Name: Analiza fenotypu szkieletowego modelu myszy z warunkową delecją Stat3 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Poznaj analizę fenotypu szkieletowego myszy z delecją Stat3 w osteoklastach. Metoda obejmuje barwienie TRAP, mikro-CT i podwójne znakowanie fluorescencyjne. Badanie ujawnia rolę genu w regulacji masy kostnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Prof. Weiguo Zou i S. Kato za odczynniki i myszy oraz członkom laboratorium Zou za przydatne dyskusje. Dziękujemy również Laboratorium Stomatologii Cyfrowej i Centrum Badawczemu Anomalii Twarzoczaszki Dziewiątego Szpitala Ludowego w Szanghaju za pomoc. Praca ta była częściowo wspierana przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (NSFC) [81570950,81870740,81800949], Shanghai Summit & Plateau Disciplines, funduszu SHIPM-mu z Shanghai Institute of Precision Medicine, Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine [JC201809], Projektu Motywacyjnego Zespołu ds. Innowacji Wysokiego Szczebla dla Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Interdyscyplinarny Fundusz Badawczy Dziewiątego Szpitala Ludowego w Szanghaju, Szkoła Medyczna Uniwersytetu JiaoTong w Szanghaju [JYJC201902]. L.J. jest stypendystą Outstanding Youth Medical Talents, Programu Rozwoju Młodzieży "Rising Stars of Medical Talent" w Szanghaju oraz projektu "Chen Xing" na Uniwersytecie Jiaotong w Szanghaju.

Wszystkie metody związane z opisywanymi tutaj zwierzętami zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Szkoły Medycznej Uniwersytetu Jiaotong w Szanghaju.
1. Hodowla myszy z delecją Stat3 specyficzną dla osteoklastów
UWAGA: MyszyStat3 fl/fl zostały pozyskane komercyjnie. Mysz Ctsk-Cre dostarczył S. Kato (Uniwersytet Tokijski, Tokio, Japonia12). Myszy były hodowane i utrzymywane w określonych warunkach wolnych od patogenów (SPF) w instytucjonalnym obiekcie dla zwierząt w znormalizowanych warunkach.
<ol>
	<li>Połącz dojrzałego płciowo samca myszy z dwiema samicami myszy w tym samym wieku. Po 18 dniach sprawdzaj codzienne kontrole noworodków. Oddziel ciężarne samice myszy i trzymaj je w spokoju, jeśli to konieczne. Zmień samce myszy między różnymi klatkami hodowlanymi, jeśli samice myszy nie były w ciąży w ciągu 1 miesiąca od parowania.</li>
	<li>Skrzyżuj myszy fl / fl Stat3 z myszami Ctsk-Cre (F0). Przytnij ogony w celu genotypowania i zachowaj samca Stat3fl/+; Myszy Ctsk-Cre do momentu osiągnięcia dojrzałości płciowej, czyli do około 6 tygodnia życia (F1). Użyj następujących starterów: Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Ctsk-cre F-GAACGCACTGATTTCGACCA; Ctsk-cre R-GCTAACCAGCGTTTTCGTTC.</li>
	<li>Krzyżówka 6-tygodniowego samca Stat3fl/+; Myszy Ctsk-Cre z samicami myszy Stat3 fl / fl. Przytnij ogony w celu genotypowania i zachowaj samca Stat3 fl/fl; Myszy Ctsk-Cre do momentu osiągnięcia dojrzałości płciowej, czyli do około 6 tygodnia życia (F2).</li>
	<li>Krzyżówka 6-tygodniowego samca Stat3 fl/fl; Myszy Ctsk-Cre z samicami myszy Stat3 fl / fl (F3). Obetnij ogony w celu genotypowania i z czasem zastąp stare myszy hodowlane młodszymi myszami (F3+N).</li>
</ol>
2. Pobieranie próbek
<ol>
	<li>Poddaj eutanazji sześć par 8-tygodniowych samców myszy Stat3fl/fl i Stat3Ctsk z miotu oddzielnie z uduszeniem dwutlenkiem węgla. 
	UWAGA: Natężenie przepływu CO2 wypiera 30% objętości klatki na minutę (np. w przypadku klatki o wymiarach 45 cm x 30 cm x 30 cm natężenie przepływu CO2 wynosi 40 l/min).</li>
	<li>Umieść myszy w pozycji leżącej. Delikatnie zwichnij obustronne stawy biodrowe ręką. Użyj nożyczek okulistycznych, aby odciąć skórę pionowo od dystalnej kości piszczelowej, a następnie wypreparuj całą skórę od kończyny tylnej.</li>
	<li>Odetnij więzadło stawowe prawego stawu biodrowego i stawu kolanowego nożyczkami, aby oddzielić kończynę tylną. Przetnij krętarz i połączenie kości strzałkowej, a następnie zanurz tylną kończynę w 4% paraformaldehydzie. Zachowaj prawe kończyny tylne w kroku 3. Odpowiednio przeciąć kość na obu końcach, aby całkowicie zanurzyć i utrwalić szpik kostny za pomocą 4% paraformaldehydu.</li>
	<li>Przetnij nożyczkami więzadło stawowe lewego stawu biodrowego i stawu kolanowego, delikatnie usuń tkankę miękką i ostrożnie oddziel kość piszczelową i udową. Zanurz kość piszczelową i kość udową osobno w 75% etanolu. Zachowaj kość udową w kroku 4 i piszczele w kroku 6. Upewnij się, że krętarz jest nienaruszony.</li>
</ol>
3. Przygotowanie sekcji parafinowej
<ol>
	<li>Umocuj prawą tylną kończynę w 4% paraformaldehydzie w temperaturze 4 °C przez 48 godzin.</li>
	<li>Odwapnienie: Delikatnie umyj próbki 1x PBS przez 10 minut 3 razy. Odwapnić próbki w 15% EDTA (150 g EDTA w 800 ml ddH2O i 100 ml 10x PBS) za pomocą odkamieniacza ultradźwiękowego przez 3 do 4 tygodni, aż kości będą mogły być zgięte. Wymieniaj na świeży płyn odwapniający co drugi dzień.</li>
	<li>Delikatnie umyj próbki 3x 1x PBS, a następnie zanurz je w 75% etanolu w temperaturze 4 °C na noc.</li>
	<li>Odwodnić: Drugiego dnia kolejno zanurz próbki w 95% etanolu, 100% etanolu i ksylenie, każdy na 1 godzinę dwa razy.</li>
	<li>Zanurzyć próbki w parafinie 1/2 ksylenu 1/2 na 30 minut. Zanurzyć próbki w parafinie w temperaturze 65 °C na noc.</li>
	<li>Osadzanie: Wybierz odpowiedni zbiornik do osadzania. Umieść piszczel równomiernie pod spodem. Umieść kość udową i piszczel pod kątem 90°. Po całkowitym ostygnięciu i zestaleniu się parafiny wyjmij ją ze zbiornika do zatapiania. Ponumeruj próbki i przechowuj je przez noc w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Ciąć odcinki o grubości 5 μm w sposób ciągły za pomocą mikrotomu. Wytnij 20–40 sekcji. Rozłóż skrawki na wodzie o temperaturze 37 °C, przyklej je do szkiełek mikroskopowych i piecz w temperaturze 42 °C przez noc.</li>
</ol>
4. Skanowanie i analiza mikrotomografii komputerowej
<ol>
	<li>Zeskanuj lewą kość udową za pomocą mikrotomografu komputerowego. Rozdzielczość: 10 μm; Napięcie: 70 kV; Prąd: 114 μA; Fliter: 0,5 mm Al; Krok obrotu: 0,5°.</li>
	<li>Rekonstruuj obrazy 3D kości korowej i kości beleczkowej za pomocą oprogramowania pomocniczego skanera zgodnie z instrukcjami producenta. ROI występują w kości beleczkowej o łącznej szerokości 1 mm w pobliżu dystalnej płytki wzrostowej oraz w całkowitym odcinku kości korowej o szerokości 1 mm w środku kości udowej.</li>
	<li>Oblicz ilościowe parametry mikroarchitektury: gęstość mineralną kości (BMD), frakcję objętościową kości (BV/TV), grubość beleczka (Tb.Th.), liczbę beleczkową (Tb.N.), separację beleczkową (Tb.Sp.) i grubość kości korowej (Ct.Th.).</li>
</ol>
5. Barwienie PUŁAPKI
<ol>
	<li>Porcje parafiny pieczemy w temperaturze 65°C przez 30 minut.</li>
	<li>Odwoskowanie: Zanurz skrawki w ksylenie na 10 minut. Wykonaj ten krok 3 razy ze świeżym ksylenem.</li>
	<li>Ponowne nawodnienie: Zanurz sekcje kolejno w 100% etanolu, 95% etanolu, 70% etanolu i ddH2O, każda na 5 minut dwa razy.</li>
	<li>Przygotować roztwór barwiący za pomocą zestawu do barwienia TRAP zgodnie z instrukcjami producenta i ogrzać do temperatury 37 °C. 
	UWAGA: Roztwór barwiący TRAP powinien być świeżo przygotowany bezpośrednio przed każdym badaniem.</li>
	<li>Do każdej próbki dodać 50–100 μl roztworu barwiącego i inkubować w wilgotnej komorze o temperaturze 37 °C przez 20–30 minut. Sprawdzaj stan wybarwienia osteoklastów pod mikroskopem świetlnym co 5 minut, aż do momentu, gdy pojawią się czerwone wielojądrkowe osteoklasty. Zakończyć reakcję za pomocą ddH2O.</li>
	<li>Barwienie przeciwstawne w roztworze hematoksyliny przez 30 s. Stwórz stabilny niebieski kolor, zanurzając go w 1% roztworze amoniaku na 1 min. Spłucz w wolno płynącej wodzie z kranu.</li>
	<li>Zamontuj sekcje z szkiełkami nakrywkowymi za pomocą neutralnego balsamu i wysusz przez noc.</li>
	<li>Uchwyć 3–5 interesujących obszarów za pomocą mikroskopu. Przeanalizuj obwód beleczkowy za pomocą obrazu J: zmierz długość podziałki liniowej (Ls) za pomocą narzędzia "linia prosta" jako L1, a następnie zmierz długość obwodu beleczkowania za pomocą narzędzia "linia segmentowa" jako L2, długość fizyczna (Lp) = Ls*L2 /L1). Policz liczbę komórek TRAP-dodatnich z więcej niż trzema jądrami.</li>
</ol>
6. Podwójne etykietowanie kalceiny i alizaryny na czerwono
<ol>
	<li>Przygotowanie próbki: Dootrzewnowo wstrzyknąć 20 mg/kg kalceiny (1 mg/ml w 2% roztworze NaHCO3) w dniu 0 i 25 mg/kg czerwieni alizarynowej S (AL, 2 mg/ml w H2O) w dniu 4. Ofiaruj myszy w dniu 7. Ostrożnie odłączyć piszczele i utrwalić w 4% paraformaldehydu w temperaturze 4 °C przez 48 godzin.</li>
	<li>Odwodnienie: Po utrwaleniu delikatnie umyj piszczele 3x za pomocą 1x PBS. Sekwencyjnie zanurz próbki w 95% etanolu, 100% etanolu i ksylenie na 5 minut dwa razy osobno.</li>
	<li>Zanurz próbki w acetonie na 12 godzin, w żywicy 1/2 acetonu 1/2 na 2 godziny, a w czystej żywicy w piecu suszącym na noc. 
	UWAGA: Żywica została przygotowana z dostępnej na rynku żywicy (np. Embed 812 Resin) zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Osadzanie: Dodaj czystą żywicę do odpowiedniego zbiornika do zatapiania żelu krzemionkowego i delikatnie umieść próbki, aby uniknąć pęcherzyków. Polimeryzować żywicę w piecu suszącym w temperaturze 60 °C przez 48 godzin.</li>
	<li>Próbki należy ciąć w sposób ciągły na odcinki o grubości 5 μm za pomocą mikrotomu obrotowego. Pozostałe próbki należy przechowywać ze środkiem osuszającym w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przyklej skrawki pęsetą w kropli 75% alkoholu. Zamontuj sekcje z szkiełkami nakrywkowymi za pomocą neutralnego balsamu. Uchwyć czerwone i zielone znakowanie fluorescencyjne za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
	<li>Zmierz szerokość między dwiema liniami etykietowania (IRL.Wi), obwodem beleczkowym z pojedynczym znacznikiem (sL.Pm), podwójnie oznakowanym obwodem beleczkowym (dL.Pm) i całkowitym obwodem beleczkowania (Tb.Pm). Oblicz szybkość apozycji minerałów (MAR) i szybkość tworzenia kości (BFR/BS). MAR = Ir.L.Wi/dni interwału. BFR/BS= (dL.Pm±sL.Pm/2)*MAR/Tb.Pm*100 %.</li>
</ol>

<ol><li>Zaidi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+remodeling+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Skeletal remodeling in health and disease.</a> Nature Medicine. 13 (7), 791-801 (2007).</li>
<li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+differentiation+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li>
<li>Cummings, S. R., Melton, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+and+outcomes+of+osteoporotic+fractures%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Epidemiology and outcomes of osteoporotic fractures.</a> Lancet. 359 (9319), 1761-1767 (2002).</li>
<li>Black, D. M., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Practice.+Postmenopausal+Osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Clinical Practice. Postmenopausal Osteoporosis.</a> New England Journal of Medicine. 374 (3), 254-262 (2016).</li>
<li>Kos, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre%2FloxP+system+for+generating+tissue-specific+knockout+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrition+reviews%22%5BJournal%5D)">Cre/loxP system for generating tissue-specific knockout mouse models.</a> Nutrition reviews. 62 (6), Pt 1 243-246 (2004).</li>
<li>Elefteriou, F., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mouse+models+for+bone+studies-Strengths+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Genetic mouse models for bone studies-Strengths and limitations.</a> Bone. 49 (6), 1242-1254 (2011).</li>
<li>Hirano, T., Ishihara, K., Hibi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+STAT3+in+mediating+the+cell+growth%2C+differentiation+and+survival+signals+relayed+through+the+IL-6+family+of+cytokine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Roles of STAT3 in mediating the cell growth, differentiation and survival signals relayed through the IL-6 family of cytokine receptors.</a> Oncogene. 19 (21), 2548-2556 (2000).</li>
<li>Yu, H., Lee, H., Herrmann, A., Buettner, R., Jove, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+STAT3+signalling+in+cancer%3A+new+and+unexpected+biological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Revisiting STAT3 signalling in cancer: new and unexpected biological functions.</a> Nature Reviews Cancer. 14 (11), 736-746 (2014).</li>
<li>Itoh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+interleukin-6+family-mediated+Stat3+activation+in+osteoblast+differentiation+and+bone+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">A critical role for interleukin-6 family-mediated Stat3 activation in osteoblast differentiation and bone formation.</a> Bone. 39 (3), 505-512 (2006).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblast%2Fosteocyte-specific+inactivation+of+Stat3+decreases+load-driven+bone+formation+and+accumulates+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Osteoblast/osteocyte-specific inactivation of Stat3 decreases load-driven bone formation and accumulates reactive oxygen species.</a> Bone. 49 (3), 404-411 (2011).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+controls+osteoclast+differentiation+and+bone+homeostasis+by+regulating+NFATc1+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">STAT3 controls osteoclast differentiation and bone homeostasis by regulating NFATc1 transcription.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (42), 15395-15407 (2019).</li>
<li>Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+prevents+bone+loss+via+estrogen+receptor+alpha+and+induction+of+Fas+ligand+in+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Estrogen prevents bone loss via estrogen receptor alpha and induction of Fas ligand in osteoclasts.</a> Cell. 130 (5), 811-823 (2007).</li>
<li>Kim, H., Kim, M., Im, S. K., Fang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Cre-LoxP+system%3A+general+principles+to+determine+tissue-specific+roles+of+target+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+animal+research%22%5BJournal%5D)">Mouse Cre-LoxP system: general principles to determine tissue-specific roles of target genes.</a> Laboratory animal research. 34 (4), 147-159 (2018).</li>
<li>Minkin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+acid+phosphatase%3A+tartrate-resistant+acid+phosphatase+as+a+marker+of+osteoclast+function%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">Bone acid phosphatase: tartrate-resistant acid phosphatase as a marker of osteoclast function.</a> Calcified Tissue International. 34 (3), 285-290 (1982).</li>
<li>Vaaraniemi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+machinery+for+matrix+degradation+in+bone-resorbing+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Intracellular machinery for matrix degradation in bone-resorbing osteoclasts.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 19 (9), 1432-1440 (2004).</li>
<li>Ljusberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+excision+of+a+repressive+loop+domain+in+tartrate-resistant+acid+phosphatase+by+cathepsin+K+in+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Proteolytic excision of a repressive loop domain in tartrate-resistant acid phosphatase by cathepsin K in osteoclasts.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (31), 28370-28381 (2005).</li>
<li>Janckila, A. J., Takahashi, K., Sun, S. Z., Yam, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naphthol-ASBI+phosphate+as+a+preferred+substrate+for+tartrate-resistant+acid+phosphatase+isoform+5b%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Naphthol-ASBI phosphate as a preferred substrate for tartrate-resistant acid phosphatase isoform 5b.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 16 (4), 788-793 (2001).</li>
<li>Janckila, A. J., Li, C. Y., Lam, K. W., Yam, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytochemistry+of+tartrate-resistant+acid+phosphatase.+Technical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">The cytochemistry of tartrate-resistant acid phosphatase. Technical considerations.</a> American Journal of Clinical Pathology. 70 (1), 45-55 (1978).</li>
<li>Janckila, A. J., Simons, R. M., Yam, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+immunoassay+for+tartrate-resistant+acid+phosphatase+isoform+5b+using+the+fluorogenic+substrate+naphthol+ASBI-phosphate+and+heparin%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%3A+International+Journal+of+Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Alternative immunoassay for tartrate-resistant acid phosphatase isoform 5b using the fluorogenic substrate naphthol ASBI-phosphate and heparin.</a> Clinica Chimica Acta: International Journal of Clinical Chemistry. 347 (1-2), 157-167 (2004).</li>
<li>Janckila, A. J., Yam, L. T., Li, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoalkaline+phosphatase+cytochemistry.+Technical+considerations+of+endogenous+phosphatase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Immunoalkaline phosphatase cytochemistry. Technical considerations of endogenous phosphatase activity.</a> American Journal of Clinical Pathology. 84 (4), 476-480 (1985).</li>
<li>Solberg, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+tartrate-resistant+Acid+phosphatase+expression+in+osteoblasts+and+osteocytes+in+experimental+osteoporosis+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">Increased tartrate-resistant Acid phosphatase expression in osteoblasts and osteocytes in experimental osteoporosis in rats.</a> Calcified Tissue International. 94 (5), 510-521 (2014).</li>
<li>Tambutté, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcein+labelling+and+electrophysiology%3A+insights+on+coral+tissue+permeability+and+calcification%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings.+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Calcein labelling and electrophysiology: insights on coral tissue permeability and calcification.</a> Proceedings. Biological Sciences. 279 (1726), 19-27 (2012).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lkb1+deletion+in+periosteal+mesenchymal+progenitors+induces+osteogenic+tumors+through+mTORC1+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Lkb1 deletion in periosteal mesenchymal progenitors induces osteogenic tumors through mTORC1 activation.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (5), 1895-1909 (2019).</li>
<li>Dai, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR%2FRaptor+signaling+is+critical+for+skeletogenesis+in+mice+through+the+regulation+of+Runx2+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">mTOR/Raptor signaling is critical for skeletogenesis in mice through the regulation of Runx2 expression.</a> Cell Death and Differentiation. 24 (11), 1886-1899 (2017).</li>
<li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+demethylase+LSD1+regulates+bone+mass+by+controlling+WNT7B+and+BMP2+signaling+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Research%22%5BJournal%5D)">Histone demethylase LSD1 regulates bone mass by controlling WNT7B and BMP2 signaling in osteoblasts.</a> Bone Research. 6, 14(2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Genetycznie modyfikowane modele myszy są powszechnie stosowane do badania mechanizmu i leczenia farmakologicznego chorób u ludzi13. Myszy Ctsk-Cre są szeroko stosowane do badań funkcjonalnych osteoklastów6. W niniejszej pracy opisano protokoły metod analizy fenotypu szkieletu oraz badania krytycznych genów kontrolujących aktywność osteoklastów in vivo.
Analiza histologiczna jest najlepszą intuicyjną metodą wykrywania metabolizmu kości. A...

Kość szkieletowa jest głównym organem nośnym ludzkiego ciała i jest pod presją zarówno ze strony środowiska wewnętrznego, jak i zewnętrznego podczas chodzenia i ćwiczeń1. Przez całe życie kości nieustannie przechodzą samoodnowę, która jest równoważona przez osteoblasty i osteoklasty. Proces oczyszczania starych kości przez osteoklasty i tworzenie nowych kości przez osteoblasty utrzymuje homeostazę i funkcję mechaniczną układu kostnego2. Zaburzenia równowagi mogą wywoływać choroby metaboliczne kości, takie jak osteoporoza. Osteoporoza, która jest spowodowana nadmierną aktywnością osteoklastyczną, jest powszechna na całym świecie i powoduje znaczne straty ekonomiczne dla społeczeństwa2,3,4. Ze względu na ograniczoną liczbę leków dostępnych w leczeniu osteoporozy i ryzyko wystąpienia działań niepożądanych4, ważne jest, aby ujawnić szczegóły dotyczące powstawania i aktywności osteoklastów.
Osteoklasty wywodzące się z linii hematopoetycznej monocytów/makrofagów mają wiele jąder (mogą mieć od 2 do 50 jąder) i są duże (zwykle o średnicy większej niż 100 μm)2. Chociaż badanie mechanizmów i badania przesiewowe leków na zaburzenia osteoklastyczne zostały znacznie ulepszone dzięki hodowli osteoklastów in vitro, skomplikowane reakcje organiczne sprawiają, że dowody in vivo są niezbędne dla terapii celowanej. Ze względu na genetyczne i patofizjologiczne podobieństwa między myszami a ludźmi, genetycznie modyfikowane modele myszy są powszechnie używane do badania mechanizmów i leczenia farmaceutycznego chorób u ludzi in vivo6. System Cre-loxP jest szeroko stosowaną technologią edycji genów myszy i umożliwił naukowcom badanie funkcji genów w sposób specyficzny dla tkanki/komórki5. Katepsyna K (CSTK) to proteaza cysteinowa wydzielana przez osteoklasty, która może degradować kolagen kostny8. Powszechnie przyjmuje się, że CTSK ulega selektywnej ekspresji w dojrzałych osteoklastach; dlatego myszy Ctsk-Cre są uważane za użyteczne narzędzie do badań funkcjonalnych osteoklastów i były używane6.
Rodzina przetworników sygnału i aktywatorów transkrypcji (STAT) jest klasyczna i bardzo istotna w odporności oraz progresji i rozwoju raka7,8. Spośród siedmiu STAT, STAT3 jest najbardziej istotny dla homeostazy kości9,10. Kilka badań in vivo wykazało, że specyficzna inaktywacja STAT3 w osteoblastach zmniejsza tworzenie kości9,10. Niemniej jednak solidne dowody dotyczące udziału STAT3 w tworzeniu osteoklastów i metabolizmie kości in vivo są nadal ograniczone. Niedawno dostarczyliśmy dowody in vivo z mysim modelem delecji Stat3 specyficznym dla osteoklastów (Stat3fl/fl; Ctsk-Cre, zwany dalej Stat3Ctsk), że STAT3 uczestniczy w różnicowaniu osteoklastów i metabolizmie kości11. W niniejszym badaniu opisujemy metody i protokoły, które zastosowaliśmy do analizy zmian masy kostnej, histomorfologii kości oraz anabolizmu kostnego i katabolizmu myszy Stat3Ctsk w celu zbadania wpływu delecji STAT3 specyficznej dla osteoklastów na homeostazę kości.

<table><tbody><tr><td>4% roztwór paraformaldehydu</td><td>Sangon biotech Co., Ltd.</td><td></td><td></td>E672002</tr><tr><td>Aceton</td><td>Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.</td><td></td><td></td>80000360</tr><tr><td>Alizarin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5533</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór amoniaku</td><td>Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Myszy</td><td></td><td></td> Calcein Sigma-Aldrich C0875<td></td></tr><tr><td>Ctsk-Cre</td><td>prezent od S. Kato, Uniwersytet Tokijski, Tokio, Japonia</td>Nauki o mikroskopii elektronowej DDSA 13710 DeCa RapidlyDecalcifier Pro-Cure DX1100 DMP-30 Mikroskopia elektronowa Sciences 13600 <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Szanghaj Eksperymentalny odczynnik Co., Ltd.</td><td>60-00-4</td><td></td></tr><tr><td>EMBED 812 ŻYWICA</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>14900</td><td></td></tr><tr><td>mikroskop fluorescencyjny</td><td>Olympus</td><td>IX73</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór hematoksyliny</td><td>Beyotime Biotechanology</td><td>C0107</td><td></td></tr><tr><td>Micro-CT</td><td>Scanco Medical AG</td> <td>&mu; CT 80</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Eksperymentalny odczynnik w Szanghaju Co., Ltd.</td><td></td><td></td>10018918</tr><tr><td>Neutralny balsam</td><td>Sangon biotech Co., Ltd.</td><td></td><td></td>E675007</tr><tr><td>NMA</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>19000</td><td></td></tr><tr><td>Parafina</td><td>Sangon biotech Co., Ltd.</td><td></td><td></td>A601889</tr><tr><td>mikrotom obrotowy</td><td>Leica</td><td>RM2265</td><td></td></tr><tr><td>Stat3fl/fl</td><td>myszy GemPharmatech Co., Ltd</td><td>D000527</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do barwienia TRAP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A</td><td></td></tr><tr><td>xylene</td><td>Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.</td><td>Numer katalogowy: 1330-20-7</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza fenotypu szkieletowego modelu myszy z warunkową delecją stat3

Skeletal Phenotype Analysis of a Conditional Stat3 Deletion Mouse Model

Transgeniczne modele myszy są potężne w zrozumieniu kluczowych genów kontrolujących różnicowanie i aktywność osteoklastów, a także w badaniu mechanizmów i leczenia farmakologicznego osteoporozy. Myszy katepsyna K (Ctsk)-Cre są szeroko stosowane do badań funkcjonalnych osteoklastów. Przetwornik sygnału i aktywator transkrypcji 3 (STAT3) jest istotny w homeostazie kości, ale jego rola w osteoklastach in vivo pozostaje słabo zdefiniowana. Aby dostarczyć dowodów in vivo, że STAT3 uczestniczy w różnicowaniu osteoklastów i metabolizmie kości, stworzyliśmy swoisty dla osteoklastów mysi model delecji Stat3 (Stat3 fl/fl; Ctsk-Cre) i przeanalizował jego fenotyp szkieletowy. Skanowanie mikro-CT i rekonstrukcja 3D sugerowały zwiększoną masę kostną u myszy z warunkowym nokautem. Przeprowadzono barwienie H&E, podwójne barwienie kalceiną i czerwienią alizarynową oraz barwienie kwaśną fosfatazą odporną na winian (TRAP) w celu wykrycia metabolizmu kości. Krótko mówiąc, protokół ten opisuje niektóre kanoniczne metody i techniki analizy fenotypu szkieletu i badania krytycznych genów kontrolujących aktywność osteoklastów in vivo.

Zastosowanie niniejszego protokołu pozwoliło na wytworzenie myszy z specyficzną dla osteoklastów delecją genu Stat3 w celu zbadania wpływu braku STAT3 na różnicowanie osteoklastów. Myszy Stat3Ctsk oraz ich dzikie (WT) rodzeństwo z jednego miotu były rozmnażane i utrzymywane po wykonaniu genotypowania. Makrofagi szpiku kostnego zostały wyizolowane i poddane hodowli w celu różnicowania w osteoklasty, co pozwoliło potwierdzić delecję STAT3 u myszy Stat3Ctsk ...

Ten protokół opisuje kanoniczną metodę zrozumienia krytycznych genów kontrolujących aktywność osteoklastów in vivo. Metoda ta wykorzystuje transgeniczny model myszy i niektóre techniki kanoniczne do analizy fenotypu szkieletu.

Analiza fenotypu szkieletowego modelu myszy z warunkową delecją Stat3

Transgenic mouse models are powerful for understanding the critical genes controlling osteoclast differentiation and activity, and for studying mechanisms ...

Genetycznie modyfikowane modele myszy są potężnymi narzędziami do badania mechanizmów chorób u ludzi in vivo. Analiza fenotypu szkieletu myszy jest podstawą badań szkieletowych. Artykuł ten opisuje kilka typowych technik analizy fenotypu szkieletu, które mogą być interesujące dla tych, którzy są nowicjuszami w badaniach nad tkankami szkieletowymi.Próbując tej cząsteczki, pamiętaj, że eksperymenty na zwierzętach wymagają czasu, więc zbierz jak najwięcej wysokiej jakości próbek podczas każdego eksperymentu, nawet jeśli nie potrzebujesz ich w krótkim okresie. Zacznij od umieszczenia uśpionej myszy w pozycji leżącej na plecach i delikatnie ręcznie zwichnąć obustronne stawy biodrowe. Użyj nożyczek okulistycznych, aby pionowo odciąć skórę od dystalnej kości piszczelowej, a następnie usuń całą skórę z tylnej kończyny.Odetnij więzadło stawowe prawego stawu biodrowego i stawu kolanowego nożyczkami, aby oddzielić kończynę tylną. Następnie przetnij kość na obu końcach, aby całkowicie zanurzyć kość w 4% PFA. Przetnij krętarz i połączenie kości strzałkowej.Zanurz tylną kończynę w 4% PFA, pozostawiając prawą tylną kończynę do cięcia parafiny. Przetnij nożyczkami więzadła stawowe lewego stawu biodrowego i kolanowego i delikatnie usuń tkankę miękką. Oddziel kość piszczelową i kość udową i zanurz je osobno w 75% etanolu.Zachowaj kość udową do mikrotomografii komputerowej, a piszczele do podwójnego znakowania kalceiną i alizaryną na czerwono. Aby przygotować skrawki parafiny, delikatnie umyj nieruchomą prawą kończynę tylną trzy razy PBS przez 10 minut na pranie. Następnie odwapniaj go w 15% EDTA za pomocą odkamieniacza ultradźwiękowego przez trzy do czterech tygodni, aż kości będą mogły zostać zgięte, wymieniając płyn odwapniający co drugi dzień.Po odwapnieniu umyj próbki trzykrotnie PBS i zanurz je w 75% etanolu w temperaturze czterech stopni Celsjusza na noc. Drugiego dnia sekwencyjnie zanurz próbki w 95% etanolu, 100% etanolu i ksylenie na jedną godzinę każda. Zanurz próbki w połowie ksylenu i połowie parafiny na 30 minut, a następnie w parafinie w temperaturze 65 stopni Celsjusza na noc.Aby osadzić próbkę, zanurz ją w parafinie, umieszczając kość udową i piszczelową pod kątem 90 stopni. Gdy parafina całkowicie ostygnie, wyjmij próbki ze zbiornika do zatapiania. Ponumeruj i przechowuj je przez noc w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.Porcje parafiny pieczemy w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 30 minut, a następnie woskujemy je, zanurzając je w ksylenie na 10 minut. Za każdym razem zanurz sekcje trzykrotnie w świeżym ksylenie. Ponownie nawodnij sekcje, zanurzając je kolejno w 100% etanolu, 95% etanolu, 70% etanolu i wodzie destylowanej na pięć minut każda.Przygotuj roztwór barwiący za pomocą zestawu do barwienia TRAP i podgrzej go do 37 stopni Celsjusza. Dodaj 50 do 100 mikrolitrów roztworu barwiącego do każdej sekcji i inkubuj je w wilgotnej komorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 do 30 minut. Sprawdzaj stan barwienia osteoklastów pod mikroskopem świetlnym co pięć minut, aż pojawią się czerwone wielojądrowe osteoklasty.Następnie zakończ reakcję wodą. Przeciwbarwić skrawki w roztworze hematoksyliny przez 30 sekund i uzyskać stabilny niebieski kolor, zanurzając je w 1% roztworze amoniaku na jedną minutę. Następnie opłucz je w wolno płynącej wodzie z kranu.Zamontuj sekcje za pomocą szkiełek nakrywkowych z neutralnym balsamem i wysusz je przez noc. Uchwyć od trzech do pięciu pól widzenia za pomocą mikroskopu i przeanalizuj obwód beleczkowania za pomocą obrazu J. Użyj narzędzia linii prostej, aby zmierzyć długość podziałki liniowej jako L1. Następnie użyj narzędzia Linia segmentowa, aby zmierzyć długość obwodu beleczki jako L2. Oblicz długość fizyczną i policz liczbę komórek dodatnich TRAP z więcej niż trzema jądrami. Po utrwaleniu delikatnie umyj piszczele trzykrotnie PBS i kolejno zanurz próbki w 95% etanolu, 100% etanolu i ksylenie na pięć minut każda.Zanurz próbki w acetonie na 12 godzin, a następnie w połowie acetonu i połowie żywicy na dwie godziny, a następnie w czystej żywicy w piecu do suszenia na noc. Dodaj czystą żywicę do odpowiedniego zbiornika do zatapiania żelu krzemionkowego i umieść próbki w zbiorniku, unikając pęcherzyków. Polimeryzuj żywicę w piecu suszącym w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 48 godzin.Pociąć próbki na odcinki o grubości pięciu mikrometrów w sposób ciągły za pomocą mikrotomu obrotowego i przechowywać resztę próbek ze środkiem osuszającym w temperaturze pokojowej. Przyklej skrawki pęsetą w kropli 75% etanolu i przymocuj je do szkiełek nakrywkowych za pomocą neutralnego balsamu. Uchwyć czerwone i zielone znakowanie fluorescencyjne za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.Myszy z delecją Stat3 specyficzne dla osteoklastów zostały wygenerowane w celu zbadania wpływu delecji Stat3 na różnicowanie osteoklastów. Rekonstrukcja kości udowej i analiza ilościowa za pomocą mikro CT wykazały, że masa kostna myszy Stat3 Ctsk była zwiększona w porównaniu z myszami typu dzikiego. Morfologię histo kości udowej myszy typu dzikiego i Stat3 Ctsk badano za pomocą barwienia H i E.Aktywność osteoklastogenną wykryto za pomocą barwienia TRAP. Osteoklasty to duże komórki TRAP dodatnie z wieloma jądrami. Liczba osteoklastów TRAP dodatnich była niższa u myszy Stat3 Ctsk w porównaniu z myszami typu dzikiego, co wskazuje, że niedobór Stat3 upośledzał tworzenie osteoklastów.Osteogenezę mierzono za pomocą podwójnego znakowania kalceiną i czerwoną alizaryną. Obszar między kalceiną a czerwoną fluorescencją alizaryny reprezentuje nowo utworzoną kość. Delecjonowany Stat3 w osteoklastach nie wpływał na anabolizm kostny.Strzałkowe odcinki parafiny, w których później chrząstka była symetryczna, co pokazało, że zastosowano tu wyraźną linię w kształcie litery M. Do badań uwzględnimy więcej cech układu kostnego, takich jak właściwości mechaniczne.

skeletal-phenotype-analysis-conditional-stat3-deletion-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Tutaj prezentujemy systematyczne podejście do opracowywania fizjologicznie istotnych, czułych i specyficznych testów in vivo do interpretacji zmienności w ludzkiej patologii. Przejściowa manipulacja genetyczna poprzez mikrowstrzyknięcie WT i zmutowanych ludzkich oligonukleotydów antysensownych mRNA i morfoliny (MO) wykorzystuje podatność rozwijającego się zarodka danio pręgowanego do szybkiego oznaczania mutacji patogennych, zwłaszcza, ale nie wyłącznie, w kontekście zaburzeń rozwojowych...

In vivo (in vivo) Modelowanie chorobliwego genomu ludzkiego przy użyciu Danio rerio

Poziomy aktywności w otwartym polu są używane do oceny poziomu aktywności lokomotywy i zachowania. Protokół ten zapewnia dobrze zaprojektowany, ustandaryzowany protokół do stosowania w badaniach przedklinicznych dotyczących zaburzeń nerwowo-mięśniowych.

Pomiary behawioralne i ruchowe z wykorzystaniem otwartego systemu monitorowania aktywności w chorobach mięśni szkieletowych

Eksperymentalne potwierdzenie aktywności wzmacniacza najlepiej podejść poprzez analizę utraty funkcji. Przedstawiono tutaj skuteczny protokół, który wykorzystuje delecję za pośrednictwem CRISPR/Cas9 do badania specyficznej dla alleli regulacji transkrypcji genów w komórkach F1 ES, które zawierają genom hybrydowy (Mus musculus129 x Mus castaneus).

Generowanie delecji monoallelicznych za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w celu zbadania funkcji wzmacniacza w embrionalnych komórkach macierzystych myszy

Białka często zawierają wiele domen, które mogą pełnić różne funkcje komórkowe. Nokauty genów (KO) nie uwzględniają tej różnorodności funkcjonalnej. W tym miejscu przedstawiamy podejście oparte na wymianie kasetowej za pośrednictwem rekombinacji (RMCE) oparte na strukturze i funkcji w embrionalnych komórkach macierzystych KO, które pozwala na molekularną sekcję różnych domen funkcjonalnych lub wariantów białka.

Badania strukturyczno-funkcjonalne w embrionalnych komórkach macierzystych myszy z wykorzystaniem wymiany kasetowej za pośrednictwem rekombinazy

Celem tego protokołu jest zmiana penetracji śmiercionośnych zmutowanych fenotypów szkieletowych u danio pręgowanego poprzez selektywną hodowlę. Śmiertelne mutanty nie mogą być dorosłe do dorosłości i rozmnażane samodzielnie, dlatego ten protokół opisuje metodę śledzenia i selekcji penetracji przez wiele pokoleń za pomocą testów potomstwa.

Przesuwająca się penetracja śmiertelnych mutantów szkieletowych danio pręgowanego za pomocą testów potomstwa

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół do wykrywania i ilościowego określania poziomów białek podczas morfogenezy/patogenezy twarzoczaszki poprzez barwienie immunologiczne na przykładzie tkanek twarzoczaszki myszy. Ponadto opisano metodę przygotowania i kriosekcji nieodwapnionych tkanek twardych od młodych myszy w celu barwienia immunologicznego.

Przygotowanie tkanek i barwienie immunologiczne tkanek twarzoczaszki myszy i kości nieodwapnionej

Analiza śladów to tania alternatywa dla cyfrowych programów do analizy chodu dla badaczy kwantyfikujących nieprawidłowości ruchowe u myszy. Ze względu na swoją szybkość, prostotę i potencjał podłużny idealnie nadaje się do fenotypowania behawioralnego modeli mysich.

Tania analiza chodu do fenotypowania behawioralnego mysich modeli choroby nerwowo-mięśniowej

Tutaj proponujemy metodę efektywnego pozyskiwania pojedynczych włókien mięśniowych we wczesnych stadiach rozwoju pourodzeniowego z homozygotycznego zmutowanego modelu myszy Lamin Δ8-11, bardzo ciężkiego modelu dystrofii mięśniowej Emery'ego-Dreifussa (EDMD).

Izolacja i hodowla pojedynczych włókien mięśniowych z mysiego modelu dystrofii mięśniowej Embergla-Dreifussa we wczesnym rozwoju poporodowym

Tutaj opisujemy narzędzia i metody obliczeniowe, które umożliwiają wizualizację i analizę trzy- i czterowymiarowych danych obrazowych zarodków myszy w kontekście osiowego wydłużania i segmentacji, uzyskanych przez optyczną tomografię projekcyjną in toto oraz przez obrazowanie na żywo i barwienie immunofluorescencyjne w całości za pomocą mikroskopii wielofotonowej.

Trój- i czterowymiarowe podejścia do wizualizacji i analizy w celu badania wydłużenia osiowego i segmentacji kręgowców

To badanie dostarcza protokołu do wykorzystania indukowalnych myszy z nokautem Stat3 specyficznych dla linii osteoblastów do badania przebudowy kości pod wpływem siły ortodontycznej i opisuje metody analizy przebudowy kości wyrostka zębodołowego podczas ortodontycznego ruchu zębów, rzucając tym samym światło na biologię mechaniczną szkieletu.

Wykorzystanie indukowalnych myszy z nokautem Stat3 specyficznych dla linii osteoblastycznej do badania przebudowy kości wyrostka zębodołowego podczas ortodontycznego ruchu zębów

Tutaj szczegółowo opisujemy metodę, która opiera się na mikrotomografii komputerowej, do segmentacji i pomiaru modeli 3D kości czaszkowo-szczękowo-twarzowych u myszy, dla lepszej oceny rozwoju kości czaszkowo-szczękowo-twarzowej u myszy niż jest to możliwe przy użyciu obecnych metod.

Analiza malformacji czaszkowo-szczękowo-twarzowych u myszy za pomocą trójwymiarowej mikrotomografii komputerowej

Poznaj analizę fenotypu szkieletowego myszy z delecją Stat3 w osteoklastach. Metoda obejmuje barwienie TRAP, mikro-CT i podwójne znakowanie fluorescencyjne. Badanie ujawnia rolę genu w regulacji masy kostnej.

Analiza fenotypu szkieletowego modelu myszy z warunkową delecją Stat3

Przeglądaj więcej filmów