Model epileptogenezy w organotypowych kulturach warstwowych kory nosa i hipokampa

Padaczka jest powszechną chorobą neurologiczną. Warstwy organotypowe kory nosa i hipokampa przedstawiają ewoluujące zdarzenia podobne do padaczkowych, które przypominają padaczkę in vivo i dlatego mogą być wykorzystane jako model epileptogenezy ex vivo. System ten jest rzeczywiście doskonałym narzędziem do monitorowania dynamiki i postępu epileptogenezy, a także do badań przesiewowych potencjalnych celów terapeutycznych dla tej patologii mózgu.

Procedury zademonstrują ze mną moi studenci Francisco Meda i Mafalda Carvalho. Aby pobrać mózg z szóstego do siódmego dnia po urodzeniu, najpierw umyj głowę trzy razy w pięciu mililitrach GBSS. Pracując w gabinecie bezpieczeństwa biologicznego, mocno włóż ostre kleszcze do oczodołów, aby utrzymać głowę na miejscu i użyj nożyczek z cienką końcówką, aby przeciąć skórę głowy wzdłuż linii środkowej od otworu kręgowego do płatów czołowych.

Przetnij czaszkę w ten sam sposób i wzdłuż poprzecznej szczeliny mózgowia i użyj zakrzywionych długich kleszczy, aby rozsunąć części czaszki. Użyj szpatułki, aby wyrzucić opuszki węchowe i przenieść grzbietową stronę mózgu do góry na 60-milimetrową płytkę zawierającą pięć mililitrów zimnego GBSS. Włóż cienkie kleszcze do móżdżku i włóż szpatułkę wzdłuż linii środkowej, aby ostrożnie otworzyć półkulę.

Użyj krótkich, zakrzywionych kleszczy, aby ostrożnie usunąć nadmiar tkanki pokrywającej hipokamp bez dotykania struktury hipokampa, a następnie przetnij poniżej każdego hipokampa. Przenieś jedną półkulę po drugiej hipokampem do góry i równolegle do siebie na kawałek bibuły filtracyjnej. Umieść bibułę filtracyjną na rozdrabniaczu do tkanek z półkulami prostopadłymi do ostrza i pokrój półkule na plastry o grubości 350 mikronów.

Przenieś pokrojoną tkankę na nową szalkę Petriego zawierającą pięć mililitrów zimnego GBSS i użyj elektrod z okrągłą końcówką, aby ostrożnie oddzielić plastry, zachowując tylko próbki z nienaruszoną strukturalnie korą nosa i hipokampem. Obszary DG i CA powinny być idealnie zdefiniowane, podobnie jak obszary kory śródwęchowej i okołęchowej. Za pomocą szpatułki i elektrody z okrągłą końcówką umieść do czterech nienaruszonych plasterków na pojedynczych wkładkach w odpowiedniej liczbie dołków sześciodołkowej płytki zawierającej 1,1 mililitra pożywki hodowlanej na studzienkę.

Użyj pipety P20, aby usunąć nadmiar pożywki preparacyjnej z okolic każdej kromki. Umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych. Zmieniaj podłoże co dwa do trzech dni.

Użyj kleszczy, aby podnieść wkładkę. Zassać pożywkę z odpowiedniej studzienki i umieścić wkładkę z powrotem na miejscu. Użyj pipety P1000, aby dodać jeden mililitr świeżej pożywki o temperaturze 37 stopni Celsjusza do każdego dołka.

Przygotuj zestaw do elektrofizjologii w obiegu zamkniętym. Sprawdź, czy natężenie przepływu w komorze typu interfejsu jest ustawione na dwa mililitry na minutę i otwórz zawór carb-ox. Sprawdź poziom wody w systemie i umieść kawałek bibuły filtracyjnej w komorze rejestrującej interfejs, aby spuścić nadmiar medium.

Umieść kawałek papieru do czyszczenia soczewek pod ramką, aby dostarczyć medium do plasterka i włącz regulator temperatury, amplifiery i mikromanipulatory. Za pomocą strzykawki napełnij szklaną elektrodę świeżo przygotowanym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym. Umieść szklaną elektrodę w elektrodzie odbiorczej i poczekaj, aż temperatura w komorze interfejsu ustabilizuje się na poziomie 37 stopni Celsjusza.

Pracując w komorze bezpieczeństwa biologicznego, umieść wkładkę w 60 milimetrowej płytce z kroplą pożywki. Użyj ostrego ostrza, aby wyciąć plasterek z wkładki i umieść plasterek w komorze interfejsu z hipokampem w prawym dolnym rogu, a następnie umieść elektrodę odbiorczą w warstwie ogniwa piramidalnego CA3, zainicjuj protokół ciągłej akwizycji i nagrywaj plasterek przez 30 minut. Aby wykonać test wychwytu jodku propidyny, należy pracować w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

Wyjmij wkładkę ze studzienki i dodaj jodek propidyny w pożywce do końcowego stężenia dwóch mikromolów na studzienkę. Powoli mieszaj płytkę przed włożeniem wkładki z powrotem do dołka, uważając, aby pod plastrami nie było pęcherzyków. Gdy wszystkie wycinki zostaną poddane obróbce, należy umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych.

W celu barwienia immunologicznego plastrów, pod koniec inkubacji jodku propidyny, odessać pożywkę od dna każdej studzienki i dodać jeden mililitr 4% paraformaldehydu na górze i na dole każdej wkładki. Po godzinie w temperaturze pokojowej umyj plastry dwa razy przez 10 minut i jeden mililitr PBS na pranie i użyj hydrofobowego pisaka, aby narysować dwa prostokąty na szkiełkach mikroskopowych. Użyj ostrego ostrza, aby odciąć plastry z wkładek i umieść po jednym plasterku w każdym prostokącie.

Dodaj roztwór blokujący przepuszczalność do każdego plasterka na trzygodzinną inkubację w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji dodaj podstawowe przeciwciała będące przedmiotem zainteresowania do każdego plasterka w celu inkubacji w czterech stopniach Celsjusza przez noc. Następnego ranka przemyj plastry PBS-Tween trzy razy przez 10 minut na mycie i inkubuj plastry z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi przez cztery godziny w temperaturze pokojowej.

Następnie umyj plastry, jak pokazano, i dodaj 50 mikrolitrów roztworu Hoechsta do każdego plasterka na 20-minutową inkubację w temperaturze pokojowej. Po inkubacji Hoechsta ponownie umyj plastry i dodaj do każdego z nich 50 mikrolitrów podłoża montażowego, a następnie umieść szkiełko nakrywkowe na plastrach i zamknij lakierem do paznokci. Po pozostawieniu szkiełek do wyschnięcia przez 24 godziny w temperaturze pokojowej, zobrazuj barwienie immunologiczne i wychwyt jodku propidyny za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Warstwy organotypowe kory nosa i hipokampa przedstawiają mieszaną aktywność międzynapadową i podobną do ictal po siedmiu dniach in vitro. Po 14 dniach in vitro spontaniczna aktywność charakteryzuje się wyładowaniami ictal, które ewoluują do przytłaczającej aktywności ictal po 21 dniach in vitro, przy czym zdarzenia ictal trwają dłużej niż jedną minutę. Wychwyt jodku propidyny i immunohistochemia w stosunku do markera neuronalnego NeuN ujawniły pewną śmierć neuronów w ciągu siedmiu dni in vitro, która jest znacznie zwiększona po 14 dniach in vitro we wszystkich obszarach hipokampa.

Po siedmiu dniach in vitro rozgałęziony mikroglej z niską ekspresją CD68 jest liczniejszy niż Iba1-dodatni CD68 reaktywny mikroglej. Natomiast po 14 dniach in vitro, we wszystkich obszarach hipokampa, Iba1-dodatni CD68 ameboidalny mikroglej M1 przewyższa mikroglej o niskiej ekspresji CD68. Po 14 dniach in vitro można wskazać niektóre Iba1-dodatnie komórki CD68 z wyglądem hiperrozgałęzienia, co sugeruje możliwość fenotypu przeciwzapalnego mikrogleju M2.

Po siedmiu dniach in vitro ekspresja CD3 jest ledwo wykrywalna, podczas gdy w 14-dniowych wycinkach in vitro można zaobserwować przerostowe astrocyty glejowe fibrylarne z dodatnim białkiem CD3 dodatnim, co sugeruje postępującą aktywację astrocytów A1. Przygotuj plastry kory nosa i hipokampa z najwyższą starannością. Upewnij się, że usunąłeś nadmiar tkanki powyżej hipokampa, ponieważ może to zagrozić integralności plastrów podczas krojenia.

Deficyt strukturalny będzie miał negatywny wpływ na rentowność segmentów. Oprócz zademonstrowanych podejść, w tym systemie można zastosować mnóstwo testów, takich jak analiza Western blot, PCR w czasie rzeczywistym i ELISA, aby odpowiedzieć na konkretne pytania dotyczące epileptogenezy.