Przygotowanie tkanek i barwienie immunologiczne tkanek twarzoczaszki myszy i kości nieodwapnionej
May 10th, 2019
Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół do wykrywania i ilościowego określania poziomów białek podczas morfogenezy/patogenezy twarzoczaszki poprzez barwienie immunologiczne na przykładzie tkanek twarzoczaszki myszy. Ponadto opisano metodę przygotowania i kriosekcji nieodwapnionych tkanek twardych od młodych myszy w celu barwienia immunologicznego.
W tym miejscu przedstawiamy nasz prosty protokół detekcji immunofluorescencji białek na wycinkach materiałów. Ta metoda nie wymaga pobierania antygenu. Użyjemy głów myszy, w tym nieodwapnionych tkanek twardych.
Główną zaletą tej techniki jest pominięcie pobierania antygenu i odwapnienia tkanek twardych. Prowadzi to do dobrej jakości wyników barwienia immunologicznego. Ta metoda oszczędza również czas i pracę.
Metoda ta ma również zastosowanie do innych tkanek z odpowiednimi modyfikacjami. Aby zrobić ładne skrawki z nieodwapnionych tkanek, należy dalej wyciąć tkankę docelową, aby przyciąć otaczające tkanki, a jeśli to konieczne, potraktuj próbki 10% EDTA w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwa dni przed krioprotekcją. Demonstracja wizualna zapewnia szczegółowe i jasne wyjaśnienie procedury tej metody.
Na początek przygotuj jedną 10-centymetrową i kilka 3,5-centymetrowych szalek zawierających PBS i jedną 12-dołkową płytkę hodowlaną zawierającą dwa mililitry 4% PFA w PBS w każdym dołku dla każdej ciężarnej myszy i umieść je wszystkie na lodzie. Aby wypreparować zarodki ciężarnych myszy, chwyć kleszczami skórę poniżej środka brzucha myszy poddanej eutanazji, przetnij tylko skórę, a następnie delikatnie pociągnij za skórę, aby oddzielić ją od leżącej poniżej ściany mięśni brzucha. Podążając za tą samą linią nacięcia skóry, wciąć w jamę brzuszną.
Usuń macicę zawierającą ciąg zarodków. Następnie usuń zarodki, delikatnie odcinając ścianę macicy, co usunie tkanki pozazarodkowe, takie jak woreczek żółtkowy i owodnia. Odciąć i odizolować głowę od każdego zarodka, a następnie za pomocą kleszczy przenieść każdą głowę do oddzielnego dołka na 12-dołkowej płytce zawierającej 4% PFA.
Inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez cztery godziny, aby się utrwalić. Opłucz głowy w PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza, delikatnie potrząsając przez 12 godzin. Aby kriochronić głowy, przenieś je za pomocą kleszczy do nowej 12-dołkowej płytki zawierającej dwa mililitry 30% sacharozy w PBS.
Inkubować z delikatnym mieszaniem w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż główki opadną na dno naczynia. Aby osadzić głowice kriochronione, przenieś je do formy zawierającej związek o optymalnej temperaturze cięcia i równoważ przez kilka minut. Za pomocą kleszczy dostosuj położenie i kierunek próbek tak, aby przycięta strona próbek była skierowana w stronę dolnej części formy do zatapiania.
Następnie umieść formę na suchym lodzie do zamrożenia i przechowuj w plastikowej torbie w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będzie gotowa do kriosekcji. W przypadku tkanek poporodowych, po usunięciu skóry i tkanki tłuszczowej poddanej eutanazji, trzytygodniowej do trzymiesięcznej myszy, należy przeciąć i odizolować głowę oraz usunąć żuchwę. Następnie unieruchom, i kriozabezpiecz głowę, tak jak w przypadku główek zarodków.
Zanurz w 8% żelatynie w podobny sposób, jak główki zarodków w OCT i trzymaj Cryomolds w plastikowej torbie w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do kriosekcji. Ustaw odpowiednią temperaturę kriostatu. Umieścić próbki w komorze kriostatu na około 30 minut, aby zrównoważyły się z temperaturą kriostatu.
Wyjmij blok z próbką z Cryomold i zamontuj go za pomocą kropli OCT na uchwycie na próbkę i zamroź go, upewniając się, że przycięta strona próbki jest jak najdalej od uchwytu i skierowana w stronę operatora. Załaduj uchwyt mocowany na bloku na uchwyt kriostatu. Wyreguluj uchwyt ostrza tak, aby kąt ostrza wynosił od trzech do pięciu stopni w stosunku do próbki.
Zebrać 10-mikrometryczne skrawki na powlekane szkiełka mikroskopowe. Pozostaw sekcje w temperaturze pokojowej do całkowitego wyschnięcia, a następnie przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby rozpocząć barwienie, wyjmij szkiełka z minus 80 stopni Celsjusza i trzymaj je w temperaturze pokojowej przez godzinę, aby wysuszyć sekcje na powietrzu.
Przepłukać szkiełka w 0,1% PBST trzy razy przez pięć minut każdy, aby wypłukać OCT i przepuszczalność skrawków. Dodaj 200 mikrolitrów roztworu blokującego do każdego szkiełka i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie usunąć roztwór blokujący bez spłukiwania szkiełka.
Dodać 100 mikrolitrów przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w roztworze blokującym do każdego szkiełka i inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przepłukać szkiełka PBS trzy razy po 10 minut w temperaturze pokojowej. Dodać 100 mikrolitrów przeciwciała drugorzędowego rozcieńczonego w roztworze blokującym i inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.
Płukać w PBS trzy razy przez 10 minut w temperaturze pokojowej, nadal chroniąc przed światłem. Aby zamontować szkiełka, dodaj dwie krople podłoża zapobiegającego blaknięciu z DAPI na każdy slajd, przykryj szkiełkiem nakrywkowym i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż będzie gotowe do obrazowania. Kości czołowe zarodków kontrolnych były dodatnie dla pSmad1/5/9, dalszych czynników sygnalizacyjnych BMP i Ki67, markera proliferacji komórek.
Jednak w specyficznych dla grzebienia nerwowego, konstytutywnie aktywowanych zarodkach z mutacją BMPR1A, poziomy pSmad1/5/9 były zwiększone, podczas gdy poziomy Ki67 były zmniejszone. Ponadto zaobserwowano więcej komórek apoptotycznych w kościach czołowych zmutowanych zarodków niż w zarodkach kontrolnych. Kriosekcje koronalne głów zanurzonych w żelatynie wyraźnie pokazują sygnał GFP i sygnał RFP z kasety tdTomato w kości nosowej i tkankach nosa, wykazując, że żelatyna nie zakłóca sygnałów fluorescencyjnych.
Gdy skrawki te zostały wybarwione immunologicznie na obecność SOX9 lub Osterix i E11/Podoplaniny, uzyskano dobrej jakości skrawki z większości trzytygodniowych tkanek twardych. Z drugiej strony, w przypadku próbek sprzed trzech miesięcy, dobrej jakości skrawki uzyskano tylko w niektórych tkankach twardych, w tym w przedziałach beleczkowych kości udowej, tkankach nosa i czaszce, w tym w szwie nosowo-szczękowym i otaczających kościach głowy. Komórki SOX9-dodatnie wykryto specyficznie w chondrocytach płytki wzrostowej i stawu z kości udowej i przegrody nosowej.
W trzytygodniowym siekaczu wykryto SOX9 w komórkach mezenchymalnych. Wyniki podwójnego barwienia Osterix i E11 pokazują, że Osterix wykryto w osteoblastach, podczas gdy E11 wykryto w osteocytach kości udowej i głowy. W trzytygodniowym siekaczu Osterix był dodatni w odontoblastach, podczas gdy E11 był dodatni w mezenchymalnych komórkach pęcherzykowych.
Proszę nie przesadzać próbek z 4% PFA. Do cięcia nieodwapnionych tkanek twardych w żelatynie najlepsza temperatura to minus 25 stopni Celsjusza i niższa. Po tej procedurze można określić ilościowo poziomy fluorescencji zgodnie z opisem w naszym protokole.
Pomiary te dostarczą danych informacyjnych, które pokażą różnicę we względnym poziomie białka między różnymi grupami. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę do podwójnego lub potrójnego barwienia w celu uzyskania wzorców koekspresji różnych białek. 4% PFA jest niebezpieczne.
Może powodować alergie skórne, poważne uszkodzenia oczu, uszkodzenia narządów lub raka. Należy używać środków ochrony osobistej, a po użyciu dokładnie umyć skórę.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół immunofluorescencyjnego wykrywania białek w przekrojach tkanek twarzoczaszki myszy. Metoda eliminuje potrzebę odzyskiwania antygenów i dekalcyfikacji, upraszczając proces immunobarwienia.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia
- Immunologia
Tło
- Morfogenia i patogeneza twarzoczaszki to krytyczne obszary badań.
- Zrozumienie poziomów białek może dostarczyć wglądu w procesy rozwojowe.
- Tradycyjne metody często wymagają rozległej przygotowania, co może być czasochłonne.
- Ten protokół ma na celu uproszczenie procesu, zachowując jakość.
Cel badania
- Dostarczyć niezawodną metodę wykrywania poziomów białek w tkankach twarzoczaszki.
- Poprawić efektywność technik immunobarwienia.
- Ułatwić badania nad rozwojem twarzoczaszki i powiązanymi zaburzeniami.
Zastosowanie metod
- Wykrywanie immunofluorescencyjne w przekrojach twarzoczaszki myszy.
- Przygotowanie i kriosekcja nieskalcyfikowanych twardych tkanek.
- Unikanie etapów odzyskiwania antygenów.
- Zastosowanie technik immunobarwienia do oceny poziomów białek.
Główne wyniki
- Protokół skutecznie wykrywa białka bez potrzeby dekalcyfikacji.
- Wyniki immunobarwienia są wysokiej jakości i powtarzalne.
- Metoda oszczędza czas i pracę w porównaniu z tradycyjnymi technikami.
- Dostarcza użytecznego narzędzia do badań nad morfogenezą twarzoczaszki.
Wnioski
- Ten protokół oferuje uproszczone podejście do wykrywania białek w badaniach twarzoczaszki.
- Poprawia efektywność immunobarwienia, czyniąc je bardziej dostępnym dla badaczy.
- Metoda przyczynia się do lepszego zrozumienia rozwoju twarzoczaszki.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol enables efficient protein detection in craniofacial tissues by eliminating antigen retrieval and decalcification steps, reducing time and labor in preclinical target validation workflows. It supports mechanistic de-risking by providing reliable spatial protein expression data in disease-relevant systems, facilitating go/no-go decisions in early discovery. The method enhances assay standardization and reproducibility for downstream screening applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through specific protein localization in craniofacial morphogenesis models.
- Operational Value: Reduces procedural complexity by avoiding antigen retrieval and decalcification, accelerating target validation timelines.
- Predictive Confidence: Supports biological de-risking via high-quality immunostaining of key markers like pSmad1/5/9 and Ki67 in BMP signaling pathways.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized cryosections suitable for quantitative immunofluorescence screening of protein expression changes.
- Reproducibility: Enables consistent section quality from undecalcified hard tissues, supporting reliable compound evaluation in phenotypic screening.
- Scalability: Compatible with gelatin embedding for long-term storage and batch processing of tissue samples.
Translational & Preclinical Research
- Disease-Relevant System: Applicable to craniofacial pathogenesis models, allowing assessment of protein expression alterations in mutant embryos.
- Translational Continuity: Facilitates progression from discovery to preclinical validation by maintaining antigen integrity without harsh treatments.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables quantification of fluorescence levels to inform go/no-go decisions based on protein expression thresholds.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through preclinical research, supporting hypothesis testing and pathway clarification in craniofacial biology.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by detecting spatial protein expression patterns in embryonic and postnatal tissues.
- Screening: Enables assay standardization through consistent cryosectioning and immunostaining of hard and soft tissues.
- Analytics: Provides quantitative fluorescence readouts that allow comparison of protein levels across experimental groups.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by preserving tissue morphology and antigenicity in undecalcified samples.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for protein detection across multiple tissue types with protocol adaptations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation through reliable detection of proliferation and apoptosis markers.
- Operational Value: Improves standardization and reduces variability by eliminating antigen retrieval steps.
- Strategic Value: Enhances capital efficiency by decreasing hands-on time and accelerating data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by delivering quantitative protein expression data for decision-making.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection, cryoprotection, and immunofluorescence techniques.
- Dependent on cryostat and fluorescence microscopy infrastructure for sectioning and imaging.
- Necessitates standardization of blocking, antibody incubation, and washing protocols across teams.
- Requires adaptation of embedding media (OCT vs. gelatin) based on tissue age and hardness.
- Limited by antibody specificity and quantification challenges noted in the source material.
