływowych

Obecny protokół opisuje zasiewanie i barwienie mitochondriów neuronalnych w komorach mikroprzepływowych. Gradient ciśnienia płynu w tych komorach pozwala na selektywne traktowanie mitochondriów w aksonach w celu analizy ich właściwości w odpowiedzi na wyzwania farmakologiczne bez wpływu na przedział ciała komórki.

Selektywna depolaryzacja mitochondriów aksonalnych wspomagana mikrofluidyką

Poznaj metodę śledzenia transportu aksonalnego organelli w neuronach ruchowych z wykorzystaniem komór mikroprzepływowych. Ta technika umożliwia badanie mechanizmów neurodegeneracyjnych w czasie rzeczywistym.

Transport aksonalny organelli w kulturach neuronów ruchowych z wykorzystaniem systemu komór mikroprzepływowych

Przeglądaj więcej filmów