Generacja jednostek motorycznych człowieka z funkcjonalnymi połączeniami nerwowo-mięśniowymi w urządzeniach mikroprzepływowych

Ta stosunkowo prosta metoda może pomóc w badaniach koncentrujących się na neuronach ruchowych i połączeniach nerwowo-mięśniowych w zdrowiu i chorobie. Protokół ten wykorzystuje standardową technologię komórek macierzystych i dostępne na rynku urządzenia mikroprzepływowe, co zwiększa odtwarzalność. Rozłączenie neuronów ruchowych i komórek mięśniowych jest wczesnym zjawiskiem w wielu chorobach nerwowo-mięśniowych.

Prosty, humanizowany model może pomóc w opracowaniu strategii przeciwdziałania temu zjawisku. Używamy tego modelu do badania zaburzenia neuronu ruchowego, stwardnienia zanikowego bocznego, jednak model ten może być również stosowany w innych zaburzeniach, w których jednostka ruchowa jest niezbędna. Rozpocznij od przeniesienia urządzenia za pomocą kleszczy z pojemnika transportowego na szalkę Petriego zawierającą 10 mililitrów 70% do 100% etanolu w celu sterylizacji przez 10 sekund.

Przenieś urządzenie za pomocą kleszczy na kartkę papieru, aby wyschło na powietrzu w przepływie laminarnym przez około 30 minut. Po wysuszeniu urządzenia użyj kleszczy, aby przesunąć każde urządzenie na indywidualną 10-centymetrową szalkę Petriego. Aby pokryć urządzenie poli-L-ornityną lub PLO, dodaj 100 mikrolitrów roztworu PLO do górnej studzienki i obserwuj płyn przepływający z górnej studzienki przez kanał do dolnej studzienki.

Następnie dodaj 100 mikrolitrów roztworu PLO do dolnej studzienki i powtórz po drugiej stronie mikrorowków. Zakończ, dodając 100 mikrolitrów roztworu PLO z jednej strony, aby utworzyć gradient objętości między dwiema lustrzanymi stronami urządzenia, aby pokryć mikrorowki. Inkubuj przez trzy godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Po trzech godzinach umyj urządzenie trzykrotnie przez pięć minut za pomocą DPBS. Pokryj urządzenie 20 mikrogramami na mililitr lamininy i pożywką neuropodstawową, postępując zgodnie z procedurą podobną do powlekania PLO. Inkubuj urządzenie przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Następnego dnia użyj pipety o pojemności 200 mikrolitrów i umieść końcówkę w studzience przeciwnej do otworu kanału, aby usunąć powłokę lamininy ze studzienek. Po dodaniu DPBS do wszystkich studzienek, pozostaw urządzenia z DPBS w przepływie laminarnym w temperaturze pokojowej w celu wysiewu komórek. Przytnij arkusze SCM do rozmiaru urządzenia, pozostawiając kilka milimetrów z każdej strony.

Po wysterylizowaniu urządzeń i arkuszy SCM na szalce Petriego zawierającej 10 mililitrów od 70% do 100% etanolu przez 10 sekund, przenieś urządzenia za pomocą kleszczy na płytkę sześciodołkową, a arkusze SCM na 10-centymetrową szalkę Petriego w celu wysuszenia na powietrzu w przepływie laminarnym. Ustaw urządzenie na krawędzi, aby wszystkie strony wyschły przez około 30 minut. Pokryj urządzenia, dodając jeden mililitr roztworu PLO na studzienkę do każdego urządzenia na płytce sześciodołkowej.

Upewnij się, że urządzenie unosi się na roztworze PLO, a kanał i strona z mikrorowkiem są skierowane w dół do cieczy. Pokryj arkusze SCM, dodając 10 mililitrów roztworu PLO do 10-centymetrowej szalki Petriego i użyj kleszczyków, aby wepchnąć arkusze SCM do cieczy. Inkubuj urządzenia i arkusze SCM przez trzy godziny, jak pokazano wcześniej.

Po trzech godzinach umyj urządzenia i arkusze SCM dwa razy przez pięć minut za pomocą DPBS, a następnie ponownie umyj przez pięć minut sterylną wodą. Następnie przenieś każdy arkusz SCM na pojedynczą 10-centymetrową szalkę Petriego do wyschnięcia na powietrzu. Podczas pracy pod mikroskopem w przepływie laminarnym użyj kleszczyków, aby zamontować urządzenie silikonowe stroną z kanałem i mikrorowkiem do dołu pod kątem 90 stopni na arkuszu SCM, upewniając się, że wszystkie strony są wyrównane.

Lekko dociśnij urządzenie, aby upewnić się, że uszczelniłeś nie tylko zewnętrzne krawędzie, ale także wokół studzienek, kanałów i mikrorowków. Aby pokryć urządzenie lamininą, wewnątrz przepływu laminarnego i pod mikroskopem dodaj 100 mikrolitrów po 20 mikrogramów na mililitr roztworu lamininy w górnej studzience za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów. Obserwuj, jak płyn przepływa od górnej studzienki przez kanał do dolnej studzienki bez żadnych wycieków wokół studni i kanału.

Następnie dodaj 100 mikrolitrów roztworu lamininy do dolnej studzienki, powtórz po drugiej stronie mikrorowków i zakończ dodatkowymi 100 mikrolitrami lamininy po jednej stronie, aby utworzyć gradient objętości między dwiema lustrzanymi stronami urządzenia, aby pokryć mikrorowki, a następnie inkubować urządzenie przez noc. Następnego dnia usuń powłokę ze studzienek za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów, umieszczając końcówkę w studzience naprzeciwko otworu kanału, po dodaniu DPBS do wszystkich studzienek, pozostaw urządzenia z DPBS w przepływie laminarnym w temperaturze pokojowej w celu wysiewu komórek. Aby umieścić komórki progenitorowe neuronów lub NPC w urządzeniu mikroprzepływowym, usuń DPBS z dwóch studzienek po jednej stronie mikrorowków w urządzeniu za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów.

Aby zasiać w sumie 250 000 NPC i od 60 do 100 mikrolitrów pożywki dla neuronów ruchowych dnia 10 na urządzenie, w prawym górnym dołku wysiewaj połowę zawiesiny komórkowej w pobliżu otworu kanału pod kątem 45 stopni. Zatrzymaj się na kilka sekund, aby zawiesina komórek przepłynęła przez kanał przed dodaniem pozostałej połowy zawiesiny komórek do dolnej studzienki. Użyj długopisu, aby oznaczyć stronę z nasionami jako NPC lub równoważny, aby ułatwić orientację urządzenia bez mikroskopu, i inkubuj przez pięć minut w celu przyłączenia komórek.

Następnie powoli uzupełnij dwie studzienki z nasionami NPC dodatkowym podłożem neuronów ruchowych dnia 10 do całkowitej objętości 200 mikrolitrów na studzienkę. Za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów usuń DPBS z dwóch dołków po drugiej stronie mikrorowków naprzeciwko świeżo wysianych NPC. Dodaj 200 mikrolitrów pożywki dla neuronów ruchowych dnia 10 na studzienkę do dołków niezasianych.

Następnie dodaj sześć mililitrów DPBS na 10-centymetrowe naczynie wokół urządzenia, aby zapobiec parowaniu pożywki podczas inkubacji. Aby zmienić pożywkę, powoli usuń pożywkę z obu studzienek za pomocą NPC, umieszczając końcówkę pipety o pojemności 200 mikrolitrów na dolnej krawędzi ściany studzienki naprzeciwko otworu kanału. Aby zapobiec uszkodzeniu komórek w kanale przez silny przepływ pożywki, powoli dodawaj od 50 do 100 mikrolitrów świeżej pożywki neuronów ruchowych do każdej studzienki, ciągle przełączając się między górną i dolną studzienką.

Powtarzaj proces, aż każda studzienka będzie zawierała 200 mikrolitrów pożywki. W 17 dniu różnicowania neuronów ruchowych usuń pożywkę neuronu ruchowego po nieobsianej stronie mikrorowków w urządzeniu za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów i umyj studzienki DPBS. Wysiewaj łącznie 200 000 ludzkich pierwotnych mezoangioblastów lub MAB w 60 do 100 mikrolitrach pożywki wzrostowej na urządzenie, wysiewając połowę zawiesiny komórkowej w górnej studzience.

Zatrzymaj się na kilka sekund, aby zawiesina komórkowa mogła przepłynąć przez kanał przed wysianiem pozostałej połowy zawiesiny komórek w dolnej studzience, jak pokazano wcześniej w przypadku posiewu NPC. Inkubuj urządzenie przez pięć minut w celu przyłączenia komórek. Następnie uzupełnij dwie studzienki świeżo wysiane MAB dodatkowym podłożem wzrostowym i ponownie inkubuj, jak pokazano.

Aby zainicjować taktykę chemioterapii i gradient wolumetryczny w 21 dniu różnicowania neuronów ruchowych, dodaj 200 mikrolitrów na studzienkę pożywki neuropodstawowej neuronu ruchowego zawierającej czynniki wzrostu do przedziału Myotube, a następnie dodaj 100 mikrolitrów na studzienkę podłoża podstawowego neuronu ruchowego bez czynników wzrostu do przedziału neuronu ruchowego. Ważne jest, aby ocenić potencjał różnicowania linii komórkowych przed ich kokulturą w urządzeniach mikroprzepływowych. Określono wskaźnik fuzji MAB i oszacowano, że około 8% jest wystarczające do kohodowli.

Wygenerowane hodowle neuronów ruchowych były od 85 do 95% dodatnie dla markerów neuronów ruchowych. W celu scharakteryzowania i ilościowego określenia ilości połączeń nerwowo-mięśniowych lub NMJ, liczba kolokalizacji między neuronem ruchowym a presynaptycznymi markerami łańcucha ciężkiego neurofilamentu i synaptofizyny oraz postsynaptycznego markera receptora acetylenowego alfa bungarotoksyny została policzona przez każdy stos chorobowy i została znormalizowana w liczbie ciężkich łańcuchów miozyny oznaczonych Myotubes obecnych w stosie Z. NMJ pojawiły się jako pojedyncze punkty kontaktowe NMJ, w których neuryt dotykał klastra subtelnego receptora choliny w jednym punkcie interakcji.

Lub jako wiele punktów kontaktowych NMJ, w których neuryt rozchodził się i angażował w subtelne skupisko receptora choliny na większej powierzchni. Kwantyfikacja odsetka innowacyjnych neuronów ruchowych Myotubes wykazała, że nie wszystkie Myotubes zawierały NMJ. Po aktywacji neuronu ruchowego chlorkiem potasu zaobserwowano napływ wapnia w Myotubes znakowanych Fluo-4, co potwierdziło funkcjonalne połączenie poprzez neuryt neuronu ruchowego w Myotube, dodanie blokera NMJ d-tubokuraryny lub DTC do przedziału Myotube spowodowało zahamowanie napływu wapnia.

Aby odnieść jak największy sukces z tym modelem, niezwykle ważne jest przeprowadzenie kontroli jakości linii komórkowej i unikanie tworzenia się pęcherzyków powietrza w kanałach urządzenia. Połączenie połączenia nerwowo-mięśniowego w naczyniu z innymi bezpośrednimi typami komórek IPC jeszcze lepiej naśladuje sytuację in vitro, co pozwala również na badanie roli tych typów komórek.