Name: Model epileptogenezy w organotypowych kulturach warstwowych kory nosa i hipokampa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Poznaj model epileptogenezy w organotypowych kulturach warstwowych kory nosa i hipokampa szczura. Ta metoda pozwala monitorować dynamikę aktywności epileptycznej oraz postęp neurozapalenia w czasie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Jednostce Bioobrazowania Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes, za wszystkie sugestie dotyczące pozyskiwania obrazów.
Ten projekt otrzymał dofinansowanie z programu Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań i innowacji na podstawie umowy o grant nr 952455, Fundação para a Ciênciae Tecnologia (FCT) w ramach projektu PTDC/MEDFAR/30933/2017 oraz Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa.

Wszystkie procedury dotyczące ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych były zgodne z prawem portugalskim oraz wytycznymi Unii Europejskiej (2010/63/UE). Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucyjny Organ ds. Dobrostanu Zwierząt iMM (ORBEA-iMM) oraz krajowy organ właściwy (DGAV – Direção Geral de Alimentação e Veterinária).
1. Przygotowanie skrawków kory nosowej i hipokampa
UWAGA: Przygotowanie skrawków kory nosowej i hipokampa wykorzystuje szczury Sprague-Dawley w wieku P6-7.
<ol>
	<li>Przygotowanie hodowli i pożywek
	<ol>
		<li>W dniu poprzedzającym hodowlę przygotować wymagane pożywki i przechowywać je w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotować pożywkę do mikrodysekcji: 25 mM glukozy w zrównoważonym roztworze soli Geya (GBSS).</li>
		<li>Przygotować pożywkę hodowlaną: 50% Opti-MEM, 25% HBSS, 25% surowicy konia (HS), 25 mM glukozy, 30 µg/mL gentamycyny.</li>
		<li>Przygotować pożywkę utrzymującą: Neurobasal-A (NBA), 2% B27, 1 mM L-glutaminy, 30 µg/mL gentamycyny, HS (15%, 10%, 5% i 0%).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie mózgu
	<ol>
		<li>Bezpośrednio przed rozpoczęciem hodowli dodać 1,1 mL pożywki hodowlanej do każdego dołka płytki 6-dołkowej za pomocą pipety P100 i ogrzać do 37 °C.</li>
		<li>Umieścić cały sprzęt (mikroskop do mikrodysekcji, przecinarkę do tkanek, lampę do mikrodysekcji, narzędzia do mikrodysekcji, elektrody, płytki, inserty i papierki filtracyjne) w komorze z laminarnym przepływem powietrza i sterylizować światłem UV przez 15 minut.</li>
		<li>Ustawić grubość skrawków na 350 µm.</li>
		<li>Wyjąć GBSS z lodówki. Dodać 5 mL GBSS do sześciu szalek Petriego. Na każde zwierzę wymagane będą sześć szalek Petriego.</li>
		<li>Eutanazować młode szczura. Przeprowadzić dekapitację za pomocą ostrych nożyczek u podstawy pnia mózgu zwierzęcia.</li>
		<li>Przemyć głowę zwierzęcia trzykrotnie w zimnym GBSS i przenieść do komory bezpieczeństwa.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja tkanki i przygotowanie skrawków
	<ol>
		<li>Mocno wsunąć ostre pęsety w oczodoły, aby unieruchomić głowę.</li>
		<li>Używając cienkich nożyczek, rozciąć skórę/owłosienie wzdłuż linii środkowej, zaczynając od otworu potylicznego w kierunku płatów czołowych i odsunąć ją na bok.</li>
		<li>W ten sam sposób rozciąć czaszkę oraz wzdłuż poprzecznej szczeliny mózgowej (przestrzeń między mózgowiem a móżdżkiem). Za pomocą długich zakrzywionych pęset rozsunąć tkanki.</li>
		<li>Usunąć cebulki węchowe za pomocą szpatułki. Wyjąć mózg z głowy i umieścić go w lodowatym GBSS powierzchnią grzbietową do góry (Ryc. 1A).</li>
		<li>Wsunąć cienką pęsetę w móżdżek i prowadzić szpatułką wzdłuż linii środkowej, bardzo ostrożnie rozwierając każdą półkulę (Ryc. 1B).</li>
		<li>Krótką zakrzywioną pęsetą ostrożnie usunąć nadmiar tkanki pokrywającej hipokampy, nie dotykając struktury hipokampa. Następnie szpatułką wyciąć tkankę poniżej każdego hipokampa (Ryc. 1C).</li>
		<li>Podnieść jedną półkulę i położyć ją hipokampem do góry na papierku filtracyjnym. Powtórzyć procedurę z drugą półkulą i położyć ją równolegle do pierwszej na papierku filtracyjnym. Położyć papirek filtracyjny na przecinarce do tkanek, tak aby półkule były prostopadłe do ostrza, i pociąć półkule na skrawki o grubości 350 μm (Ryc. 1D).</li>
		<li>Przenieść pociętą tkankę do szalki Petriego z zimnym GBSS (Ryc. 1E).</li>
		<li>Ostrożnie rozdzielić skrawki za pomocą elektrod z okrągłą końcówką (Ryc. 1F). Zachować tylko skrawki ze strukturalnie nienaruszoną korą rynalną i hipokampem. Obszary DG i CA powinny być wyraźnie zdefiniowane, podobnie jak kora entorynalna i peryrynalna (Ryc. 1G).</li>
		<li>Umieścić każdy skrawek na insercie (Ryc. 1H-I) za pomocą szpatułki i elektrody z okrągłą końcówką. Usunąć nadmiar pożywki do mikrodysekcji wokół każdego skrawka za pomocą pipety P20 (Ryc. 1J). W jednym insercie można hodować cztery skrawki kory rynalnej i hipokampa (Ryc. 1K).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrzymanie hodowli
	<ol>
		<li>Wymieniać pożywkę co drugi dzień.</li>
		<li>Ogrzać pożywkę do 37 °C.</li>
		<li>Wyjąć płytki z inkubatora. Podnieść każdy insert, trzymając pęsetą za plastikową krawędź (Ryc. 1L).</li>
		<li>Drugą ręką odessać pożywkę z dołka. Włożyć insert z powrotem dołka i dodać 1 mL świeżej, ogrzanej pożywki za pomocą pipety P10 (Ryc. 1M). Powtórzyć dla wszystkich insertów. Upewnić się, że między membraną a pożywką nie uwięzły pęcherzyki powietrza.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
UWAGA: Przetoki o charakterze epileptycznym poddawane są stopniowej i kontrolowanej deprywacji surowicy w medium. Od 9. dnia in vitro (DIV) przetoki są utrzymywane w NBA bez HS14.
<img alt="Przygotowanie preparatów tkankowych i hodowli organów, metoda krok po kroku w serii eksperymentów laboratoryjnych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61330/61330fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Szczegółowa procedura przygotowania organotypowych skrawków kory nosowej i hipokampa. (A) Wyjąć mózg z głowy i umieścić go w lodowatym roztworze GBSS stroną grzbietową do góry. (BWprowadzić pęsetę do móżdżku. Rozciąć mózg wzdłuż linii środkowej i usunąć nadmiar tkanki nad hipokampem.C) Za pomocą szpatułki należy przeciąć tkankę poniżej hipokampa, zgodnie ze wskazaniem strzałek. (D) Umieść oba hipokampy stroną górną do góry, równolegle do siebie na papierze filtracyjnym i przetnij 350 µm przekroje na przecinarce do tkanek. (E) Umieścić przekrojony hipokamp w schłodzonym do temperatury lodowej roztworze GBSS. (F) Oddzielić plastry za pomocą szklanych elektrod z zaokrąglonymi końcami. (GWybierz wyłącznie te przekroje, które przedstawiają nienaruszoną korę nosową oraz hipokamp.H, I) Za pomocą szklanej elektrody o zaokrąglonym zakończeniu przesuń każdy plasterek do szpatułki i umieść go w insertcie. (J) Usuń GBSS otaczający skibek. (K) Umieść po cztery plasterki w każdym wkładzie. (LAby wymienić medium, należy podnieść insert i odessać medium za pomocą pipety szklanej.M) Dodać świeżą pożywkę, umieszczając pipetę pomiędzy wkładem a ściankami płytki 6-dołkowej. Należy upewnić się, że pod plastrami nie znajdują się pęcherzyki powietrza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61330/61330fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
2. Rejestracje elektrofizjologiczne
UWAGA: Rejestracje elektrofizjologiczne przeprowadzono na organotypowych skrawkach kory rynej i hipokampa w 7, 14 i 21 DIV w komorze typu interface. Rejestracje wykonano za pomocą wzmacniacza, a następnie zdigitalizowano i przeanalizowano przy użyciu oprogramowania. Wszystkie sygnały zostały poddane filtracji pasmowej (ośmiobiegunowy filtr Bessela przy 60 Hz oraz filtr Gaussa przy 60 Hz).
<ol>
	<li>Przygotowanie aparatury
	<ol>
		<li>Przygotować 50 mL pożywki NBA z dodatkiem 1 mL B27 oraz 250 μL L-Glutaminy. Podgrzać do 37 °C.</li>
		<li>Konfigurować układ elektrofizjologiczny w obiegu zamkniętym. Zweryfikować, czy szybkość przepływu wynosi 2 mL/min.</li>
		<li>Otworzyć zawór z mieszanką gazową (5% CO2/95% O2) i sprawdzić poziom wody w systemie.</li>
		<li>Umieścić papier filtracyjny w komorze rejestracyjnej typu interface w celu odprowadzenia nadmiaru pożywki oraz papier do czyszczenia soczewek pod ramką, aby dostarczyć pożywkę do skrawka.</li>
		<li>Włączyć kontroler temperatury, wzmacniacze oraz mikromanipulator.</li>
		<li>Pozostawić temperaturę w komorze interface do czasu stabilizacji na poziomie 37 °C przed rozpoczęciem rejestracji.</li>
		<li>Przygotować sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (aCSF: 124 mM NaCl, 3mM KCl, 1,2 mM NaH2PO4, 25 mM NaHCO3, 10 mM glukozy, 2 mM CaCl2, 1 mM MgSO4 o pH 7,4) i za pomocą strzykawki napełnić nim elektrodę szklaną. Umieścić ją w gnieździe elektrody odbiorczej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rejestracja aktywności spontanicznej
	<ol>
		<li>Po stabilizacji temperatury wyjąć płytkę z inkubatora i wyciąć jeden skrawek z insertu za pomocą bardzo ostrego ostrza. Umieścić go na płytce 60 mm z kroplą pożywki. Przenieść skrawek do komory rejestracyjnej typu interface.</li>
		<li>Umieścić skrawek w komorze interface tak, aby hipokamp znajdował się w prawym dolnym rogu. Umieścić elektrodę odbiorczą w warstwie komórek piramidalnych obszaru CA3.</li>
		<li>Przejść do protokołu ciągłej akwizycji i rejestrować sygnał przez 30 min.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza pobierania PI
UWAGA: Śmierć komórek oceniano poprzez monitorowanie wchłaniania przez komórki fluorescencyjnego barwnika jodku propidyny (PI). PI jest związkiem polarnym, który wnika do komórek z uszkodzonymi błonami komórkowymi i oddziałuje z DNA, emitując czerwoną fluorescencję (absorbancja 493 nm, emisja 630 nm). Ponieważ PI nie przenika do żywych komórek, jest on wykorzystywany do wykrywania martwych komórek w populacji.
<ol>
	<li>Inkubacja z PI
	<ol>
		<li>Przygotować w medium hodowlanym świeże rozcieńczenie zapasu PI w stosunku 1:10.</li>
		<li>W celu przeprowadzenia testu poboru PI wyjąć płytkę z inkubatora i ostrożnie podnieść wkład. Za pomocą pipety P20 dodać do medium 13 µL PI, aby uzyskać stężenie końcowe 2 µM. Przed ponownym umieszczeniem wkładu powoli potrząsnąć płytką. Upewnić się, że pod plastrami nie ma pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Umieścić plastry z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 2 h.</li>
		<li>Postępować zgodnie z protokołem immunohistochemii opisanym w następnej sekcji. Przykryć płytki aluminium, ponieważ PI jest światłoczułe.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Immunohistochemia
UWAGA: W badaniu immunohistochemicznym zastosowano przeciwciało specyficzne dla neuronów, a także przeciwciała umożliwiające rozróżnienie fenotypów spoczynkowych i reaktywnych mikrogleju oraz astrocytów, aby ocenić zakres obumierania neuronów i gliozy w organotypowych plastrach kory nosowej i hipokampa z indukowaną aktywnością przypominającą epilepsję.
<ol>
	<li>Fiksacja tkanki
	<ol>
		<li>Wyjąć płytkę z inkubatora i odessać medium. Przymocować skrawki za pomocą 4% paraformaldehydu (PFA) przez 1 h w RT, dodając 1 mL PFA pod i nad skrawkami za pomocą pipety P100.</li>
		<li>Usunąć PFA i dodać 1 mL PBS. Dodać również PBS pod i nad skrawkami.</li>
		<li>Przechowywać skrawki w 4 °C w PBS do czasu dalszego użycia. Zawsze owijać płytki parafilmem, aby zapobiec wysychaniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Etapy immunobarwienia
	<ol>
		<li>Przemyć dwukrotnie, po 10 min za każdym razem, za pomocą 1 mL PBS.</li>
		<li>Przygotować roztwór do permeabilizacji i blokowania zawierający 1% Triton-X10, 10% HS i 10% BSA w PBS. Przygotować roztwór 5% BSA.</li>
		<li>Narysować dwa prostokąty za pomocą pisaka hydrofobowego (Rycina 2A). Wyciąć skrawki z insertu (Rycina 2B) bardzo ostrym ostrzem. Umieścić dwa skrawki na każdym szkiełku (Rycina 2C) i nanieść 140 µL roztworu do permeabilizacji i blokowania na wierzch każdego skrawka, używając pipety P200. Inkubować przez 3 h w RT.</li>
		<li>Rozcieńczyć przeciwciała pierwotne do stężenia roboczego w 5% BSA w PBS. Inkubować z przeciwciałami pierwotnymi przez noc w 4 °C.</li>
		<li>Inkubować z przeciwciałami wtórnymi przez 4 h w RT. Od tego momentu chronić płytkę przed światłem, ponieważ pracuje się z fluoroforami.</li>
		<li>Nanieść kroplę 50 μL roztworu Hoechst na wierzch każdego skrawka i inkubować przez 20 min w RT.</li>
		<li>Przemywać pomiędzy inkubacjami. Zawsze przemywać trzykrotnie, po 10 min za każdym razem, za pomocą PBS-T.</li>
		<li>Usunąć Hoechst i przemyć zgodnie z zaleceniami.</li>
		<li>Nanieść 50 μL medium montującego na wierzch każdego skrawka. Przykryć szkiełkiem cover slip i zabezpieczyć lakierem do paznokci (Rycina 2D).</li>
		<li>Pozostawić do wyschnięcia w RT przez 24 h.</li>
		<li>Zwizualizować immunobarwienie pod mikroskopem konfokalnym. Przechowywać zabarwione skrawki w -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Proces chromatografii; schemat chromatografii cienkowarstwowej; etapy rozdziału substancji; konfiguracja aparatury laboratoryjnej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61330/61330fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Specyficzna procedura badania immunohistochemicznego. (A) Za pomocą pisaka hydrofobowego narysuj na szkiełku dwa kwadraty. (B) Wytnij fragment wkładki zawierający plasterek. (C) Umieść każdy plaster w kwadratach narysowanych hydrofobowym pisakiem i rozpocznij etap permeabilizacji/blokowania. (DPo zakończeniu protokołu należy zamontować skrawki w medium montażowym, przykryć je szkiełkiem nakrywkowym i zabezpieczyć brzegi lakierem do paznokci. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61330/61330fig02large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>

<ol><li>Fisher, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+stimulation+of+the+anterior+nucleus+of+thalamus+for+treatment+of+refractory+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">Electrical stimulation of the anterior nucleus of thalamus for treatment of refractory epilepsy.</a> Epilepsia. 51, 899-908 (2010).</li>
<li>Loscher, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+review+of+current+animal+models+of+seizures+and+epilepsy+used+in+the+discovery+and+development+of+new+antiepileptic+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Seizure%22%5BJournal%5D)">Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs.</a> Seizure. 20, 359-368 (2011).</li>
<li>Heinemann, U., Kann, O., Schuma, S. An overview of in vitro seizure models in acute and organotypic slices. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeinemann%2C+U+%22Models+of+seizures+and+epilepsy%22">Models of seizures and epilepsy</a>. Pitkänen, A., Schwartzkroin, P. A., Moshé, S. L. , Elsevier Academic Press. Cambridge. 35-44 (2006).</li>
<li>Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+cultures+as+tools+for+functional+screening+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%3A+Targets%22%5BJournal%5D)">Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS.</a> Drug Discovery Today: Targets. 10, 993-1000 (2005).</li>
<li>Holopainen, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+hippocampal+slice+cultures%3A+a+model+system+to+study+basic+cellular+and+molecular+mechanisms+of+neuronal+cell+death%2C+neuroprotection%2C+and+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemical+Research%22%5BJournal%5D)">Organotypic hippocampal slice cultures: a model system to study basic cellular and molecular mechanisms of neuronal cell death, neuroprotection, and synaptic plasticity.</a> Neurochemical Research. 30, 1521-1528 (2005).</li>
<li>Noraberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+hippocampal+slice+cultures+for+studies+of+brain+damage%2C+neuroprotection+and+neurorepair%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Neurological+Disorders+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair.</a> CNS Neurological Disorders Drug Targets. 4, 435-452 (2005).</li>
<li>Dyhrfjeld-Johnsen, J., Berdichevsky, Y., Swiercz, W., Sabolek, H., Staley, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interictal+spikes+precede+ictal+discharges+in+an+organotypic+hippocampal+slice+culture+model+of+epileptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Interictal spikes precede ictal discharges in an organotypic hippocampal slice culture model of epileptogenesis.</a> Journal of Clinical Neurophysiology. 27, 418-424 (2010).</li>
<li>Chong, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+Inflammation+Is+a+Potential+Anti-Epileptogenic+Target+in+the+Organotypic+Hippocampal+Slice+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Intrinsic Inflammation Is a Potential Anti-Epileptogenic Target in the Organotypic Hippocampal Slice Model.</a> Neurotherapeutics. 15, 470-488 (2018).</li>
<li>Li, Q., Han, X., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+hippocampal+slices+as+models+for+stroke+and+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Organotypic hippocampal slices as models for stroke and traumatic brain injury.</a> Molecular Neurobiology. 53 (6), 4226-4237 (2016).</li>
<li>Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+slices+as+models+for+neurodegenerative+disease+and+screening+platforms+to+identify+novel+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics.</a> Current Neuropharmacology. 5, 19-33 (2007).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: a review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
<li>Doussau, F., Dupont, J. L., Neel, D., Schneider, A., Poulain, B., Bossu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+cultures+of+cerebellar+slices+as+a+model+to+investigate+demyelinating+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Organotypic cultures of cerebellar slices as a model to investigate demyelinating disorders.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (10), 1011-1022 (2017).</li>
<li>Vismer, M. S., Forcelli, P. A., Skopin, M. D., Gale, K., Koubeissi, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+piriform%2C+perirhinal%2C+and+entorhinal+cortex+in+seizure+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">The piriform, perirhinal, and entorhinal cortex in seizure generation.</a> Frontiers in Neural Circuits. 9, 27(2015).</li>
<li>Magalhães, D. M., Pereira, N., Rombo, D. M., Beltrão-Cavacas, C., Sebastião, A. M., Valente, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+model+of+epilepsy+in+organotypic+slices+-+a+new+tool+for+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Ex vivo model of epilepsy in organotypic slices - a new tool for drug screening.</a> Journal of Neuroinflammation. 15, 203(2018).</li>
<li>Ravizza, T., Balosso, S., Vezzani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+prevention+of+epileptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Inflammation and prevention of epileptogenesis.</a> Neuroscience Letters. 497 (3), 223-230 (2011).</li>
<li>Liddelow, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotoxic+reactive+astrocytes+are+induced+by+activated+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurotoxic reactive astrocytes are induced by activated microglia.</a> Nature. 541, 481-487 (2017).</li>
<li>Wu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+C3+is+activated+in+human+AD+brain+and+is+required+for+neurodegeneration+in+mouse+models+of+amyloidosis+and+tauopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Complement C3 is activated in human AD brain and is required for neurodegeneration in mouse models of amyloidosis and tauopathy.</a> Cell Reports. 28 (8), 2111-2123 (2019).</li>
<li>Hartmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+3%2B-astrocytes+are+highly+abundant+in+prion+diseases%2C+but+their+abolishment+led+to+an+accelerated+disease+course+and+early+dysregulation+of+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Complement 3+-astrocytes are highly abundant in prion diseases, but their abolishment led to an accelerated disease course and early dysregulation of microglia.</a> Acta Neuropathologica Communications. 7, 83(2019).</li>
<li>Nilsson, U. R., Funke, L., Nilsson, B., Ekdahl, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+conformational+forms+of+target-bound+iC3b+that+distinctively+bind+complement+receptors+1+and+2+and+two+specific+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Upsala+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Two conformational forms of target-bound iC3b that distinctively bind complement receptors 1 and 2 and two specific monoclonal antibodies.</a> Upsala Journal of Medical Sciences. 116, 26-33 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zwierzęce modele padaczki odegrały kluczową rolę w odkryciu wielu defibrylatorów AED, jednak wymagają one wielu zwierząt, a większość z nich jest czasochłonna ze względu na utajony okres wystąpienia napadów. Niska indukcja magnezu aktywności padaczkowej w ostrych wycinkach hipokampa została również gruntownie zrewidowana w literaturze3, ale ostre plastry mają żywotność 6-12 godzin, co uniemożliwia ocenę długoterminowych zmian. Plastry organotypowe mogą być utrzymywane w kulturze przez kilka dni do tygodni, co pozwala przezwyciężyć krótki czas żywotności ostrych plastrów, a modele epileptogenezy w organotypowych wycinkach hipokampa zaproponowano 3,7,8.
Tutaj opisujemy przygotowanie plastrów organotypowych, składających się z kory nosa i hipokampa. Przygotowanie tych plastrów zajmuje 15-20 minut na zwierzę, począwszy od złożenia ofiary ze zwierzęcia do umieszczenia plastrów na wkładkach, i można uzyskać 6-8 plastrów na półkulę. Należy zachować szczególną ostrożność podczas otwierania półkuli w celu odsłonięcia hipokampa oraz podczas wyjmowania tkanki z bibuły filtracyjnej po pokrojeniu. Nadmiar tkanki powyżej hipokampa może również zagrozić integralności plastra podczas krojenia.
Warstwy organotypowe kory nosa i hipokampa przedstawiają ewoluującą aktywność podobną do padaczkowej, przypominającą padaczkę in vivo. Po tygodniu w kulturze większość wycinków przedstawia mieszaną aktywność międzycząsteczkową i ictalową, która z czasem w kulturze przechodzi w wydarzenia wyłącznie podobne do ictal. Do tej pory odnotowaliśmy kilka wyładowań międzynapadowych w plastrach w ciągu 2-3 tygodni. W tym systemie aktywność podobna do padaczkowej wydaje się rozwijać szybciej niż w organtypowych wycinkach hipokampa. Można to przypisać obecności kory nosowej, która zachowuje większość funkcjonalnych danych wejściowych do hipokampa. Aby w pełni rozwiązać ten problem, obecnie przeprowadzana jest pełna charakterystyka sygnałów padaczkowych wykazywanych przez te wycinki w czasie, takich jak liczba i czas trwania zdarzeń zakaźnych, wraz z ich amplitudą i częstotliwością.
System ten może być utrzymywany w hodowli przez ponad trzy tygodnie i naśladuje wiele molekularnych korelatów padaczki, takich jak śmierć neuronów, aktywacja mikrogleju i astrocytów oraz zwiększona produkcja cytokin prozapalnych14, co pozwala na długoterminową charakterystykę tych aspektów. Jest to również łatwa w użyciu platforma do badań przesiewowych, na której można wdrażać interwencje farmakologiczne ukierunkowane na określone szlaki komórkowe i testować potencjalne cele terapeutyczne. Niewątpliwie, przedstawiony tu system może przyczynić się do dalszego wyjaśnienia mechanizmów epileptogenezy.

Padaczka, jedno z najbardziej rozpowszechnionych zaburzeń neurologicznych na świecie, charakteryzuje się okresowym i nieprzewidywalnym występowaniem zsynchronizowanej i nadmiernej aktywności neuronalnej w mózgu. Pomimo różnych dostępnych leków przeciwpadaczkowych (AED), jedna trzecia pacjentów z padaczką jest oporna na terapię1 i nadal doświadcza napadów padaczkowych i pogorszenia funkcji poznawczych. Co więcej, dostępne defibrylatory AED utrudniają poznanie ze względu na ich stosunkowo uogólnione działanie na aktywność neuronalną. Padaczka, którą trudno jest badać u ludzi, ze względu na liczne i niejednorodne urazy padaczkowe, długie okresy utajenia trwające od miesięcy do dziesięcioleci oraz mylące efekty leczenia przeciwdrgawkowego po pierwszym spontanicznym napadzie.
Identyfikacja potencjalnych środków terapeutycznych do leczenia epilepsji stała się możliwa dzięki zwierzęcym modelom padaczki: 1) modele genetyczne, które wykorzystują genetycznie predysponowane zwierzęta, u których napady występują spontanicznie lub w odpowiedzi na bodziec sensoryczny; 2) modele napadów padaczkowych wywołanych stymulacją elektryczną; oraz 3) farmakologiczne modele indukcji napadów, które wykorzystują m.in. pilokarpinę (agonistę receptora muskarynowego), kainian (agonista receptora kainianowego) lub 4-aminopirydynę (bloker kanału potasowego). Modele te odegrały kluczową rolę w zrozumieniu zmian w zachowaniu, a także mechanizmów molekularnych i komórkowych leżących u podstaw padaczki, a także doprowadziły do odkrycia wielu defibrylatorów AED2.
Preparaty ex vivo są również potężnym narzędziem do badania mechanizmów leżących u podstaw epileptogenezy i iktogenezy. Ostre wycinki hipokampa, które umożliwiają badania elektrofizjologiczne żywych komórek w okresie 6-12 godzin, oraz organtypowe wycinki hipokampa, które mogą być przechowywane w inkubatorze przez okres dni lub tygodni, były szeroko stosowane w badaniach aktywności padaczkowej3. 
Organotypowe wycinki mózgu są przygotowywane z eksplantowanej tkanki i reprezentują fizjologiczny trójwymiarowy model mózgu. Wycinki te zachowują cytoarchitekturę interesującego nas regionu i obejmują wszystkie komórki mózgowe oraz ich komunikację międzykomórkową4. Najczęściej używanym regionem do długoterminowych hodowli organotypowych jest hipokamp, ponieważ region ten jest dotknięty utratą neuronów w wielu stanach neurodegeneracyjnych. Są one szeroko stosowane do modelowania zaburzeń mózgu i są uważane za doskonałe narzędzia do oceny potencjału neuroprotekcyjnego i terapeutycznego leku5,6. Modele epileptogenezy, udaru mózgu i toksyczności wywołanej przez Aβ opisano w wycinkach organotypowych hipokampa7,8,9,10. Chorobę Parkinsona badano w brzusznym śródmózgowiu i prążkowiu, a także w korze-ciele modzelowatym-prążkowiu-istocie czarnej, plastry organotypowe11. Organotypowe kultury warstw móżdżku naśladują wiele aspektów mielinizacji aksonów i funkcji móżdżku i są szeroko rozpowszechnionym modelem do badania nowych strategii terapeutycznych w stwardnieniu rozsianym12.
Jednak badania kliniczne i modele zwierzęce epilepsji sugerują, że kora nosowa, złożona z kory okołonosowej i śródwęchowej, odgrywa rolę w generowaniu napadów13. W ten sposób ustalono model epileptogenezy w warstwach organotypowych kory nosa i hipokampa14. Pod wpływem stopniowego i kontrolowanego pozbawiania surowicy, organotypowe plastry kory nosa-hipokampa przedstawiają ewoluujące zdarzenia podobne do padaczkowych, w przeciwieństwie do analogicznych plastrów zawsze trzymanych w pożywce zawierającej surowicę.
W epilepsji, podobnie jak w wielu ostrych i przewlekłych chorobach ośrodkowego układu nerwowego, neurocentryczne widzenie nie wyjaśnia mechanizmów leżących u podstaw początku i postępu choroby. Dowody kliniczne i eksperymentalne wskazują na zapalenie mózgu, w którym mikroglej i astrocyty odgrywają istotną rolę, jako jeden z kluczowych czynników przyczyniających się do procesu padaczkowego. Eksperymenty farmakologiczne na zwierzęcych modelach padaczki sugerują, że efekty przeciwpadaczkowe można osiągnąć poprzez ukierunkowanie na szlaki prozapalne, a obecnie zapalenie nerwów jest uważane za nową opcję rozwoju podejść terapeutycznych dla padaczki15.
Tutaj dokładnie opisujemy przygotowanie kultur organotypowych w warstwach kory nosowej i hipokampa, a także szczegóły dotyczące rejestrowania spontanicznej aktywności epileptiformalnej z nich. Podkreślamy, że system ten naśladuje kilka neurozapalnych aspektów padaczki, dzięki czemu nadaje się do zbadania roli komórek glejowych i zapalenia nerwów w tej patologii. Co więcej, stanowi łatwą w użyciu platformę do badań przesiewowych potencjalnych podejść terapeutycznych w leczeniu padaczki.

<table><tbody><tr><td>Probówka wirówkowa 50 ml, stożkowe dno</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>70% etanolu</td><td>Manuel Vieira, Lda</td><td>UN1170</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz</td><td>Axon Instruments</td><td>Axoclamp 900A</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz</td><td>Axon Instruments</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Anti-C3d (koza)</td><td>R& D Systems</td><td>AF2655</td><td>Rozcieńczyć w stosunku 1:1000</td></tr><tr><td>Anti-CD68 (mysz)</td><td>Abcam</td><td>ab31630-125ug</td><td>Rozcieńczyć w stosunku 1:250</td></tr><tr><td>Anti-GFAP (mysz)</td><td>Milipore SAS</td><td>MAB360</td><td>Rozcieńczyć w stosunku 1:500</td></tr><tr><td>Anti-Iba1 (królik)</td><td>Abcam</td><td>ab108539</td><td>Rozcieńczyć w stosunku 1:600</td></tr><tr><td>Anti-NeuN (królik)</td><td>Werfen</td><td>16712943S</td><td>Rozcieńczyć w stosunku 1:500</td></tr><tr><td>Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (aCSF)</td><td></td><td></td><td>Domowy</td></tr><tr><td>B-27&handel; Suplement (50X), bez surowicy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza do rękojeści skalpela</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>NZYTech</td><td>MB04602</td><td>5% BSA służy do rozcieńczania przeciwciał pierwotnych. Dodaj 0,5 g BSA do 10 ml PBS.</td></tr><tr><td>System komór do wycinków mózgu/tkanek</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dwuwodny chlorek wapnia</td><td>Merck Millipore</td><td>1.02382.0500</td><td></td></tr><tr><td>Wkładki do hodowli komórkowych, 30 mm, hydrofilowe PTFE</td><td>Milipore SAS</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>Źródło zimnego światła</td><td>SCHOTT</td><td>KL 300 LED</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalny mikroskop laserowy</td><td>Zeiss</td><td>LSM 710</td><td></td></tr><tr><td>Konwencjonalny inkubator</td><td>Thermo Scientific Heraeus</td><td>BB15, linia funkcyjna</td><td>ustawiona na 37 & deg; C i 5% CO2</td></tr><tr><td>D(+)-Monohydrat glukozy</td><td>Merck Millipore</td><td>1.08342.1000</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Roztwór glukozy, 45% w wodzie</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>di-sodowy wodorofosforan dwuwodny</td><td>Merck Milipore</td><td>1.06580.1000</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny/lupa</td><td>MEIJI TECHNO CO. LTD</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>122285IgG (H+L) przeciw kozom osła sprzężona z Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A11057</td><td>Rozcieńczony w stosunku 1:200</td></tr><tr><td>IgG (H+L) przeciw mysim osłom sprzężony z Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21202</td><td>Rozcieńczony w stosunku 1:200</td></tr><tr><td>IgG przeciw myszom osła (H+L) sprzężony z Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A10037</td><td>Rozcieńczony w stosunku 1:200</td></tr><tr><td>IgG przeciw królikom osła (H+L) sprzężony z Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td>Rozcieńczyć w stosunku 1:500</td></tr><tr><td>IgG przeciwko królikom osłom (H+L) sprzężony z Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A10042</td><td>Rozcieńczony w stosunku 1:500</td></tr><tr><td>Dumont #5 Kleszcze drobne Biologie Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Kleszcze Standard Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 Kleszcze Standard Dumoxel</td><td>Fine Science Tools</td><td>11271-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Medical #7S Kleszcze Short Curve Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11273-22</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór podstawowy gentamycyny, 50 mg/ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15750-037</td><td></td></tr><tr><td>Gey' s Zrównoważony roztwór soli (GBSS)</td><td>Przemysł biologiczny</td><td>01-919-1A Elektrody szklane</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Produkty naukowe</td><td>GB150F-10</td><td>Okrągłe końcówki domowej roboty</td></tr><tr><td>Szklane pipety Pasteura, 230 mm</td><td>VWR International</td><td>612-1702</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s Zrównoważony roztwór soli (HBSS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24020-091</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H1399</td><td>Roztwór podstawowy o stężeniu 2 mg/ml w</td></tr><tr><td>PBS Surowica końska, inaktywowana termicznie (HS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Merck Milipore</td><td>1.09057.1000</td><td></td></tr><tr><td>Długopis hydrofobowy</td><td>Dako</td><td>S200230-2</td><td></td></tr><tr><td>INCU-Line IL10</td><td>VWR</td><td>390-0384</td><td></td></tr><tr><td>Komora interfejsu</td><td>Warner Instruments</td><td>BSC-HT Haas Top</td><td></td></tr><tr><td>Iris Spatula Zakrzywione</td><td>narzędzia do nauki o</td> wysokiej jakości <td>10092-12</td><td></td></tr><tr><td>Labculture Klasa II Szafa bezpieczeństwa biologicznego</td><td>HERASafe</td><td>HS 12</td><td></td></tr><tr><td>Papier do czyszczenia soczewek</td><td>TIFFEN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór L-glutaminy 200 mM (Q)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu siedmiowodny</td><td>Merck Millipore</td><td>1.05886.0500</td><td></td></tr><tr><td>Mikrorurka 0,5 mL, PP</td><td>SARSTEDT</td><td>72,699</td><td></td></tr><tr><td>Mikrorurka 1,5 mL, PP</td><td>SARSTEDT</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>Mikrorurka 2,0 mL, PP</td><td>SARSTEDT</td><td>72.691</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulatory</td><td>Sutter Instrument</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Miroscope Okulary nakrywkowe, 24 mm x 60 mm</td><td>Marienfeld</td><td>102242</td><td></td></tr><tr><td>Lakier do paznokci</td><td>Clich&eacute;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal-A Medium (NBA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM&reg; I Medium o obniżonej surowicy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985-047</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd, proszek</td><td>VWR Chemicals</td><td>2,87,94,295</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>Gilson</td><td>M312</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy soli fizjologicznej (PBS)</td><td></td><td></td><td>Domowej roboty. PBS z 0,5% Tween-20 (PBS-T) służy do mycia plastrów podczas testu immunohistochemicznego.</td></tr><tr><td>Wzorcowe roztwory fosforanów, PO43- w wodzie</td><td>BDH ARISTAR</td><td>452232C</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw pipet</td><td>Gilson</td><td>P2, P10, P20, P100, P200, P1000</td><td></td></tr><tr><td>Platinum 5 ostrzy</td><td>Gillette</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405-250g</td><td></td></tr><tr><td>Jodek propidyny (PI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170-25MG</td><td>Roztwór podstawowy o stężeniu 1 mg/ml w wodzie.</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna jakościowa, celuloza, klasa 1, 55 mm</td><td>Whatman</td><td>1001-055</td><td>Średnia retencja 11&micro; m</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna jakościowa, celuloza, klasa 1, 90 mm</td><td>Whatman</td><td>1001-090</td><td>Średnia retencja 11&mikro; </td></tr><tr><td>m Rękojeść skalpela</td><td>Fine Science Tools</td><td>91003-12</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa z końcówką bez igły 1 ml</td><td>SOL-M</td><td>161000</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>VWR Chemicals</td><td>27800.360</td><td></td></tr><tr><td>Diwodorofosforan sodu jednowodny</td><td>Merck Millipore</td><td>1.06346.1000</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Merck Millipore</td><td>1.06329.1000</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu&lrm;</td><td>Merck Milipore</td><td>535C549998</td><td></td></tr><tr><td>Stymulator</td><td>Astro Med Inc GRASS Grupa produktów</td><td>S48 Stymulator</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki studenckie Proste SharpSharp 12cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>91402-12</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus&trade; Szkiełka adhezyjne</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne naczynie do hodowli tkankowych 60 x 15 mm</td> z <td>powłoką TC Corning</td><td>CORN430166</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne płytki 6-dołkowe z powłoką TC</td><td>Kontroler temperatury Corning</td><td>CORN3516</td><td></td></tr><tr><td></td><td>MEDICAL SYSTEMS CORP.</td><td>TC-102</td><td></td></tr><tr><td>Rozdrabniacz do tkanek</td><td>Mickle Laboratory Engineering CO. LTD.</td><td>MTC/2</td><td>Ustaw na 350 &mu; m</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BDH</td><td>14630</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr></tbody></table>

model epileptogenezy w organotypowych kulturach warstwowych kory nosa i hipokampa

A Model of Epileptogenesis in Rhinal Cortex-Hippocampus Organotypic Slice Cultures

Organotypowe kultury warstwowe są powszechnie używane do modelowania zaburzeń mózgu i są uważane za doskonałe platformy do oceny potencjału neuroprotekcyjnego i terapeutycznego leku. Plastry organotypowe są przygotowywane z eksplantowanych tkanek i reprezentują złożone wielokomórkowe środowisko ex vivo. Zachowują trójwymiarową cytoarchitekturę i lokalne środowisko komórek mózgowych, utrzymują łączność neuronalną i wzajemną interakcję neuron-glej. Plastry organotypowe hipokampa są uważane za odpowiednie do zbadania podstawowych mechanizmów epileptogenezy, ale badania kliniczne i modele zwierzęce padaczki sugerują, że kora nosa, składająca się z kory okołożołądkowej i śródwęchowej, odgrywa istotną rolę w powstawaniu napadów.
Tutaj opisujemy przygotowanie organicznych plastrów kory nosa i hipokampa. Zapisy spontanicznej aktywności z obszaru CA3 pod perfuzją z pełną pożywką wzrostową, w temperaturze fizjologicznej i przy braku manipulacji farmakologicznych, wykazały, że wycinki te przedstawiają ewoluujące zdarzenia podobne do padaczkowych w czasie w kulturze. Zaobserwowano również zwiększoną śmierć komórek poprzez test wychwytu jodku propidyny i glejozę, ocenianą za pomocą immunohistochemii sprzężonej z fluorescencją. Przedstawione podejście eksperymentalne podkreśla wartość organotypowych kultur warstwowych kory nosa i hipokampa jako platformy do badania dynamiki i progresji epileptogenezy oraz do badań przesiewowych potencjalnych celów terapeutycznych dla tej patologii mózgu.

Na podstawie wcześniejszych opisów analizy sygnałów epileptycznych w organotypowych skrawkach hipokampa, wyładowania epileptiformne międzynapadowe definiuje się tutaj jako wyładowania napadowe, które są wyraźnie odróżnialne od aktywności tła, charakteryzują się gwałtowną zmianą polaryzacji i występują z niską częstotliwością (&lt;2 Hz). Wyładowania napadowe trwające ponad 10 s i występujące z wyższą częstotliwością (≥2 Hz) określa się jako aktywność epileptiformną napadową. Jeśli zdarzenie napadowe wystąpi w ciągu 10 s po poprzednim, oba te zdarzenia uznaje się za jedno zdarzenie napadowe.
Organotypowe plastry kory nosowej i hipokampa w 7 DIV (Rysunek 3A) wykazują mieszaną aktywność interictalną i podobną do ictalnej. W 14 DIV (Rysunek 3B), aktywność spontaniczna charakteryzuje się wyładowaniami ictalnymi, które przekształcają się w dominującą aktywność ictalną w 21 DIV, przy czym zdarzenia ictalne trwają &gt;1 min (Rysunek 3C).
<img alt="Dane przebiegów elektrofizjologicznych, skala 50 µV, powiększenie czasowe, schemat analizy aktywności neuronalnej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61330/61330fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Spontaniczna aktywność epileptoidalna organotypowych skrawków kory rynalnej i hipokampa. Reprezentatywne zdarzenia elektrograficzne przypominające napady, zarejestrowane z obszaru CA3 w komorze typu interfejsowego, po (A) 7 DIV, (B) 14 DIV i (C) 21 DIV. Szczegóły napadu drgawkowego przedstawiono na dolnych śladach. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61330/61330fig03large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Test pobierania PI, po którym wykonano immunohistochemię przeciwko markerowi neuronalnemu NeuN w celu identyfikacji śmierci neuronów. Pobieranie PI przez neurony ziarniste i piramidalne zaobserwowano w skrawkach w 7 DIV (strzałki na Rysunku 4A), jednak liczba neuronów PI+ wzrosła w 14 DIV (strzałki na Rysunku 4B), co potwierdza wzrost śmierci neuronów wraz z postępem epileptogenezy.
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna kultur neuronów, barwienie PI i NeuN, analiza żywotności komórek, 7 i 14 DIV." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61330/61330fig04.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rycina 4: Reprezentatywne obrazy organotypowych skrawków kory nosowej i hipokampa barwionych NeuN oraz PI. Obrazy dojrzałych neuronów barwionych przeciwciałem przeciwko NeuN oraz komórek wykazujących pozytywną reakcję z PI wykonano przy (A) 7 DIV i (B) 14 DIV, przy użyciu konfokalnego mikroskopu laserowego z obiektywem 20x. Przedstawiono powiększone obrazy obszarów zaznaczonych przerywanymi liniami. Strzałki wskazują obumarłe neurony (kolor pomarańczowy). Pasek skali, 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61330/61330fig04large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
Do oceny fenotypu mikrogleju zastosowano podwójne barwienie na Iba1 oraz CD68. Iba1 jest markerem mikrogleju/makrofagów, natomiast CD68 to białko lizosomalne wykazujące wysoką ekspresję w reaktywnym mikrogleju i niską ekspresję w mikrogleju spoczynkowym. W skrawkach po 7 dniach in vitro (DIV), mikroglej rozgałęziony o niskiej ekspresji CD68 (strzałki na Rysunku 5A) jest liczniejszy niż reaktywny mikroglej Iba1+/CD68+ (groty strzałek na Rysunku 5A), podczas gdy w 14 DIV, we wszystkich obszarach hipokampa, liczba krzewiastych/ameboidalnych komórek mikrogleju M1 Iba1+/CD68+ (groty strzałek na Rysunku 5B) przewyższa liczbę komórek mikrogleju o niskiej ekspresji CD68 (strzałki na Rysunku 5B). W 14 DIV można zidentyfikować niektóre komórki Iba1+/CD68+ o wyglądzie hiper-rozgałęzionym (otwarte groty strzałek na Rysunku 5B), co może sugerować występowanie przeciwzapalnego fenotypu M2 mikrogleju. Kwestia ta wymaga jednak dalszych badań.
Niedawne badania wykazały, że różne inicjujące urazy OUN mogą wywołać co najmniej dwa typy astrocytów reaktywnych, A1 i A2, przy czym astrocyty A1 wykazują działanie neurotoksyczne16. Podtyp A1 astrocytów charakteryzuje się zwiększoną ekspresją dopełniacza C316,17,18. Dopełniacz C3, który odgrywa kluczową rolę w aktywacji układu dopełniacza, generuje C3b, który jest następnie degradowany do iC3b, C3dg i C3d19. W związku z tym, w celu oceny astrogliozy zastosowano podwójne barwienie na GFAP i C3d. W 7 DIV ekspresja C3d jest niemal niewykrywalna (Rysunek 6A), natomiast w skrawkach z 14 DIV można zaobserwować hipertroficzne astrocyty GFAP+/C3d+ (groty strzałek na Rysunku 6B), co sugeruje postępującą aktywację astrocytów A1.
Wyniki wykazują progresywną aktywację mikrogleju i astrocytów w przebiegu epileptogenezy, co odzwierciedla zjawiska opisane u pacjentów z epilepsją oraz w modelach zwierzęcych tej patologii.
<img alt="Badanie różnicowania neuronalnego, markery Iba1/CD68, analiza z użyciem mikroskopii fluorescencyjnej, obszary mózgu CA1, CA3, DG, DIV7 i DIV14." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61330/61330fig5v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Reprezentatywne obrazy organotypowych skrawków kory nosowej i hipokampa barwionych na Iba1 i CD68. Obrazy mikrogleju barwionego Iba1 i CD68 oraz jąder barwionych Hoechstem zostały pozyskane przy (A) 7 DIV i (B) 14 DIV, przy użyciu konfokalnego mikroskopu laserowego z obiektywem 20x. Przedstawiono powiększone obrazy obszarów zaznaczonych przerywaną linią. Strzałki wskazują Iba1+/CD68- mikroglej w stanie spoczynku, groty strzałek wskazują Iba1+/CD68+ mikrogliia krzaczkowata/ameboidalna, a otwarte groty strzałek wskazują Iba1+/CD68+ hiper-rozgałęzione mikroglej. Pasek skali, 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61330/61330fig5v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Immunofluorescencja: barwienie neuronów w 7. i 14. dniu in vitro (DIV), analiza Hoechst, GFAP i C3d, wyniki mikroskopowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61330/61330fig06.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Reprezentatywne obrazy organotypowych skrawków kory nosowej i hipokampa barwionych na GFAP i C3d. Obrazy astrocytów barwionych na GFAP i C3d oraz jąder komórkowych barwionych Hoechstem zostały pozyskane przy (A) 7 DIV i (B) 14 DIV, przy użyciu konfokalnego mikroskopu laserowego z obiektywem 20x. Przedstawiono powiększone obrazy obszarów zaznaczonych przerywanymi liniami. Grotami strzałek wskazano GFAP+/C3d+ reaktywne astrocyty A1 (na żółto). Pasek skali, 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61330/61330fig06large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>

Tutaj opisujemy przygotowanie organicznych plastrów kory nosa i hipokampa. Przy stopniowym i kontrolowanym pozbawianiu surowicy, plastry te przedstawiają ewoluujące zdarzenia podobne do padaczki i mogą być uważane za model epileptogenezy ex vivo. System ten stanowi doskonałe narzędzie do monitorowania dynamiki spontanicznej aktywności, a także do oceny progresji cech neurozapalnych w całym przebiegu epileptogenezy.

Model epileptogenezy w organotypowych kulturach warstwowych kory nosa i hipokampa

Organotypic slice cultures have been widely used to model brain disorders and are considered excellent platforms for evaluating a drug&#8217;s ...

Padaczka jest powszechną chorobą neurologiczną. Warstwy organotypowe kory nosa i hipokampa przedstawiają ewoluujące zdarzenia podobne do padaczkowych, które przypominają padaczkę in vivo i dlatego mogą być wykorzystane jako model epileptogenezy ex vivo. System ten jest rzeczywiście doskonałym narzędziem do monitorowania dynamiki i postępu epileptogenezy, a także do badań przesiewowych potencjalnych celów terapeutycznych dla tej patologii mózgu.Procedury zademonstrują ze mną moi studenci Francisco Meda i Mafalda Carvalho. Aby pobrać mózg z szóstego do siódmego dnia po urodzeniu, najpierw umyj głowę trzy razy w pięciu mililitrach GBSS. Pracując w gabinecie bezpieczeństwa biologicznego, mocno włóż ostre kleszcze do oczodołów, aby utrzymać głowę na miejscu i użyj nożyczek z cienką końcówką, aby przeciąć skórę głowy wzdłuż linii środkowej od otworu kręgowego do płatów czołowych.Przetnij czaszkę w ten sam sposób i wzdłuż poprzecznej szczeliny mózgowia i użyj zakrzywionych długich kleszczy, aby rozsunąć części czaszki. Użyj szpatułki, aby wyrzucić opuszki węchowe i przenieść grzbietową stronę mózgu do góry na 60-milimetrową płytkę zawierającą pięć mililitrów zimnego GBSS. Włóż cienkie kleszcze do móżdżku i włóż szpatułkę wzdłuż linii środkowej, aby ostrożnie otworzyć półkulę.Użyj krótkich, zakrzywionych kleszczy, aby ostrożnie usunąć nadmiar tkanki pokrywającej hipokamp bez dotykania struktury hipokampa, a następnie przetnij poniżej każdego hipokampa. Przenieś jedną półkulę po drugiej hipokampem do góry i równolegle do siebie na kawałek bibuły filtracyjnej. Umieść bibułę filtracyjną na rozdrabniaczu do tkanek z półkulami prostopadłymi do ostrza i pokrój półkule na plastry o grubości 350 mikronów.Przenieś pokrojoną tkankę na nową szalkę Petriego zawierającą pięć mililitrów zimnego GBSS i użyj elektrod z okrągłą końcówką, aby ostrożnie oddzielić plastry, zachowując tylko próbki z nienaruszoną strukturalnie korą nosa i hipokampem. Obszary DG i CA powinny być idealnie zdefiniowane, podobnie jak obszary kory śródwęchowej i okołęchowej. Za pomocą szpatułki i elektrody z okrągłą końcówką umieść do czterech nienaruszonych plasterków na pojedynczych wkładkach w odpowiedniej liczbie dołków sześciodołkowej płytki zawierającej 1,1 mililitra pożywki hodowlanej na studzienkę.Użyj pipety P20, aby usunąć nadmiar pożywki preparacyjnej z okolic każdej kromki. Umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych. Zmieniaj podłoże co dwa do trzech dni.Użyj kleszczy, aby podnieść wkładkę. Zassać pożywkę z odpowiedniej studzienki i umieścić wkładkę z powrotem na miejscu. Użyj pipety P1000, aby dodać jeden mililitr świeżej pożywki o temperaturze 37 stopni Celsjusza do każdego dołka.Przygotuj zestaw do elektrofizjologii w obiegu zamkniętym. Sprawdź, czy natężenie przepływu w komorze typu interfejsu jest ustawione na dwa mililitry na minutę i otwórz zawór carb-ox. Sprawdź poziom wody w systemie i umieść kawałek bibuły filtracyjnej w komorze rejestrującej interfejs, aby spuścić nadmiar medium.Umieść kawałek papieru do czyszczenia soczewek pod ramką, aby dostarczyć medium do plasterka i włącz regulator temperatury, amplifiery i mikromanipulatory. Za pomocą strzykawki napełnij szklaną elektrodę świeżo przygotowanym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym. Umieść szklaną elektrodę w elektrodzie odbiorczej i poczekaj, aż temperatura w komorze interfejsu ustabilizuje się na poziomie 37 stopni Celsjusza.Pracując w komorze bezpieczeństwa biologicznego, umieść wkładkę w 60 milimetrowej płytce z kroplą pożywki. Użyj ostrego ostrza, aby wyciąć plasterek z wkładki i umieść plasterek w komorze interfejsu z hipokampem w prawym dolnym rogu, a następnie umieść elektrodę odbiorczą w warstwie ogniwa piramidalnego CA3, zainicjuj protokół ciągłej akwizycji i nagrywaj plasterek przez 30 minut. Aby wykonać test wychwytu jodku propidyny, należy pracować w komorze bezpieczeństwa biologicznego.Wyjmij wkładkę ze studzienki i dodaj jodek propidyny w pożywce do końcowego stężenia dwóch mikromolów na studzienkę. Powoli mieszaj płytkę przed włożeniem wkładki z powrotem do dołka, uważając, aby pod plastrami nie było pęcherzyków. Gdy wszystkie wycinki zostaną poddane obróbce, należy umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych.W celu barwienia immunologicznego plastrów, pod koniec inkubacji jodku propidyny, odessać pożywkę od dna każdej studzienki i dodać jeden mililitr 4% paraformaldehydu na górze i na dole każdej wkładki. Po godzinie w temperaturze pokojowej umyj plastry dwa razy przez 10 minut i jeden mililitr PBS na pranie i użyj hydrofobowego pisaka, aby narysować dwa prostokąty na szkiełkach mikroskopowych. Użyj ostrego ostrza, aby odciąć plastry z wkładek i umieść po jednym plasterku w każdym prostokącie.Dodaj roztwór blokujący przepuszczalność do każdego plasterka na trzygodzinną inkubację w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji dodaj podstawowe przeciwciała będące przedmiotem zainteresowania do każdego plasterka w celu inkubacji w czterech stopniach Celsjusza przez noc. Następnego ranka przemyj plastry PBS-Tween trzy razy przez 10 minut na mycie i inkubuj plastry z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi przez cztery godziny w temperaturze pokojowej.Następnie umyj plastry, jak pokazano, i dodaj 50 mikrolitrów roztworu Hoechsta do każdego plasterka na 20-minutową inkubację w temperaturze pokojowej. Po inkubacji Hoechsta ponownie umyj plastry i dodaj do każdego z nich 50 mikrolitrów podłoża montażowego, a następnie umieść szkiełko nakrywkowe na plastrach i zamknij lakierem do paznokci. Po pozostawieniu szkiełek do wyschnięcia przez 24 godziny w temperaturze pokojowej, zobrazuj barwienie immunologiczne i wychwyt jodku propidyny za pomocą mikroskopii konfokalnej.Warstwy organotypowe kory nosa i hipokampa przedstawiają mieszaną aktywność międzynapadową i podobną do ictal po siedmiu dniach in vitro. Po 14 dniach in vitro spontaniczna aktywność charakteryzuje się wyładowaniami ictal, które ewoluują do przytłaczającej aktywności ictal po 21 dniach in vitro, przy czym zdarzenia ictal trwają dłużej niż jedną minutę. Wychwyt jodku propidyny i immunohistochemia w stosunku do markera neuronalnego NeuN ujawniły pewną śmierć neuronów w ciągu siedmiu dni in vitro, która jest znacznie zwiększona po 14 dniach in vitro we wszystkich obszarach hipokampa.Po siedmiu dniach in vitro rozgałęziony mikroglej z niską ekspresją CD68 jest liczniejszy niż Iba1-dodatni CD68 reaktywny mikroglej. Natomiast po 14 dniach in vitro, we wszystkich obszarach hipokampa, Iba1-dodatni CD68 ameboidalny mikroglej M1 przewyższa mikroglej o niskiej ekspresji CD68. Po 14 dniach in vitro można wskazać niektóre Iba1-dodatnie komórki CD68 z wyglądem hiperrozgałęzienia, co sugeruje możliwość fenotypu przeciwzapalnego mikrogleju M2.Po siedmiu dniach in vitro ekspresja CD3 jest ledwo wykrywalna, podczas gdy w 14-dniowych wycinkach in vitro można zaobserwować przerostowe astrocyty glejowe fibrylarne z dodatnim białkiem CD3 dodatnim, co sugeruje postępującą aktywację astrocytów A1. Przygotuj plastry kory nosa i hipokampa z najwyższą starannością. Upewnij się, że usunąłeś nadmiar tkanki powyżej hipokampa, ponieważ może to zagrozić integralności plastrów podczas krojenia.Deficyt strukturalny będzie miał negatywny wpływ na rentowność segmentów. Oprócz zademonstrowanych podejść, w tym systemie można zastosować mnóstwo testów, takich jak analiza Western blot, PCR w czasie rzeczywistym i ELISA, aby odpowiedzieć na konkretne pytania dotyczące epileptogenezy.

a-model-epileptogenesis-rhinal-cortex-hippocampus-organotypic-slice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Organotypowe hodowle skrawków embrionalnego mózgu gryzoni są szeroko stosowane w badaniach nad rozwojem mózgu. Choć systemy in vivo często oferują pewne korzyści, ...

Organotypowa hodowla plastrów mózgu szczura w 18. dniu embrionalnym (E18)

Organoptypowy model hodowli plastrów hipokampa jest modelem in vitro stosowanym do badania uszkodzeń neuronalnych w różnych paradygmatach. W niniejszym artykule opisujemy metody przygotowania hodowli plastrów oraz ilościowego oznaczania uszkodzeń neuronalnych.

Model organotypowej hodowli skrawków hipokampa do badania uszkodzeń neuronów

Opisujemy metodę przygotowania organotypowych skrawków hipokampa, którą można łatwo dostosować do innych obszarów mózgu. Skrawki mózgu umieszcza się na porowatych membranach, pozwalając na utworzenie interfejsu z pożywką hodowlaną. Metoda ta pozwala zachować ogólną architekturę hipokampa przez okres do 2 tygodni hodowli.

Organotypowe hodowle przekrojów hipokampa

Ten film opisuje technikę rejestrowania aktywności padaczkowej wycinków organotypowych kory nosa i hipokampa ex vivo za pomocą elektrofizjologii lub ustawień EEG. Pomaga to w badaniu dynamiki i progresji epileptogenezy oraz w badaniach przesiewowych potencjalnych celów terapeutycznych w leczeniu padaczki.

Technika zapisu oparta na elektroencefalografii do rejestrowania aktywności padaczkowej

Ten film demonstruje technikę oceny śmierci neuronów w wycinkach organotypowych kory nosowej i hipokampa. Śmierć neuronów następuje w wyniku ewoluujących napadów padaczkowych – przypominających padaczkę in vivo – i jest wykrywana poprzez podwójne barwienie martwych komórek za pomocą jodku propidyny i immunofluorescencji.

Test śmierci neuronalnej w celu oceny śmierci komórki w modelu padaczki ex vivo

Ten film demonstruje metodę przygotowania organotypowych kultur wycinków hipokampa z mózgu szczeniaka szczura. Przedstawia etapy związane z sekcją hipokampa, krojeniem i warunkami hodowli wymaganymi do promowania żywotności i wzrostu komórek w wycinkach hipokampa, ostatecznie generując organotypowe kultury warstwowe.

Przygotowanie organtypowych kultur plasterkowych z hipokampa szczeniaka szczura

Wideo demonstruje metodę uzyskiwania wycinków kory nosowej i hipokampa z mózgu szczeniaka szczura i hodowania ich w błoniastych wkładkach na wielodołkowej płytce wypełnionej pożywką do dalszej analizy.

Przygotowanie plasterków kory nosa i hipokampa z mózgu szczeniaka szczura

Tutaj opisujemy technikę badania neurogenezy poporodowej hipokampa za pomocą techniki organotypowej hodowli plastrów. Metoda ta pozwala na manipulację neurogenezą dorosłych w warunkach in vitro i pozwala na bezpośrednie zastosowanie środków farmakologicznych do hodowanego hipokampa.

Organotypowe kultury warstwowe do badań neurogenezy poporodowej

Organotypowe kultury plastrów hipokampa (OHSC) reprezentują model in vitro, który bardzo dobrze symuluje sytuację in vivo. W tym miejscu opisujemy ulepszony protokół krojenia oparty na wibratomie w celu uzyskania wysokiej jakości plastrów do wykorzystania w ocenie potencjału neuroprotekcyjnego nowych substancji lub biologicznego zachowania komórek nowotworowych.

Organotypowe kultury warstwowe hipokampa jako model do badania neuroprotekcji i inwazyjności komórek nowotworowych

Przedstawiono protokół przygotowania swobodnie pływających kultur warstwowych z dorosłego ludzkiego mózgu. Protokół jest odmianą szeroko stosowanej metody hodowli plastrowej z wykorzystaniem wkładek membranowych. Jest prosty, opłacalny i zalecany do przeprowadzania krótkoterminowych testów mających na celu rozwikłanie mechanizmów neurodegeneracji stojących za chorobami mózgu związanymi z wiekiem.

Krótkoterminowe, swobodnie unoszące się w powietrzu kultury warstwowe z dorosłego ludzkiego mózgu

Ten protokół opisuje przygotowanie poziomych wycinków kory hipokampowo-śródwęchowej (HEC) od myszy wykazujących spontaniczną aktywność fal ostrych. Plastry są inkubowane w uproszczonej komorze przechowawczej, a nagrania są wykonywane w warunkach zanurzonych z szybko płynącym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym, aby promować dotlenienie tkanek i spontaniczne pojawienie się aktywności na poziomie sieci.

Ostre krojenie mózgu myszy w celu zbadania spontanicznej aktywności sieci hipokampa

Poznaj model epileptogenezy w organotypowych kulturach warstwowych kory nosa i hipokampa szczura. Ta metoda pozwala monitorować dynamikę aktywności epileptycznej oraz postęp neurozapalenia w czasie.

Model epileptogenezy w organotypowych kulturach warstwowych kory nosa i hipokampa

Przeglądaj więcej filmów