Analiza ilościowa losowej migracji komórek za pomocą poklatkowej mikroskopii wideo

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ilościowy pomiar migracji komórek w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii poklatkowej wideo. Osiąga się to poprzez najpierw pokrycie sześciodołkowej płytki hodowlanej kolagenem, a następnie rzadkie wysiewanie interesujących komórek na pokrytej płytce. W drugim etapie tworzy się ranę na płytce za pomocą końcówki pipety, zapewniając wystarczającą ilość miejsca do migracji.

Następnie ustawiany jest mikroskop, a obrazy są rejestrowane w regularnych odstępach czasu za pomocą systemu kontroli temperatury, aby umożliwić ciągłe monitorowanie migrujących komórek w czasie rzeczywistym. Ostatecznie protokół śledzenia cząstek służy do oceny różnic w średniej prędkości i całkowitym przemieszczeniu komórek testowych i kontrolnych. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak test migracji w komorze unikającej, jest to, że nie opiera się ona na ilościowych pomiarach migracji w punkcie końcowym.

Zamiast tego umożliwia ciągłe monitorowanie i obliczanie różnych parametrów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii nowotworów, takie jak to, w jaki sposób określone geny lub leki wpływają na migrację komórek nowotworowych? Dwa dni przed zabiegiem dodaj 1,5 mililitra kolagenu rozcieńczonego w pożywce optymalnej do każdego dołka sześciodołkowej płytki hodowlanej, a następnie inkubuj płytkę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza na dzień przed zabiegiem.

Ponownie zawiesić interesujące komórki w dwóch mililitrach DMEM plus FBS na studzienkę i przenieść komórki do każdej studzienki płytki pokrytej kolagenem ENC, inkubując komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. W dniu zabiegu. Użyj końcówki pipety, aby utworzyć ranę w nocnych komórkach hodowlanych i umyj każdą studzienkę PBS, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia, które powstały w wyniku rany.

Dodaj DMEM plus FBS do przepłukanych studzienek, a następnie sprawdź pod mikroskopem, aby potwierdzić, że utworzono czystą przestrzeń rany. Po włączeniu kamery mikroskopu i aparatu do obrazowania żywych komórek umieść płytkę nad stolikiem mikroskopu. Przykryj płytkę nową komorą kontroli środowiska z żywymi komórkami i ustaw termostat na 37 stopni Celsjusza, a dwutlenek węgla na 5%Teraz otwórz oprogramowanie książki slajdów na pasku menu.

Wybierz sterowanie ostrością, klikając przycisk F w kółku. W polu celu użyj okna rozwijanego, aby zdefiniować cel W polu zestawu filtrów wybierz ustawienia, aby skierować ścieżkę światła do dwuteownika. Wybierz odpowiedni filtr dla oświetlenia jasnego pola, a następnie kliknij otwórz jasny.

Aby otworzyć migawkę jasnego pola. Teraz wybierz filtr jasnego pola na wieżyczce i view próbkę przez okular, aby znaleźć odpowiednie pola i ustawić ostrość próbki. Następnie przesuń wieżyczkę filtra, aby zmienić ścieżkę światła do kamery Aby przechwycić obraz w oprogramowaniu do książki slajdów, kliknij kontrolę ostrości, wybierz XY, aby wybrać różne pozycje za pomocą dwuteownika, a następnie kliknij ustaw punkt, aby zablokować każdą lokalizację.

Aby przechwycić obraz, ręcznie dostosuj ostrość obrazu z kamery, który jest wyświetlany na ekranie, a następnie użyj narzędzi w oknie sterowania ostrością, aby dostosować położenie Z stołu montażowego. Aby uzyskać najlepsze wyniki, skoncentruj się na płaskich wypukłościach komórkowych w pobliżu kontaktu z płytką, aby pomóc w ustawieniu ostrości. Użyj suwaka, aby dostosować czasy ekspozycji, aby znaleźć się w odpowiednim zakresie do ustawiania ostrości.

Jeśli wybrano wiele pozycji XY, dostosuj ostrość dla każdej pozycji, wybierając opcję sterowania ostrością. Następnie xy, a następnie punkt wizyty. W skoroszycie slajdów wybierz grafikę aparatu z paska menu, wybierz typ przechwytywania, a następnie upływ czasu, aby wybrać czas trwania eksperymentu.

Z menu rozwijanego wpisz żądane opóźnienie między początkiem jednego punktu czasowego a początkiem następnego. W polach interwałów trzecie pole zostanie automatycznie obliczone na podstawie ręcznie wprowadzonych wartości. W obszarze Przechwytywanie wielu obiektów XY wybierz listę wielopunktową dla eksperymentów z więcej niż jedną pozycją XY.

Na koniec nazwij plik, aby zapisać plik, przejdź do kontroli przechwytywania i wybierz zaawansowane, a następnie buforuj. Następnie przechwyć do pamięci i zapisz do pliku buforowania Po każdym punkcie czasowym. Zacznij od kliknięcia obrazu.

Na pasku menu skoroszytu slajdów wybierz opcję importuj z menu rozwijanego, a następnie kliknij bufor książki slajdów. Wybierz żądane pliki skoroszytów slajdów wygenerowane w eksperymencie migracji dla różnych pól i punktów czasowych. Otwórz pierwszy plik, a następnie wybierz maskę na pasku menu i wybierz protokół śledzenia cząstek z menu rozwijanego.

W menu śledzenia cząstek wybierz opcję ręcznego śledzenia cząstek. Pojawi się okno z punktami czasowymi rozpoczęcia i zakończenia Aby przeanalizować losową migrację, wybierz maskę, a następnie protokół śledzenia cząstek. Ponownie, aby określić współrzędne środka obiektu, wybierz środek obszaru.

Następnie kliknij śledź i kontynuuj. Teraz wybierz żądane statystyki dla każdej ścieżki, takie jak przemieszczenie i średnia prędkość. Jak pokazano poniżej, kliknij przycisk Oblicz, aby wyświetlić statystyki.

Przykład analizy migracji losowej określonej ilościowo pod względem szybkości przedstawiono w tej ramce. Na wykresie Whiskersa, w tym eksperymencie, nastąpił wzrost średniej prędkości w 31 komórkach M-D-A-M-B 2 z powalonym genem supresorowym nowotworu. W porównaniu z kontrolnymi komórkami M-D-A-M-B 2 31 tutaj, losowa migracja komórek z pierwszego rysunku została przeanalizowana pod kątem przemieszczenia komórek.

Ponownie, grupa całkowitego knockdownu genu supresorowego guza miała zwiększone przemieszczenie komórek w porównaniu z grupą kontrolną M-D-A-M-B 2 31. Komórki w tym filmie poklatkowym, mikroskopia, kontrola filmu, MDA MB 2, 31 komórek osadzono na kolagenie przez noc. Zdjęcia były następnie wykonywane w odstępach godzinnych przez łącznie 18 godzin podczas losowej migracji.

Zwróć uwagę, jak komórki oddalają się od swoich pierwotnych pozycji w czasie. W tym filmie zarejestrowano i przeanalizowano migrację testowych komórek M-D-A-M-B 2 31 po nocnym wysiewie na kolagen. Zauważ, że komórki testowe są bardziej migrujące w porównaniu z komórkami kontrolnymi w poprzednim filmie.

Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak inwazja komórek i dyny, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak: jakie są role komórek w przerzutach raka po jego rozwoju? Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią komórkową do zbadania migracji komórek przy użyciu izolowanych linii komórek nowotworowych.