Name: Trójwymiarowe generowanie organoidów nerwów ruchowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Poznaj metodę generowania trójwymiarowych organoidów nerwów ruchowych z ludzkich komórek iPS przy użyciu mikrofluidycznego chipu PDMS. Ta technika umożliwia badanie rozwoju pęczków aksonów oraz skuteczniejsze testowanie leków na choroby neuronów ruchowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki (JSPS) Grants-in-Aid for Scientific Research 17H05661 i 18K19903, program Core-2-core oraz instytut Beyond AI.

<ol><li>Raper, J., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+strategies+of+axonal+pathfinding%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspective+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular strategies of axonal pathfinding.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (9), 001933(2010).</li>
<li>Ito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIPK1+mediates+axonal+degeneration+by+promoting+inflammation+and+necroptosis+in+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RIPK1 mediates axonal degeneration by promoting inflammation and necroptosis in ALS.</a> Science. 353 (6299), 603-608 (2016).</li>
<li>Fujimori, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+sporadic+ALS+in+iPSC-derived+motor+neurons+identifies+a+potential+therapeutic+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Modeling sporadic ALS in iPSC-derived motor neurons identifies a potential therapeutic agent.</a> Nature Medicine. 24 (10), 1579-1589 (2018).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+ALS+with+iPSCs+Reveals+that+Mutant+SOD1+Misregulates+Neurofilament+Balance+in+Motor+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling ALS with iPSCs Reveals that Mutant SOD1 Misregulates Neurofilament Balance in Motor Neurons.</a> Cell Stem Cell. 14 (6), 796-809 (2014).</li>
<li>Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microphysiological+3D+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+%28ALS%29+from+human+iPS-derived+muscle+cells+and+optogenetic+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons.</a> Science Advances. 4 (10), (2018).</li>
<li>Imamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Src%2Fc-Abl+pathway+is+a+potential+therapeutic+target+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Src/c-Abl pathway is a potential therapeutic target in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Science Translational Medicine. 9 (391), (2017).</li>
<li>Wang, L., Marquardt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+axons+tell+each+other%3A+axon-axon+signaling+in+nerve+and+circuit+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">What axons tell each other: axon-axon signaling in nerve and circuit assembly.</a> Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 974-982 (2013).</li>
<li>Kawada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+Motor+Nerve+Organoid+with+Human+Stem+Cell-Derived+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of a Motor Nerve Organoid with Human Stem Cell-Derived Neurons.</a> Stem Cell Reports. 9 (5), 1441-1449 (2017).</li>
<li>Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Pre-Assembled+Plastic+Microfluidic+Chips+for+Compartmentalizing+Primary+Murine+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons.</a> JoVE. (141), e58421(2018).</li>
<li>Paranjape, S. R., Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+of+Human+Stem+Cell-Derived+Neurons+within+Pre-Assembled+Plastic+Microfluidic+Chips%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips.</a> JoVE. (147), e59250(2019).</li>
<li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+small-molecule+inhibition+accelerates+developmental+timing+and+converts+human+pluripotent+stem+cells+into+nociceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors.</a> Nature Biotechnology. 30 (7), 715-720 (2012).</li>
<li>Rimington, R. P., Fleming, J. W., Capel, A. J., Wheeler, P. C., Lewis, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+model+of+the+human+motor+unit+with+physiologically+functional+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Bioengineered model of the human motor unit with physiologically functional neuromuscular junctions.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Cullen, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bundled+Three-Dimensional+Human+Axon+Tracts+Derived+from+Brain+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Bundled Three-Dimensional Human Axon Tracts Derived from Brain Organoids.</a> iScience. 21, 57-67 (2019).</li>
<li>Giandomenico, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+at+the+air-liquid+interface+generate+diverse+nerve+tracts+with+functional+output%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output.</a> Nature Neurosciences. 22 (4), 669-679 (2019).</li>
<li>Egawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+for+ALS+using+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Drug screening for ALS using patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Science Translational Medicine. 4 (145), (2012).</li>
<li>Sances, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+ALS+with+motor+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Nature Neurosciences. 19 (4), 542-553 (2016).</li>
<li>Qu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+and+the+function+of+Islet-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1.</a> Nature Communications. 5 (1), 3449(2014).</li>
<li>Kirihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Tissue+Model+of+a+Cerebral+Tract+Connecting+Two+Cortical+Regions%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">A Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Tissue Model of a Cerebral Tract Connecting Two Cortical Regions.</a> iScience. 14, 301-311 (2019).</li>
<li>Rigamonti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-Scale+Production+of+Mature+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Three-Dimensional+Suspension+Culture+System%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System.</a> Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).</li>
<li>Yan, Y., Song, L., Madinya, J., Ma, T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+Cortical+Spheroids+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Suspension+Bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor.</a> Tissue Engineering Part A. 24 (5-6), 418-431 (2017).</li>
</ol>

W ramach tego protokołu patent został udzielony firmie Jiksak Bioengineering, Inc., która została założona przez Jiro Kawadę.

Protokół ten opisuje tworzenie organoidu nerwu ruchowego (MNO), który ma wiązkę aksonów przedłużoną ze sferoidy neuronu ruchowego generowanej z ludzkich komórek iPS. Utworzona wiązka aksonów jest gruba, elastyczna i dobrze zorganizowana w jednokierunkowe struktury. Poprzez preparację pęczka aksonów można uzyskać białko aksonalne i RNA o wysokiej czystości w stopniu wystarczającym do analiz biochemicznych. Aktywność neuronalną można mierzyć w wiązkach aksonów i sferoidach za pomocą obrazowania wapnia. Zanieczyszczenie białek jądrowych i dendrytycznych w lizacie aksonalnym nie zostało wykryte przez western blotting, co pokazuje, że nasza metoda skutecznie oddziela aksony od ciał komórkowych i dendrytów.
Jedną z zalet tego protokołu jest szybkie różnicowanie i generowanie MNO wyposażonego w wiązkę aksonów, w której wszystkie procesy można wykonać w ciągu 4 tygodni przy użyciu protokołu 3D i 5-6 tygodni przy użyciu protokołu 2D. Jest to krótki okres w porównaniu z innymi protokołami, które zazwyczaj potrzebują 3-4 tygodni, aby po prostu różnicować się w MN z embrionalnych komórek macierzystych i komórek iPS17 , a uzyskanie wydłużenia aksonów zajmuje dodatkowe 2-4 tygodnie. Protokół 3D jest ogólnie preferowany w stosunku do protokołu 2D ze względu na krótszy czas różnicowania, mniej kroków i zmniejszone ryzyko techniczne bez etapu dysocjacji w porównaniu z protokołem 2D. Chip do hodowli tkankowej oparty na mikroprzepływach został zaprojektowany w taki sposób, aby aksony MNS mogły wydłużać się w kierunku drugiego przedziału przez mikrokanał, co ułatwia tworzenie wiązki aksonów poprzez indukowanie interakcji aksoaksonalnych i powinowactwa między aksonami. Ze względu na prostą konfigurację eksperymentalną, wszystkie opisane tutaj protokoły mogą być wykonywane nie tylko przez bioinżynierów, którzy są zaznajomieni z manipulacją chipem do hodowli tkankowej, ale także przez biologów i neurobiologów, którzy nie są zaznajomieni z technikami mikrofluidyki i mikrofabrykacji. Należy zauważyć, że kroki 1 i 2 można również wykonać przy użyciu zewnętrznej usługi produkcyjnej.
Jednym z kluczowych kroków do realizacji protokołu jest sekwencyjna zmiana pożywki hodowlanej. Zaleca się całkowitą zmianę pożywki hodowlanej na każdym etapie różnicowania, tak aby czynniki w zużytej pożywce nie zakłócały różnicowania MN. Kolejnym krytycznym punktem tego protokołu jest utrzymanie niezróżnicowanych komórek iPS w dobrej jakości. Jakość początkowej hodowli komórek iPS znacząco wpływa na efektywność pozyskiwania neuronów ruchowych i MNO. Kolejną kwestią jest to, że średnica MNS powinna być mniejsza niż rozmiar otworu chipa (1,5 mm). Większe sferoidy nie mogą dostać się do komory i potencjalnie doświadczają ciężkiej martwicy niedotlenienia w środkowej części. Wielkość MNS może być kontrolowana poprzez zmianę początkowej liczby zasiewów komórek iPS (w protokole 3D) lub neuronów ruchowych (w protokole 2D). Gęstość wysiewu komórek powinna być zoptymalizowana dla każdej linii komórkowej iPS.
Podzielone na przedziały urządzenia mikroprzepływowe z mikrorowkami i filtrami o małych porach są szeroko stosowane do oddzielania aksonów od ciał komórkowych i dendrytów. Technika ta może również oddzielać aksony od ciał komórkowych i dendrytów, z większą obfitością aksonów w tkankach wiązkowych. W porównaniu z innymi metodami, jednym z głównych ograniczeń tej metody jest to, że nie może ona oddzielić dwóch różnych pożywek hodowlanych w obecnej konstrukcji chipa do hodowli tkankowej, co utrudnia wspólną hodowlę dwóch różnych komórek, które wymagają dwóch różnych pożywek. Kolejnym ograniczeniem jest to, że chip PDMS nakłada z góry określone ograniczenie na rozmiar tkanki. Sferoida większa niż otwór nie może wejść do komory, a wiązka aksonów nie może urosnąć grubsza niż szerokość kanału mikroprzepływowego.
Metodę tę można zastosować do innych typów neuronów. Nasza grupa wykazała zdolność do modelowania układu mózgowego przy użyciu zmodyfikowanej metody w połączeniu z technikami organoidów mózgowych18. Sferoidy korowe zostały wprowadzone do obu przedziałów, a aksony spontanicznie wydłużały się odwrotnie w kierunku każdej sferoidy, a następnie spontanicznie utworzyła się wiązka aksonów. W rezultacie dwie sferoidy korowe można połączyć za pomocą wiązki aksonów, a tkankę można uzyskać jako jeden kawałek. Pokazuje to, że podejście to jest bardzo wszechstronne w tworzeniu tkanek pęczka aksonów niezależnie od typów komórek neuronalnych. W tym protokole wykorzystano ludzkie komórki iPS, jednak inne komórki macierzyste, w tym ludzkie komórki ES i ludzkie nerwowe komórki macierzyste, mogą być wykorzystane z modyfikacjami przedstawionego protokołu. Sferoidy 3D neuronów mogą być generowane za pomocą różnych protokołów 19,20. Ta metoda wytwarzania tkanek z wiązką aksonów może być potencjalnie połączona w przyszłości z innymi protokołami różnicowania w celu uzyskania sferoidy 3D MN. Ponadto grubość i długość wiązki aksonów można kontrolować, po prostu zmieniając szerokość i wysokość mikrokanałów chipa do hodowli tkankowej w celu przyszłych opracowań.
Uważamy, że protokół ten może być wykorzystany do testowania narkotyków i badań przesiewowych oraz może przyczynić się do zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw rozwoju i chorób pęczków aksonów.

Rdzeniowe neurony ruchowe (MN) rozciągają aksony do mięśni szkieletowych, aby kontrolować ruchy ciała. Ich trajektorie aksonalne są wysoce zorganizowane i regulowane w procesie rozwojowym. Pomimo wielu badań nad rozszerzaniem i prowadzeniem aksonów1, mechanizmy tworzenia zorganizowanych wiązek aksonów są nadal badane. Aksony neuronów ruchowych są często uszkadzane przez choroby neurodegeneracyjne, takie jak stwardnienie zanikowe boczne (ALS)2, ale patofizjologiczne mechanizmy uszkodzenia pęczków aksonów są słabo poznane. W związku z tym w terenie wymagany jest fizjologiczny i patologiczny model do podsumowania tworzenia i regresji wiązki aksonów.
Neuron ruchowy pochodzenia ludzkiego z komórek macierzystych jest obiecującą platformą do zrozumienia rozwoju i chorób, takich jak ALS3. Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (komórki iPS) mogą być wykorzystywane do modelowania chorób przy użyciu komórek pochodzących od pacjenta. Do tej pory opisano różne metody różnicowania pluripotencjalnych komórek macierzystych do MN4,5,6. Jednak aksony neuronów w kulturze dwuwymiarowej są zorientowane losowo i nie rekapitulują in vivo mikrośrodowiska w rozwijających się nerwach, w których aksony są jednokierunkowo składane poprzez gęste interakcje akso-aksonalne7. Aby przezwyciężyć ten problem, opracowaliśmy technikę generowania trójwymiarowej tkanki przypominającej nerw ruchowy z ludzkich komórek iPS8 i nazwaliśmy tę tkankę organoidem nerwu ruchowego (MNO). MNO składa się z ciał komórkowych znajdujących się w sferoidzie neuronu ruchowego (MNS) i pęczku aksonalnym wysuniętym ze sferoidy. Aksony w pęczku są zorientowane jednokierunkowo, co przypomina aksony w rozwoju nerwów ruchowych. W związku z tym MNO w unikalny sposób zapewniają fizjologiczne mikrośrodowisko aksonalne, czego nie osiągnięto za pomocą żadnych innych wcześniej opracowanych metod hodowli neuronów.
W tym protokole opisujemy metody wytwarzania chipów do hodowli tkankowych, szybkiego różnicowania neuronów ruchowych i tworzenia organoidów nerwów ruchowych w opracowanych chipach. Nasz chip do hodowli tkankowej jest bardzo prosty i zawiera tylko komorę do przyjmowania sferoidy, mikrokanalik do tworzenia wiązki aksonów i komorę do przechowywania końców aksonów. Urządzenie nie zawiera skomplikowanych struktur, w tym mikrorowków ani filtrów mikroporowych, które są często używane do oddzielania aksonów i ciał komórek według rozmiaru9,10. Dzięki temu nasze urządzenia można łatwo wyprodukować, wykonując czynności opisane w tym protokole, jeśli dostępna jest konfiguracja fotolitograficzna.
Szybkie różnicowanie ludzkich komórek iPS osiąga się dzięki zoptymalizowanej kombinacji czynników indukujących i wzorcujących (SB431542, LDN-193189, kwas retinowy (RA) i wygładzonego agonisty (SAG)) oraz czynników przyspieszenia (SU5402 i DAPT). Doniesiono, że połączenie SU5402 i DAPT przyspiesza różnicowanie neuronów obwodowych i komórek grzebienia nerwowego11. W tym protokole oferujemy trzy różne metody generowania MNO, dzięki czemu czytelnicy mogą zdecydować się na metodę najbardziej dopasowaną do ich potrzeb. Zalecamy przeprowadzenie różnicowania ludzkich komórek iPS po utworzeniu sferoidy (metoda 3D), ponieważ zróżnicowany MNS może być przenoszony bezpośrednio do chipa do hodowli tkankowej. Alternatywnie, ludzkie komórki iPS mogą być różnicowane w neurony ruchowe w hodowli jednowarstwowej (2D), a następnie tworzone w trójwymiarowe sferoidy neuronów ruchowych, jak wcześniej informowaliśmy8. Zaktualizowaliśmy protokół, a dzięki metodzie trójwymiarowego różnicowania opisanej w tym protokole można uniknąć przejścia z 2D do 3D, a MNO można uzyskać przy krótszym czasie różnicowania, mniejszej liczbie kroków i zmniejszonym ryzyku technicznym bez etapu dysocjacji. Dostępne na rynku neurony mogą być również wykorzystywane do generowania MNS w celu skrócenia czasu różnicowania.
Aby wygenerować MNO, wyhodowaliśmy MNS w chipie do hodowli tkankowej. Aksony wydłużają się od sferoidy i rozciągają się do mikrokanału, w którym aksony gromadzą się i ustawiają jednokierunkowo. Ułatwia to interakcję aksoaksonalną i spontaniczne tworzenie ciasno zmontowanej jednokierunkowej tkanki pęczka aksonów w mikrokanale, co jest unikalnie osiągane przez ten protokół, podczas gdy zarówno spontaniczne tworzenie pęczka, jak i sama sterowana orientacja aksonów mogą być osiągnięte przez inne protokoły12,13,14. W typowym eksperymencie niewiele komórek migruje ze sferoid do mikrokanałów, a większość komórek pozostaje w pobliżu sferoid. Metoda ta pozwala na spontaniczne oddzielenie aksonów od sferoid bez użycia zależnych od wielkości barier fizycznych (np. mikrorowków lub filtrów mikroporowych) w celu oddzielenia aksonów od ciał komórkowych.
Wynikowy MNO może być poddany różnym badaniom, w tym analizom morfologicznym, biochemicznym i fizycznym. Ciało komórki i rozszerzona wiązka aksonów mogą być fizycznie izolowane przez cięcie i mogą być oddzielnie analizowane w dalszych eksperymentach, np. testach biochemicznych. Materiały biologiczne, w tym RNA i białko, można wyizolować z zaledwie kilku wiązek aksonów w celu przeprowadzenia regularnych testów biochemicznych, w tym RT-PCR i western blotting. W tym miejscu opisujemy protokół generowania organoidu nerwów ruchowych z komórek iPS, który oferuje atrakcyjny model fizjologiczny i patologiczny do badania mechanizmu leżącego u podstaw rozwoju i choroby pęczków aksonów.

<table><tbody><tr><td>(Tridekafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooktylo)-1-trichlorosilan</td><td>Sigma</td><td>440302</td><td></td></tr><tr><td>16% wodny roztwór paraformaldehydu (formaldehydu)</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>200&mikro; l Końcówki do pipet o szerokim otworze</td><td>BMBio</td><td>BMT-200WRS 6-dołkowe</td><td></td></tr><tr><td>płytki</td><td>Violamo</td><td>2-8588-01</td><td></td></tr><tr><td>Suplement Accutase</td><td>ICT</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>B-27 (50X)</td> <td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>A6003</td><td></td></tr><tr><td>Neurotroficzny czynnik pochodzenia mózgowego (BDNF)</td><td>Wako</td><td>020-12913</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2</td><td>Panasonic</td><td>MCO-18AIC</td><td></td></tr><tr><td>Cryostor CS10</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>07959</td><td></td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Sigma</td><td>D5942</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Sigma</td><td>D8437</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Dojindo Laboratories</td><td>CS22</td><td></td></tr><tr><td>Suplement GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Zredukowany czynnik wzrostu Matrigel (macierz błony podstawnej)</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>HB9 Przeciwciało</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-22542</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Wako</td><td>085-09355</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma</td><td>14533</td><td></td></tr><tr><td>Neuron ruchowy iCell (dostępne na rynku ludzkie neurony ruchowe pochodzące z komórek iPS)</td><td>Dynamika komórkowa</td><td>R1051</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol izopropylowy (IPA)</td><td>Wako</td><td>166-04836</td><td></td></tr><tr><td>Zamiennik surowicy do nokautowania</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>LDN193189</td><td>Sonda</td><td>SML0559</td><td></td></tr><tr><td>Sigma MEA</td><td>Alpha MED Scientific inc</td><td>MED-P5004A</td><td></td></tr><tr><td>MEM Nieistotny roztwór aminokwasów (100x) (NEAA)</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop szklany</td><td>Matsunami</td><td>S9111</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR Plus</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>05825</td><td></td></tr><tr><td>Suplement N2</td><td>Wako</td><td>141-08941</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka neuropodstawowa</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Photoresist SU-8 2100</td><td>Microchem</td><td>#SU-8 2100</td><td></td></tr><tr><td>Powierzchnia Prime 96U</td><td>Sumitomo Bakelite</td><td>MS-9096U</td><td></td></tr><tr><td>ReLeSR (odczynnik do pasakcji)</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>05872</td><td></td></tr><tr><td>Kwas retinowy</td><td>Wako</td><td>186-01114</td><td></td></tr><tr><td>SAG</td><td>Sigma</td><td>SML1314</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Wako</td><td>192-16541</td><td></td></tr><tr><td>Wafel krzemowy</td><td>SUMCO</td><td>PW-100-100</td><td></td></tr><tr><td>Silpot 184 z</td><td>zestawem Dow Toray</td><td>Silpot 184 z zestawem</td><td></td></tr><tr><td>Smi32 Przeciwciało</td><td>Biolegend</td><td>801701</td><td></td></tr><tr><td>SU5402</td><td>Sigma</td><td>SML0443</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 Developer</td><td>Microchem</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>Synapsin I Przeciwciało</td><td>Millipore</td><td>Ab1543</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Ekspresowy płyn bez czerwieni fenolowej (roztwór dysocjacyjny)</td><td>Gibco</td><td>12604-021</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało Tuj1</td><td>Biolegend</td><td>801202</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Wako</td><td>030-24021</td><td></td></tr></tbody></table>

trójwymiarowe generowanie organoidów nerwów ruchowych

Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

Pęczek aksonów jest jednym z głównych motywów strukturalnych obserwowanych w układzie nerwowym. Przerwanie pęczków aksonów może powodować choroby rozwojowe i neurodegeneracyjne. Chociaż przeprowadzono liczne badania nad aksonami, nasza wiedza na temat powstawania i dysfunkcji pęczków aksonów jest nadal ograniczona ze względu na brak solidnych trójwymiarowych modeli in vitro. W tym miejscu opisujemy krok po kroku protokół szybkiego generowania organoidu nerwów ruchowych (MNO) z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) w mikroprzepływowym chipie do hodowli tkankowej. Po pierwsze, opisano wytwarzanie chipów wykorzystywanych w tej metodzie. Z ludzkich komórek iPS tworzy się sferoida neuronu ruchowego (MNS). Następnie zróżnicowany MNS jest przenoszony do chipa. Następnie aksony spontanicznie wyrastają ze sferoidy i łączą się w pęczek w mikrokanale wyposażonym w chip, który generuje tkankę MNO przenoszącą wiązkę aksonów wysuniętych ze sferoidy. W celu dalszej analizy MNO mogą zostać wyjęte z chipa w celu utrwalenia w celu przeprowadzenia analiz morfologicznych lub wypreparowania w celu przeprowadzenia analiz biochemicznych, a także obrazowania wapnia i zapisów z matrycy wieloelektrodowej. MNO wygenerowane za pomocą tego protokołu mogą ułatwić testowanie narkotyków i badania przesiewowe oraz mogą przyczynić się do zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw rozwoju i chorób pęczków aksonów.

Neurony ruchowe różnicowały się w ciągu 12-14 dni w procedurach różnicowania 3D (Rysunek 4 oraz Rysunek 5). Co istotne, ponad 60% komórek wykazywało ekspresję markera neuronów ruchowych HB9 podczas różnicowania. Immunohistochemia wykazała, że około 80% komórek w MNS stanowiły SMI32-dodatnie neurony ruchowe. HB9 i SMI32 są uznanymi markerami wczesnego etapu rozwoju neuronów ruchowych15,16. Ekspresja HB9 i SMI32 to kluczowe parametry, które należy potwierdzić, aby zapewnić tożsamość komórkową neuronów ruchowych. Po wprowadzeniu MNS do chipa hodowlanego aksony wnikają do kanału, tworząc pęk aksonalny. Dzięki temu, że mikrokanały służą jako przewodniki fizyczne, aksony wydłużają się z MNS i tworzą pęk poprzez oddziaływania akson-akson (Rysunek 6A). Niezbędne jest potwierdzenie powstania pęku aksonalnego poprzez obserwację mikroskopową, aby zweryfikować utworzenie MNO. Pomyślnie utworzony MNO charakteryzuje się pękiem aksonalnym o szerokości powyżej 50 μm oraz niewielką liczbą izolowanych aksonów poza pękiem w kanale. Początkowe wydłużanie się aksonów można zaobserwować 24 godziny po wprowadzeniu sferoidu. W ciągu kolejnych 3-4 dni aksony dotarły do środka mikrokanału, a następnie do jego drugiego końca w ciągu dodatkowych 10 dni (Rysunek 6A). W konsekwencji aksony zgromadziły się i utworzyły prosty, jednokierunkowy pęk w ciągu 2-3 tygodni w chipie, po czym zaobserwowano aktywność neuronalną.
Organoidy nerwów ruchowych można pobrać z chipa poprzez oddzielenie PDMS od szkła mikroskopowego w celu przeprowadzenia analiz biologicznych (Rysunek 6B). Pęczki aksonów oraz ciała komórkowe można wypreparować i wyizolować, wycinając je skalpelem chirurgicznym lub pęsetą pod mikroskopem (Rysunek 6B). Materiały biologiczne, w tym RNA i białka, mogą być wykorzystane w standardowych badaniach biochemicznych, takich jak RT-PCR i western blotting. W pęczkach aksonów MNO w analizie western blotting nie wykryto białek markerowych jądra lub dendrytów (Rysunek 6C).
W połączeniu z wskaźnikiem wapnia (Fluo-4 AM) możliwe jest rejestrowanie aktywności neuronalnej w chipie do hodowli tkankowej. W obrębie MNO zaobserwowano spontaniczną aktywność neuronów ruchowych w sferoidzie oraz w pęczku aksonów. Aktywność neuronalna była również monitorowana przy użyciu systemu wieloelektrodowego (multi-electrode array).
<img alt="Schemat projektu kanału mikroprzepływowego; wymiary i geometria do analizy dynamiki płynów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1: Wymiary chipa do hodowli tkanek z PDMS. 
(A) Fotomaska układu do hodowli tkanek. (B) Wymiary mikrokanału w chipie do hodowli tkankowej. Średnica komory podstawowej przeznaczonej do utrzymania sferoidu neuronów ruchowych wynosi 2 mm, a otwór w PDMS powyżej komory ma średnicę 1,5 mm. Szerokość i wysokość mikrokanału łączącego dwie komory wynoszą odpowiednio 150 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig01large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="procesy różnicowania komórek iPS, protokoły 2D/3D, tworzenie sferoidów, schemat organoidu neuronów ruchowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Schematyczny przebieg różnicowania neuronów ruchowych. 
(AEtapy różnicowania obejmowały indukcję neuronalną, modelowanie w kierunku linii neuronów ruchowych oraz dojrzewanie neuronów ruchowych.BDwie opcje tworzenia sferoid neuronów ruchowych (MNS) z komórek iPS: protokół 3D oraz protokół 2D z etapem dysocjacji neuronów ruchowych. Organoidy nerwu ruchowego (MNO) można uzyskać za pomocą obu protokołów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig02large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Proces równowagi statycznej w eksperymentalnym układzie PDMS; powlekanie PDMS, inkubacja, schemat przepływu hodowli." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rycina 3: Protokół krok po kroku powlekania macierzą błony podstawnej i wprowadzania sferoidów neuronów ruchowych. 
(A) Powlekanie kanału chipa do hodowli tkankowej macierzą błony podstawnej. (B) Wprowadzenie MNS do otworu w chipie. (C) Wymiana pożywki hodowlanej poprzez odessanie zużytej pożywki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Różnicowanie komórek macierzystych w czasie; obrazy mikroskopowe; etapy rozwojowe od -D2 do D12." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig04.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Różnicowanie neuronów ruchowych w 2D i 3D. 
(A) Przebieg czasowy reprezentatywnego różnicowania 3D MNS (protokół 3D). Wielkość MNS stopniowo wzrosło w czasie. Pasek skali: 500 μm(B) Przebieg czasowy różnicowania 2D w dniach -D2, D0, D1, D6, D12 (protokół 2D). Pasek skali: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obrazy 2D i 3D hodowli neuronów; immunofluorescencja z markerami SMI-32, Synapsin, TUJ1, HB9." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig05.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rysunek 5: Charakterystyka neuronów ruchowych. 
(A) (Lewo) Przekrój mrożony MNS barwiony przeciwciałem SMI-32 i DAPI. (Środek) Obraz w kontraście fazowym replatowanych MNS na powierzchni pokrytej macierzą błony podstawnej. Zaobserwowano elongację aksonów. (Prawo) Aksony replatowanych MNS barwione przeciwciałami przeciwko Synapsynie I i Tuj1. Pasek skali: 500 μm (lewa i środkowa) i 50μm (Prawo). (B) Reprezentatywny obraz neuronów ruchowych 2D poddanych immunostainingowi z użyciem przeciwciał przeciwko Tuj i HB9. Pasek skali: 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig05large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Proces izolacji aksonów; urządzenie mikroprzepływowe, znakowanie fluorescencyjne, markery białkowe w analizie Western blot." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig06.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Charakterystyka organoidu nerwu ruchowego (MNO) wytworzonego w chipie hodowlanym. 
(A) Reprezentatywne obrazy elongacji aksonów i tworzenia się grubych pęczków aksonalnych w dniu 32. Pasek skali: 500 μm. (B) Immunobarwienie organoidu nerwu ruchowego (MNO) przeciwciałem SMI-32 oraz DAPI. Aksony i ciała komórkowe można wyizolować poprzez fizyczne przecięcie. Pasek skali: 1 mm. (C) Czystość białka z aksonów i ciał komórkowych określona za pomocą western blotingu. MAP2, marker dendrytyczny, nie został wykryty w białku aksonalnym, podczas gdy marker aksonalny Tau1 jest wzbogacony w białku aksonalnym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

Ten protokół zapewnia kompleksową procedurę wytwarzania ludzkiego organoidu nerwu ruchowego pochodzącego z komórek iPS poprzez spontaniczne składanie solidnego pakietu aksonów przedłużonego z sferoidy w chipie do hodowli tkankowej.

Trójwymiarowe generowanie organoidów nerwów ruchowych

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and ...

Protokół ten ułatwia badanie mechanizmów leżących u podstaw rozwoju i choroby wiązek aksonów przy użyciu organoidu nerwów ruchowych pochodzących z ludzkich komórek iPS znajdujących się poza ciałami. Poprzez prostą hodowlę sferoidów neuronalnych i niestandardowych chipów mikrokulturowych, jednokierunkowe wiązki aksonów mogą być spontanicznie generowane i wykorzystywane do różnych dalszych eksperymentów. Organoid nerwów ruchowych może ułatwić badania przesiewowe i testowanie leków na choroby neuronu ruchowego, w tym LS, zapewniając bardziej fizjologiczny model, który był wcześniejszymi systemami in vitro.W dygestorium i przy założeniu odpowiednich środków ochrony osobistej dozuj trzy mililitry SU-8 2100 na oczyszczoną acetonem płytkę krzemową i umieść ją w środku powlekarki wirowej. Utrwal wafel za pomocą próżni i obracaj wafel z prędkością 500 obrotów na minutę przez 10 sekund, aby równomiernie pokryć SU-8 na powierzchni płytki, a następnie obracaj wafel z prędkością 1,500 obrotów na minutę przez 30 sekund z przyspieszeniem 300 obrotów na sekundę, aby uzyskać warstwę fotorezystu o grubości 150 mikronów na płytce. Po miękkim upieczeniu ustaw fotomaskę na nakładce maski i wystaw wafel na działanie światła ultrafioletowego przez 60 sekund.Po upieczeniu na gorącej płycie, rozwijaj wafel przez 10 do 20 minut w wywoływaczu fotorezystu z mieszaniem na wytrząsarce orbitalnej, zmieniając roztwór rozwijający się raz w trakcie procesu. Aby przygotować dolną warstwę chipa do hodowli tkankowej, należy wlać świeżo przygotowany PDMS na płytkę do pożądanej grubości i odgazować mieszaninę w komorze próżniowej. Utwardź PDMS w piekarniku przez co najmniej trzy godziny w temperaturze 60 stopni Celsjusza.Po schłodzeniu użyj ostrza, aby odciąć utwardzony PDMS od płytki, a następnie użyj nieutwardzonego PDMS z wypalaniem, aby przymocować zbiornik pożywki do dolnej warstwy PDMS, aby uzyskać zmontowany chip do hodowli tkankowej PDMS. Aby przygotować chip PDMS do tworzenia organoidów nerwów ruchowych, sterylizuj chip i szkło mikroskopowe o wymiarach 76 na 52 milimetry na szalce Petriego zawierającej 70% etanolu przez co najmniej jedną godzinę. Pod koniec inkubacji umieść chip na mokrym szkle mikroskopu.Po wyschnięciu przez noc wiór powinien przylegać do szkła. Umieścić 30 mikrolitrów kropli rozcieńczonej matrycy membrany podstawnej w DMEM/F12 po jednej stronie wlotu kanału i zassać roztwór z drugiej strony wlotu, aby pokryć powierzchnię mikrokanału matrycą. Następnie inkubować chip PDMS z roztworem powlekającym na szalce Petriego przez godzinę w temperaturze pokojowej.Aby indukować różnicowanie komórek 3D iPS w neuronach ruchowych, wysiewaj cztery razy 10 do czwartej komórki iPS na studzienkę do odpowiedniej liczby dołków 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery U w 100 mikrolitrach pożywki do hodowli komórek bez surowicy i surowicy uzupełnionej 10 mikromolami Y-27632. Następnego dnia zastąp supernatant w każdej studzience 100 mikrolitrami pożywki KSR uzupełnionej 10 mikromolowymi SB431542 i 100 nanomolowymi LDN-193189. W drugim i trzecim dniu zastąp supernatanty 100 mikrolitrami pożywki KSR uzupełnionej 10 mikromolowymi SB431542, 100 nanomolowymi LDN-193189, pięcioma mikromolowymi DAPT, pięcioma mikromolowymi SU5402, jednym mikromolowym kwasem retinowym i jednym mikromolowym wygładzonym agonistą.W czwartym i piątym dniu zastąp supernatanty mieszaniną 75% pożywki KSR i 25% pożywki N2 uzupełnionej 10 SB431542 mikromolowymi, 100 LDN193189 nanomolowych, pięcioma mikromolowymi DAPT, pięcioma mikromolowymi SU5402, jednym mikromolowym kwasem retinowym i jednym mikromolowym wygładzonymi agonistami. W szóstym i siódmym dniu zastąp supernatanty mieszaniną 50% pożywki KSR i 50% pożywki N2 uzupełnionej pięcioma mikromolowymi DAPT, pięcioma mikromolowymi SU5402, jednym mikromolowym kwasem retinowym i jednym mikromolowym wygładzonym agonistą. W ósmym i dziewiątym dniu zastąp supernatanty mieszaniną 25% pożywki KSR i 75% pożywki N2 uzupełnionej pięcioma mikromolowymi DAPT, pięcioma mikromolowymi SU5402, jednym mikromolowym kwasem retinowym i jednym mikromolowym wygładzonym agonistą.W dniach 10 i 11 zastąp supernatanty pożywką N2 uzupełnioną pięcioma mikromolowymi DAPT, pięcioma mikromolowymi SU5402, jednym mikromolowym kwasem retinowym i jednym mikromolowym wygładzonym agonistą. W dniu 12 zastąp supernatanty w każdym dołku 100 mikrolitrami pożywki dojrzewającej uzupełnionej 20 nanogramami na mililitr neurotroficznego czynnika pochodzenia mózgowego na studzienkę. Aby indukować tworzenie organoidów nerwów ruchowych, zastąp roztwór powlekający w chipie PDMS 150 mikrolitrami pożywki dojrzewającej uzupełnionej 20 nanogramami na mililitr neurotroficznego czynnika pochodzenia mózgowego i użyj końcówki mikropipety o szerokim otworze, aby delikatnie dodać sferoidy neuronów ruchowych z jednego dołka 96-dołkowej płytki do wlotu mikrokanału chipa.Umieść mały zbiornik sterylnej wody w pobliżu chipa do hodowli tkankowej w naczyniu, aby zapobiec parowaniu pożywki i umieść naczynie w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Co dwa do trzech dni zastępować połowę wyczerpanej pożywki hodowlanej ze środka zbiornika pożywki świeżą pożywką dojrzewającą uzupełnioną 20 nanogramami na mililitr neurotroficznego czynnika pochodzenia mózgowego. Aksony będą rosły od sferoidy neuronu ruchowego do kanału, spontanicznie łącząc się w pojedynczą wiązkę w ciągu dwóch do trzech tygodni, tworząc organoid nerwu ruchowego.Neurony ruchowe różnicują się w ciągu 12 do 14 dni w procedurach różnicowania 3D. Co ważne, ponad 60% komórek wykazuje ekspresję markera neuronu ruchowego HB9 podczas różnicowania, a około 80% komórek sferoidu neuronu ruchowego jest SMI32 dodatnich. Ponieważ mikrokanał służy jako fizyczne przewodniki, aksony wydłużają się od sferoidy neuronu ruchowego, tworząc wiązkę interakcji aksoaksonalnej w ciągu 24 godzin od wprowadzenia do sferoidy.Aksony dotarły do środka mikrokanału w ciągu następnych trzech do czterech dni, rozszerzając się na drugi koniec mikrokanału po dodatkowych 10 dniach. Organoidy nerwów ruchowych można pobrać z chipa do analizy biologicznej poprzez odłączenie PDMS od szkła mikroskopu. Pęczki aksonów i ciała komórkowe można następnie wypreparować i wyizolować pod mikroskopem za pomocą noża chirurgicznego lub pęsety.W wiązkach aksonów organoidów nerwów ruchowych dendrytyczne białka markerowe nie są wykrywane przez Western blot. Ważne jest, aby upewnić się, że sferoidy są całkowicie opuszczone na dno w chipie hodowlanym. Pokazaliśmy badanie miejsc, a dno może pomóc w określeniu lokalizacji sferoidy w chipie.Izolowane wiązki aksonów można badać pod kątem różnych dodatkowych metod. Można uzyskać dużą ilość aksonów i wykorzystać je do testów biochemicznych, które wymagają znacznych materiałów.

three-dimensional-motor-nerve-organoid-generation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Film pokazuje tworzenie połączeń nerwowo-mięśniowych za pomocą urządzenia mikroprzepływowego. Neuronalne komórki prekursorowe i komórki progenitorowe mięśni są umieszczane w różnych studzienkach w urządzeniu i pozostawiane do dojrzewania odpowiednio w neuronach ruchowych i miotubach. Stworzenie gradientu objętościowego i chemicznego prowadzi do rozwoju aktywnych połączeń nerwowo-mięśniowych.

Generowanie połączeń nerwowo-mięśniowych za pomocą urządzenia mikroprzepływowego

Ten film demonstruje metodę tworzenia organoidów nerwów ruchowych poprzez najpierw hodowlę ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w specjalnym podłożu w celu utworzenia sferoid, następnie różnicowanie ich w neurony ruchowe za pomocą specyficznych inhibitorów, a na końcu hodowanie ich w mikroprzepływowym chipie w celu rozszerzenia aksonów i utworzenia organoidów nerwów ruchowych.

Opracowywanie ludzkich organoidów nerwów ruchowych pochodzących z iPSC przy użyciu chipa mikroprzepływowego

Ten film demonstruje różnicowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) w neurony dopaminergiczne, aby dostarczyć modelu do badania choroby Parkinsona. HESC są hodowane w pożywce do indukcji neuronalnej na płytce mikrodołkowej w celu utworzenia neurosfer 3D. Są one następnie hodowane w pożywce do indukcji neuronalnej, aby promować różnicowanie w dopaminergiczne neurony progenitorowe. Końcowe dojrzewanie neuronów zachodzi we wstawce hodowlanej w warunkach granicy faz...

Wytwarzanie dopaminergicznych organoidów neuronalnych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

To badanie przedstawia i opisuje protokoły do uzyskania dwóch specyficznych ludzkich organoidów nerwowych jako odpowiedniego i dokładnego modelu do badania: 1) rozwoju glejaka u człowieka w obrębie ludzkich organoidów nerwowych wyłącznie u ludzi oraz 2) różnicowania dopaminergicznego neuronów generującego trójwymiarowy organoid.

Ludzkie organoidy nerwowe do badania raka mózgu i chorób neurodegeneracyjnych

Opisujemy metodę generowania ludzkich jednostek motorycznych w komercyjnie dostępnych urządzeniach mikroprzepływowych poprzez kokulturację ludzkich indukowanych pluripotencjalnych neuronów ruchowych pochodzących z komórek macierzystych z ludzkimi pierwotnymi miotubami pochodzącymi z mezoangioblastów, co prowadzi do powstania funkcjonalnie aktywnych połączeń nerwowo-mięśniowych.

Generacja jednostek motorycznych człowieka z funkcjonalnymi połączeniami nerwowo-mięśniowymi w urządzeniach mikroprzepływowych

Tutaj opisujemy protokół generowania organoidów mózgowych z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Aby uzyskać organoidy mózgowe w dużych ilościach i wysokiej jakości, używamy domowych mini bioreaktorów.

Wytwarzanie organoidów mózgowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w domowych mini bioreaktorach

W tym badaniu przedstawiamy szczegółową technikę prostego, ale solidnego systemu hodowli organoidów korowych przy użyciu standardowych kultur hPSC bez karmienia. Jest to szybki, wydajny i powtarzalny protokół generowania organoidów, które modelują aspekty starzenia się mózgu in vitro.

Solidna i wysoce odtwarzalna generacja organoidów korowych mózgu do modelowania starzenia się neuronów mózgu in vitro

Chociaż obwodowy układ nerwowy (PNS) jest zdolny do znacznej naprawy po urazie, niewiele wiadomo o komórkowych i molekularnych mechanizmach rządzących tym zjawiskiem. Korzystając z żywego, transgenicznego danio pręgowanego i powtarzalnego testu przecięcia nerwów, możemy badać dynamiczne zachowania komórek glejowych podczas degeneracji i regeneracji nerwów.

Przekrój nerwu ruchowego i obrazowanie poklatkowe zachowań komórek glejowych u żywych danio pręgowanego

Astrocyty w OUN zmieniają swoje właściwości funkcjonalne i strukturalne w odpowiedzi na szkodliwe bodźce. W artykule przedstawiono protokół oceny trójwymiarowej morfologii astrocytów w stanach chorobowych lub po interwencjach terapeutycznych.

Protokół trójwymiarowej konfokalnej analizy morfometrycznej astrocytów

Ten protokół wykorzystuje trójwymiarowe (3D) techniki obrazowania i analizy do wizualizacji i ilościowego określenia mitochondriów specyficznych dla nerwów. Techniki te mają zastosowanie w innych sytuacjach, w których jeden sygnał fluorescencyjny jest używany do odizolowania podzbioru danych od innego sygnału fluorescencyjnego.

Trójwymiarowe obrazowanie i analiza mitochondriów w obrębie śródnaskórkowych włókien nerwowych człowieka

Poznaj metodę generowania trójwymiarowych organoidów nerwów ruchowych z ludzkich komórek iPS przy użyciu mikrofluidycznego chipu PDMS. Ta technika umożliwia badanie rozwoju pęczków aksonów oraz skuteczniejsze testowanie leków na choroby neuronów ruchowych.

Trójwymiarowe generowanie organoidów nerwów ruchowych

Przeglądaj więcej filmów