Profilowanie redoks komórkowe przy użyciu mikroskopii o wysokiej zawartości

Ogólnym celem tej metody opartej na mikroskopii wysokotreściowej (high-content microscopy) jest jednoczesna kwantyfikacja morfofunkcji mitochondriów oraz komórkowych poziomów reaktywnych form tlenu, aby stworzyć wiarygodny profil redox dla linii komórkowych poddanych różnym perturbacjom eksperymentalnym. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii redox, takie jak to, czy warunki patogenne lub traktowanie związkami wywołują stres oksydacyjny oraz w jakim stopniu wpływają one na formę i funkcję mitochondriów. Główną zaletą tej techniki jest możliwość pomiaru wszystkich parametrów w tej samej komórce w tym samym czasie.

Aby rozpocząć procedurę, należy zasiać od 8 do 10 000 ludzkich fibroblastów skóry w 60 wewnętrznych studzienkach czarnej płytki 96-dołkowej z ciennym, ciągłym dnem polistyrenowym lub szklanym. W przypadku stosowania różnych warunków, zabiegów lub linii komórkowych, należy rozmieścić miejsca ich zasiewu homogenicznie na płytce, aby zminimalizować efekt brzegowy. Następnie w studzience B01 należy zasiać kolejne 8 do 10 000 komórek, które posłużą do regulacji ostrości.

Następnie wypełnij puste zewnętrzne studzienki pożywką, aby zminimalizować gradienty między studzienkami a otoczeniem. Delikatnie stuknij płytkę trzy razy przed ponownym umieszczeniem jej w inkubatorze, aby zapobiec wzrostowi komórek w skupiskach. Hoduj komórki przez 24 godziny lub do momentu osiągnięcia przez nie 70% konfluencji.

Następnie zapisz informacje o traktowaniu w eksperymencie w arkuszu kalkulacyjnym o nazwie setup. Aby przygotować mikroskop, najpierw skalibruj stolik XY za pomocą oprogramowania. Następnie, przy użyciu oprogramowania do akwizycji, stwórz protokół obrazowania dla płytki wielodołkowej.

Niniejszy protokół umożliwia automatyczne pozyskiwanie obrazów z określonych pozycji oraz wybranych dołków płytki 96-dołkowej. Następnie należy wybrać odpowiedni typ płytki wielodołkowej z listy dostępnych płytek dostarczonych w oprogramowaniu. Alternatywnie można zdefiniować format płytki wielodołkowej, określając wymiary płytki i dołków.

Następnie wyrównaj płytkę pomiarową, definiując dwa narożniki z czterech zewnętrznych studzienek narożnych. Po tym wyborze zaznacz studzienki, z których należy pobrać dane, i zdefiniuj protokół akwizycji polegający na sekwencyjnym pomiarze długości fal. Upewnij się, że w pierwszej kolejności ustawiony jest kanał GFP.

Następnie zdefiniuj pętlę dla płytki wielodołkowej, aby pozyskać cztery regularnie rozmieszczone, niezakładające się obrazy zlokalizowane wokół centrum każdego z wybranych dołków, korzystając z określonego protokołu akwizycji. Na tym etapie przygotuj roztwór barwiący dla 60 dołków, dodając roztwory stokowe CM-H2DCFDA oraz TMRM do buforu HBSS HEPES. Następnie usuń pożywkę hodowlaną z komórek, odwracając płytkę do góry dnem jednym płynnym ruchem.

Komórki należy delikatnie przemyć dwukrotnie buforem HH. Nie pomijaj studzienki A01 z komórkami używanymi do regulacji ostrości. Bufor HH należy odpirować pomiędzy poszczególnymi etapami płukania.

Następnie należy obciążyć komórki barwnikami CM-H2DCFDA i TMRM, dodając 100 µl roztworu barwiącego do każdej studzienki. Ponownie, nie zapomnijcie o studzience A01. Inkubować komórki przez 25 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.

Po 25 minutach przemyj komórki dwukrotnie 100 µl buforu HH i dodaj 100 µl buforu HH do wszystkich 60 wewnętrznych studzienek. Aby przeprowadzić właściwy pomiar, umieść płytkę w mikroskopie. Następnie włącz sprzętowy system autofokusa i dostrój przesunięcie autofokusa (autofocus offset), korzystając ze studzienki B01 i kanału TMRM, aż uzyskasz ostry obraz.

Następnie przeprowadź protokół obrazowania. Uzyskany zestaw danych obrazowych dostarczy informacji o podstawowych poziomach ROS, potencjale błony mitochondrialnej oraz morfologii mitochondriów. Dalej, aby zmierzyć indukowane poziomy ROS, ostrożnie wyjmij płytkę 96-dołkową z mikroskopu.

Do każdej studzienki dodaj 100 µL roztworu TBHP o stężeniu 40 µM i odczekaj co najmniej trzy minuty, aby umożliwić całkowitą reakcję TBHP z CM-H2DCFDA. W tym czasie dodaj 100 µL roboczego roztworu przeciwciał do studzienki A01. Następnie ponownie umieść płytkę na mikroskopie i ponownie sprawdź ostrość, korzystając ze studzienki B01.

Następnie obrazuj te same pozycje co w pierwszej rundzie, stosując ten sam protokół obrazowania. Otrzymany zestaw danych obrazowych dostarczy informacji o indukowanych poziomach ROS. W następnym kroku wykonaj obrazy pola płaskiego w studzience A01.

Należy upewnić się, że sygnały znajdują się w pełnym zakresie dynamicznym, regulując ustawienia akwizycji. Następnie wyeksportować pozyskane zestawy danych do jednego folderu jako oddzielne pliki TIFF, stosując ustandaryzowaną nomenklaturę.

Obejmuje to odniesienie do płytki, stan przed lub po traktowaniu TBHP, studzienkę, pole oraz kanał, oddzielone podkreślnikami. Ponadto należy zapisać obrazy pola płaskiego w tym samym folderze jako oddzielne pliki TIFF, stosując ustandaryzowaną nomenklaturę. Na tym etapie należy otworzyć oprogramowanie do przetwarzania obrazów i zainstalować zestaw makr redox metrics.

Następnie otwórz interfejs konfiguracji, aby ustawić parametry analizy, klikając przycisk S. Wybierz typ obrazu, liczbę kanałów oraz dołek, który został wykorzystany do pozyskania obrazów pola płaskiego. Po tym kroku wskaż, który kanał zawiera komórki lub mitochondria.

Zaznacz pola wyboru „background” oraz „enhance”, aby odpowiednio przeprowadzić odejmowanie tła oraz adaptacyjną ekwalizację histogramu z ograniczonym kontrastem. Następnie zdefiniuj wartość sigma dla rozmycia Gaussa komórek oraz dla wzmocnienia Laplacjana mitochondriów. Wybierz algorytm automatycznego progowania i wprowadź granice wykluczania wielkości.

Następnie przetestuj ustawienia segmentacji na kilku wybranych obrazach z pozyskanych zestawów danych, otwierając je i klikając przyciski C lub M w menu w celu segmentacji odpowiednio komórek lub mitochondriów. Po tym wykonaj analizę wsadową wybranego folderu, klikając przycisk z symbolem kratki i wybierając folder z obrazami. Zweryfikuj ustawienia i zatwierdź je przyciskiem OK.

Po analizie wsadowej należy wizualnie zweryfikować wydajność segmentacji na stosie weryfikacyjnym, klikając przycisk V i wybierając folder z obrazami. Przejrzyj stos weryfikacyjny, aby potwierdzić, czy segmentacja przebiegła pomyślnie. Wstępna analiza wyekstrahowanych danych jest wykonywana automatycznie za pomocą bezpłatnej aplikacji Shiny.

Umożliwia to szybką interpretację wyników. Aby rozpocząć, otwórz aplikację w programie R Studio. Wybierz opcję uruchomienia w zewnętrznej przeglądarce.

Na stronie wejściowej należy wybrać katalog, w którym znajdują się pliki z wynikami. Upewnij się, że w tym samym katalogu znajduje się również plik konfiguracyjny. Pliki z wynikami oraz informacje konfiguracyjne zostaną automatycznie zaimportowane, skompilowane i zwizualizowane.

Strona z konfiguracją eksperymentu przedstawia układ doświadczenia. Kolejna strona wyświetla poziomy ROS oraz kilka parametrów mitochondrialnych dla każdej płytki osobno. Wybierz płytkę, którą chcesz zwizualizować, korzystając z menu rozwijanego.

Dane są przedstawione w formacie płytki wielodołkowej, a także na wykresach pudełkowych z wartościami odstającymi oznaczonymi numerem dołka i obrazu. Strona z wynikami całego eksperymentu prezentuje znormalizowane wyniki ze wszystkich połączonych płytek wraz z podstawową analizą statystyczną. Jeśli za pośrednictwem strony wejściowej zostanie dostarczony plik z wykluczeniami, określone punkty danych zostaną pominięte.

Na stronie analizy skupień tworzony jest czuły profil redox z wykorzystaniem głównej składowej oraz analizy danych z pięciu parametrów. Na koniec strona pobierania danych umożliwia zapisanie przetworzonych i uporządkowanych danych do dalszego wykorzystania. Przedstawione tutaj wyniki pochodzą z eksperymentu, w którym ludzkie fibroblasty skóry właściwej zostały poddane działaniu inhibitora proteazy HIV Saquinavir.

Stosując opisany protokół, stwierdzono istotny wzrost poziomu ROS zarówno w stanie spoczynkowym, jak i indukowanym, w porównaniu z komórkami kontrolnymi traktowanymi DMSO. Sakwinawir znacząco wpłynął również na morfofunkcję mitochondriów.

Potencjał błony mitochondrialnej, mierzony jako średni sygnał TMRM na piksel mitochondrialny, uległ znacznemu zwiększeniu. Ponadto mitochondria przyjęły silnie pofragmentowany wzorzec, co ilościowo wykazano poprzez wyższą kolistość oraz mniejszy średni rozmiar poszczególnych mitochondriów. Po połączeniu wyżej wymienionych parametrów za pomocą analizy głównych składowych, zarówno warunki kontrolne, jak i traktowanie Saquinavirem mogły zostać wyraźnie od siebie oddzielone na podstawie ich sygnatur redoks.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że samo naświetlanie wywołuje stres oksydacyjny. W związku z tym czas ekspozycji powinien być zminimalizowany i utrzymany na stałym poziomie przez cały eksperyment. Po opanowaniu tej metody, w ciągu jednego dnia można przeprowadzić barwienie i akwizycję obrazów dla maksymalnie 20 płytek 96-dołkowych.

Po drugiej rundzie obrazowania komórki mogą zostać utrwalone i wykorzystane do późniejszego barwienia immunofluorescencyjnego. Zwiększa to liczbę mierzonych parametrów w tych samych komórkach i pozwala na udzielenie odpowiedzi na dodatkowe pytania. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie przeprowadzić połączone pomiary ROS i morfofunkcji mitochondriów w adherentnych kulturach komórkowych z wykorzystaniem mikroskopii wysokotreściowej.