Profilowanie redoks komórkowe przy użyciu mikroskopii o wysokiej zawartości

Ogólnym celem tej metody opartej na mikroskopii o wysokiej zawartości jest jednoczesne ilościowe określenie morfofunkcji mitochondriów i poziomów komórkowych reaktywnych form tlenu, aby ustalić solidny redoks odcisk palca dla linii komórkowych narażonych na różne perturbacje eksperymentalne. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w biologii redoks, takie jak to, czy stany chorobotwórcze lub leczenie złożone wywołują stres oksydacyjny oraz w jakim stopniu wpływa to na formę i funkcję mitochondriów. Główną zaletą tej techniki jest to, że wszystkie parametry mogą być mierzone w tej samej komórce w tym samym czasie.

Aby rozpocząć procedurę, należy wysiać od ośmiu do 10 000 ludzkich fibroblastów skórnych w 60 wewnętrznych dołkach czarnej 96-dołkowej płytki z cienkim ciągłym dnem z polistyrenu lub szkła. W przypadku stosowania różnych warunków, zabiegów lub linii komórkowych, należy równomiernie rozmieścić ich miejsca siewu na płytce, aby zminimalizować efekty płytki. Następnie zasiaj kolejne osiem do 10 000 komórek w studzience B01, aby użyć ich do regulacji ostrości.

Następnie wypełnij puste dołki zewnętrzne podłożem, aby zminimalizować gradienty między studzienkami a otoczeniem. Delikatnie postukaj w płytkę trzy razy przed umieszczeniem jej z powrotem w inkubatorze, aby uniknąć wzrostu komórek w płatach. Hoduj komórki przez 24 godziny lub do momentu, gdy osiągną 70% konfluencji.

Następnie zapisz informacje o leczeniu dla eksperymentu w arkuszu kalkulacyjnym o nazwie konfiguracja. Aby skonfigurować mikroskop, najpierw skalibruj stolik XY za pomocą oprogramowania. Następnie utwórz protokół obrazowania dla płytki wielodołkowej za pomocą oprogramowania do akwizycji.

Protokół ten umożliwia automatyczne pobieranie zadanych pozycji i wybranych dołków płytki 96-dołkowej. Teraz wybierz odpowiedni typ płytki wielodołkowej z listy dostępnych płytek dostępnych w oprogramowaniu. Alternatywnie można zdefiniować format płytki wielodołkowej za pomocą wymiarów płytki i studzienki.

Następnie wyrównaj płytę studzienki, definiując dwa narożniki z czterech zewnętrznych rowków narożnych. Następnie wybierz studnie, które należy pozyskać, i zdefiniuj protokół akwizycji składający się z sekwencyjnej akwizycji długości fali. Upewnij się, że kanał GFP jest ustawiony jako pierwszy.

Następnie zdefiniuj pętlę płytki studziennej, aby uzyskać cztery regularnie rozmieszczone, nie nakładające się na siebie obrazy umieszczone wokół środka każdej wybranej studni przy użyciu zdefiniowanego protokołu akwizycji. Na tym etapie przygotuj roztwór barwiący na 60 studzienek, dodając CM-H2DCFDA i roztwór podstawowy TMRM do buforu HBSS HEPES. Następnie wyrzuć pożywkę hodowlaną z komórek, obracając płytkę do góry nogami jednym płynnym ruchem.

Delikatnie umyj komórki dwukrotnie buforem HH. Nie zapomnij dobrze A01 z komórkami używanymi do regulacji ostrości. Wyrzuć bufor HH pomiędzy etapami mycia.

Następnie załaduj komórki CM-H2DCFDA i TMRM, dodając 100 mikrolitrów roztworu barwiącego do każdej studzienki. Ponownie, nie zapomnij o A01. Inkubować komórki przez 25 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.

Po 25 minutach przemyj komórki dwukrotnie 100 mikrolitrami buforu HH i dodaj 100 mikrolitrów buforu HH do wszystkich 60 studzienek wewnętrznych. Aby wykonać rzeczywisty pomiar, zainstaluj płytkę na mikroskopie. Następnie włącz sprzętowy system autofokusa i dostosuj przesunięcie autofokusa za pomocą dobrze B01 i kanału TMRM, aż uzyskasz ostry obraz.

Następnie uruchom protokół obrazowania. Uzyskany zestaw danych obrazowych dostarczy informacji na temat podstawowych poziomów ROS, potencjału błony mitochondrialnej i morfologii mitochondriów. Następnie, aby zmierzyć indukowane poziomy ROS, ostrożnie wyjmij 96-dołkową płytkę z mikroskopu.

Dodać 100 mikrolitrów roztworu TBHP o stężeniu 40 mikromolowym do każdej studzienki i odczekać co najmniej trzy minuty, aby umożliwić pełną reakcję TBHP z CM-H2DCFDA. W tym czasie dodać 100 mikrolitrów roztworu roboczego przeciwciała do studzienki A01. Teraz zamontuj płytkę z powrotem na mikroskopie i ponownie sprawdź ostrość, używając dobrze B01.

Następnie przyjmij te same pozycje, co w pierwszej rundzie obrazowania, korzystając z tego samego protokołu obrazowania. Wynikowy zestaw danych obrazowych dostarczy informacji o indukowanych poziomach ROS. Następnie uzyskaj obrazy płaskiego pola w dołku A01.

Upewnij się, że sygnały mieszczą się w zakresie dynamiki. Dostosowując ustawienia akwizycji. Następnie wyeksportuj pozyskane zestawy danych w jednym folderze jako pojedyncze pliki TIFF przy użyciu ustandaryzowanej nomenklatury.

Obejmuje to odniesienie do płytki, przed lub po leczeniu TBHP, studni, pola i kanału oddzielonych podkreśleniami. Obrazy płaskich pól można również zapisać w tym samym folderze, co poszczególne pliki TIFF, korzystając ze standardowej nomenklatury. W tym kroku otwórz oprogramowanie do przetwarzania obrazu i zainstaluj makrozestaw metryk redoks.

Następnie otwórz interfejs konfiguracji, aby skonfigurować ustawienia analizy, klikając przycisk S. Wybierz typ obrazu, liczbę kanałów i studnię, która została użyta do uzyskania obrazów płaskiego pola. Następnie wskaż, który kanał zawiera komórki lub mitochondria.

Zaznacz pola wyboru tła i wzmocnienia, aby odpowiednio wykonać odejmowanie tła i adaptacyjne wyrównanie histogramu z ograniczonym kontrastem. Następnie zdefiniuj sigma dla gaussowskiego i rozmycia komórek oraz laplace'owskiego wzmocnienia mitochondriów. Wybierz algorytm automatycznego progowania i wypełnij limity wykluczania rozmiaru.

Następnie przetestuj ustawienia segmentacji na kilku wybranych obrazach pozyskanych zestawów danych, otwierając je i klikając przyciski C lub M w menu, aby odpowiednio segmentować komórki lub mitochondria. Następnie z analizy wsadowej w interesującym Cię folderze, klikając przycisk skrótu i wybierając folder z obrazami. Sprawdź ustawienia i naciśnij OK.

Po analizie wsadowej zweryfikuj wizualnie wydajność segmentacji na stosie weryfikacyjnym, klikając przycisk V i wybierając folder z obrazami. Przejrzyj stos weryfikacyjny, aby potwierdzić, czy segmentacja się powiodła. Wstępna analiza wyodrębnionych danych odbywa się automatycznie za pomocą bezpłatnej aplikacji Shiny.

Pozwala to na szybką interpretację wyników. Aby rozpocząć, otwórz aplikację w programie R Studio. Wybierz, aby uruchomić go w zewnętrznej przeglądarce.

Na stronie wejściowej wybierz katalog, w którym znajdują się pliki wynikowe. Upewnij się, że plik instalacyjny znajduje się również w tym katalogu. Pliki wynikowe i informacje konfiguracyjne są automatycznie importowane, kompilowane i wizualizowane.

Na stronie konfiguracji eksperymentu jest wyświetlany układ eksperymentu. Następna strona wyświetla poziomy ROS, a także kilka parametrów mitochondrialnych dla każdej płytki z osobna. Wybierz płytę, którą chcesz zwizualizować, korzystając z menu rozwijanego.

Dane są wyświetlane w formacie płytki wielodołkowej, a także na wykresach pudełkowych z wartościami odstającymi oznaczonymi numerem dołka i obrazu. Strona z wynikami całego eksperymentu pokazuje znormalizowane wyniki ze wszystkich płytek łącznie, wraz z podstawową analizą statystyczną. Jeśli plik upuszczania zostanie dostarczony za pośrednictwem strony wejściowej, określone punkty danych zostaną wykluczone.

Na stronie analizy skupień poufny profil redoks jest tworzony przy użyciu głównego składnika i analizy danych z pięciu parametrów. Wreszcie, strona pobierania danych umożliwia zapisanie przetworzonych i przegrupowanych danych do dalszego wykorzystania. Poniżej przedstawiono wyniki eksperymentu, w którym ludzkie fibroblasty skóry były leczone inhibitorem proteazy HIV Saquinavirem.

Korzystając z opisanego protokołu, wykryto znaczny wzrost zarówno podstawowego, jak i indukowanego poziomu ROS. W porównaniu z komórkami kontrolnymi, leczonymi DMSO. Sakwinawir wpływał również znacząco na morfoczynność mitochondriów.

Potencjał błony mitochondrialnej mierzony jako średni sygnał TMRM na piksel mitochondrialny znacznie wzrósł. Ponadto mitochondria uzyskały wysoce rozdrobniony wzór, na co ilościowo wskazuje wyższa kolistość i mniejsza średnia wielkość poszczególnych mitochondriów. Łącząc wyżej wymienione parametry za pomocą analizy składowych głównych, zarówno warunki kontrolne, jak i warunki sakwinawiru można wyraźnie oddzielić od siebie za pomocą odcisków palców redoks.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że samo oświetlenie powoduje stres utleniony. Dlatego warunki ekspozycji powinny być zminimalizowane i utrzymywane na stałym poziomie przez cały czas trwania eksperymentu. Po opanowaniu można wybarwić i pozyskać do 20 96-dołkowych płytek w ciągu jednego dnia.

Po drugiej rundzie obrazowania komórki można utrwalić i wykorzystać do dalszego barwienia immunofluorescencyjnego. Zwiększa to liczbę mierzonych parametrów na dokładnie tych samych ogniwach i pozwala na udzielenie odpowiedzi na dodatkowe pytania. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie wykonać połączone pomiary ROS i morfofunkcji mitochondriów w przylegających hodowlach komórkowych przy użyciu mikroskopii o wysokiej zawartości.