Name: Profilowanie redoks komórkowe przy użyciu mikroskopii o wysokiej zawartości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Poznaj metodę profilowania redoks w żywych komórkach przywierających przy użyciu mikroskopii o wysokiej zawartości. Jednocześnie mierzy poziomy ROS i morfofunkcję mitochondriów w tej samej komórce.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Badania były wspierane przez Uniwersytet w Antwerpii (TTBOF/29267, TTBOF/30112), Specjalny Fundusz Badawczy Uniwersytetu w Gandawie (projekt BOF/11267/09), NB-Photonics (kod projektu 01-MR0110) oraz inicjatywę CSBR (Centers for Systems Biology Research) z Holenderskiej Organizacji Badań Naukowych (NWO; Nr katalogowy: CSBR09/013V). Fragmenty tego manuskryptu zostały zaadaptowane z innej publikacji1, za zgodą Springera. Autorzy dziękują Geertowi Meesenowi za pomoc przy mikroskopie szerokokątnym.

<ol><li>Sieprath, T., Corne, T. D. J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H., De Vos, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+High-Content+Quantification+of+Intracellular+ROS+Levels+and+Mitochondrial+Morphofunction%5BTitle%5D)+AND+%22AAEC%22%5BJournal%5D)">Integrated High-Content Quantification of Intracellular ROS Levels and Mitochondrial Morphofunction.</a> AAEC. 219, 149-177 (2016).</li>
<li>Marchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria-ros+crosstalk+in+the+control+of+cell+death+and+aging%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Signal+Transduct%22%5BJournal%5D)">Mitochondria-ros crosstalk in the control of cell death and aging).</a> J Signal Transduct. 2012, article ID 329635 1-17 (2012).</li>
<li>Korshunov, S. S., Skulachev, V. P., Starkov, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+protonic+potential+actuates+a+mechanism+of+production+of+reactive+oxygen+species+in+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+lett%22%5BJournal%5D)">High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria.</a> FEBS lett. 416 (1), 15-18 (1997).</li>
<li>Miwa, S., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+matrix+reactive+oxygen+species+production+is+very+sensitive+to+mild+uncoupling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial matrix reactive oxygen species production is very sensitive to mild uncoupling.</a> Biochem Soc Trans. 31 (Pt 6), 1300-1301 (2003).</li>
<li>Verkaart, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+production+is+inversely+related+to+complex+I+activity+in+inherited+complex+I+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22BBA-GEN+SUBJECTS%22%5BJournal%5D)">Superoxide production is inversely related to complex I activity in inherited complex I deficiency.</a> BBA-GEN SUBJECTS. 1772 (3), 373-381 (2007).</li>
<li>Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+mitochondria+produce+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">How mitochondria produce reactive oxygen species.</a> Biochem J. 417 (pt 1), 1-13 (2009).</li>
<li>Lebiedzinska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress-dependent+p66Shc+phosphorylation+in+skin+fibroblasts+of+children+with+mitochondrial+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22BBA-GEN+SUBJECTS%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress-dependent p66Shc phosphorylation in skin fibroblasts of children with mitochondrial disorders.</a> BBA-GEN SUBJECTS. 1797 (6-7), 952-960 (2010).</li>
<li>Forkink, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+hyperpolarization+during+chronic+complex+I+inhibition+is+sustained+by+low+activity+of+complex+II%2C+III%2C+IV+and+V%5BTitle%5D)+AND+%22BBA-BIOENERGETICS%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial hyperpolarization during chronic complex I inhibition is sustained by low activity of complex II, III, IV and V.</a> BBA-BIOENERGETICS. 1837 (8), 1247-1256 (2014).</li>
<li>Willems, P. H. G. M., Rossignol, R., Dieteren, C. E. J., Murphy, M. P., Koopman, W. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+Homeostasis+and+Mitochondrial+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Redox Homeostasis and Mitochondrial Dynamics.</a> Cell Metab. 22 (2), 207-218 (2015).</li>
<li>Koopman, W. J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+NADH%3Aubiquinone+oxidoreductase+deficiency%3A+radical+changes+in+mitochondrial+morphology%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Human NADH:ubiquinone oxidoreductase deficiency: radical changes in mitochondrial morphology?</a> Am J Physiol Cell Physiol. 293 (1), C22-C29 (2007).</li>
<li>Archer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics--mitochondrial+fission+and+fusion+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics--mitochondrial fission and fusion in human diseases.</a> N Engl J Med. 369 (23), 2236-2251 (2013).</li>
<li>Rambold, A. S., Kostelecky, B., Elia, N., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubular+network+formation+protects+mitochondria+from+autophagosomal+degradation+during+nutrient+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Tubular network formation protects mitochondria from autophagosomal degradation during nutrient starvation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (25), 10190-10195 (2011).</li>
<li>Koopman, W. J. H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17066472">Simultaneous quantification of oxidative stress and cell spreading using 5-(and-6)-chloromethyl-2 &#34;,7 -&#34;dichlorofluorescein.</a> Cytometry A. 69A (12), 1184-1192 (2006).</li>
<li>Iannetti, E. F., Smeitink, J. A. M., Beyrath, J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+high-content+analysis+of+mitochondrial+morphofunction+using+live-cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Multiplexed high-content analysis of mitochondrial morphofunction using live-cell microscopy.</a> Nat Protoc. 11 (9), 1693-1710 (2016).</li>
<li>Sieprath, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+accumulation+of+prelamin+A+and+depletion+of+lamin+A%2FC+both+cause+oxidative+stress+and+mitochondrial+dysfunction+but+induce+different+cell+fates%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">Sustained accumulation of prelamin A and depletion of lamin A/C both cause oxidative stress and mitochondrial dysfunction but induce different cell fates.</a> Nucleus. 6 (3), 236-246 (2015).</li>
<li>Zuiderveld, K. Contrast limited adaptive histogram equalization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZuiderveld%2C+K+%22Graphics+gems+IV%22">Graphics gems IV</a>. , Academic Press Professional, Inc. 474-485 (1994).</li>
<li>Chang, W., Cheng, J., Allaire, J. J., Xie, Y., McPherson, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChang%2C+W+%22shiny%3A+Web+Application+Framework+for+R.+R+package+version+0.14.2%22">shiny: Web Application Framework for R. R package version 0.14.2</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://CRAN.R-project.org/package=shiny ">https://CRAN.R-project.org/package=shiny </a> (2017).</li>
<li>Konietschke, F., Placzek, M., Schaarschmidt, F., Hothorn, L. A. <a target="_blank" href="https://www.jstatsoft.org/article/view/v064i09">nparcomp: An R Software Package for Nonparametric Multiple Comparisons and Simultaneous Confidence Intervals.</a> J Stat Softw. 64 (9), 1-17 (2015).</li>
<li>Estaquier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+antiretroviral+drugs+on+human+immunodeficiency+virus+type+1-induced+CD4%28%2B%29+T-cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Effects of antiretroviral drugs on human immunodeficiency virus type 1-induced CD4(+) T-cell death.</a> J Virol. 76 (12), 5966-5973 (2002).</li>
<li>Matarrese, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+membrane+hyperpolarization+hijacks+activated+T+lymphocytes+toward+the+apoptotic-prone+phenotype%3A+homeostatic+mechanisms+of+HIV+protease+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial membrane hyperpolarization hijacks activated T lymphocytes toward the apoptotic-prone phenotype: homeostatic mechanisms of HIV protease inhibitors.</a> J Immunol. 170 (12), 6006-6015 (2003).</li>
<li>Roumier, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+protease+inhibitors+and+cytomegalovirus+vMIA+induce+mitochondrial+fragmentation+without+triggering+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">HIV-1 protease inhibitors and cytomegalovirus vMIA induce mitochondrial fragmentation without triggering apoptosis.</a> Cell Death Differ. 13 (2), 348-351 (2006).</li>
<li>Chandra, S., Mondal, D., Agrawal, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+protease+inhibitor+induced+oxidative+stress+suppresses+glucose+stimulated+insulin+release%3A+protection+with+thymoquinone%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Biol+Med+%28Maywood%29%22%5BJournal%5D)">HIV-1 protease inhibitor induced oxidative stress suppresses glucose stimulated insulin release: protection with thymoquinone.</a> Exp Biol Med (Maywood). 234 (4), 442-453 (2009).</li>
<li>Touzet, O., Philips, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resveratrol+protects+against+protease+inhibitor-induced+reactive+oxygen+species+production%2C+reticulum+stress+and+lipid+raft+perturbation%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Resveratrol protects against protease inhibitor-induced reactive oxygen species production, reticulum stress and lipid raft perturbation.</a> AIDS. 24 (10), 1437-1447 (2010).</li>
<li>Bociąga-Jasik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+effects+of+the+HIV+protease+inhibitor--saquinavir+in+differentiating+human+preadipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rep%22%5BJournal%5D)">Metabolic effects of the HIV protease inhibitor--saquinavir in differentiating human preadipocytes.</a> Pharmacol Rep. 65 (4), 937-950 (2013).</li>
<li>Xiang, T., Du, L., Pham, P., Zhu, B., Jiang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nelfinavir%2C+an+HIV+protease+inhibitor%2C+induces+apoptosis+and+cell+cycle+arrest+in+human+cervical+cancer+cells+via+the+ROS-dependent+mitochondrial+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Nelfinavir, an HIV protease inhibitor, induces apoptosis and cell cycle arrest in human cervical cancer cells via the ROS-dependent mitochondrial pathway.</a> Cancer Lett. 364 (1), 79-88 (2015).</li>
<li>Blanchet, L., Smeitink, J. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+small+molecule+phenotypic+effects+using+mitochondrial+morpho-functional+fingerprinting+and+machine+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Quantifying small molecule phenotypic effects using mitochondrial morpho-functional fingerprinting and machine learning.</a> Sci. Rep. 5, 8035(2015).</li>
<li>Invitrogen. Reactive Oxygen Species (ROS) Detection Reagents. , 
 <a target="_blank" href="https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp36103.pdf ">https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp36103.pdf </a> (2006).</li>
<li>Koh, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+cells+for+microscopy+using+cytospin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Preparation of cells for microscopy using cytospin.</a> Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).</li>
<li>Mihara, K., Nakayama, T., Saitoh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Convenient+Technique+to+Fix+Suspension+Cells+on+a+Coverslip+for+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A Convenient Technique to Fix Suspension Cells on a Coverslip for Microscopy.</a> Curr Protoc Cell Biol. 68, 4.30.1-4.30.10 (2015).</li>
<li>Deutsch, M., Deutsch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+miniature+cell+retainer+for+correlative+high-content+analysis+of+individual+untethered+non-adherent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A novel miniature cell retainer for correlative high-content analysis of individual untethered non-adherent cells.</a> Lab Chip. 6 (8), 995-996 (2006).</li>
<li>Price, H. P., MacLean, L., Marrison, J., O'Toole, P. J., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+new+method+for+immobilising+kinetoplastid+parasites+for+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Validation of a new method for immobilising kinetoplastid parasites for live cell imaging.</a> Mol Biochem Parasitol. 169 (1), 66-69 (2010).</li>
<li>Sabati, T., Galmidi, B. S., Korngreen, A., Zurgil, N., Deutsch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+changes+in+plasma+membrane+potential+via+imaging+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+at+individual+cell+resolution+in+suspension%5BTitle%5D)+AND+%22JBO%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of changes in plasma membrane potential via imaging of fluorescence resonance energy transfer at individual cell resolution in suspension.</a> JBO. 18 (12), (2013).</li>
<li>Fercher, A., O'Riordan, T. C., Zhdanov, A. V., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+cellular+oxygen+and+analysis+of+metabolic+responses+of+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging of cellular oxygen and analysis of metabolic responses of mammalian cells.</a> Meth Mol Biol. 591 (Chapter 16), 257-273 (2010).</li>
<li>Graf, R., Rietdorf, J., Zimmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+spinning+disk+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Biochem.+Eng.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Live cell spinning disk microscopy.</a> Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 95 (Chapter 3), 57-75 (2005).</li>
<li>Gao, L., Shao, L., Chen, B. C., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+live+fluorescence+imaging+of+cellular+dynamics+using+Bessel+beam+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">3D live fluorescence imaging of cellular dynamics using Bessel beam plane illumination microscopy.</a> Nat. Protoc. 9 (5), 1083-1101 (2014).</li>
<li>Meijer, M., Hendriks, H. S., Heusinkveld, H. J., Langeveld, W. T., Westerink, R. H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+plate+reader-based+methods+with+fluorescence+microscopy+for+measurements+of+intracellular+calcium+levels+for+the+assessment+of+in+vitro+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Comparison of plate reader-based methods with fluorescence microscopy for measurements of intracellular calcium levels for the assessment of in vitro neurotoxicity.</a> Neurotoxicology. 45, 31-37 (2014).</li>
<li>Bushway, P. J., Mercola, M., Price, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+analysis+of+standard+microtiter+plate+reading+versus+imaging+in+cellular+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+drug+development+technologies%22%5BJournal%5D)">A comparative analysis of standard microtiter plate reading versus imaging in cellular assays.</a> Assay and drug development technologies. 6 (4), 557-567 (2008).</li>
<li>Black, C. B., Duensing, T. D., Trinkle, L. S., Dunlay, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Based+Screening+Using+High-Throughput+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">Cell-Based Screening Using High-Throughput Flow Cytometry.</a> Assay Drug Dev Technol. 9 (1), 13-20 (2011).</li>
</ol>

Autorzy stwierdzają, że nie ma konkurujących ze sobą interesów finansowych ani innych konfliktów interesów. Autor korespondencyjny zapewnia również, że wszyscy autorzy zostali poproszeni o ujawnienie wszelkich konfliktów interesów.

W artykule opisano metodę mikroskopii o wysokiej zawartości do jednoczesnej kwantyfikacji wewnątrzkomórkowych poziomów ROS i morfofunkcji mitochondriów w NHDF. Jego skuteczność została zademonstrowana w studium przypadku NHDF leczonego SQV. Wyniki potwierdzają wcześniejsze dowody z literatury, w których zaobserwowano podwyższony poziom ROS lub dysfunkcję mitochondriów po leczeniu inhibitorami proteazy HIV typu 1, choć w oddzielnych eksperymentach 19,20,21,22,23,2...

Stężenie wewnątrzkomórkowych ROS jest skrupulatnie regulowane poprzez dynamiczne współdziałanie między systemami produkującymi ROS i rozbrajającymi ROS. Brak równowagi między nimi wywołuje stan stresu oksydacyjnego. Do głównych źródeł ROS należą mitochondria1. Biorąc pod uwagę ich rolę w oddychaniu komórkowym, są one odpowiedzialne za większość wewnątrzkomórkowych cząsteczek ponadtlenkowych (O2•-)2. Wynika to głównie z wycieku elektronów doO2 w kompleksie 1 łańcucha transportu elektronów w warunkach silnego ujemnego potencjału wewnętrznej błony mitochondrialnej (Δψm), tj. hiperpolaryzacji mitochondriów. Z drugiej strony, depolaryzacja mitochondriów została również skorelowana ze zwiększoną produkcją ROS, co wskazuje na wiele trybów działania3,4,5,6,7,8. Ponadto, poprzez modyfikacje redoks w białkach maszynerii rozszczepienia i fuzji, ROS współregulują morfologię mitochondriów9. Na przykład fragmentacja jest skorelowana ze zwiększoną produkcją ROS i apoptozą10,11, podczas gdy nitkowate mitochondria zostały powiązane z niedoborem składników odżywczych i ochroną przed mitofagią12. Biorąc pod uwagę skomplikowany związek między komórkowymi ROS a morfofunkcją mitochondriów, najlepiej byłoby, gdyby oba te czynniki były oznaczane ilościowo jednocześnie w żywych komórkach. Aby to osiągnąć, opracowano test obrazowania o wysokiej zawartości oparty na zautomatyzowanej mikroskopii szerokokątnej i analizie obrazu przylegających kultur komórkowych barwionych sondami fluorescencyjnymi CM-H2DCFDA (ROS) i TMRM (mitochondrialne Δψm i morfologia). Obrazowanie o wysokiej zawartości odnosi się do ekstrakcji bogatych czasoprzestrzennie (tj. dużej liczby cech opisowych) informacji o fenotypach komórkowych przy użyciu wielu komplementarnych markerów i zautomatyzowanych analiz obrazu. W połączeniu z mikroskopią automatyczną wiele próbek może być badanych równolegle (tj. z dużą wydajnością), co zwiększa moc statystyczną testu. Rzeczywiście, główną zaletą protokołu jest to, że pozwala on na jednoczesną kwantyfikację wielu parametrów w tej samej komórce, i to dla dużej liczby komórek i warunków.
Protokół jest podzielony na 8 części (szczegółowo opisanych w poniższym protokole): 1) Wysiewanie komórek na 96-dołkowej płytce; 2) Przygotowanie roztworów podstawowych, roztworów roboczych i buforu do obrazowania; 3) Ustawienie mikroskopu; 4) Załadunek komórek za pomocą CM-H2DCFDA i TMRM; 5) Pierwsza runda obrazowania na żywo w celu pomiaru podstawowych poziomów ROS i morfofunkcji mitochondriów; 6) Druga runda obrazowania na żywo po dodaniu nadtlenku tert-butylu (TBHP) w celu pomiaru indukowanych poziomów ROS; 7) Zautomatyzowana analiza obrazu; 8) Analiza danych, kontrola jakości i wizualizacja.
Test został pierwotnie opracowany dla normalnych ludzkich fibroblastów skórnych (NHDF). Ponieważ komórki te są duże i płaskie, dobrze nadają się do oceny morfologii mitochondriów na obrazach szerokokątnych 2D13,14. Jednak z niewielkimi modyfikacjami metoda ta ma zastosowanie do innych przylegających typów komórek. Co więcej, oprócz kombinacji CM-H2DCFDA i TMRM, przepływ pracy jest zgodny z różnymi parami barwników fluorescencyjnych o różnej specyficzności molekularnej1,15.

<table><tbody><tr><td>Odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetrametylorodamina, ester metylowy, nadchloran (TMRM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T668</td><td></td></tr><tr><td>CM-H2DCFDA (Ogólny wskaźnik stresu oksydacyjnego)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C6827</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma)Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>MatriPlate 96-dołkowa płytka MicroWell ze szklanym dnem 630 &micro; L-Black 0,17 mm Low Glass</td><td>Lided Brooks life science systems</td><td>MGB096-1-2-LG-L</td><td></td></tr><tr><td>HBSS bez czerwieni fenolowej 500 ml</td><td>Lonza</td><td>BE10-527F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM wysoka glukoza z L-glutaminą</td><td>Lonza</td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna z fosforanem (PBS) bez Ca i Mg</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M 500 mL</td><td>Lonza</td><td>17-737F</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny-versenu (EDTA)</td><td>Lonza</td><td>BE17-161E</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure F(ab')2 Fragment osiołka Anty-królik IgG (H+L)</td><td>Jackson</td><td>711-166-152</td><td>Przeciwciało używane do pozyskiwania obrazu płaskiego pola</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment osiołka Anty-królik IgG (H+L)</td><td>Jackson</td><td>711-546-152</td><td>Przeciwciało używane do pozyskiwania obrazu płaskiego pola</td></tr><tr><td><silny>Nazwa</silny></td><td><silny>Firma</silny></td><td><silny>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Sprzęt</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop szerokokątny zaćmienia Nikon Ti</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perfect Focus System (PFS)</td><td></td><td></td><td>Sprzętowy system autofokusa</td></tr><tr><td>CFI Plan Apo Lambda 20X</td><td>obiektyw Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS Elelements Advanced Research 4.5 z modułem JOBS</td><td>Nikon</td><td></td><td>To oprogramowanie służy do sterowania mikroskopem i programowania/wykonywania automatycznej akwizycji obrazu ImageJ</td></tr><tr><td>(FIJI) Wersja 2.0.0-rc-43/1.50g</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RStudio Wersja 1.0.44</td><td>Rstudio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R wersja 3.3.2</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

profilowanie redoks komórkowe przy użyciu mikroskopii o wysokiej zawartości

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Reaktywne formy tlenu (ROS) regulują podstawowe procesy komórkowe, w tym ekspresję genów, migrację, różnicowanie i proliferację. Jednak nadmierny poziom ROS wywołuje stan stresu oksydacyjnego, któremu towarzyszą nieodwracalne uszkodzenia oksydacyjne DNA, lipidów i białek. W ten sposób kwantyfikacja ROS zapewnia bezpośredni wskaźnik zastępczy dla stanu zdrowia komórek. Ponieważ mitochondria są jednym z głównych źródeł komórkowych i celów ROS, wspólna analiza funkcji mitochondriów i produkcji ROS w tych samych komórkach ma kluczowe znaczenie dla lepszego zrozumienia wzajemnych powiązań w warunkach patofizjologicznych. W związku z tym opracowano strategię opartą na mikroskopii o wysokiej zawartości w celu jednoczesnego ilościowego oznaczania wewnątrzkomórkowych poziomów ROS, potencjału błony mitochondrialnej (ΔΨm) i morfologii mitochondriów. Opiera się na zautomatyzowanej szerokokątnej mikroskopii fluorescencyjnej i analizie obrazu żywych komórek przylegających, hodowanych na płytkach wielodołkowych i barwionych przepuszczalnymi dla komórek fluorescencyjnymi cząsteczkami reporterowymi CM-H2DCFDA (ROS) i TMRM (ΔΨm i morfologia mitochondriów). W przeciwieństwie do fluorymetrii lub cytometrii przepływowej, strategia ta umożliwia ilościowe określenie parametrów subkomórkowych na poziomie pojedynczej komórki z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną, zarówno przed, jak i po stymulacji eksperymentalnej. Co ważne, obrazowy charakter metody pozwala na wyodrębnienie parametrów morfologicznych oprócz intensywności sygnału. Połączony zestaw funkcji jest używany do eksploracyjnej i statystycznej analizy danych wielowymiarowych w celu wykrycia różnic między subpopulacjami, typami komórek i/lub leczeniem. W tym miejscu znajduje się szczegółowy opis testu wraz z przykładowym eksperymentem, który dowodzi jego potencjału do jednoznacznego rozróżniania stanów komórkowych po zaburzeniach chemicznych.

Metoda została zwalidowana za pomocą kilku eksperymentów kontrolnych, których wyniki opisano w pracy Sieprath et al.1. W skrócie, w celu określenia zakresu dynamicznego zmierzono odpowiedź fluorescencyjną CM-H2DCFDA i TMRM na zewnętrznie indukowane zmiany w obrębie wewnątrzkomórkowych ROS oraz Δψm odpowiednio. W przypadku CM-H2DCFDA w komórkach NHDF zaobserwowano liniowy wzrost sygnału fluorescencji po zastosowaniu zwiększa...

Ten artykuł przedstawia proces pracy mikroskopii o wysokiej zawartości do jednoczesnej kwantyfikacji wewnątrzkomórkowych poziomów ROS, jak również potencjału i morfologii błony mitochondrialnej - wspólnie określanych jako morfofunkcja mitochondriów - w żywych komórkach przylegających przy użyciu przenikających komórkę fluorescencyjnych cząsteczek reporterowych 5-(i-6)-chlorometylo-2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny dioctanu, ester acetylowy (CM-H2DCFDA) i ester metylowy tetrametylodaminy (TMRM).

Profilowanie redoks komórkowe przy użyciu mikroskopii o wysokiej zawartości

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

Ogólnym celem tej metody opartej na mikroskopii wysokotreściowej (high-content microscopy) jest jednoczesna kwantyfikacja morfofunkcji mitochondriów oraz komórkowych poziomów reaktywnych form tlenu, aby stworzyć wiarygodny profil redox dla linii komórkowych poddanych różnym perturbacjom eksperymentalnym. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii redox, takie jak to, czy warunki patogenne lub traktowanie związkami wywołują stres oksydacyjny oraz w jakim stopniu wpływają one na formę i funkcję mitochondriów. Główną zaletą tej techniki jest możliwość pomiaru wszystkich parametrów w tej samej komórce w tym samym czasie.Aby rozpocząć procedurę, należy zasiać od 8 do 10 000 ludzkich fibroblastów skóry w 60 wewnętrznych studzienkach czarnej płytki 96-dołkowej z ciennym, ciągłym dnem polistyrenowym lub szklanym. W przypadku stosowania różnych warunków, zabiegów lub linii komórkowych, należy rozmieścić miejsca ich zasiewu homogenicznie na płytce, aby zminimalizować efekt brzegowy. Następnie w studzience B01 należy zasiać kolejne 8 do 10 000 komórek, które posłużą do regulacji ostrości.Następnie wypełnij puste zewnętrzne studzienki pożywką, aby zmini

cellular-redox-profiling-using-high-content-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Poziom reaktywnych form tlenu wzrasta, gdy komórki znajdują się w warunkach stresowych. Przedstawiamy tutaj przykład barwienia 3',3'-diaminobenzydyną oraz znakowania cysTMT i spektrometrii mas w celu profilowania proteomu redoks w liściach pomidora traktowanych Pseudomonas syringae.

Profilowanie proteomu redoks grup tiolowych z wykorzystaniem spektrometrii mas z tagowaniem izotopowym

Źródło: Katsalifis, A., et al. Obrazowanie na żywo mitochondrialnego stanu redoks glutationu w neuronach pierwotnych przy użyciu wskaźnika ratiometrycznego. J. Vis. Exp. (2021)Ten film pokazuje obrazowanie mitochondrialnego stanu redoks w neuronach pierwotnych przy użyciu ratiometrycznego wskaźnika fluorescencyjnego. Stosując dwie długości fal wzbudzenia pod mikroskopem fluorescencyjnym, mierzy się współczynnik intensywności fluorescencji w celu oceny utleniania mitochondriów. Protokół obejmuje...

Obrazowanie mitochondrialnego stanu redoks w neuronach pierwotnych za pomocą wskaźnika ratiometrycznego

Ten manuskrypt opisuje użycie genetycznie kodowanych reporterów fluorogenicznych w zastosowaniu obrazowania żywych komórek do badania stresu oksydacyjnego wywołanego ksenobiotykami. To eksperymentalne podejście oferuje niezrównaną rozdzielczość czasoprzestrzenną, czułość i swoistość, unikając jednocześnie wielu niedociągnięć konwencjonalnych metod stosowanych do wykrywania toksykologicznego stresu oksydacyjnego.

Obrazowe podejścia do oceny toksykologicznego stresu oksydacyjnego przy użyciu genetycznie kodowanych czujników fluorogennych

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania całkowitej komórkowej reaktywnej formy tlenu (ROS) za pomocą dioctanu 2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny (DCFH-DA). Ta metoda może wizualizować komórkową lokalizację ROS w przylegających komórkach za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i określać ilościowo intensywność ROS za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych. Ten protokół jest prosty, wydajny i opłacalny.

Wykrywanie całkowitych reaktywnych form tlenu w przylegających komórkach za pomocą barwienia dioctianem 2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny

Ten protokół opisuje ocenę statusu redoks specyficznego dla kompartmentu subkomórkowego w komórce. Wrażliwa na redoks sonda fluorescencyjna umożliwia wygodną analizę ratiometryczną w nienaruszonych komórkach.

Ocena utleniania komórkowego przy użyciu subkomórkowego białka zielonej fluorescencji wrażliwego na redoks specyficznego dla przedziału subkomórkowego

Opisujemy protokoły pomiaru pH, zdarzeń oksydacyjnych i trawienia białek w poszczególnych makropinosomach w żywych komórkach. Nacisk kładziony jest na mikroskopię ratiometryczną z podwójnym fluoroforem i zalety, jakie oferuje w porównaniu z technikami populacyjnymi.

Pomiar pH, chemii redoks i zdolności degradacyjnej makropinosomów za pomocą mikroskopii ratiometrycznej z podwójnym fluoroforem

Ten artykuł opisuje protokół do określania różnic w podstawowym stanie redoks i redoks odpowiedzi na ostre perturbacje w pierwotnych neuronach hipokampa i kory mózgowej za pomocą konfokalnej mikroskopii na żywo. Protokół może być stosowany do innych typów komórek i mikroskopów przy minimalnych modyfikacjach.

Obrazowanie na żywo mitochondrialnego stanu redoks glutationu w neuronach pierwotnych przy użyciu wskaźnika ratiometrycznego

Ten protokół opisuje obrazowanie fluorescencyjne i analizę endogennych koenzymów metabolicznych, zredukowanego dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (fosforanu) (NAD(P)H) i utlenionego dinukleotydu flawinoadeninowego (FAD). Obrazowanie autofluorescencyjne NAD(P)H i FAD zapewnia bezznacznikową, nieniszczącą metodę oceny metabolizmu komórkowego.

Obrazowanie autofluorescencyjne w celu oceny metabolizmu komórkowego

Tutaj proponujemy usystematyzowany, dostępny i powtarzalny protokół do wykrywania komórkowych reaktywnych form tlenu (ROS) za pomocą sondy dioctanu 2′,7′-dichlorofluoresceiny (DCFH-DA) w komórkach glejowych Müllera (MGC). Ta metoda określa ilościowo całkowite komórkowe poziomy ROS za pomocą cytometru przepływowego. Ten protokół jest bardzo łatwy w użyciu, odpowiedni i powtarzalny.

Kwantyfikacja reaktywnych form tlenu za pomocą sondy dioctanu 2′,7′-dichlorofluoresceiny i cytometrii przepływowej w komórkach glejowych Müllera

Ten protokół opisuje nowatorską metodę ilościowego oznaczania wewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu (ROS) przy użyciu dihydroetydydy (DHE) jako sondy barwnika fluorescencyjnego przy użyciu wysokoprzepustowego podejścia przesiewowego. W protokole opisano metody oceny ilościowej wewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu (ROS) w trzech różnych liniach komórkowych raka wątrobowokomórkowego.

Wysokoprzepustowa ocena przesiewowa wytwarzania reaktywnych form tlenu (ROS) przy użyciu barwnika fluorescencyjnego Dihydroethidium (DHE)

Korzystając z platformy multimodalnej łączącej metody obrazowania optycznego bez znaczników, opracowaliśmy protokół do wizualizacji i ilościowego określania dynamiki komórkowej i metabolizmu. Dzięki obrazowaniu za pomocą fluorescencji wielofotonowej, generowania drugiej harmonicznej i wymuszonej mikroskopii rozpraszania Ramana możemy uzyskać całościowy przegląd środowiska komórkowego i molekularnego.

Multimodalna platforma obrazowania optycznego do badania metabolizmu komórkowego

Poznaj metodę profilowania redoks w żywych komórkach przywierających przy użyciu mikroskopii o wysokiej zawartości. Jednocześnie mierzy poziomy ROS i morfofunkcję mitochondriów w tej samej komórce.

Profilowanie redoks komórkowe przy użyciu mikroskopii o wysokiej zawartości

Przeglądaj więcej filmów