Name: Charakterystyka składu silników molekularnych na ruchomym ładunku aksonalnym za pomocą analizy mapowania ładunku (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Poznaj metodę mapowania ładunku do analizy składu silników molekularnych kinesyn i dynein w neuronach myszy. Technika łączy obrazowanie na żywo z immunofluorescencją w mikrofluidycznych urządzeniach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Ge Yangowi, Gaudenzowi Danuserowi, Khuloudowi Jaqamanowi i Danielowi Whislerowi za pomoc w adaptacji i rozwoju oprogramowania do ilościowego mapowania ładunków, a także Emily Niederst za pomoc w tworzeniu urządzeń mikroprzepływowych. Praca ta była częściowo wspierana przez AG032180 grantów NIH-NIA dla L.S.B.G. oraz Instytutu Medycznego Howarda Hughesa. L.S. był częściowo wspierany przez NIH Bioinformatics Training Grant T32 GM008806, SEE był wspierany przez stypendium Damon Runyon Cancer Research Foundation Fellowship, NIH Neuroplasticity Training Grant AG000216 oraz przez grant z The Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging Award, GEC był wspierany przez NIH / NCATS 1 TL1 award TR001114 oraz przez fundację Achievement Rewards for College Scientists.

<ol><li>Goldstein, A. Y. N., Wang, X., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+and+the+delivery+of+pre-synaptic+components%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 18, 495-503 (2008).</li>
<li>Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+and+dynein+superfamily+proteins+and+the+mechanism+of+organelle+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Kinesin and dynein superfamily proteins and the mechanism of organelle transport.</a> Science. 279, 519-526 (1998).</li>
<li>Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+motors+in+neurons%3A+transport+mechanisms+and+roles+in+brain+function%2C+development%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease.</a> Neuron. 68, 610-638 (2010).</li>
<li>Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+superfamily+motor+proteins+and+intracellular+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 10, 682-696 (2009).</li>
<li>Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+transport+along+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Bidirectional transport along microtubules.</a> Curr. Biol. 14, 525-537 (2004).</li>
<li>Bryantseva, S. A., Zhapparova, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+transport+of+organelles%3A+unity+and+struggle+of+opposing+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Biol.+Int%22%5BJournal%5D)">Bidirectional transport of organelles: unity and struggle of opposing motors.</a> Cell. Biol. Int. 36, 1-6 (2011).</li>
<li>Gross, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hither+and+yon%3A+a+review+of+bi-directional+microtubule-based+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Biol%22%5BJournal%5D)">Hither and yon: a review of bi-directional microtubule-based transport.</a> Phys. Biol. 1, 1-11 (2004).</li>
<li>Gross, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+and+regulation+of+molecular+motors+in+Xenopus+melanophores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Interactions and regulation of molecular motors in Xenopus melanophores.</a> J. Cell. Biol. 156, 855-865 (2002).</li>
<li>Gross, S. P., Welte, M. A., Block, S. M., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+opposite-polarity+microtubule+motors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Coordination of opposite-polarity microtubule motors.</a> J. Cell. Biol. 156, 715-724 (2002).</li>
<li>Kural, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+and+dynein+move+a+peroxisome+in+vivo%3A+a+tug-of-war+or+coordinated+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Kinesin and dynein move a peroxisome in vivo: a tug-of-war or coordinated movement.</a> Science. 308, 1469-1472 (2005).</li>
<li>Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin-1+and+Dynein+are+the+primary+motors+for+fast+transport+of+mitochondria+in+Drosophila+motor+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).</li>
<li>Shubeita, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consequences+of+motor+copy+number+on+the+intracellular+transport+of+kinesin-1-driven+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets.</a> Cell. 135, 1098-1107 (2008).</li>
<li>Soppina, V., Rai, A. K., Ramaiya, A. J., Barak, P., Mallik, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tug-of-war+between+dissimilar+teams+of+microtubule+motors+regulates+transport+and+fission+of+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Tug-of-war between dissimilar teams of microtubule motors regulates transport and fission of endosomes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 19381-19386 (2009).</li>
<li>Verhey, K. J., Hammond, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traffic+control%3A+regulation+of+kinesin+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev.+Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Traffic control: regulation of kinesin motors.</a> Nat Rev. Mol. Cell. Biol. 10, 765-777 (2009).</li>
<li>Hendricks, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+Coordination+via+a+Tug-of-War+Mechanism+Drives+Bidirectional+Vesicle+Transport%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biol%22%5BJournal%5D)">Motor Coordination via a Tug-of-War Mechanism Drives Bidirectional Vesicle Transport.</a> Current Biol. 20, 697-702 (2010).</li>
<li>Encalada, S. E., Szpankowski, L., Xia, C. -h, Goldstein, L. S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+kinesin+and+dynein+assemblies+drive+the+axonal+transport+of+mammalian+prion+protein+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stable kinesin and dynein assemblies drive the axonal transport of mammalian prion protein vesicles.</a> Cell. 144, 551-565 (2011).</li>
<li>Harris, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-plasma+Bonding+of+PDMS+for+Inexpensive+Fabrication+of+Microfluidic+Devices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices.</a> J. Vis. Exp. 9 (410), (2007).</li>
<li>Harris, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+a+Microfluidic+Device+for+the+Compartmentalization+of+Neuron+Soma+and+Axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons.</a> J Vis. Exp. 7 (261), (2007).</li>
<li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury%2C+regeneration+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nat. Methods. 2, 599-605 (2005).</li>
<li>Szpankowski, L., Encalada, S. E., Goldstein, L. S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subpixel+colocalization+reveals+amyloid+precursor+protein-dependent+kinesin-1+and+dynein+association+with+axonal+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Subpixel colocalization reveals amyloid precursor protein-dependent kinesin-1 and dynein association with axonal vesicles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 8582-8587 (2012).</li>
<li>Jaqaman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+single-particle+tracking+in+live-cell+time-lapse+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences.</a> Nat. Methods. 5, 695-702 (2008).</li>
<li>Thomann, D., Dorn, J., Sorger, P. K., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+fluorescent+tag+localization+II%3A+Improvement+in+super-resolution+by+relative+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Automatic fluorescent tag localization II: Improvement in super-resolution by relative tracking.</a> J. Microsc. 211, 230-248 (2003).</li>
<li>Thomann, D., Rines, D. R., Sorger, P. K., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+fluorescent+tag+detection+in+3D+with+super-resolution%3A+application+to+the+analysis+of+chromosome+movement%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Automatic fluorescent tag detection in 3D with super-resolution: application to the analysis of chromosome movement.</a> J. Microsc. 208, 49-64 (2002).</li>
<li>Bolte, S., Cordelieres, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> J. Microsc. 224, 213-232 (2006).</li>
<li>Nunez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Culture+of+Hippocampal+Neurons+from+P0+Newborn+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats.</a> J. Vis. Exp. 29 (19), (2008).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li>
<li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ+for+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">ImageJ for microscopy.</a> Biotechniques. 43, 25-30 (2007).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Moore, D. S., McCabe, G. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoore%2C+DS+%22Introduction+to+the+Practice+of+Statistics%22">Introduction to the Practice of Statistics</a>. , 5th edition, W.H. Freeman. New York, NY. (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiony tu protokół umożliwia korelację kierunkowości ruchu poszczególnych fluorescencyjnych cząstek ładunku ruchomego na bazie mikrotubul ze względnym typem i ilością związanych z nimi białek ruchowych w żywych neuronach. Wcześniej całkowity skład motoryczny aksonalnych ładunków pęcherzykowych oznaczano na niejednorodnych populacjach biochemicznie oczyszczonych pęcherzyków i organelli9,15. Jednak scharakteryzowanie składu silnika dla pojedynczego rodzaju ładunku wewnątrz komór...

Transport wewnątrzkomórkowy jest krytyczny we wszystkich typach komórek dla dostarczania białek, błon, organelli i cząsteczek sygnałowych do różnych domen komórkowych1. Neurony to wysoce wyspecjalizowane komórki z długimi, spolaryzowanymi projekcjami, które krytycznie zależą od wewnątrzkomórkowego transportu niezbędnych ładunków do ich dostarczania na duże odległości do różnych mikrodomen aksonalnych. W transporcie tym pośredniczą kinezyny i dyneiny – dwie duże rodziny molekularnych białek motorycznych – które wiążą się z ładunkami i podążają wzdłuż spolaryzowanych mikrotubul odpowiednio w kierunku następczym i wstecznym. Podczas gdy ruch wsteczny jest głównie zapośredniczony przez dyneinę, ruch w kierunku następczym jest ułatwiony przez dużą, funkcjonalnie zróżnicowaną rodzinę silników kinezynowych. W związku z tym w następczym transporcie ładunków aksonalnych mogą pośredniczyć różni członkowie rodziny nadrodziny kinezyn1-5. Chociaż niektóre ładunki poruszają się stale w obu kierunkach, większość ładunków porusza się dwukierunkowo i często cofa się w drodze do miejsc docelowych1,5-13. Ponadto wykazano, że silniki o przeciwnej kierunkowości kojarzą się jednocześnie z ładunkami, co rodzi pytanie, w jaki sposób regulowany ruch ładunków jest koordynowany przez silniki o przeciwnej polaryzacji5-7. Łącznie transport ładunków aksonalnych jest skoordynowanym procesem, który jest regulowany przez skład silników i ich specyficzne działania biochemiczne, które z kolei są zależne od różnych adapterów i regulacyjnych partnerów wiążących14.
Aby wiernie opisać mechanizm transportu aksonalnego dla konkretnego ładunku i odkryć podstawową regulację tego transportu, najważniejsze jest określenie składu białek motorycznych i ich regulatorowych partnerów wiążących związanych z poszczególnymi ładunkami podczas ich transportu na żywo. Inne metody, na przykład podejścia biochemiczne, dostarczają szacunków średniego składu motorycznego w oczyszczonych heterogenicznych populacjach pęcherzyków, ale szacunki te nie ujawniają rodzaju ani ilości silników związanych z pojedynczymi poruszającymi się pęcherzykami. Ponadto odtworzenie transportu pęcherzyków wzdłuż wstępnie zmontowanych mikrotubul in vitro umożliwiło zmierzenie ilości jednego typu silnika na poziomie pojedynczego pęcherzyka15. Jednak eksperymenty te nie korelowały bezpośrednio liczby silników z charakterystyką transportową tych pęcherzyków i mierzyły transport przy braku komórkowych czynników regulacyjnych.
A przedstawiono tutaj protokół, który określa skład motoryczny (typ i względną ilość silników) poszczególnych poruszających się pęcherzyków na podstawie danych immunofluorescencyjnych (IF) mierzących endogennie wyrażane białka motoryczne i koreluje te parametry z żywym transportem dokładnie tych samych pęcherzyków w neuronach16. Metoda ta polega na precyzyjnym mapowaniu danych o ruchu ładunku IF-to-live. Osiąga się to poprzez hodowlę neuronów myszy hipokampa w urządzeniach mikroprzepływowych zgodnie z ustalonymi protokołami17-19. Urządzenia te pozwalają na identyfikację i korelację ("mapowanie") aksonów i pojedynczych ruchomych ładunków w mikroskopii w świetle stałym i na żywo (ryc. 1). Hodowane neurony są transfekowane fluorescencyjnie znakowanymi białkami ładunkowymi, których transport jest obrazowany w wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej w celu uzyskania szczegółowych informacji o ruchu, które są wykreślane na kimografach. W trakcie obrazowania neurony są utrwalane paraformaldehydem, a następnie barwione przeciwciałami przeciwko endogennym białkom ruchowym. Stałe obrazy ładunku i silnika są nakładane na kimografy ruchu na żywo w celu "zmapowania" (kolokalizacji) ich do trajektorii ruchu ładunku na żywo16. Aby skorelować żywy ruch ładunków z asocjacją białek motorycznych, kolokalizacja jest analizowana za pomocą specjalnie przygotowanego pakietu oprogramowania MATLAB o nazwie "Kolokalizacja motoryczna"16,20. Fluorescencyjnie znakowane ładunki i silniki generują punktowe cechy ograniczone dyfrakcją, które mogą częściowo się na siebie nakładać. Aby określić położenie nakładających się punktów punktowych, oprogramowanie najpierw automatycznie dopasowuje funkcje Gaussa do każdej funkcji rozproszenia punktów, reprezentujących poszczególne punkty fluorescencyjne, w celu określenia ich dokładnych współrzędnych położenia subpikseli X-Y i amplitudintensywności 21-23. Pozycje silników i ładunków są następnie porównywane ze sobą w celu określenia kolokalizacji16,20. W związku z tym metoda ta dokładniej przypisuje kolokalizację między punktami fluorescencyjnymi w porównaniu z innymi metodami24.
Mocną stroną tej metody jest możliwość oceny kolokalizacji silników z pojedynczym ładunkiem w stałych komórkach, dla których zarejestrowano trajektorie ruchu na żywo (np. kierunek, w którym poruszały się w momencie fiksacji). Dzięki tej metodzie stwierdzono, że kinezyny i dyneiny łączą się jednocześnie z pęcherzykami, które przenoszą normalne białko prionowe (PrPC-komórkowe), neuronalnie wzbogacony ładunek, który porusza się dwukierunkowo lub pozostaje nieruchomy w aksonach16. Analiza ta pozwoliła na sformułowanie roboczego modelu regulacji ruchu pęcherzyków PrPC, w którym silniki następcze (kinezyna) i wsteczne (dyneina) koordynują swoje działania w celu poruszania pęcherzykami w dowolnym kierunku lub pozostawania nieruchomymi podczas łączenia z ładunkiem. Kolejną mocną stroną tej metody jest jej potencjalne szerokie zastosowanie do charakteryzowania kolokalizacji/asocjacji wielu fluorescencyjnie znakowanych ładunków, które przemieszczają się w praktycznie każdym typie komórki, z dowolnymi innymi białkami będącymi przedmiotem zainteresowania. W związku z tym korelacja między żywym a stałym ładunkiem może potencjalnie pozwolić na wykrycie przejściowych interakcji białko-ładunek, ponieważ wiele pojedynczych, znakowanych fluorescencyjnie poruszających się cząstek może być analizowanych w pożądanym okresie czasu. Biorąc pod uwagę szerokie zastosowanie i rodzaj pytań, na które może odpowiedzieć ta metoda, protokół ten będzie interesujący dla szerokiego grona biologów komórkowych, w tym osób badających transport i transport w neuronach lub w innych typach komórek.

<table><tbody><tr><td>poli-L-lizyna</td><td>Sigma</td><td>P5899-20mg</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM (Dulbecco' s Modified Eagle Medium) Wysoka glukoza, z L-glutaminą, bez pirogronianu sodu (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Płodowa surowica bydlęca)</td><td>Life Technologies</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal-A Medium (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>10888022</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Serum Free Suplement</td><td>Life Technologies</td><td>10888022</td><td></td></tr><tr><td>Suplement GlutaMAX I (100x)</td><td>Life Technologie</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (1x) (Hank' s Zrównoważony roztwór soli)</td><td>Life Technologies</td><td>24020117</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, bez magnezu, bez wapnia (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Corning cellgro Woda do hodowli komórkowych&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT46000CM</td><td></td></tr><tr><td>Papaina</td><td>USB Corporation</td><td>19925</td><td></td></tr><tr><td>DL-cysteina HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9768</td><td></td></tr><tr><td>BSA (albumina surowicy bydlęcej)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I stopień II</td><td>Roche Applied Sciences</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>&nbsp; </td><td></td>11668027</tr><tr><td>Roztwór formaldehydu 16% EM Grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>50980487</td><td>Uwaga: Działa szkodliwie przez drogi oddechowe, w kontakcie ze skórą i po połknięciu. Działa drażniąco na oczy, drogi oddechowe i skórę. Utylizować zgodnie z oficjalnymi przepisami.</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H-3375</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica osła</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>017-000-0121</td><td></td></tr><tr><td>Bez kwasów tłuszczowych BSA i IgG</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>001-000-162</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2403-4</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-100</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik przeciwblaknięcie ProLong Gold</td><td>Life Technologies</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Szkło osłonowe 1 1/2. 24 x 40 mm</td><td>Corning</td><td>2980-244</td><td></td></tr><tr><td>Osiowe urządzenie mikroprzepływowe, 450 i mikro; m</td><td>Millipore</td><td>AX450</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE2000-U&nbsp;</td><td>Aparat Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coolsnap HQ&nbsp;</td>Naczynie do hodowli komórkowych <td>Roper Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-95</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych 150 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-100</td><td></td></tr><tr><td>Zastosowane przeciwciała:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Łańcuch lekki antykinezyny, V-17</td><td>Santa Cruz&nbsp;</td><td>swoistość sc-13362</td><td>zweryfikowana za pomocą neuronów KLC1-/- (Ref. 16), zalecane rozcieńczenie 1:100.</td></tr><tr><td>Ciężki łańcuch Anti Dynein 1, R-325</td><td>Santa Cruz&nbsp;</td><td>swoistość sc-9115</td><td>zweryfikowana przy użyciu shRNA przeciwko DYN1HC1 (Ref. 16), zalecane rozcieńczenie 1:100</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Anti-Rabbit</td><td>Antibody Life Technologies</td><td>A10042</td><td>&nbsp; Zalecane rozcieńczenie 1:200.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Przeciwciało</td><td>Life Technologies</td><td>A31573</td><td>&nbsp; Zalecane rozcieńczenie 1:200.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Donkey Przeciwciało anty-kozie IgG (H+L) Przeciwciało IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11057</td><td>&nbsp; Zalecane rozcieńczenie 1:200.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Przeciwciało</td><td>Life Technologies</td><td>A21447</td><td>&nbsp; Zalecane rozcieńczenie 1:200.</td></tr><tr><td colspan="4">Wtyczki i makra</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td><a href="http://imagej.nih.gov/ij/index.html">&nbsp; http://imagej.nih.gov/ij/index.html.&nbsp; </a></td></tr><tr><td>ImageJ Kymograph Plugin</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html">http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html.</a></td></tr></tbody></table>

charakterystyka składu silników molekularnych na ruchomym ładunku aksonalnym za pomocą analizy "mapowania ładunku"

Characterizing the Composition of Molecular Motors on Moving Axonal Cargo Using "Cargo Mapping" Analysis

Zrozumienie mechanizmów, za pomocą których silniki molekularne koordynują swoje działania w celu transportu pęcherzykowych ładunków wewnątrz neuronów, wymaga ilościowej analizy powiązań motoryka/ładunek na poziomie pojedynczego pęcherzyka. Celem tego protokołu jest wykorzystanie ilościowej mikroskopii fluorescencyjnej do skorelowania ("zmapowania") położenia i kierunkowości ruchu żywego ładunku ze składem i względną ilością silników związanych z tym samym ładunkiem. "Mapowanie ładunku" polega na obrazowaniu w czasie rzeczywistym znakowanych fluorescencyjnie ładunków poruszających się w aksonach hodowanych na urządzeniach mikroprzepływowych, a następnie na utrwalaniu chemicznym podczas rejestrowania ruchu w czasie rzeczywistym, a następnie na barwieniu immunofluorescencyjnym (IF) dokładnie tych samych obszarów aksonów przeciwciałami przeciwko silnikom. Kolokalizacja między ładunkami i powiązanymi z nimi silnikami jest oceniana poprzez przypisanie współrzędnych położenia subpikseli do kanałów motorycznych i ładunkowych, poprzez dopasowanie funkcji Gaussa do ograniczonych dyfrakcją funkcji rozrzutu punktów reprezentujących poszczególne fluorescencyjne źródła punktowe. Stałe obrazy ładunku i silnika są następnie nakładane na wykresy ruchu ładunków, aby "odwzorować" je na ich śledzone trajektorie. Mocną stroną tego protokołu jest połączenie danych na żywo i danych IF w celu zarejestrowania zarówno transportu ładunków pęcherzykowych w żywych komórkach, jak i określenia silników związanych z tymi samymi pęcherzykami. Technika ta pozwala przezwyciężyć wcześniejsze wyzwania, które polegały na wykorzystaniu metod biochemicznych do określenia średniego składu motorycznego oczyszczonych heterogenicznych populacji pęcherzyków masowych, ponieważ metody te nie ujawniają składu na pojedynczych ruchomych ładunkach. Ponadto protokół ten można dostosować do analizy innych szlaków transportu i/lub transportu w innych typach komórek w celu skorelowania ruchu poszczególnych struktur wewnątrzkomórkowych z ich składem białkowym. Ograniczeniami tego protokołu są stosunkowo niska przepustowość spowodowana niską wydajnością transfekcji hodowanych neuronów pierwotnych oraz ograniczone pole widzenia dostępne dla obrazowania w wysokiej rozdzielczości. Przyszłe zastosowania mogą obejmować metody zwiększania liczby neuronów wyrażających fluorescencyjnie znakowane ładunki.

Rysunek 1 przedstawia ogólny schemat urządzenia mikroprzepływowego wykorzystanego do hodowli neuronów hipokampa (Rysunek 1A, B). Neurony są wysiewane do zbiornika 1. Rozmiar mikrokanałów zapobiega dyfuzji ciał komórkowych (soma) do przedziału aksonalnego, natomiast długość kanałów uniemożliwia wypustkom dendrytycznym przedostanie się w całości do przedziału aksonalnego. Po około 2-3 dniach hodowli neurony zaczynają wysuwać aksony przez mikrokanały do przedziału aksonalnego (Rysun...

Wewnątrzkomórkowy transport ładunków, takich jak pęcherzyki czy organelle, odbywa się za pomocą molekularnych białek motorycznych, które śledzą na spolaryzowanych mikrotubulach. Protokół ten opisuje korelację kierunkowości transportu pojedynczych cząstek ładunku poruszających się wewnątrz neuronów, do względnej ilości i rodzaju związanych z nimi białek motorycznych.

Charakterystyka składu silników molekularnych na ruchomym ładunku aksonalnym za pomocą analizy "mapowania ładunku"

Understanding the mechanisms by which molecular motors coordinate their activities to transport vesicular cargoes within neurons requires the quantitative ...

Ogólnym celem mapowania ładunku jest określenie względnej ilości i rodzaju molekularnych białek motorycznych, które łączą się z ładunkami pęcherzykowymi i przemieszczają je, oraz skorelowanie tego składu silników z kierunkowością ruchu ładunku na żywo. Osiąga się to poprzez najpierw wyhodowanie pierwotnych mysich neuronów hipokampa w urządzeniach mikroprzepływowych, tak aby aksony rosły stosunkowo prosto, oraz poprzez rejestrowanie żywego ruchu wewnątrzkomórkowego znakowanych fluorescencyjnie białek ładunkowych w aksonach przejściowo transfekowanych neuronów. Drugim krokiem jest utrwalenie neuronów w trakcie obrazowania żywego ładunku, a następnie wybarwienie aksonów przeciwciałami przeciwko molekularnym białkom motorycznym, takim jak kinezyna i diny, a następnie obrazowanie mikroskopem immunofluorescencyjnym.Następnie stałe obrazy ładunku i silnika są wyrównywane do wykresów ruchu ładunku w czasie, zwanych również kraftami, w celu skorelowania ruchu ładunku na żywo z poplamionymi powiązanymi silnikami, jak określono za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego. Ostatnim krokiem jest określenie pozycji subpikseli białka ładunku i motorycznej za pomocą specjalnie opracowanego pakietu oprogramowania MATLAB o nazwie kolokalizacja motoryczna. Oprogramowanie to zapewnia dokładne współrzędne XY każdego ładunku i pozycji silnika, a także względną ilość intensywności fluorescencji związanej z ładunkami i silnikami.Ostatecznie korelacja mikroskopii fluorescencyjnej żywych i stałych ładunków i silników na poziomie rozdzielczości subpikselowej dostarcza informacji na temat typów silników, które są powiązane z określonymi ładunkami, dla których znana jest kierunkowość ruchu. Tak więc ta metoda daje wgląd w mechanizm transportu eksonów. Można go zastosować w innych badaniach korelujących mikroskopię życia z barwieniem immunofluorescencyjnym, takich jak asocjacja białek z mikrotufiami podczas dynamiki mikrojajowodów lub rekrutacja białek podczas endocytozy.Wizualna demonstracja tej metody pomoże wykonać etapy fiksacji i analizy obrazowania, które w przeciwnym razie mogą być trudne do nauczenia, ponieważ wymagają specjalistycznej konfiguracji. Pierwotne neurony hipokampa myszy do tej procedury są przygotowywane zgodnie z opisem w tekście protokołu i ponownie zawieszane w neuropodstawowym wzroście jaja. Pożywka do płytki neuronów w urządzeniu mikroprzepływowym.Usuń pożywkę ze zbiornika mikroprzepływowego jeden i jeden prime. Nałóż 20 mikrolitrów komórek do zbiornika mikroprzepływowego i pozwól im przepłynąć. Umieść urządzenie w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2 na 20 minut.Spójrz pod mikroskop, aby upewnić się, że komórki przylegają do zakrytego szkła. Dodaj neuro basal, pożywkę wzrostową, aby uzupełnić wszystkie zbiorniki. Umieść urządzenie z komórkami z powrotem w inkubatorze w dziewiątym dniu.W hodowli neurony rozciągają aksony przez mikrokanały i są gotowe do transfekcji w celu ekspresji białek fluorescencyjnych. Obrazowanie na żywo transfekowanych pierwotnych neuronów hipokampa myszy odbywa się na odwróconym mikroskopie świetlnym epi fluorescencyjnym, wyposażonym w inkubator o temperaturze 37 stopni Celsjusza i komorę kontrolną CO2. Aby rozpocząć tę procedurę, wybierz obiektyw 100 x olej.Nałóż olej na obiektyw i zamontuj szkiełko nakrywkowe z neuronami hipokampa wyhodowanymi w urządzeniu mikroprzepływowym na stoliku mikroskopu. Aby uniknąć śmierci neuronalnej, należy szybko utrzymywać próbki pod mikroskopem nie dłużej niż godzinę. Znajdź aksony transfekowanych komórek, które rozciągają się przez kanały komory mikroprzepływowej.Zapisz liczbę kanałów, w których znaleziono transfekowany akson. Policz liczbę kanałów za pomocą ręcznego licznika zliczeń, aby uzyskać optymalne rejestrowanie ruchu na żywo i późniejszą analizę kolokalizacji. Wybierz aksony, które rosną stosunkowo płasko przez kanały, aby obrazowanie większości pęcherzyków mogło być wykonane w ostrości.Aby ułatwić późniejsze wyrównanie ustalonych obrazów z trajektoriami ruchu na przeszczepie chm. Wyrównaj prawą krawędź mikrokanałów z polem widzenia podczas obrazowania. Aby skutecznie utrwalić komórki podczas obrazowania na żywo, procedurę najlepiej wykonywać przy pomocy dwóch osób, z których jedna dodaje utrwalacz, a druga osoba dostosowuje ostrość.Ważne jest również, aby wszystkie odczynniki były gotowe i w zasięgu ręki. Za pomocą plastikowej pipety transferowej o pojemności jednego mililitra. Usuń większość pożywki ze zbiorników drugiego i drugiego Prime Start obrazuje ruch ładunku na żywo ze specyfikacjami poklatkowymi specyficznymi dla dynamiki transportu analizowanego ładunku.Po zebraniu wystarczającej ilości danych o ruchu na żywo, poproś jedną osobę, aby napełniła zbiorniki dwa i dwa zalane wstępnie ciepłym utrwalaczem. Unikaj dotykania urządzenia mikroprzepływowego, ponieważ zakłóci to ostrość obrazowania na żywo. Poproś drugą osobę, aby dostosowała ostrość podczas dodawania utrwalacza.W ten sam sposób napełnij zbiorniki jeden i jeden prime z mocowaniem utrwalającym jest skuteczne, gdy obserwuje się natychmiastowe zatrzymanie ruchu. Następnie utrwalone neurony są barwione przeciwciałami przeciwko endogennym białkom motorycznym i obrazowane zgodnie z opisem w tekście protokołu. Aby rozpocząć mapowanie ładunku, wygeneruj chromograf ruchu ładunku za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.Wtyczka Image J opracowana przez Rich Dorf Insights jest zalecana do generowania Kraft za pomocą dostępnego na rynku oprogramowania graficznego, ręcznego wyrównywania obrazu immunofluorescencyjnego ładunku do wykresu CHM ruchu ładunku, nakładania punktu ładunku na położenie trajektorii na wykresie CHM w punkcie fiksacji tak, aby każda puncta ładunku odpowiadała określonej trajektorii na wykresie CHM. Aby uzyskać najlepsze wyniki wyrównania, należy użyć wycinka Z, który jest najlepiej ostry dla zmapowanego ładunku. Dla każdego obrazu w stosie Z można użyć kilku plasterków Z.Określ współrzędne XY i amplitudy intensywności dla każdej punkcji fluorescencyjnej za pomocą ustalonego algorytmu, aby dopasować gaussy 2D do funkcji rozpiętości punktów, która reprezentuje źródła punktowe w każdym z trzech kanałów. Aby uzyskać współrzędne XY, opracowano specjalnie zbudowany pakiet oprogramowania MATLAB o nazwie kolokalizacja silnika, który zawiera algorytm dopasowania Gaussa opracowany przez Yakima DONA i współpracowników dla każdego z indywidualnych punktów ładunku, które zostały odwzorowane na trajektoriach ruchomych lub stacjonarnych. Na wykresie Kog wybierz współrzędne XY i amplitudy intensywności z wyników programu kolokalizacji motorycznej.Użyj kilku obrazów Zacka, aby zmapować więcej ładunków, które znajdują się w różnych płaszczyznach ogniskowych. Porównaj indywidualne współrzędne XY dla zmapowanego ładunku z współrzędnymi uzyskanymi dla każdego z kanałów motorycznych w odpowiednim przekroju Z. Określ i wybierz współrzędne silnika XY, które znajdują się w promieniu 300 nanometrów od ładunku dla ładunków i silników, które zasygnalizowały w tej samej płaszczyźnie ogniskowej.Użyj pakietu oprogramowania do kolokalizacji silników, aby określić punkty, które znajdują się w promieniu 300 nanometrów. Mapowanie ładunku wykorzystano do skorelowania transportu pęcherzyków przenoszących normalne białko prionowe znakowane żółtym białkiem fluorescencyjnym lub Y-F-P-P-R-P-C ze względnymi ilościami kinezyny i silników dine w aksonach. Ten wykres pokazuje ruch pęcherzyków F-P-P-R-P-C, a przerywana linia wskazuje czas fiksacji podczas obrazowania na żywo.Obrazy fluorescencyjne utrwalonych pęcherzyków Y-F-P-P-R-P-C, a także odpowiadające im obrazy immunofluorescencyjne pierwszego łańcucha lekkiego Kinesin i dine są dopasowywane do chromografu. To powiększenie pokazuje sygnały immunofluorescencyjne każdego z trzech kanałów z przypisanymi funkcjami gian 2D. Ten wykres przedstawia kwantyfikację kolokalizacji między pęcherzykami Y-F-P-P-R-P-C, kinezyną o łańcuchu lekkim i dine w neuronach typu dzikiego oraz w neuronach pozbawionych łańcucha ciężkiego KINESIN.Względna ilość kinezyny o łańcuchu lekkim i dine związana z pęcherzykami Y-F-P-P-R-P-C jest uzyskiwana z amplitud Gaussa i wykreślana w celu zbadania możliwych korelacji między względnymi ilościami motorycznymi a kierunkowością ruchu. Ten przykład z neuronów typu dzikiego wskazuje, że pęcherzyki Y-F-P-P-R-P-C, które są poruszające się lub nieruchome, kojarzą się z jednym łańcuchem lekkim KINESIN lub jedzą lub obydwoma Po opanowaniu tej techniki można wykonać w ciągu trzech dni. Oprócz około 10 dni przygotowania do obrazowania pre-EM urządzeń mikro fillic i neuronu pierwotnego, w ciągu trzech dni będzie można wykonać obrazowanie na żywo barwienia immunofluorescencyjnego i analizę danych.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak rejestrować na żywo ruch fluorescencyjnie znakowanych ładunków i neuronów, które zostały wyhodowane w urządzeniach mikroprzepływowych. Jak naprawić komórki C podczas obrazowania, jak analizować kolokalizację jako rozdzielczość subpikseli i jak skorelować kolokalizację ładunku i molekularnych białek motorycznych z ruchem ładunku.

characterizing-composition-molecular-motors-on-moving-axonal-cargo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Molekularne wahadła składające się z funkcjonalizowanych mikrotubul przesuwających się po przytwierdzonych do powierzchni białkach motorycznych kinezynach mogą służyć jako nanoskala system transportowy. W niniejszej pracy opisano montaż typowego systemu wahadłowego.

Ładowanie ładunku na molekularne wahadła napędzane kinezyną

Tutaj prezentowany jest protokół identyfikacji ładunków Kinesin-1. Bezsilnikowy mutant ciężkiego łańcucha Kinesin-1 (KIF5B) agreguje się w cytoplazmie i indukuje agregację jej ładunków. Oba agregaty są wykrywane pod mikroskopią fluorescencyjną. Podobną strategię można zastosować do identyfikacji ładunków innych białek motorycznych.

Identyfikacja ładunków kinezyny-1 za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Tutaj opisujemy metodę obrazowania na żywo in vitro, która umożliwia wizualizację wewnątrzkomórkowego transportu organelli i transportu białek błony komórkowej w mysich astrocytach. W protokole tym przedstawiono również metodologię analizy obrazu w celu wyznaczenia tras transportu i kinetyki transportu ładunków.

Wizualizacja i analiza transportu wewnątrzkomórkowego organelli i innych ładunków w astrocytach

Celem tego protokołu jest tworzenie zespołów silników molekularnych na nanostrukturach origami DNA i obserwowanie ruchliwości zespołu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem.

Produkcja zespołów motorycznych dyneiny i kinezyny na nanostrukturach DNA origami do obserwacji pojedynczych cząsteczek

Upośledzony transport i morfologia mitochondriów są zaangażowane w różne choroby neurodegeneracyjne. Prezentowany protokół wykorzystuje indukowane pluripotencjalne neurony przodomózgowia pochodzące z komórek macierzystych do oceny transportu mitochondrialnego i morfologii w dziedzicznej paraplegii spastycznej. Protokół ten pozwala na scharakteryzowanie transportu mitochondrialnego wzdłuż aksonów i analizę ich morfologii, co ułatwi badanie chorób neurodegeneracyjnych.

Analiza transportu i morfologii mitochondriów w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronach pochodzących z komórek macierzystych w dziedzicznej paraplegii spastycznej

Opisujemy metody fotoaktywacji fluorescencji do analizy transportu aksonalnego neurofilamentów w pojedynczych mielinizowanych aksonach nerwów obwodowych od transgenicznych myszy, które wyrażają fotoaktywowane białko neurofilamentu.

Obrazowanie i analiza transportu neurofilamentów w wyciętym nerwie piszczelowym myszy

Dwukierunkowa mitoza kinezyna-5 Cin8 gromadzi się w klastrach, które rozdzielają się i łączą podczas swojej ruchliwości. Akumulacja w gromadach zmienia również prędkość i kierunkowość Cin8. W tym miejscu opisano protokół oznaczania ruchliwości z oczyszczonym Cin8-GFP oraz analizy właściwości ruchliwych pojedynczych cząsteczek i klastrów Cin8.

Ruchliwość pojedynczych cząsteczek i klastrów dwukierunkowej kinezyny-5 Cin8 oczyszczonej z komórek S. cerevisiae

Korzystając z transgenicznych myszy fluorescencyjnych, opisano szczegółowe protokoły do oceny in vivo transportu aksonalnego endosomów sygnałowych i mitochondriów w obrębie aksonów motorycznych i czuciowych nienaruszonego nerwu kulszowego u żywych zwierząt.

Rozszerzenie zestawu narzędzi do obrazowania in vivo transportu aksonalnego

To badanie szczegółowo opisuje oczyszczanie KIF1A(1-393LZ), członka rodziny kinezyny-3, przy użyciu systemu ekspresji Sf9-bakulowirusa. Analiza in vitro pojedynczych cząsteczek i wielu silników ślizgowych tych oczyszczonych silników wykazała silne właściwości ruchliwości porównywalne z silnikami z lizatu komórkowego ssaków. W ten sposób system Sf9-bakulowirusa jest podatny na ekspresję i oczyszczanie białka motorycznego będącego przedmiotem zainteresowania.

Analiza pojedynczych cząsteczek oczyszczonych superprocesyjnych silników z rodziny Kinesin-3 Sf9

Artykuł opisuje optymalizację parametrów akwizycji mikroskopii fluorescencyjnej w celu wizualizacji aksonalnego transportu endogennych znakowanych ładunków w rozdzielczości pojedynczego neuronu u żywego nicienia.

Optymalizacja wizualizacji transportu aksonalnego ładunków endogennych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej u żywych Caenorhabditis elegans

Poznaj metodę mapowania ładunku do analizy składu silników molekularnych kinesyn i dynein w neuronach myszy. Technika łączy obrazowanie na żywo z immunofluorescencją w mikrofluidycznych urządzeniach.

Charakterystyka składu silników molekularnych na ruchomym ładunku aksonalnym za pomocą analizy "mapowania ładunku"

Przeglądaj więcej filmów