Model epileptogenezy w organotypowych kulturach warstwowych kory nosa i hipokampa
18 marca 2021
Tutaj opisujemy przygotowanie organicznych plastrów kory nosa i hipokampa. Przy stopniowym i kontrolowanym pozbawianiu surowicy, plastry te przedstawiają ewoluujące zdarzenia podobne do padaczki i mogą być uważane za model epileptogenezy ex vivo. System ten stanowi doskonałe narzędzie do monitorowania dynamiki spontanicznej aktywności, a także do oceny progresji cech neurozapalnych w całym przebiegu epileptogenezy.
Padaczka jest powszechną chorobą neurologiczną. Warstwy organotypowe kory nosa i hipokampa przedstawiają ewoluujące zdarzenia podobne do padaczkowych, które przypominają padaczkę in vivo i dlatego mogą być wykorzystane jako model epileptogenezy ex vivo. System ten jest rzeczywiście doskonałym narzędziem do monitorowania dynamiki i postępu epileptogenezy, a także do badań przesiewowych potencjalnych celów terapeutycznych dla tej patologii mózgu.
Procedury zademonstrują ze mną moi studenci Francisco Meda i Mafalda Carvalho. Aby pobrać mózg z szóstego do siódmego dnia po urodzeniu, najpierw umyj głowę trzy razy w pięciu mililitrach GBSS. Pracując w gabinecie bezpieczeństwa biologicznego, mocno włóż ostre kleszcze do oczodołów, aby utrzymać głowę na miejscu i użyj nożyczek z cienką końcówką, aby przeciąć skórę głowy wzdłuż linii środkowej od otworu kręgowego do płatów czołowych.
Przetnij czaszkę w ten sam sposób i wzdłuż poprzecznej szczeliny mózgowia i użyj zakrzywionych długich kleszczy, aby rozsunąć części czaszki. Użyj szpatułki, aby wyrzucić opuszki węchowe i przenieść grzbietową stronę mózgu do góry na 60-milimetrową płytkę zawierającą pięć mililitrów zimnego GBSS. Włóż cienkie kleszcze do móżdżku i włóż szpatułkę wzdłuż linii środkowej, aby ostrożnie otworzyć półkulę.
Użyj krótkich, zakrzywionych kleszczy, aby ostrożnie usunąć nadmiar tkanki pokrywającej hipokamp bez dotykania struktury hipokampa, a następnie przetnij poniżej każdego hipokampa. Przenieś jedną półkulę po drugiej hipokampem do góry i równolegle do siebie na kawałek bibuły filtracyjnej. Umieść bibułę filtracyjną na rozdrabniaczu do tkanek z półkulami prostopadłymi do ostrza i pokrój półkule na plastry o grubości 350 mikronów.
Przenieś pokrojoną tkankę na nową szalkę Petriego zawierającą pięć mililitrów zimnego GBSS i użyj elektrod z okrągłą końcówką, aby ostrożnie oddzielić plastry, zachowując tylko próbki z nienaruszoną strukturalnie korą nosa i hipokampem. Obszary DG i CA powinny być idealnie zdefiniowane, podobnie jak obszary kory śródwęchowej i okołęchowej. Za pomocą szpatułki i elektrody z okrągłą końcówką umieść do czterech nienaruszonych plasterków na pojedynczych wkładkach w odpowiedniej liczbie dołków sześciodołkowej płytki zawierającej 1,1 mililitra pożywki hodowlanej na studzienkę.
Użyj pipety P20, aby usunąć nadmiar pożywki preparacyjnej z okolic każdej kromki. Umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych. Zmieniaj podłoże co dwa do trzech dni.
Użyj kleszczy, aby podnieść wkładkę. Zassać pożywkę z odpowiedniej studzienki i umieścić wkładkę z powrotem na miejscu. Użyj pipety P1000, aby dodać jeden mililitr świeżej pożywki o temperaturze 37 stopni Celsjusza do każdego dołka.
Przygotuj zestaw do elektrofizjologii w obiegu zamkniętym. Sprawdź, czy natężenie przepływu w komorze typu interfejsu jest ustawione na dwa mililitry na minutę i otwórz zawór carb-ox. Sprawdź poziom wody w systemie i umieść kawałek bibuły filtracyjnej w komorze rejestrującej interfejs, aby spuścić nadmiar medium.
Umieść kawałek papieru do czyszczenia soczewek pod ramką, aby dostarczyć medium do plasterka i włącz regulator temperatury, amplifiery i mikromanipulatory. Za pomocą strzykawki napełnij szklaną elektrodę świeżo przygotowanym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym. Umieść szklaną elektrodę w elektrodzie odbiorczej i poczekaj, aż temperatura w komorze interfejsu ustabilizuje się na poziomie 37 stopni Celsjusza.
Pracując w komorze bezpieczeństwa biologicznego, umieść wkładkę w 60 milimetrowej płytce z kroplą pożywki. Użyj ostrego ostrza, aby wyciąć plasterek z wkładki i umieść plasterek w komorze interfejsu z hipokampem w prawym dolnym rogu, a następnie umieść elektrodę odbiorczą w warstwie ogniwa piramidalnego CA3, zainicjuj protokół ciągłej akwizycji i nagrywaj plasterek przez 30 minut. Aby wykonać test wychwytu jodku propidyny, należy pracować w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
Wyjmij wkładkę ze studzienki i dodaj jodek propidyny w pożywce do końcowego stężenia dwóch mikromolów na studzienkę. Powoli mieszaj płytkę przed włożeniem wkładki z powrotem do dołka, uważając, aby pod plastrami nie było pęcherzyków. Gdy wszystkie wycinki zostaną poddane obróbce, należy umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych.
W celu barwienia immunologicznego plastrów, pod koniec inkubacji jodku propidyny, odessać pożywkę od dna każdej studzienki i dodać jeden mililitr 4% paraformaldehydu na górze i na dole każdej wkładki. Po godzinie w temperaturze pokojowej umyj plastry dwa razy przez 10 minut i jeden mililitr PBS na pranie i użyj hydrofobowego pisaka, aby narysować dwa prostokąty na szkiełkach mikroskopowych. Użyj ostrego ostrza, aby odciąć plastry z wkładek i umieść po jednym plasterku w każdym prostokącie.
Dodaj roztwór blokujący przepuszczalność do każdego plasterka na trzygodzinną inkubację w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji dodaj podstawowe przeciwciała będące przedmiotem zainteresowania do każdego plasterka w celu inkubacji w czterech stopniach Celsjusza przez noc. Następnego ranka przemyj plastry PBS-Tween trzy razy przez 10 minut na mycie i inkubuj plastry z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi przez cztery godziny w temperaturze pokojowej.
Następnie umyj plastry, jak pokazano, i dodaj 50 mikrolitrów roztworu Hoechsta do każdego plasterka na 20-minutową inkubację w temperaturze pokojowej. Po inkubacji Hoechsta ponownie umyj plastry i dodaj do każdego z nich 50 mikrolitrów podłoża montażowego, a następnie umieść szkiełko nakrywkowe na plastrach i zamknij lakierem do paznokci. Po pozostawieniu szkiełek do wyschnięcia przez 24 godziny w temperaturze pokojowej, zobrazuj barwienie immunologiczne i wychwyt jodku propidyny za pomocą mikroskopii konfokalnej.
Warstwy organotypowe kory nosa i hipokampa przedstawiają mieszaną aktywność międzynapadową i podobną do ictal po siedmiu dniach in vitro. Po 14 dniach in vitro spontaniczna aktywność charakteryzuje się wyładowaniami ictal, które ewoluują do przytłaczającej aktywności ictal po 21 dniach in vitro, przy czym zdarzenia ictal trwają dłużej niż jedną minutę. Wychwyt jodku propidyny i immunohistochemia w stosunku do markera neuronalnego NeuN ujawniły pewną śmierć neuronów w ciągu siedmiu dni in vitro, która jest znacznie zwiększona po 14 dniach in vitro we wszystkich obszarach hipokampa.
Po siedmiu dniach in vitro rozgałęziony mikroglej z niską ekspresją CD68 jest liczniejszy niż Iba1-dodatni CD68 reaktywny mikroglej. Natomiast po 14 dniach in vitro, we wszystkich obszarach hipokampa, Iba1-dodatni CD68 ameboidalny mikroglej M1 przewyższa mikroglej o niskiej ekspresji CD68. Po 14 dniach in vitro można wskazać niektóre Iba1-dodatnie komórki CD68 z wyglądem hiperrozgałęzienia, co sugeruje możliwość fenotypu przeciwzapalnego mikrogleju M2.
Po siedmiu dniach in vitro ekspresja CD3 jest ledwo wykrywalna, podczas gdy w 14-dniowych wycinkach in vitro można zaobserwować przerostowe astrocyty glejowe fibrylarne z dodatnim białkiem CD3 dodatnim, co sugeruje postępującą aktywację astrocytów A1. Przygotuj plastry kory nosa i hipokampa z najwyższą starannością. Upewnij się, że usunąłeś nadmiar tkanki powyżej hipokampa, ponieważ może to zagrozić integralności plastrów podczas krojenia.
Deficyt strukturalny będzie miał negatywny wpływ na rentowność segmentów. Oprócz zademonstrowanych podejść, w tym systemie można zastosować mnóstwo testów, takich jak analiza Western blot, PCR w czasie rzeczywistym i ELISA, aby odpowiedzieć na konkretne pytania dotyczące epileptogenezy.
Przegląd
To badanie bada przygotowanie organizmotypowych płatów kory rezonowej i hipokampu, które służą jako ex vivo model epileptogenezy. Te płaty wykazują zdarzenia podobne do epileptycznych w warunkach deprywacji surowicy, co sprawia, że są odpowiednie do monitorowania spontanicznej aktywności i progresji neuroinflamacji w trakcie epileptogenezy.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Epileptogeneza
- Elektrofizjologia
Tło
- Epilepsja jest powszechnym zaburzeniem neurologicznym.
- Organizmotypowe płaty zapewniają model, który bardzo przypomina warunki in vivo.
- Postęp epileptogenezy można ocenić za pomocą tego modelu.
- Uczonym może pomóc model w identyfikacji potencjalnych celów terapeutycznych.
Cel badania
- Przygotowanie organizmotypowych płatów kory rezonowej i hipokampu.
- Badanie dynamiki aktywności podobnej do epileptycznej.
- Ocena cech neuroinflamacji podczas epileptogenezy.
Stosowane metody
- Organizmotypowe płaty kory rezonowej i hipokampu zostały przygotowane z szczurów Sprague-Dawley.
- Płaty były hodowane i monitorowane pod kątem aktywności podobnej do epileptycznej.
- Przeprowadzono rejestracji elektrofizjologiczne w celu zbadania spontanicznej aktywności.
- Za pomocą poboru jodek propiodynowego i immunohistochemii oceniono integralność neuronów.
- Dynamiczne zmiany aktywności były monitorowane przez trzy tygodnie.
Główne wyniki
- Po siedmiu dniach in vitro płaty wykazywały mieszane aktywności interyktalne i przypominające ataki.
- Po 14 dniach in vitro spontaniczna aktywność ewoluowała z coraz większą liczbą rozładów iktalnych.
- Po 21 dniach in vitro dominujące zdarzenia iktalne trwały ponad jedną minutę.
- Znaczące zwiększenie śmierci neuronów zaobserwowano od siedmiu do 14 dni in vitro.
Wnioski
- To badanie zapewnia wiarygodny model do zrozumienia epileptogenezy i związanych z nią mechanizmów.
- Wyniki mogą ułatwić poszukiwanie celów terapeutycznych w epilepsji.
- Podkreślono wgląd w mechanizmy neuronalne i plastyczność podczas epileptogenezy.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This model provides a reproducible ex vivo platform for studying epileptogenesis progression, enabling early-stage target validation and mechanistic de-risking in epilepsy drug discovery. By capturing evolving epileptic-like activity and neuroinflammatory changes over time, it supports predictive confidence in therapeutic screening and translational continuity from discovery to preclinical evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by modeling evolving epileptogenesis dynamics in a disease-relevant system.
- Operational Value: Supports functional target validation through longitudinal monitoring of epileptiform activity and neuronal death.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by identifying compounds that modify epileptogenesis progression and neuroinflammatory markers.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized, reproducible system for preparing validated biological structures suitable for compound screening.
- Operational Value: Delivers quantitative electrophysiological and immunohistochemical readouts for reliable compound evaluation.
- Scalability: Supports platform reuse across multiple time points and intervention studies.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models disease-relevant epileptogenesis progression with temporal dynamics mirroring in vivo pathology.
- Operational Value: Enables assessment of neuroinflammatory biomarkers and neuronal integrity changes over a three-week culture period.
- Translational Continuity: Bridges discovery findings to preclinical validation by capturing key epileptogenesis hallmarks.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, offering a platform for mechanistic de-risking and predictive modeling in epilepsy research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by modeling epileptogenesis evolution in rhinal cortex-hippocampus circuits.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized slice preparation and stable electrophysiological recording conditions.
- Analytics: Provides quantitative measurements of epileptiform activity, neuronal death (via propidium iodide), and glial activation for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical work by modeling progressive epileptogenesis and neuroinflammation relevant to therapeutic intervention.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for longitudinal epileptogenesis studies across multiple compound screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by modeling epileptogenesis progression and reducing mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Ensures standardization, reproducibility, and scalability of epileptogenesis modeling across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of disease-modifying effects and reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through longitudinal assessment of antiepileptogenic potential.
Implementation Considerations
- Requires expertise in organotypic slice culture, electrophysiology, and immunohistochemical techniques.
- Depends on specialized instrumentation including interface recording chambers, temperature controllers, and confocal microscopy systems.
- Necessitates cross-team standardization of slice preparation, culture maintenance, and assay timing for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when extending the model to other brain regions or neurological conditions.
- Practical limitations include the need for meticulous dissection to preserve hippocampal and rhinal cortex integrity during slicing.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:49
Rhinal Cortex-Hippocampus Slice Preparation
3:41
Electrophysiological Recordings
5:07
Propidium Iodide (PI) Uptake Assay and Immunohistochemistry
7:26
Results: Epileptic-like Events, Neuronal Death and Gliosis are Observed in Rhinal Cortex-Hippocampus Organotypic Slices
9:18
Conclusion
