Przygotowanie tkanek i barwienie immunologiczne tkanek twarzoczaszki myszy i kości nieodwapnionej

W tym miejscu przedstawiamy nasz prosty protokół detekcji immunofluorescencji białek na wycinkach materiałów. Ta metoda nie wymaga pobierania antygenu. Użyjemy głów myszy, w tym nieodwapnionych tkanek twardych.

Główną zaletą tej techniki jest pominięcie pobierania antygenu i odwapnienia tkanek twardych. Prowadzi to do dobrej jakości wyników barwienia immunologicznego. Ta metoda oszczędza również czas i pracę.

Metoda ta ma również zastosowanie do innych tkanek z odpowiednimi modyfikacjami. Aby zrobić ładne skrawki z nieodwapnionych tkanek, należy dalej wyciąć tkankę docelową, aby przyciąć otaczające tkanki, a jeśli to konieczne, potraktuj próbki 10% EDTA w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwa dni przed krioprotekcją. Demonstracja wizualna zapewnia szczegółowe i jasne wyjaśnienie procedury tej metody.

Na początek przygotuj jedną 10-centymetrową i kilka 3,5-centymetrowych szalek zawierających PBS i jedną 12-dołkową płytkę hodowlaną zawierającą dwa mililitry 4% PFA w PBS w każdym dołku dla każdej ciężarnej myszy i umieść je wszystkie na lodzie. Aby wypreparować zarodki ciężarnych myszy, chwyć kleszczami skórę poniżej środka brzucha myszy poddanej eutanazji, przetnij tylko skórę, a następnie delikatnie pociągnij za skórę, aby oddzielić ją od leżącej poniżej ściany mięśni brzucha. Podążając za tą samą linią nacięcia skóry, wciąć w jamę brzuszną.

Usuń macicę zawierającą ciąg zarodków. Następnie usuń zarodki, delikatnie odcinając ścianę macicy, co usunie tkanki pozazarodkowe, takie jak woreczek żółtkowy i owodnia. Odciąć i odizolować głowę od każdego zarodka, a następnie za pomocą kleszczy przenieść każdą głowę do oddzielnego dołka na 12-dołkowej płytce zawierającej 4% PFA.

Inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez cztery godziny, aby się utrwalić. Opłucz głowy w PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza, delikatnie potrząsając przez 12 godzin. Aby kriochronić głowy, przenieś je za pomocą kleszczy do nowej 12-dołkowej płytki zawierającej dwa mililitry 30% sacharozy w PBS.

Inkubować z delikatnym mieszaniem w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż główki opadną na dno naczynia. Aby osadzić głowice kriochronione, przenieś je do formy zawierającej związek o optymalnej temperaturze cięcia i równoważ przez kilka minut. Za pomocą kleszczy dostosuj położenie i kierunek próbek tak, aby przycięta strona próbek była skierowana w stronę dolnej części formy do zatapiania.

Następnie umieść formę na suchym lodzie do zamrożenia i przechowuj w plastikowej torbie w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będzie gotowa do kriosekcji. W przypadku tkanek poporodowych, po usunięciu skóry i tkanki tłuszczowej poddanej eutanazji, trzytygodniowej do trzymiesięcznej myszy, należy przeciąć i odizolować głowę oraz usunąć żuchwę. Następnie unieruchom, i kriozabezpiecz głowę, tak jak w przypadku główek zarodków.

Zanurz w 8% żelatynie w podobny sposób, jak główki zarodków w OCT i trzymaj Cryomolds w plastikowej torbie w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do kriosekcji. Ustaw odpowiednią temperaturę kriostatu. Umieścić próbki w komorze kriostatu na około 30 minut, aby zrównoważyły się z temperaturą kriostatu.

Wyjmij blok z próbką z Cryomold i zamontuj go za pomocą kropli OCT na uchwycie na próbkę i zamroź go, upewniając się, że przycięta strona próbki jest jak najdalej od uchwytu i skierowana w stronę operatora. Załaduj uchwyt mocowany na bloku na uchwyt kriostatu. Wyreguluj uchwyt ostrza tak, aby kąt ostrza wynosił od trzech do pięciu stopni w stosunku do próbki.

Zebrać 10-mikrometryczne skrawki na powlekane szkiełka mikroskopowe. Pozostaw sekcje w temperaturze pokojowej do całkowitego wyschnięcia, a następnie przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby rozpocząć barwienie, wyjmij szkiełka z minus 80 stopni Celsjusza i trzymaj je w temperaturze pokojowej przez godzinę, aby wysuszyć sekcje na powietrzu.

Przepłukać szkiełka w 0,1% PBST trzy razy przez pięć minut każdy, aby wypłukać OCT i przepuszczalność skrawków. Dodaj 200 mikrolitrów roztworu blokującego do każdego szkiełka i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie usunąć roztwór blokujący bez spłukiwania szkiełka.

Dodać 100 mikrolitrów przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w roztworze blokującym do każdego szkiełka i inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przepłukać szkiełka PBS trzy razy po 10 minut w temperaturze pokojowej. Dodać 100 mikrolitrów przeciwciała drugorzędowego rozcieńczonego w roztworze blokującym i inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.

Płukać w PBS trzy razy przez 10 minut w temperaturze pokojowej, nadal chroniąc przed światłem. Aby zamontować szkiełka, dodaj dwie krople podłoża zapobiegającego blaknięciu z DAPI na każdy slajd, przykryj szkiełkiem nakrywkowym i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż będzie gotowe do obrazowania. Kości czołowe zarodków kontrolnych były dodatnie dla pSmad1/5/9, dalszych czynników sygnalizacyjnych BMP i Ki67, markera proliferacji komórek.

Jednak w specyficznych dla grzebienia nerwowego, konstytutywnie aktywowanych zarodkach z mutacją BMPR1A, poziomy pSmad1/5/9 były zwiększone, podczas gdy poziomy Ki67 były zmniejszone. Ponadto zaobserwowano więcej komórek apoptotycznych w kościach czołowych zmutowanych zarodków niż w zarodkach kontrolnych. Kriosekcje koronalne głów zanurzonych w żelatynie wyraźnie pokazują sygnał GFP i sygnał RFP z kasety tdTomato w kości nosowej i tkankach nosa, wykazując, że żelatyna nie zakłóca sygnałów fluorescencyjnych.

Gdy skrawki te zostały wybarwione immunologicznie na obecność SOX9 lub Osterix i E11/Podoplaniny, uzyskano dobrej jakości skrawki z większości trzytygodniowych tkanek twardych. Z drugiej strony, w przypadku próbek sprzed trzech miesięcy, dobrej jakości skrawki uzyskano tylko w niektórych tkankach twardych, w tym w przedziałach beleczkowych kości udowej, tkankach nosa i czaszce, w tym w szwie nosowo-szczękowym i otaczających kościach głowy. Komórki SOX9-dodatnie wykryto specyficznie w chondrocytach płytki wzrostowej i stawu z kości udowej i przegrody nosowej.

W trzytygodniowym siekaczu wykryto SOX9 w komórkach mezenchymalnych. Wyniki podwójnego barwienia Osterix i E11 pokazują, że Osterix wykryto w osteoblastach, podczas gdy E11 wykryto w osteocytach kości udowej i głowy. W trzytygodniowym siekaczu Osterix był dodatni w odontoblastach, podczas gdy E11 był dodatni w mezenchymalnych komórkach pęcherzykowych.

Proszę nie przesadzać próbek z 4% PFA. Do cięcia nieodwapnionych tkanek twardych w żelatynie najlepsza temperatura to minus 25 stopni Celsjusza i niższa. Po tej procedurze można określić ilościowo poziomy fluorescencji zgodnie z opisem w naszym protokole.

Pomiary te dostarczą danych informacyjnych, które pokażą różnicę we względnym poziomie białka między różnymi grupami. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę do podwójnego lub potrójnego barwienia w celu uzyskania wzorców koekspresji różnych białek. 4% PFA jest niebezpieczne.

Może powodować alergie skórne, poważne uszkodzenia oczu, uszkodzenia narządów lub raka. Należy używać środków ochrony osobistej, a po użyciu dokładnie umyć skórę.