Trójwymiarowe generowanie organoidów nerwów ruchowych

Protokół ten ułatwia badanie mechanizmów leżących u podstaw rozwoju i choroby wiązek aksonów przy użyciu organoidu nerwów ruchowych pochodzących z ludzkich komórek iPS znajdujących się poza ciałami. Poprzez prostą hodowlę sferoidów neuronalnych i niestandardowych chipów mikrokulturowych, jednokierunkowe wiązki aksonów mogą być spontanicznie generowane i wykorzystywane do różnych dalszych eksperymentów. Organoid nerwów ruchowych może ułatwić badania przesiewowe i testowanie leków na choroby neuronu ruchowego, w tym LS, zapewniając bardziej fizjologiczny model, który był wcześniejszymi systemami in vitro.

W dygestorium i przy założeniu odpowiednich środków ochrony osobistej dozuj trzy mililitry SU-8 2100 na oczyszczoną acetonem płytkę krzemową i umieść ją w środku powlekarki wirowej. Utrwal wafel za pomocą próżni i obracaj wafel z prędkością 500 obrotów na minutę przez 10 sekund, aby równomiernie pokryć SU-8 na powierzchni płytki, a następnie obracaj wafel z prędkością 1,500 obrotów na minutę przez 30 sekund z przyspieszeniem 300 obrotów na sekundę, aby uzyskać warstwę fotorezystu o grubości 150 mikronów na płytce. Po miękkim upieczeniu ustaw fotomaskę na nakładce maski i wystaw wafel na działanie światła ultrafioletowego przez 60 sekund.

Po upieczeniu na gorącej płycie, rozwijaj wafel przez 10 do 20 minut w wywoływaczu fotorezystu z mieszaniem na wytrząsarce orbitalnej, zmieniając roztwór rozwijający się raz w trakcie procesu. Aby przygotować dolną warstwę chipa do hodowli tkankowej, należy wlać świeżo przygotowany PDMS na płytkę do pożądanej grubości i odgazować mieszaninę w komorze próżniowej. Utwardź PDMS w piekarniku przez co najmniej trzy godziny w temperaturze 60 stopni Celsjusza.

Po schłodzeniu użyj ostrza, aby odciąć utwardzony PDMS od płytki, a następnie użyj nieutwardzonego PDMS z wypalaniem, aby przymocować zbiornik pożywki do dolnej warstwy PDMS, aby uzyskać zmontowany chip do hodowli tkankowej PDMS. Aby przygotować chip PDMS do tworzenia organoidów nerwów ruchowych, sterylizuj chip i szkło mikroskopowe o wymiarach 76 na 52 milimetry na szalce Petriego zawierającej 70% etanolu przez co najmniej jedną godzinę. Pod koniec inkubacji umieść chip na mokrym szkle mikroskopu.

Po wyschnięciu przez noc wiór powinien przylegać do szkła. Umieścić 30 mikrolitrów kropli rozcieńczonej matrycy membrany podstawnej w DMEM/F12 po jednej stronie wlotu kanału i zassać roztwór z drugiej strony wlotu, aby pokryć powierzchnię mikrokanału matrycą. Następnie inkubować chip PDMS z roztworem powlekającym na szalce Petriego przez godzinę w temperaturze pokojowej.

Aby indukować różnicowanie komórek 3D iPS w neuronach ruchowych, wysiewaj cztery razy 10 do czwartej komórki iPS na studzienkę do odpowiedniej liczby dołków 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery U w 100 mikrolitrach pożywki do hodowli komórek bez surowicy i surowicy uzupełnionej 10 mikromolami Y-27632. Następnego dnia zastąp supernatant w każdej studzience 100 mikrolitrami pożywki KSR uzupełnionej 10 mikromolowymi SB431542 i 100 nanomolowymi LDN-193189. W drugim i trzecim dniu zastąp supernatanty 100 mikrolitrami pożywki KSR uzupełnionej 10 mikromolowymi SB431542, 100 nanomolowymi LDN-193189, pięcioma mikromolowymi DAPT, pięcioma mikromolowymi SU5402, jednym mikromolowym kwasem retinowym i jednym mikromolowym wygładzonym agonistą.

W czwartym i piątym dniu zastąp supernatanty mieszaniną 75% pożywki KSR i 25% pożywki N2 uzupełnionej 10 SB431542 mikromolowymi, 100 LDN193189 nanomolowych, pięcioma mikromolowymi DAPT, pięcioma mikromolowymi SU5402, jednym mikromolowym kwasem retinowym i jednym mikromolowym wygładzonymi agonistami. W szóstym i siódmym dniu zastąp supernatanty mieszaniną 50% pożywki KSR i 50% pożywki N2 uzupełnionej pięcioma mikromolowymi DAPT, pięcioma mikromolowymi SU5402, jednym mikromolowym kwasem retinowym i jednym mikromolowym wygładzonym agonistą. W ósmym i dziewiątym dniu zastąp supernatanty mieszaniną 25% pożywki KSR i 75% pożywki N2 uzupełnionej pięcioma mikromolowymi DAPT, pięcioma mikromolowymi SU5402, jednym mikromolowym kwasem retinowym i jednym mikromolowym wygładzonym agonistą.

W dniach 10 i 11 zastąp supernatanty pożywką N2 uzupełnioną pięcioma mikromolowymi DAPT, pięcioma mikromolowymi SU5402, jednym mikromolowym kwasem retinowym i jednym mikromolowym wygładzonym agonistą. W dniu 12 zastąp supernatanty w każdym dołku 100 mikrolitrami pożywki dojrzewającej uzupełnionej 20 nanogramami na mililitr neurotroficznego czynnika pochodzenia mózgowego na studzienkę. Aby indukować tworzenie organoidów nerwów ruchowych, zastąp roztwór powlekający w chipie PDMS 150 mikrolitrami pożywki dojrzewającej uzupełnionej 20 nanogramami na mililitr neurotroficznego czynnika pochodzenia mózgowego i użyj końcówki mikropipety o szerokim otworze, aby delikatnie dodać sferoidy neuronów ruchowych z jednego dołka 96-dołkowej płytki do wlotu mikrokanału chipa.

Umieść mały zbiornik sterylnej wody w pobliżu chipa do hodowli tkankowej w naczyniu, aby zapobiec parowaniu pożywki i umieść naczynie w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Co dwa do trzech dni zastępować połowę wyczerpanej pożywki hodowlanej ze środka zbiornika pożywki świeżą pożywką dojrzewającą uzupełnioną 20 nanogramami na mililitr neurotroficznego czynnika pochodzenia mózgowego. Aksony będą rosły od sferoidy neuronu ruchowego do kanału, spontanicznie łącząc się w pojedynczą wiązkę w ciągu dwóch do trzech tygodni, tworząc organoid nerwu ruchowego.

Neurony ruchowe różnicują się w ciągu 12 do 14 dni w procedurach różnicowania 3D. Co ważne, ponad 60% komórek wykazuje ekspresję markera neuronu ruchowego HB9 podczas różnicowania, a około 80% komórek sferoidu neuronu ruchowego jest SMI32 dodatnich. Ponieważ mikrokanał służy jako fizyczne przewodniki, aksony wydłużają się od sferoidy neuronu ruchowego, tworząc wiązkę interakcji aksoaksonalnej w ciągu 24 godzin od wprowadzenia do sferoidy.

Aksony dotarły do środka mikrokanału w ciągu następnych trzech do czterech dni, rozszerzając się na drugi koniec mikrokanału po dodatkowych 10 dniach. Organoidy nerwów ruchowych można pobrać z chipa do analizy biologicznej poprzez odłączenie PDMS od szkła mikroskopu. Pęczki aksonów i ciała komórkowe można następnie wypreparować i wyizolować pod mikroskopem za pomocą noża chirurgicznego lub pęsety.

W wiązkach aksonów organoidów nerwów ruchowych dendrytyczne białka markerowe nie są wykrywane przez Western blot. Ważne jest, aby upewnić się, że sferoidy są całkowicie opuszczone na dno w chipie hodowlanym. Pokazaliśmy badanie miejsc, a dno może pomóc w określeniu lokalizacji sferoidy w chipie.

Izolowane wiązki aksonów można badać pod kątem różnych dodatkowych metod. Można uzyskać dużą ilość aksonów i wykorzystać je do testów biochemicznych, które wymagają znacznych materiałów.