Badania strukturyczno-funkcjonalne w embrionalnych komórkach macierzystych myszy z wykorzystaniem wymiany kasetowej za pośrednictwem rekombinazy

Ogólnym celem tej metody struktura-funkcja jest przeanalizowanie na poziomie molekularnym roli różnych domen białkowych lub mutacji istotnych dla choroby w naiwnych lub zróżnicowanych embrionalnych komórkach macierzystych myszy. Metoda ta może pomóc w ujawnieniu, w jaki sposób różne reszty lub domeny białka mogą przyczyniać się do jego funkcji w danym kontekście komórkowym. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na bardzo skuteczne ukierunkowanie konstruktów ratunkowych na genom embrionalnych komórek macierzystych lub komórek ES oraz badanie ich roli w różnych typach komórek.

Aby to osiągnąć, łączymy trzy wysoce wydajne technologie. Obejmują one ulepszoną izolację embrionalnych komórek macierzystych myszy, składanie czynników docelowych oparte na rekombinacji oraz celowanie w komórki ES poprzez wymianę kasetową za pośrednictwem rekombinacji lub RMC. Niektóre z procedur zademonstruje Jinke D'Hont, technik z mojego laboratorium.

Wymiana kasetowa za pośrednictwem rekombinacji (RMCE) umożliwia wymianę fragmentów DNA między wektorem a locus genomu. RMCE wykorzystuje heterospecyficzne miejsca rekombinacji, które nie reagują krzyżowo i które są osadzone w locus genomu. W obecności plazmidu dawcy, który zawiera fragment DNA otoczony tymi samymi heterospecyficznymi miejscami, rekombinaza wprowadzi ten fragment DNA do locus genomowego zgodnego z RMCE z powodu podwójnej jednoczesnej translokacji.

Tylko po prawidłowej rekombinacji, uwięziony gen oporności na neomycynę bez promotora w miejscu dokowania Rosa 26 zostanie przywrócony za pomocą promotora PGK w przychodzącym wektorze docelowym, co powoduje oporność na leki. Ten system pułapek oporności na neomycynę zapewnia bardzo wysoką skuteczność celowania, często bliską 100%Dzień przed izolacją blastocysty dodaj 0,1% żelatyny do 12 dobrze wyhodowanych płytek. I inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Odessać roztwór żelatyny. Następnie wysiewaj jedną czwartą fiolki z fibroblastami embrionalnymi myszy P2 lub MEF w pożywce MEF i podziel na 12-dołkową płytkę. Inkubować 12-dołkowe płytki MEF w dwóch mililitrach pożywki MEF w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

I wyhoduj komórki do zlewającej się monowarstwy. Następnie dodaj 10 mikrogramów na mililitr nasion mitomycyny do studzienek. I inkubuj kultury przez trzy godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby dezaktywować komórki.

Po wybraniu heterozygotycznych myszy z nokautem zawierających kasetę RMCE w locus Rosa 26 zgodnie z protokołem tekstowym, skonfiguruj kojarzenia, aby wyhodować heterozygotyczne myszy z nokautem kompatybilne z RMCE, z heterozygotycznymi myszami z nokautem. Następnego ranka sprawdź, czy nie ma zatyczek kopulacyjnych, podnosząc samicę za podstawę opowieści i zbadaj otwór pochwy pod kątem białawej masy. Jeśli zatyczka jest trudna do zobaczenia, za pomocą sondy kątowej lekko rozchyl wargi sromu, a następnie oddziel zatkane samice od ich samców.

Aby zebrać blastocysty po 3,5 dnia po stosunku lub DPC. Po eutanazji ciężarnych samic wykonaj nacięcie w połowie brzusznej i użyj cienkich nożyczek i kleszczy, aby wypreparować macicę i jajowód. Następnie zegnij igłę o rozmiarze 26 w kąt 45 stopni przymocowaną do 1-mililitrowej strzykawki wypełnionej podłożem M2.

I włóż igłę do końca macicy, który znajduje się najbliżej jajowodu. Użyj cienkich kleszczyków, aby przytrzymać igłę na miejscu, jednocześnie naciskając tłok, aby wypłukać blastocysty z macicy do pokrywki 10-centymetrowego naczynia. Macica spuchnie, jeśli uderzenie się powiedzie.

Za pomocą pipety doustnej zebrać wszystkie zarodki w kropli pożywki M2 i dwukrotnie umyć zarodki w kropli pożywki M2. Bezpośrednio po umyciu zarodków należy użyć PBS, aby dwukrotnie umyć komórki inaktywowane mitomycyną-C. Następnie za pomocą pipety doustnej umieść każdą blastocystę w oddzielnym dołku MEF traktowanym mitomycyną-C, w pożywce komórkowej SRES, uzupełnionej pluripotencjalnym lub 2I.

Inkubuj kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Odświeżaj pożywkę z ogniwami SREF co dwa do trzech dni. Zbadaj każdą blastocystę pod mikroskopem stereoskopowym przy 4-krotnym powiększeniu i sprawdź, czy nie ma wykluwania się i oderwania od warstwy MEF.

Po 10 do 12 dniach hodowli, pod mikroskopem stereoskopowym, użyj pipety P10 z jednorazowymi końcówkami, aby wybrać poszczególne wyrostki z kostki moczowej. Przenieś każdy wyrostek do około 10 mikrolitrów pożywki na 96-dołkową płytkę w kształcie litery V, zawierającą 30 mikrolitrów PBS na studzienkę. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 50 mikrolitrów 0,25% trypsyny do każdego dołka.

I inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez trzy minuty. Dodaj 100 mikrolitrów wstępnie inkubowanej pożywki komórkowej ES zawierającej FPS i zdysocjuj wyrostki kości słoniowej na pojedyncze komórki, pipetując od 10 do 15 razy. Następnie przenieś zdysocjowane komórki na 96-dołkowe płytki MEF traktowane mitomycyną-C.

Następnego dnia zmień nośnik oparty na SR. Rozszerz komórki ES w podobny sposób z płytek 24-dołkowych do 6-dołkowych. Po zidentyfikowaniu uratowanych wektorów CDNA zgodnie z protokołem tekstowym, przygotuj 10 mikrolitrową reakcję LR przy użyciu 100 nanogramów ratunkowego wektora CDNA, 150 nanogramów wstępnie wyciętego wektora RMCEDV1 i dwóch mikrolitrów mieszaniny rekombinazy, zawierającej integrazę kodowaną przez fagi, ekscyzjazę i bakteryjny czynnik integracji gospodarza.

Inkubować reakcję w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Aby przekształcić zrekombinowane wektory, dodaj 5 mikrolitrów każdej mieszaniny do 40 mikrolitrów bakterii E.Coli kompetentnych dla szoku cieplnego w 2-mililitrowej tubce z nakrętką. I inkubować próbkę na lodzie przez 20 minut.

Następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Dodaj jeden mililitr pożywki LB do probówki i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Płytka 50 mikrolitrów na płytkach agarowych z ampicyliną.

I rosną w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Zidentyfikuj kolonie z prawidłowym wektorem docelowym, używając końcówki P200, aby losowo wybrać pięć kolonii. Przenieś końcówkę do szklanej probówki zawierającej od dwóch do pięciu mililitrów pożywki LB i hoduj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po wyekstrahowaniu DNA z każdej kolonii zwaliduj próbki, trawiąc od 0,5 do dwóch mikrogramów DNA i oddziel próbki na 1% żelu agarozowym. Rozpocznij hodowlę komórek ES kompatybilnych z RMCE i pasaż je co najmniej dwa razy na MEF, w pożywce ES opartej na FBS. Następnie podziel komórki ES na zżelatynowaną, sześciodołkową płytkę.

Następnego dnia użyj 1,5 mililitra pożywki ES na bazie FBS, aby odświeżyć komórki ES, które są w około 50% zlewne. Połącz jeden mikrogram wstępnie wyciętego wektora docelowego RMCEDV1, zawierającego ratunkowe CDNA, i jeden mikrogram plazmidu ekspresyjnego FLIPe w 250 mikrolitrach czystego podłoża DMEM. Dodaj siedem mikrolitrów odczynnika transwekcyjnego na bazie lipofektyny do 250 mikrolitrów czystego podłoża DMEM.

I inkubować roztwór przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Połącz roztwory DNA i lipofektyny. I inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 20 minut.

Następnie pipetować mieszaninę transwekcyjną na odświeżone komórki ES i delikatnie zawirować. Dzień po transwekcji rozdziel wszystkie komórki ES z probówki na 10-centymetrową miskę hodowlaną, z nakładającą się warstwą DR4 MEFS i 10 mililitrami pożywki komórkowej ES na bazie FPS. Dwa dni po transwekcji wybierz klony komórek ES z prawidłową wymianą kasety za pośrednictwem FLIP-e, dodając G418 do pożywki.

Jak pokazano tutaj, masowe zabijanie niedocelowych kolonii powinno być widoczne po trzech do pięciu dniach. Kolonie powinny pojawić się po siedmiu do 10 dniach. Wybierz te kolonie, a następnie rozwiń je i zweryfikuj klony, jak pokazano wcześniej w tym filmie.

Aby zróżnicować komórki ES w ciała embrionoidalne lub EB, po wyhodowaniu nokautujących komórek ES za pomocą konstruktów ratunkowych sterowanych Rosa 26 zgodnie z protokołem tekstowym, pozwól EB na tworzenie się w nieprzylegających naczyniach przez 30 dni. Odświeżaj podłoże co dwa do trzech dni, przenosząc zawiesinę EB do 50-mililitrowej tubki. I niech EB osiądą grawitacyjnie.

Usunąć supernatant, dodać świeżą pożywkę i przenieść zawiesinę EB do naczynia klasy bakteryjnej. Analizuj komórki ES i EB za pomocą immunofluorescencji i TEM, zgodnie z protokołem tekstowym. Korzystając z metody funkcji struktury, wygenerowano pięć wstępnie wyciętych wektorów celowania w RMCEDV1 z wydajnością 100%, a te konstrukty ratunkowe zostały ukierunkowane za pomocą RMCE, aby komórki ES z kateniną P120 nokautowały z wydajnością 97%Morfologia torbielowatej EB może być wykorzystana jako odczyt fenotypowy do badań przesiewowych różnych konstruktów ratunkowych.

Jako dowód słuszności koncepcji, napędzana przez R26 izoforma kateniny P120 1A uratowała fenotyp kateniny p120 knock out. Aby sprawdzić, czy niezależne od E-kadheryny zakotwiczenie błony kateniny P120 umożliwiło tworzenie csytic EB, motyw celowania w błonę k-ras, CAAX, został połączony z karboksylowym końcem kateniny P120 i wprowadzony przez RMCE, aby katenina P120 wybiła komórki ES, zanim EB zostały z nich wytworzone. Jednak ten konstrukt służy dominującemu negatywnemu, który nie pozwala na wiązanie i stabilizację E-kadheryny.

I w konsekwencji nie ratuje fenotypu p120 kateniny nokautującej. Przejście nabłonkowo-mezenchymalne (EMT) jest niezbędnym procesem rozwojowym, który zachodzi również podczas różnicowania komórek ES. Po ekspresji w komórkach ES kateniny p120, induktory EMT, ZEB1, ZEB2 lub ślimak, które mogą bezpośrednio tłumić różne geny markerów nabłonkowych, takie jak E-kadheryna, nie zdołały przywrócić torbielowatego tworzenia EB.

Po opanowaniu, komórki ES kompatybilne z RMCE można wyizolować w ciągu jednego miesiąca. Wektory celowania zgodne z RMCE można wygenerować w ciągu jednego tygodnia, a celowane uratowanie komórek ES można osiągnąć w ciągu jednego miesiąca przy użyciu tej techniki, jeśli zostanie ona wykonana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać RMCE do przeprowadzania badań funkcji struktury w naiwnych lub zróżnicowanych embrionalnych komórkach macierzystych.