Analiza fenotypu szkieletowego modelu myszy z warunkową delecją Stat3

Genetycznie modyfikowane modele myszy są potężnymi narzędziami do badania mechanizmów chorób u ludzi in vivo. Analiza fenotypu szkieletu myszy jest podstawą badań szkieletowych. Artykuł ten opisuje kilka typowych technik analizy fenotypu szkieletu, które mogą być interesujące dla tych, którzy są nowicjuszami w badaniach nad tkankami szkieletowymi.

Próbując tej cząsteczki, pamiętaj, że eksperymenty na zwierzętach wymagają czasu, więc zbierz jak najwięcej wysokiej jakości próbek podczas każdego eksperymentu, nawet jeśli nie potrzebujesz ich w krótkim okresie. Zacznij od umieszczenia uśpionej myszy w pozycji leżącej na plecach i delikatnie ręcznie zwichnąć obustronne stawy biodrowe. Użyj nożyczek okulistycznych, aby pionowo odciąć skórę od dystalnej kości piszczelowej, a następnie usuń całą skórę z tylnej kończyny.

Odetnij więzadło stawowe prawego stawu biodrowego i stawu kolanowego nożyczkami, aby oddzielić kończynę tylną. Następnie przetnij kość na obu końcach, aby całkowicie zanurzyć kość w 4% PFA. Przetnij krętarz i połączenie kości strzałkowej.

Zanurz tylną kończynę w 4% PFA, pozostawiając prawą tylną kończynę do cięcia parafiny. Przetnij nożyczkami więzadła stawowe lewego stawu biodrowego i kolanowego i delikatnie usuń tkankę miękką. Oddziel kość piszczelową i kość udową i zanurz je osobno w 75% etanolu.

Zachowaj kość udową do mikrotomografii komputerowej, a piszczele do podwójnego znakowania kalceiną i alizaryną na czerwono. Aby przygotować skrawki parafiny, delikatnie umyj nieruchomą prawą kończynę tylną trzy razy PBS przez 10 minut na pranie. Następnie odwapniaj go w 15% EDTA za pomocą odkamieniacza ultradźwiękowego przez trzy do czterech tygodni, aż kości będą mogły zostać zgięte, wymieniając płyn odwapniający co drugi dzień.

Po odwapnieniu umyj próbki trzykrotnie PBS i zanurz je w 75% etanolu w temperaturze czterech stopni Celsjusza na noc. Drugiego dnia sekwencyjnie zanurz próbki w 95% etanolu, 100% etanolu i ksylenie na jedną godzinę każda. Zanurz próbki w połowie ksylenu i połowie parafiny na 30 minut, a następnie w parafinie w temperaturze 65 stopni Celsjusza na noc.

Aby osadzić próbkę, zanurz ją w parafinie, umieszczając kość udową i piszczelową pod kątem 90 stopni. Gdy parafina całkowicie ostygnie, wyjmij próbki ze zbiornika do zatapiania. Ponumeruj i przechowuj je przez noc w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Porcje parafiny pieczemy w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 30 minut, a następnie woskujemy je, zanurzając je w ksylenie na 10 minut. Za każdym razem zanurz sekcje trzykrotnie w świeżym ksylenie. Ponownie nawodnij sekcje, zanurzając je kolejno w 100% etanolu, 95% etanolu, 70% etanolu i wodzie destylowanej na pięć minut każda.

Przygotuj roztwór barwiący za pomocą zestawu do barwienia TRAP i podgrzej go do 37 stopni Celsjusza. Dodaj 50 do 100 mikrolitrów roztworu barwiącego do każdej sekcji i inkubuj je w wilgotnej komorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 do 30 minut. Sprawdzaj stan barwienia osteoklastów pod mikroskopem świetlnym co pięć minut, aż pojawią się czerwone wielojądrowe osteoklasty.

Następnie zakończ reakcję wodą. Przeciwbarwić skrawki w roztworze hematoksyliny przez 30 sekund i uzyskać stabilny niebieski kolor, zanurzając je w 1% roztworze amoniaku na jedną minutę. Następnie opłucz je w wolno płynącej wodzie z kranu.

Zamontuj sekcje za pomocą szkiełek nakrywkowych z neutralnym balsamem i wysusz je przez noc. Uchwyć od trzech do pięciu pól widzenia za pomocą mikroskopu i przeanalizuj obwód beleczkowania za pomocą obrazu J. Użyj narzędzia linii prostej, aby zmierzyć długość podziałki liniowej jako L1. Następnie użyj narzędzia Linia segmentowa, aby zmierzyć długość obwodu beleczki jako L2. Oblicz długość fizyczną i policz liczbę komórek dodatnich TRAP z więcej niż trzema jądrami. Po utrwaleniu delikatnie umyj piszczele trzykrotnie PBS i kolejno zanurz próbki w 95% etanolu, 100% etanolu i ksylenie na pięć minut każda.

Zanurz próbki w acetonie na 12 godzin, a następnie w połowie acetonu i połowie żywicy na dwie godziny, a następnie w czystej żywicy w piecu do suszenia na noc. Dodaj czystą żywicę do odpowiedniego zbiornika do zatapiania żelu krzemionkowego i umieść próbki w zbiorniku, unikając pęcherzyków. Polimeryzuj żywicę w piecu suszącym w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 48 godzin.

Pociąć próbki na odcinki o grubości pięciu mikrometrów w sposób ciągły za pomocą mikrotomu obrotowego i przechowywać resztę próbek ze środkiem osuszającym w temperaturze pokojowej. Przyklej skrawki pęsetą w kropli 75% etanolu i przymocuj je do szkiełek nakrywkowych za pomocą neutralnego balsamu. Uchwyć czerwone i zielone znakowanie fluorescencyjne za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Myszy z delecją Stat3 specyficzne dla osteoklastów zostały wygenerowane w celu zbadania wpływu delecji Stat3 na różnicowanie osteoklastów. Rekonstrukcja kości udowej i analiza ilościowa za pomocą mikro CT wykazały, że masa kostna myszy Stat3 Ctsk była zwiększona w porównaniu z myszami typu dzikiego. Morfologię histo kości udowej myszy typu dzikiego i Stat3 Ctsk badano za pomocą barwienia H i E.

Aktywność osteoklastogenną wykryto za pomocą barwienia TRAP. Osteoklasty to duże komórki TRAP dodatnie z wieloma jądrami. Liczba osteoklastów TRAP dodatnich była niższa u myszy Stat3 Ctsk w porównaniu z myszami typu dzikiego, co wskazuje, że niedobór Stat3 upośledzał tworzenie osteoklastów.

Osteogenezę mierzono za pomocą podwójnego znakowania kalceiną i czerwoną alizaryną. Obszar między kalceiną a czerwoną fluorescencją alizaryny reprezentuje nowo utworzoną kość. Delecjonowany Stat3 w osteoklastach nie wpływał na anabolizm kostny.

Strzałkowe odcinki parafiny, w których później chrząstka była symetryczna, co pokazało, że zastosowano tu wyraźną linię w kształcie litery M. Do badań uwzględnimy więcej cech układu kostnego, takich jak właściwości mechaniczne.