Name: Generacja jednostek motorycznych człowieka z funkcjonalnymi połączeniami nerwowo-mięśniowymi w urządzeniach mikroprzepływowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Odkryj metodę generowania ludzkich jednostek motorycznych z funkcjonalnymi połączeniami nerwowo-mięśniowymi w mikroprzepływowych urządzeniach. Model ten umożliwia badanie chorób neuronów ruchowych, w tym stwardnienia zanikowego bocznego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Nikky Corthout i Sebastianowi Munckowi z LiMoNe, Research Group Molecular Neurobiology (VIB-KU Leuven) za ich porady dotyczące zapisów fluorescencji przejściowej wapnia w żywych komórkach. Badania były wspierane przez Komisję Fulbrighta w Belgii i Luksemburgu, KU Leuven (C1 i Fundusz "Opening the Future"), VIB, Agencję ds. Innowacji Nauki i Technologii (IWT; SBO-iPSCAF), "Fundusz Badań Naukowych Flandrii" (FWO-Vlaanderen), Target ALS, ALS Liga België (Lekarstwo na ALS), rząd belgijski (Międzyuniwersytecki Program Przyciągania Biegunów P7/16 zainicjowany przez belgijski Federalny Urząd Polityki Naukowej), Fundacja Thierry'ego Latrana oraz "Association Belge contre les Maladies neuro-Musculaires" (ABMM). T.V. i J.B. są wspierani przez stypendia doktoranckie przyznawane przez FWO-Vlaanderen.

L.V.D.B. posiada patent na stosowanie inhibitorów HDAC w chorobie Charcota-Marie-Tootha (US-2013227717-A1), jest naukowym współzałożycielem Augustine Therapeutics i członkiem jej naukowej rady doradczej. Pozostali autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Protokół opisuje stosunkowo łatwą w użyciu metodę, która generuje ludzkie jednostki motoryczne z funkcjonalnymi NMJ w dostępnych na rynku urządzeniach mikroprzepływowych w czasie krótszym niż 30 dni. Opisano, w jaki sposób NMJ mogą być oceniane morfologicznie za pomocą standardowych technik, takich jak ICC i SEM, oraz funkcjonalnie za pomocą zapisów wapnia z żywych komórek.
Dużą zaletą tego protokołu jest zastosowanie technologii komórek macierzystych. Pozwala to na pełną zdolność adaptacji, w której NMJ mogą być oceniane zarówno pod względem zdrowia, jak i choroby, niezależnie od profilu dawcy. Model okazał się już skuteczny i korzystny w badaniach nad ALS, gdzie zidentyfikowaliśmy upośledzenia w przeroscie, odrastaniu i liczbie neurytów jako nowe fenotypy spowodowane mutacjami w genie FUS 18. Dzięki temu modelowi możliwe jest rozszerzenie badań o sporadyczne postacie ALS, których etiologia jest nieznana, poprzez wykorzystanie iPSC od sporadycznych pacjentów z ALS. Daje to przewagę nad tradycyjnymi modelami zwierzęcymi, które opierają się na transgenicznej nadekspresji zmutowanych genów w celu podsumowania choroby człowieka23,24. Ponadto, nasz w pełni ludzki system pozwala na potencjalną rekapitulację specyficznej dla człowieka fizjologii i choroby. Poprzednie badania wykazały różnice między morfologią NMJ gryzoni i ludzi25, co sugeruje, że należy zachować ostrożność podczas stosowania gryzoni w celu rozwiązania patologii NMJ u ludzi. Chociaż system ten jest stosunkowo prostą konfiguracją in vitro, której brakuje złożoności modelu in vivo, udało się wykazać, że morfologia NMJ wyświetlana w urządzeniach mikroprzepływowych przypominała NMJ u ludzi po amputacji25. Co więcej, model ten pozwala na ocenę NMJ podczas powstawania i dojrzewania NMJ, potencjalnie ujawniając wczesne fenotypy choroby, które są nieobecne, niezidentyfikowane lub przeoczone w ludzkich próbkach pośmiertnych.
MAB zapewniają ważną opcję generowania miotubek, chociaż ich ograniczona przeżywalność wynosząca 10 dni jest wadą systemu. Przetrwanie miotubki zależy od ich przyczepienia się do powierzchni, która jest prawdopodobnie zagrożona przez spontaniczne skurcze włókien mięśniowych. Po ponad 10 dniach większość miotubek odłączy się, co sprawi, że kultura NMJ stanie się bezużyteczna. Idealnie byłoby, gdyby miorurki były również generowane z iPSC. Jednak obecne protokoły okazały się trudne do odtworzenia26 ze względu na zmienność indeksu fuzji 27,28,29,30.
Dzięki zastosowaniu dostępnych na rynku urządzeń mikroprzepływowych wygenerowaliśmy ustandaryzowany system, który jest w pełni dostępny. Istnieją inne modele NMJ 31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42. Jednak zazwyczaj opierają się one na pojedynczych komorach, które nie mają podziału na przedziały i izolacji płynnej między typami komórek, lub na niestandardowych naczyniach hodowlanych, co obniża dostępność, a potencjalnie także odtwarzalność. Urządzenia mikroprzepływowe wykorzystywane w tym protokole można zakupić z mikrorowkami o różnych długościach, co pozwala na dalsze analizy, takie jak transport aksonalny43,44 lub badania aksotomii 18,45,46. Płynowa izolacja między przedziałami dodatkowo umożliwia dzielenie na przedziały leczenia farmakologicznego neuronów ruchowych lub mięśniówek, co może być korzystne w rozwoju terapii. Pojawiło się więcej firm specjalizujących się w mikrofluidyce, co otworzyło się na duży wybór konstrukcji i funkcji urządzeń, co jeszcze bardziej promuje dostępność badań in vitro.
Podsumowując, opracowaliśmy protokół zapewniający niezawodną, wszechstronną i łatwą metodę hodowli ludzkich jednostek motorycznych za pomocą funkcjonalnych NMJ.

NMJ ułatwiają komunikację między dolnymi neuronami ruchowymi rdzenia kręgowego a włóknami mięśni szkieletowych poprzez uwalnianie neuroprzekaźników1. W zaburzeniach neuronu ruchowego, takich jak ALS i SMA, NMJ ulegają degeneracji, co powoduje zakłócenia w komunikacji z mięśniami2,3,4,5,6,7. Powoduje to, że pacjenci stopniowo tracą funkcję mięśni, co powoduje, że są przykuci do wózka inwalidzkiego i ostatecznie zależni od podtrzymywania życia przez układ oddechowy z powodu postępującego zaniku ważnych grup mięśni, takich jak przepona. Dokładne mechanizmy odpowiedzialne za tę głęboką utratę NMJ w tych zaburzeniach nie są znane. Przeprowadzono wiele badań na transgenicznych modelach zwierzęcych, które dały nam pewien wgląd w patogenezę zwyrodnienia NMJ5,6,8,9,10,11. Jednak, aby w pełni zrozumieć patologię i przeciwdziałać odnerwieniu, ważne jest, aby mieć ludzki system, który umożliwia pełną dostępność.
Tutaj protokół opisuje stosunkowo prosty sposób generowania ludzkich NMJ poprzez kokulturację neuronów ruchowych pochodzących z hiPSC i ludzkich pierwotnych myotubek pochodzących z MAB za pomocą dostępnych na rynku urządzeń mikroprzepływowych. Zastosowanie mikrofluidyki do polaryzacji i płynnej izolacji somy i aksonów neuronów jest znane od czasu pierwszego opisu komór 'Campenot' 12 pod koniec lat siedemdziesiątych. Od tego czasu wyprodukowano więcej projektów mikroprzepływowych, w tym opcje komercyjne. Urządzenia używane w tym protokole zawierają dwie komory, a każda komora składa się z dwóch studzienek połączonych kanałem13. Dwie komory są lustrzane i połączone kilkoma mikrorowkami. Te mikrorowki mają rozmiar, który ułatwia wzrost neurytu, zachowując jednocześnie izolację płynów między dwoma przedziałami poprzez kapilarne ciśnienie hydrostatyczne13,14. Za pomocą tego systemu możliwe jest hodowanie neuronów ruchowych w jednym przedziale i komórek mięśniowych w drugim, każda w specyficznym pożywce hodowlanej, jednocześnie ułatwiając fizyczne połączenie poprzez neuryty przechodzące przez mikrorowki i angażujące się w komórki mięśniowe. Model ten zapewnia w pełni dostępny i adaptowalny system in vitro ludzkiej jednostki motorycznej, który może być wykorzystany do badania wczesnej patologii NMJ w chorobach takich jak ALS i SMA.

<table><tbody><tr><td>&alpha;-bungarotoxin (Btx) Alexa fluor 555</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B35451</td><td>Przeciwciało (1:1000)</td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>CHEM-Lab NV</td><td>CL00.0116.1000</td><td>Składnik powlekający. H226, H314. Arkusz P280</td></tr><tr><td>Aclar 33C (arkusz SEM)</td> <td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>50425-25</td><td>Grubość: 7,8 mil</td></tr><tr><td>Agrin (rekombinowane białko ludzkie)</td> <td>R& D systems</td><td>6624-AG-050</td><td>Suplement medialny</td></tr><tr><td>Alexa fluor IgG (H+L) 488 osioł-anty królik</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Przeciwciało A21206</td><td>(1:1000)</td></tr><tr><td>Alexa fluor IgG (H+L) 555 osioł-koza</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21432</td><td>Przeciwciało (1:1000)</td></tr><tr><td>Alexa fluor IgG (H+L) 555 osioł-anty mysz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A31570</td><td>Przeciwciało (1:1000)</td></tr><tr><td>Alexa fluor IgG (H+L) 647 osioł-anty mysz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A31571</td><td>Przeciwciało (1:1000)</td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Sigma</td><td>A4403</td><td>Składnik podłoża</td></tr> <tr><td>i beta; III-tubulina (Tubulina)</td><td>Abcam</td><td>ab7751</td><td>Przeciwciało (1:500)</td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol</td><td>Składnik Thermo Fisher Scientific</td><td>31350010</td><td>Media. H317. P280.</td></tr><tr><td>B-27 bez witaminy A</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12587-010</td><td>Składnik pożywki</td></tr><tr><td>BDNF (czynnik neurotroficzny pochodzenia mózgowego)</td><td>Peprotech</td><td>450-02B</td><td>Czynnik wzrostu</td></tr><tr><td>bFGF (rekombinowany ludzki podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Czynnik wzrostu</td></tr><tr><td>Acetylotransferaza choliny (ChAT)</td><td>Przeciwciało Millipore</td><td>ab144P</td><td>(1:500)</td></tr><tr><td>Kolagen ze skóry cielęcej</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17104019</td><td>Składnik powlekający</td></tr><tr><td>CNTF (rzęskowy czynnik neurotroficzny)</td><td>Peprotech</td><td>450-13B</td><td>Czynnik wzrostu</td></tr><tr><td>DAPI Nucblue Live Cell Stain ReadyProbes</td><td>odczynnik Thermo Fisher Scientific</td><td>R37605</td><td>Składnik immunocytochemiczny</td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Tocris Bioscience</td><td>2634</td><td>Suplement medialny</td></tr><tr><td>Przeciwciało Desmin</td><td></td><td>Abcam Ab15200</td><td>(1:200)</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11330032</td><td>Składnik podłoża</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650-100ML</td><td>Składnik kriokonserwacji. H315, H319, H335. P280.</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS) firmy DulbeccoThermo</td> <td>Fisher Scientific</td><td>14190250</td><td>bez wapnia, bez magnezu</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>20.821.296</td><td>Sterylizacja. H225. P280</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106</td><td>Składnik podłoża</td></tr><tr><td>Fluo-4 AM barwnik z żywych komórek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F14201</td><td>Barwnik do obrazowania wapnia</td></tr><tr><td>Fluorescencyjne podłoże montażowe</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td>Składnik immunocytochemiczny</td></tr><tr><td>GDNF (czynnik neurotroficzny pochodzący z linii komórek glejowych)</td><td>Peprotech</td><td>450-10B</td><td>Czynnik wzrostu</td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy</td><td>Agar Scientific</td><td>R1020</td><td>Składnik utrwalający. EUH071, H301, H314, H317, H330, H334, H410. P280.</td></tr><tr><td>Surowica dla koni</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16050122</td><td>Składnik podłoża</td></tr><tr><td>Ludzka fosfataza alkaliczna</td><td>R& Systemy D</td><td>MAB1448</td><td>Oprogramowanie</td></tr> do <tr><td>obrazowania</td> przeciwciał Analiza <td>IH IKG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>THERMO FISHER Scientific</td><td>12440053</td><td>Składnik podłoża</td></tr><tr><td>Insulina transferyna selen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41400045</td><td>Składnik podłoża</td></tr><tr><td>Przeciwciało Islet-1</td><td>Millipore</td><td>ab4326</td><td>(1:400)</td></tr><tr><td>Wymiana surowicy nokautującej</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828-028</td><td>Składnik do kriokonserwacji</td></tr><tr><td>Laminin z błony podstawnej mięsaka mysiego Engelbreth-Holm-Swarm</td><td>Sigma</td><td>L2020-1MG</td><td>Składnik powłoki i suplement podłoża</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny Leica SP8 DMI8</td><td>Mikroskopia konfokalna</td><td>Leica</td><td></td> ICC</tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-024</td><td>Składnik medialny</td></tr><tr><td>Myogenin (MyoG)</td><td>Abcam</td><td>Ab124800</td><td>Przeciwciało (1:500)</td></tr>Łańcuch <tr><td>ciężki miozyny (MyHC)</td><td>Własne, przeciwciało SCIL</td><td></td><td>(1:20)</td></tr><tr><td>Suplement N-2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502-048</td><td>Składnik podłoża</td></tr><tr><td>Podłoże neuropodstawowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21103049</td><td>Powłoka i składnik podłoża</td></tr><tr><td>Ciężki łańcuch neurofilamentu (NEFH)</td><td>Abcam</td><td>Przeciwciało AB8135</td><td>(1:1000)</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny Nikon A1R</td><td>Nikon</td><td></td><td>Mikroskopia obrazowania wapnia z żywych komórek</td></tr><tr><td>Oprogramowanie NIS-Elements AR 4.30.02</td><td>Nikon</td><td></td><td>Analiza obrazowania wapnia z żywych komórek</td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140050</td><td>Składnik podłoża</td></tr><tr><td>Normalna surowica osła</td><td>Sigma</td><td>D9663-10ML</td><td>Składnik immunocytochemiczny</td></tr><tr><td>Olig2</td><td>IBL</td><td>18953</td><td>Przeciwciało (1:1000)</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td>Sprzęt do przechowywania</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td>Składnik utrwalający. H302, H312, H315, H317, H319, H332, H335, H341, H350. P280.</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna (5000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15070063</td><td>Składnik podłoża</td></tr><tr><td>szalka Petriego (3 cm)</td><td>nunc</td><td>153066</td><td>Średnica: 3 cm</td></tr><tr><td>szalka Petriego (10 cm)</td><td>Sarstedt</td><td>833.902</td><td>Średnica: 10 cm</td></tr><tr><td>Płytka (6-dołkowa)</td><td>Cellstar Greiner bio-one</td><td>657160</td><td>Płytka hodowlana</td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P3000MP</td><td>Rozpuszczalnik barwnikowy Fluo-4</td></tr><tr><td>Poli-L-ornityna (PLO)</td><td>Sigma</td><td>P3655-100MG</td><td>Składnik powlekający</td></tr>: <tr><td>Chlorek potasu</td><td>CHEM-Lab NV</td><td>CL00.1133.1000</td><td>Odczynnik do obrazowania wapnia</td></tr><tr><td>Kwas retinowy</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>Suplement mediów. H302, H315, H360FD, H410. P280.</td></tr><tr><td>RevitaCell suplement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A2644501</td><td>roztwór inhibitora ROCK</td></tr><tr><td>Wygładzony agonista</td><td>Merch Millipore</td><td>566660</td><td>Suplement medialny</td></tr><tr><td>Bufor kakodylanu sodu</td><td>Sigma</td><td>C0250</td><td>Składnik utrwalający. H301, H331, H350, H410. P280.</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td>Składnik pożywki</td></tr><tr><td>Synaptofizyna (SYP)</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>Przeciwciało 5461S</td><td>(1:1000)</td></tr><tr><td>Kolba T75</td><td>Płytka hodowlana</td><td>Sigma</td><td>CLS3276</td> Badania</tr><tr>rozwojowe<td>tytyny</td><td>Przeciwciało Hybridoma Bank</td><td>9D10</td><td>(1:300)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-250ML</td><td>Składnik immunocytochemiczny. H302, H315, H318, H319, H410, H411. P280</td></tr><tr><td>TrypLE express</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12605010</td><td>roztwór dysocjacyjny MAB</td></tr><tr><td>Chlorowodorek tubocyryryny pentahydrat</td><td>Sigma</td><td>T2379-100G</td><td>Bloker receptora acetylocholiny. H301. P280.</td></tr><tr><td>Wstępnie zmontowane urządzenie mikroprzepływowe XonaChips</td><td>Xona Microfluidics</td><td>XC150</td><td>Długość mikrorowka: 150 &mu; m</td></tr><tr><td>Xona Silikonowe urządzenie mikrofluidyczne</td><td>Xona Microfluidics</td><td>SND75</td><td>Długość mikrorowka: 75 &mu; mln</td></tr></tbody></table>

generacja jednostek motorycznych człowieka z funkcjonalnymi połączeniami nerwowo-mięśniowymi w urządzeniach mikroprzepływowych

Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices

Połączenia nerwowo-mięśniowe (NMJ) to wyspecjalizowane synapsy między aksonem dolnego neuronu ruchowego a mięśniem, ułatwiające włączenie skurczu mięśni. W zaburzeniach neuronu ruchowego, takich jak stwardnienie zanikowe boczne (ALS) i rdzeniowy zanik mięśni (SMA), NMJ ulegają zwyrodnieniu, powodując zanik mięśni i postępujący paraliż. Mechanizm leżący u podstaw zwyrodnienia NMJ jest nieznany, głównie z powodu braku przekładalnych modeli badawczych. Badanie to miało na celu stworzenie wszechstronnego i powtarzalnego modelu in vitro ludzkiej jednostki motorycznej z funkcjonalnymi NMJ. W związku z tym neurony ruchowe pochodzące z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) i ludzkie pierwotne miorurki pochodzące z mezoangioblastów (MAB) były hodowane wspólnie w dostępnych na rynku urządzeniach mikroprzepływowych. Zastosowanie płynnie izolowanych mikrokompartmentów pozwala na utrzymanie mikrośrodowisk specyficznych dla komórek, umożliwiając jednocześnie kontakt między komórkami przez mikrorowki. Stosując gradient chemotaktyczny i wolumetryczny, stymulowano wzrost neuronów ruchowych przez mikrorowki promujące interakcję miotubową i tworzenie NMJ. Te NMJ zidentyfikowano immunocytochemicznie poprzez kolokalizację markera presynaptycznego neuronu ruchowego synaptofizyny (SYP) i markera postsynaptycznego receptora acetylocholiny (AChR) α-bungarotoksyny (Btx) na mięśniówkach i scharakteryzowano morfologicznie za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). Funkcjonalność NMJ potwierdzono poprzez pomiar odpowiedzi wapnia w miotubach po depolaryzacji neuronów ruchowych. Jednostka motoryczna wygenerowana przy użyciu standardowych urządzeń mikroprzepływowych i technologii komórek macierzystych może pomóc w przyszłych badaniach koncentrujących się na NMJ w zdrowiu i chorobie.

Opisujemy metodę generowania ludzkich jednostek motorycznych w komercyjnie dostępnych urządzeniach mikroprzepływowych poprzez kokulturację ludzkich indukowanych pluripotencjalnych neuronów ruchowych pochodzących z komórek macierzystych z ludzkimi pierwotnymi miotubami pochodzącymi z mezoangioblastów, co prowadzi do powstania funkcjonalnie aktywnych połączeń nerwowo-mięśniowych.

Generacja jednostek motorycznych człowieka z funkcjonalnymi połączeniami nerwowo-mięśniowymi w urządzeniach mikroprzepływowych

Neuromuscular junctions (NMJs) are specialized synapses between the axon of the lower motor neuron and the muscle facilitating the engagement of muscle ...

Ta stosunkowo prosta metoda może pomóc w badaniach koncentrujących się na neuronach ruchowych i połączeniach nerwowo-mięśniowych w zdrowiu i chorobie. Protokół ten wykorzystuje standardową technologię komórek macierzystych i dostępne na rynku urządzenia mikroprzepływowe, co zwiększa odtwarzalność. Rozłączenie neuronów ruchowych i komórek mięśniowych jest wczesnym zjawiskiem w wielu chorobach nerwowo-mięśniowych.Prosty, humanizowany model może pomóc w opracowaniu strategii przeciwdziałania temu zjawisku. Używamy tego modelu do badania zaburzenia neuronu ruchowego, stwardnienia zanikowego bocznego, jednak model ten może być również stosowany w innych zaburzeniach, w których jednostka ruchowa jest niezbędna. Rozpocznij od przeniesienia urządzenia za pomocą kleszczy z pojemnika transportowego na szalkę Petriego zawierającą 10 mililitrów 70% do 100% etanolu w celu sterylizacji przez 10 sekund.Przenieś urządzenie za pomocą kleszczy na kartkę papieru, aby wyschło na powietrzu w przepływie laminarnym przez około 30 minut. Po wysuszeniu urządzenia użyj kleszczy, aby przesunąć każde urządzenie na indywidualną 10-centymetrową szalkę Petriego. Aby pokryć urządzenie poli-L-ornityną lub PLO, dodaj 100 mikrolitrów roztworu PLO do górnej studzienki i obserwuj płyn przepływający z górnej studzienki przez kanał do dolnej studzienki.Następnie dodaj 100 mikrolitrów roztworu PLO do dolnej studzienki i powtórz po drugiej stronie mikrorowków. Zakończ, dodając 100 mikrolitrów roztworu PLO z jednej strony, aby utworzyć gradient objętości między dwiema lustrzanymi stronami urządzenia, aby pokryć mikrorowki. Inkubuj przez trzy godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.Po trzech godzinach umyj urządzenie trzykrotnie przez pięć minut za pomocą DPBS. Pokryj urządzenie 20 mikrogramami na mililitr lamininy i pożywką neuropodstawową, postępując zgodnie z procedurą podobną do powlekania PLO. Inkubuj urządzenie przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.Następnego dnia użyj pipety o pojemności 200 mikrolitrów i umieść końcówkę w studzience przeciwnej do otworu kanału, aby usunąć powłokę lamininy ze studzienek. Po dodaniu DPBS do wszystkich studzienek, pozostaw urządzenia z DPBS w przepływie laminarnym w temperaturze pokojowej w celu wysiewu komórek. Przytnij arkusze SCM do rozmiaru urządzenia, pozostawiając kilka milimetrów z każdej strony.Po wysterylizowaniu urządzeń i arkuszy SCM na szalce Petriego zawierającej 10 mililitrów od 70% do 100% etanolu przez 10 sekund, przenieś urządzenia za pomocą kleszczy na płytkę sześciodołkową, a arkusze SCM na 10-centymetrową szalkę Petriego w celu wysuszenia na powietrzu w przepływie laminarnym. Ustaw urządzenie na krawędzi, aby wszystkie strony wyschły przez około 30 minut. Pokryj urządzenia, dodając jeden mililitr roztworu PLO na studzienkę do każdego urządzenia na płytce sześciodołkowej.Upewnij się, że urządzenie unosi się na roztworze PLO, a kanał i strona z mikrorowkiem są skierowane w dół do cieczy. Pokryj arkusze SCM, dodając 10 mililitrów roztworu PLO do 10-centymetrowej szalki Petriego i użyj kleszczyków, aby wepchnąć arkusze SCM do cieczy. Inkubuj urządzenia i arkusze SCM przez trzy godziny, jak pokazano wcześniej.Po trzech godzinach umyj urządzenia i arkusze SCM dwa razy przez pięć minut za pomocą DPBS, a następnie ponownie umyj przez pięć minut sterylną wodą. Następnie przenieś każdy arkusz SCM na pojedynczą 10-centymetrową szalkę Petriego do wyschnięcia na powietrzu. Podczas pracy pod mikroskopem w przepływie laminarnym użyj kleszczyków, aby zamontować urządzenie silikonowe stroną z kanałem i mikrorowkiem do dołu pod kątem 90 stopni na arkuszu SCM, upewniając się, że wszystkie strony są wyrównane.Lekko dociśnij urządzenie, aby upewnić się, że uszczelniłeś nie tylko zewnętrzne krawędzie, ale także wokół studzienek, kanałów i mikrorowków. Aby pokryć urządzenie lamininą, wewnątrz przepływu laminarnego i pod mikroskopem dodaj 100 mikrolitrów po 20 mikrogramów na mililitr roztworu lamininy w górnej studzience za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów. Obserwuj, jak płyn przepływa od górnej studzienki przez kanał do dolnej studzienki bez żadnych wycieków wokół studni i kanału.Następnie dodaj 100 mikrolitrów roztworu lamininy do dolnej studzienki, powtórz po drugiej stronie mikrorowków i zakończ dodatkowymi 100 mikrolitrami lamininy po jednej stronie, aby utworzyć gradient objętości między dwiema lustrzanymi stronami urządzenia, aby pokryć mikrorowki, a następnie inkubować urządzenie przez noc. Następnego dnia usuń powłokę ze studzienek za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów, umieszczając końcówkę w studzience naprzeciwko otworu kanału, po dodaniu DPBS do wszystkich studzienek, pozostaw urządzenia z DPBS w przepływie laminarnym w temperaturze pokojowej w celu wysiewu komórek. Aby umieścić komórki progenitorowe neuronów lub NPC w urządzeniu mikroprzepływowym, usuń DPBS z dwóch studzienek po jednej stronie mikrorowków w urządzeniu za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów.Aby zasiać w sumie 250 000 NPC i od 60 do 100 mikrolitrów pożywki dla neuronów ruchowych dnia 10 na urządzenie, w prawym górnym dołku wysiewaj połowę zawiesiny komórkowej w pobliżu otworu kanału pod kątem 45 stopni. Zatrzymaj się na kilka sekund, aby zawiesina komórek przepłynęła przez kanał przed dodaniem pozostałej połowy zawiesiny komórek do dolnej studzienki. Użyj długopisu, aby oznaczyć stronę z nasionami jako NPC lub równoważny, aby ułatwić orientację urządzenia bez mikroskopu, i inkubuj przez pięć minut w celu przyłączenia komórek.Następnie powoli uzupełnij dwie studzienki z nasionami NPC dodatkowym podłożem neuronów ruchowych dnia 10 do całkowitej objętości 200 mikrolitrów na studzienkę. Za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów usuń DPBS z dwóch dołków po drugiej stronie mikrorowków naprzeciwko świeżo wysianych NPC. Dodaj 200 mikrolitrów pożywki dla neuronów ruchowych dnia 10 na studzienkę do dołków niezasianych.Następnie dodaj sześć mililitrów DPBS na 10-centymetrowe naczynie wokół urządzenia, aby zapobiec parowaniu pożywki podczas inkubacji. Aby zmienić pożywkę, powoli usuń pożywkę z obu studzienek za pomocą NPC, umieszczając końcówkę pipety o pojemności 200 mikrolitrów na dolnej krawędzi ściany studzienki naprzeciwko otworu kanału. Aby zapobiec uszkodzeniu komórek w kanale przez silny przepływ pożywki, powoli dodawaj od 50 do 100 mikrolitrów świeżej pożywki neuronów ruchowych do każdej studzienki, ciągle przełączając się między górną i dolną studzienką.Powtarzaj proces, aż każda studzienka będzie zawierała 200 mikrolitrów pożywki. W 17 dniu różnicowania neuronów ruchowych usuń pożywkę neuronu ruchowego po nieobsianej stronie mikrorowków w urządzeniu za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów i umyj studzienki DPBS. Wysiewaj łącznie 200 000 ludzkich pierwotnych mezoangioblastów lub MAB w 60 do 100 mikrolitrach pożywki wzrostowej na urządzenie, wysiewając połowę zawiesiny komórkowej w górnej studzience.Zatrzymaj się na kilka sekund, aby zawiesina komórkowa mogła przepłynąć przez kanał przed wysianiem pozostałej połowy zawiesiny komórek w dolnej studzience, jak pokazano wcześniej w przypadku posiewu NPC. Inkubuj urządzenie przez pięć minut w celu przyłączenia komórek. Następnie uzupełnij dwie studzienki świeżo wysiane MAB dodatkowym podłożem wzrostowym i ponownie inkubuj, jak pokazano.Aby zainicjować taktykę chemioterapii i gradient wolumetryczny w 21 dniu różnicowania neuronów ruchowych, dodaj 200 mikrolitrów na studzienkę pożywki neuropodstawowej neuronu ruchowego zawierającej czynniki wzrostu do przedziału Myotube, a następnie dodaj 100 mikrolitrów na studzienkę podłoża podstawowego neuronu ruchowego bez czynników wzrostu do przedziału neuronu ruchowego. Ważne jest, aby ocenić potencjał różnicowania linii komórkowych przed ich kokulturą w urządzeniach mikroprzepływowych. Określono wskaźnik fuzji MAB i oszacowano, że około 8% jest wystarczające do kohodowli.Wygenerowane hodowle neuronów ruchowych były od 85 do 95% dodatnie dla markerów neuronów ruchowych. W celu scharakteryzowania i ilościowego określenia ilości połączeń nerwowo-mięśniowych lub NMJ, liczba kolokalizacji między neuronem ruchowym a presynaptycznymi markerami łańcucha ciężkiego neurofilamentu i synaptofizyny oraz postsynaptycznego markera receptora acetylenowego alfa bungarotoksyny została policzona przez każdy stos chorobowy i została znormalizowana w liczbie ciężkich łańcuchów miozyny oznaczonych Myotubes obecnych w stosie Z. NMJ pojawiły się jako pojedyncze punkty kontaktowe NMJ, w których neuryt dotykał klastra subtelnego receptora choliny w jednym punkcie interakcji.Lub jako wiele punktów kontaktowych NMJ, w których neuryt rozchodził się i angażował w subtelne skupisko receptora choliny na większej powierzchni. Kwantyfikacja odsetka innowacyjnych neuronów ruchowych Myotubes wykazała, że nie wszystkie Myotubes zawierały NMJ. Po aktywacji neuronu ruchowego chlorkiem potasu zaobserwowano napływ wapnia w Myotubes znakowanych Fluo-4, co potwierdziło funkcjonalne połączenie poprzez neuryt neuronu ruchowego w Myotube, dodanie blokera NMJ d-tubokuraryny lub DTC do przedziału Myotube spowodowało zahamowanie napływu wapnia.Aby odnieść jak największy sukces z tym modelem, niezwykle ważne jest przeprowadzenie kontroli jakości linii komórkowej i unikanie tworzenia się pęcherzyków powietrza w kanałach urządzenia. Połączenie połączenia nerwowo-mięśniowego w naczyniu z innymi bezpośrednimi typami komórek IPC jeszcze lepiej naśladuje sytuację in vitro, co pozwala również na badanie roli tych typów komórek.

generation-human-motor-units-with-functional-neuromuscular-junctions

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Film pokazuje tworzenie połączeń nerwowo-mięśniowych za pomocą urządzenia mikroprzepływowego. Neuronalne komórki prekursorowe i komórki progenitorowe mięśni są umieszczane w różnych studzienkach w urządzeniu i pozostawiane do dojrzewania odpowiednio w neuronach ruchowych i miotubach. Stworzenie gradientu objętościowego i chemicznego prowadzi do rozwoju aktywnych połączeń nerwowo-mięśniowych.

Generowanie połączeń nerwowo-mięśniowych za pomocą urządzenia mikroprzepływowego

Ten film demonstruje metodę tworzenia organoidów nerwów ruchowych poprzez najpierw hodowlę ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w specjalnym podłożu w celu utworzenia sferoid, następnie różnicowanie ich w neurony ruchowe za pomocą specyficznych inhibitorów, a na końcu hodowanie ich w mikroprzepływowym chipie w celu rozszerzenia aksonów i utworzenia organoidów nerwów ruchowych.

Opracowywanie ludzkich organoidów nerwów ruchowych pochodzących z iPSC przy użyciu chipa mikroprzepływowego

Ten eksperyment szczegółowo opisuje metodę generowania połączeń nerwowo-mięśniowych z indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych. Wykorzystuje etapowy proces różnicowania w celu promowania rozwoju neuronów mięśniowych i ruchowych oraz tworzenia synaps, dając funkcjonalne połączenia nerwowo-mięśniowe.

Indukcja in vitro połączeń nerwowo-mięśniowych z modyfikowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych przez człowieka

Ten film demonstruje metodę oceny funkcjonalnych połączeń nerwowo-mięśniowych. Za pomocą bioreaktora zawierającego tkankę mięśniową i neurony ruchowe, wraz z mikroskopią fluorescencyjną, wrażliwe na światło kanały w neuronach są stymulowane do generowania sygnałów elektrycznych, powodując skurcze włókien mięśniowych.

Ocena funkcjonalnego połączenia nerwowo-mięśniowego za pomocą jednoczesnej stymulacji optycznej i nagrywania wideo

Transport aksonalny jest kluczowym mechanizmem dla zdrowia neuronów ruchowych. W tym protokole przedstawiamy szczegółową metodę śledzenia transportu aksonalnego przedziałów kwasowych i mitochondriów w aksonach neuronów ruchowych za pomocą komór mikroprzepływowych.

Transport aksonalny organelli w kulturach neuronów ruchowych z wykorzystaniem systemu komór mikroprzepływowych

Tutaj udostępniamy protokół do generowania in vitro NMJ z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Ta metoda może indukować NMJ o dojrzałej morfologii i funkcji w ciągu 1 miesiąca w jednym dołku. Powstałe w ten sposób NMJ mogą być potencjalnie wykorzystane do modelowania powiązanych chorób, badania mechanizmów patologicznych lub badań przesiewowych związków leczniczych do terapii.

Połączenie nerwowo-mięśniowe in vitro indukowane z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół zapewnia kompleksową procedurę wytwarzania ludzkiego organoidu nerwu ruchowego pochodzącego z komórek iPS poprzez spontaniczne składanie solidnego pakietu aksonów przedłużonego z sferoidy w chipie do hodowli tkankowej.

Trójwymiarowe generowanie organoidów nerwów ruchowych

W tym badaniu prezentujemy protokół różnicowania nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych (NPC) indukowanych wyłącznie przez stymulację impulsami prądu stałego (DC) w systemie mikroprzepływowym.

Różnicowanie neuronalnych komórek prekursorowych pod wpływem pola elektrycznego w urządzeniach mikroprzepływowych

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół tworzenia matryc 3D mikrotkanek ludzkich mięśni szkieletowych oraz minimalnie inwazyjnych testów funkcji in situ, w tym analizy siły skurczu i obchodzenia się z wapniem.

Ocena funkcjonalnych wskaźników zdrowia mięśni szkieletowych w mikrotkankach mięśni szkieletowych człowieka

Opisujemy powtarzalny, zautomatyzowany i bezstronny system obrazowania do charakteryzowania funkcji połączeń nerwowo-mięśniowych przy użyciu ludzkiej tkanki mięśniowej i optogenetycznych neuronów ruchowych. System ten pozwala na funkcjonalną kwantyfikację połączeń nerwowo-mięśniowych w czasie i wykrywa zmniejszone funkcje nerwowo-mięśniowe spowodowane przez neurotoksyny i surowicę pacjenta z miastenią.

Inżynieria i charakterystyka modelu optogenetycznego ludzkiego połączenia nerwowo-mięśniowego

Obecny protokół opisuje projekt, produkcję i charakterystykę systemu mikroprzepływowego zdolnego do wyrównania, unieruchomienia i precyzyjnego ucisku setek zarodków Drosophila melanogaster przy minimalnym zaangażowaniu użytkownika. System ten umożliwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości i odzyskiwanie próbek do analizy po stymulacji i może być skalowany w celu uwzględnienia innych wielokomórkowych systemów biologicznych.

Mechanostymulacja organizmów wielokomórkowych za pomocą wysokoprzepustowego systemu kompresji mikroprzepływowej

Odkryj metodę generowania ludzkich jednostek motorycznych z funkcjonalnymi połączeniami nerwowo-mięśniowymi w mikroprzepływowych urządzeniach. Model ten umożliwia badanie chorób neuronów ruchowych, w tym stwardnienia zanikowego bocznego.

Generacja jednostek motorycznych człowieka z funkcjonalnymi połączeniami nerwowo-mięśniowymi w urządzeniach mikroprzepływowych

Przeglądaj więcej filmów