Charakterystyka składu silników molekularnych na ruchomym ładunku aksonalnym za pomocą analizy "mapowania ładunku"

Ogólnym celem mapowania ładunku jest określenie względnej ilości i rodzaju molekularnych białek motorycznych, które łączą się z ładunkami pęcherzykowymi i przemieszczają je, oraz skorelowanie tego składu silników z kierunkowością ruchu ładunku na żywo. Osiąga się to poprzez najpierw wyhodowanie pierwotnych mysich neuronów hipokampa w urządzeniach mikroprzepływowych, tak aby aksony rosły stosunkowo prosto, oraz poprzez rejestrowanie żywego ruchu wewnątrzkomórkowego znakowanych fluorescencyjnie białek ładunkowych w aksonach przejściowo transfekowanych neuronów. Drugim krokiem jest utrwalenie neuronów w trakcie obrazowania żywego ładunku, a następnie wybarwienie aksonów przeciwciałami przeciwko molekularnym białkom motorycznym, takim jak kinezyna i diny, a następnie obrazowanie mikroskopem immunofluorescencyjnym.

Następnie stałe obrazy ładunku i silnika są wyrównywane do wykresów ruchu ładunku w czasie, zwanych również kraftami, w celu skorelowania ruchu ładunku na żywo z poplamionymi powiązanymi silnikami, jak określono za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego. Ostatnim krokiem jest określenie pozycji subpikseli białka ładunku i motorycznej za pomocą specjalnie opracowanego pakietu oprogramowania MATLAB o nazwie kolokalizacja motoryczna. Oprogramowanie to zapewnia dokładne współrzędne XY każdego ładunku i pozycji silnika, a także względną ilość intensywności fluorescencji związanej z ładunkami i silnikami.

Ostatecznie korelacja mikroskopii fluorescencyjnej żywych i stałych ładunków i silników na poziomie rozdzielczości subpikselowej dostarcza informacji na temat typów silników, które są powiązane z określonymi ładunkami, dla których znana jest kierunkowość ruchu. Tak więc ta metoda daje wgląd w mechanizm transportu eksonów. Można go zastosować w innych badaniach korelujących mikroskopię życia z barwieniem immunofluorescencyjnym, takich jak asocjacja białek z mikrotufiami podczas dynamiki mikrojajowodów lub rekrutacja białek podczas endocytozy.

Wizualna demonstracja tej metody pomoże wykonać etapy fiksacji i analizy obrazowania, które w przeciwnym razie mogą być trudne do nauczenia, ponieważ wymagają specjalistycznej konfiguracji. Pierwotne neurony hipokampa myszy do tej procedury są przygotowywane zgodnie z opisem w tekście protokołu i ponownie zawieszane w neuropodstawowym wzroście jaja. Pożywka do płytki neuronów w urządzeniu mikroprzepływowym.

Usuń pożywkę ze zbiornika mikroprzepływowego jeden i jeden prime. Nałóż 20 mikrolitrów komórek do zbiornika mikroprzepływowego i pozwól im przepłynąć. Umieść urządzenie w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2 na 20 minut.

Spójrz pod mikroskop, aby upewnić się, że komórki przylegają do zakrytego szkła. Dodaj neuro basal, pożywkę wzrostową, aby uzupełnić wszystkie zbiorniki. Umieść urządzenie z komórkami z powrotem w inkubatorze w dziewiątym dniu.

W hodowli neurony rozciągają aksony przez mikrokanały i są gotowe do transfekcji w celu ekspresji białek fluorescencyjnych. Obrazowanie na żywo transfekowanych pierwotnych neuronów hipokampa myszy odbywa się na odwróconym mikroskopie świetlnym epi fluorescencyjnym, wyposażonym w inkubator o temperaturze 37 stopni Celsjusza i komorę kontrolną CO2. Aby rozpocząć tę procedurę, wybierz obiektyw 100 x olej.

Nałóż olej na obiektyw i zamontuj szkiełko nakrywkowe z neuronami hipokampa wyhodowanymi w urządzeniu mikroprzepływowym na stoliku mikroskopu. Aby uniknąć śmierci neuronalnej, należy szybko utrzymywać próbki pod mikroskopem nie dłużej niż godzinę. Znajdź aksony transfekowanych komórek, które rozciągają się przez kanały komory mikroprzepływowej.

Zapisz liczbę kanałów, w których znaleziono transfekowany akson. Policz liczbę kanałów za pomocą ręcznego licznika zliczeń, aby uzyskać optymalne rejestrowanie ruchu na żywo i późniejszą analizę kolokalizacji. Wybierz aksony, które rosną stosunkowo płasko przez kanały, aby obrazowanie większości pęcherzyków mogło być wykonane w ostrości.

Aby ułatwić późniejsze wyrównanie ustalonych obrazów z trajektoriami ruchu na przeszczepie chm. Wyrównaj prawą krawędź mikrokanałów z polem widzenia podczas obrazowania. Aby skutecznie utrwalić komórki podczas obrazowania na żywo, procedurę najlepiej wykonywać przy pomocy dwóch osób, z których jedna dodaje utrwalacz, a druga osoba dostosowuje ostrość.

Ważne jest również, aby wszystkie odczynniki były gotowe i w zasięgu ręki. Za pomocą plastikowej pipety transferowej o pojemności jednego mililitra. Usuń większość pożywki ze zbiorników drugiego i drugiego Prime Start obrazuje ruch ładunku na żywo ze specyfikacjami poklatkowymi specyficznymi dla dynamiki transportu analizowanego ładunku.

Po zebraniu wystarczającej ilości danych o ruchu na żywo, poproś jedną osobę, aby napełniła zbiorniki dwa i dwa zalane wstępnie ciepłym utrwalaczem. Unikaj dotykania urządzenia mikroprzepływowego, ponieważ zakłóci to ostrość obrazowania na żywo. Poproś drugą osobę, aby dostosowała ostrość podczas dodawania utrwalacza.

W ten sam sposób napełnij zbiorniki jeden i jeden prime z mocowaniem utrwalającym jest skuteczne, gdy obserwuje się natychmiastowe zatrzymanie ruchu. Następnie utrwalone neurony są barwione przeciwciałami przeciwko endogennym białkom motorycznym i obrazowane zgodnie z opisem w tekście protokołu. Aby rozpocząć mapowanie ładunku, wygeneruj chromograf ruchu ładunku za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.

Wtyczka Image J opracowana przez Rich Dorf Insights jest zalecana do generowania Kraft za pomocą dostępnego na rynku oprogramowania graficznego, ręcznego wyrównywania obrazu immunofluorescencyjnego ładunku do wykresu CHM ruchu ładunku, nakładania punktu ładunku na położenie trajektorii na wykresie CHM w punkcie fiksacji tak, aby każda puncta ładunku odpowiadała określonej trajektorii na wykresie CHM. Aby uzyskać najlepsze wyniki wyrównania, należy użyć wycinka Z, który jest najlepiej ostry dla zmapowanego ładunku. Dla każdego obrazu w stosie Z można użyć kilku plasterków Z.

Określ współrzędne XY i amplitudy intensywności dla każdej punkcji fluorescencyjnej za pomocą ustalonego algorytmu, aby dopasować gaussy 2D do funkcji rozpiętości punktów, która reprezentuje źródła punktowe w każdym z trzech kanałów. Aby uzyskać współrzędne XY, opracowano specjalnie zbudowany pakiet oprogramowania MATLAB o nazwie kolokalizacja silnika, który zawiera algorytm dopasowania Gaussa opracowany przez Yakima DONA i współpracowników dla każdego z indywidualnych punktów ładunku, które zostały odwzorowane na trajektoriach ruchomych lub stacjonarnych. Na wykresie Kog wybierz współrzędne XY i amplitudy intensywności z wyników programu kolokalizacji motorycznej.

Użyj kilku obrazów Zacka, aby zmapować więcej ładunków, które znajdują się w różnych płaszczyznach ogniskowych. Porównaj indywidualne współrzędne XY dla zmapowanego ładunku z współrzędnymi uzyskanymi dla każdego z kanałów motorycznych w odpowiednim przekroju Z. Określ i wybierz współrzędne silnika XY, które znajdują się w promieniu 300 nanometrów od ładunku dla ładunków i silników, które zasygnalizowały w tej samej płaszczyźnie ogniskowej.

Użyj pakietu oprogramowania do kolokalizacji silników, aby określić punkty, które znajdują się w promieniu 300 nanometrów. Mapowanie ładunku wykorzystano do skorelowania transportu pęcherzyków przenoszących normalne białko prionowe znakowane żółtym białkiem fluorescencyjnym lub Y-F-P-P-R-P-C ze względnymi ilościami kinezyny i silników dine w aksonach. Ten wykres pokazuje ruch pęcherzyków F-P-P-R-P-C, a przerywana linia wskazuje czas fiksacji podczas obrazowania na żywo.

Obrazy fluorescencyjne utrwalonych pęcherzyków Y-F-P-P-R-P-C, a także odpowiadające im obrazy immunofluorescencyjne pierwszego łańcucha lekkiego Kinesin i dine są dopasowywane do chromografu. To powiększenie pokazuje sygnały immunofluorescencyjne każdego z trzech kanałów z przypisanymi funkcjami gian 2D. Ten wykres przedstawia kwantyfikację kolokalizacji między pęcherzykami Y-F-P-P-R-P-C, kinezyną o łańcuchu lekkim i dine w neuronach typu dzikiego oraz w neuronach pozbawionych łańcucha ciężkiego KINESIN.

Względna ilość kinezyny o łańcuchu lekkim i dine związana z pęcherzykami Y-F-P-P-R-P-C jest uzyskiwana z amplitud Gaussa i wykreślana w celu zbadania możliwych korelacji między względnymi ilościami motorycznymi a kierunkowością ruchu. Ten przykład z neuronów typu dzikiego wskazuje, że pęcherzyki Y-F-P-P-R-P-C, które są poruszające się lub nieruchome, kojarzą się z jednym łańcuchem lekkim KINESIN lub jedzą lub obydwoma Po opanowaniu tej techniki można wykonać w ciągu trzech dni. Oprócz około 10 dni przygotowania do obrazowania pre-EM urządzeń mikro fillic i neuronu pierwotnego, w ciągu trzech dni będzie można wykonać obrazowanie na żywo barwienia immunofluorescencyjnego i analizę danych.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak rejestrować na żywo ruch fluorescencyjnie znakowanych ładunków i neuronów, które zostały wyhodowane w urządzeniach mikroprzepływowych. Jak naprawić komórki C podczas obrazowania, jak analizować kolokalizację jako rozdzielczość subpikseli i jak skorelować kolokalizację ładunku i molekularnych białek motorycznych z ruchem ładunku.