Name: Analiza ilościowa losowej migracji komórek za pomocą poklatkowej mikroskopii wideo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Poznaj metodę ilościowej analizy migracji komórek w czasie rzeczywistym za pomocą poklatkowej mikroskopii wideo. Technika ta umożliwia ciągłe monitorowanie prędkości i przemieszczenia komórek, zapewniając szczegółowe dane w porównaniu do pomiarów punktowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować Amandzie Struckhoff za wstępną pomoc przy eksperymencie. Praca ta była wspierana przez grant z NIH 5RO1CA115706.

<ol><li>Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%3A+a+physically+integrated+molecular+process%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell migration: a physically integrated molecular process.</a> Cell. 84, 359-369 (1996).</li>
<li>Ridley, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%3A+integrating+signals+from+front+to+back%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell migration: integrating signals from front to back.</a> Science. 302, 1704-1709 (2003).</li>
<li>Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+versus+directionally+persistent+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Random versus directionally persistent cell migration.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).</li>
<li>Valone, F. H., Austen, K. F., Goetzl, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+random+migration+of+human+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Modulation of the random migration of human platelets.</a> J. Clin. Invest. 54, 1100-1106 (1974).</li>
<li>Biehlmaier, O., Hehl, J., Csucs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquisition+speed+comparison+of+microscope+software+programs%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">Acquisition speed comparison of microscope software programs.</a> Microsc. Res. Tech. 74, 539-545 (2011).</li>
<li>Struckhoff, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+regulation+of+ROCK+in+tumor+cells+controls+CXCR4-driven+adhesion+events%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Dynamic regulation of ROCK in tumor cells controls CXCR4-driven adhesion events.</a> J. Cell. Sci. 123, 401-412 (2010).</li>
<li>Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophoton.+Internat%22%5BJournal%5D)">Image Processing with ImageJ.</a> Biophoton. Internat. 11, 36-42 (2004).</li>
<li>Greenberg, J. H., Seppa, S., Seppa, H., Tyl Hewitt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+collagen+and+fibronectin+in+neural+crest+cell+adhesion+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of collagen and fibronectin in neural crest cell adhesion and migration.</a> Dev. Biol. 87, 259-266 (1981).</li>
<li>Albini, A., Sporn, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumour+microenvironment+as+a+target+for+chemoprevention%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The tumour microenvironment as a target for chemoprevention.</a> Nat. Rev. Cancer. 7, 139-147 (2007).</li>
<li>Yu, Y. P., Luo, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myopodin-mediated+suppression+of+prostate+cancer+cell+migration+involves+interaction+with+zyxin%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Res%22%5BJournal%5D)">Myopodin-mediated suppression of prostate cancer cell migration involves interaction with zyxin.</a> Cancer. Res. 66, 7414-7419 (2006).</li>
<li>Teng, T. S., Lin, B., Manser, E., Ng, D. C., Cao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stat3+promotes+directional+cell+migration+by+regulating+Rac1+activity+via+its+activator+betaPIX%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Stat3 promotes directional cell migration by regulating Rac1 activity via its activator betaPIX.</a> J. Cell. Sci. 122, 4150-4159 (2009).</li>
<li>Wozniak, M. A., Kwong, L., Chodniewicz, D., Klemke, R. L., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R-Ras+controls+membrane+protrusion+and+cell+migration+through+the+spatial+regulation+of+Rac+and+Rho%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">R-Ras controls membrane protrusion and cell migration through the spatial regulation of Rac and Rho.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 84-96 (2005).</li>
<li>Orr, A. W., Elzie, C. A., Kucik, D. F., Murphy-Ullrich, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombospondin+signaling+through+the+calreticulin%2FLDL+receptor-related+protein+co-complex+stimulates+random+and+directed+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Thrombospondin signaling through the calreticulin/LDL receptor-related protein co-complex stimulates random and directed cell migration.</a> J. Cell Sci. 116, 2917-2927 (2003).</li>
<li>Smith, A., Bracke, M., Leitinger, B., Porter, J. C., Hogg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LFA-1-induced+T+cell+migration+on+ICAM-1+involves+regulation+of+MLCK-mediated+attachment+and+ROCK-dependent+detachment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">LFA-1-induced T cell migration on ICAM-1 involves regulation of MLCK-mediated attachment and ROCK-dependent detachment.</a> J. Cell Sci. 116, 3123-3133 (2003).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Test migracji losowej w czasie rzeczywistym umożliwia dokładną i czułą analizę parametrów migracji komórek, takich jak prędkość i przemieszczenie. Metoda ta nie ogranicza się do pomiaru wartości końcowej, dzięki czemu jest bardziej ilościowa. Ponieważ komórki są monitorowane w zwykłej pożywce DMEM z surowicą, zmniejsza to szkodliwy wpływ długotrwałej inkubacji w pożywkach bezzurowiczych. Wykazano, że migracja komórek zależy od tworzenia i zrywania kontaktów komórkowych z podłożem8, w związku z czym metoda ta m...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>płytki surowicy wołowej</td><td>Gemini Bio Products</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>Opti-Mem</td><td>Invitrogen</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen</td><td>BD Biosciences</td><td>354231</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop z komorą do hodowli żywych komórek &amp;Automatyczny sterownik stolika XY</td><td>Olympus Corporation</td><td>Olympus 1X81</td><td></td></tr><tr><td>Komora do kontroli parametrów środowiskowych</td><td>Nowy</td><td>Nowa komora do hodowli żywych komórek</td><td>Nasze urządzenie posiada specjalnie wykonaną prostokątną szklaną płytkę górną, która zapewnia odpowiednią optykę przy dostępie od góry komory. Prostokątny kształt umożliwia zastosowanie płytek wielodołkowych wykorzystywanych w wielu z naszych eksperymentów. </td></tr><tr><td>Zautomatyzowany stół XY</td><td>Wcześniejsze badania naukowe</td><td>Wcześniejszy Proscan</td><td>Umożliwia to precyzyjny powrót do wielokrotnie wybranych pozycji XY podczas mikroskopii poklatkowej.</td></tr><tr><td>Kamera</td><td></td><td>Kamera EM Hamamatsu C9100</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie</td><td>Zazwyczaj nabywane u dostawców mikroskopów, takich jak Olympus</td><td>Książka preparatów 5</td><td></td></tr></tbody></table>

ilościowa analiza przypadkowej migracji komórek z wykorzystaniem mikroskopii wideo time-lapse

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Migracja komórek to dynamiczny proces, który jest istotny dla rozwoju zarodkowego, naprawy tkanek, funkcjonowania układu odpornościowego oraz inwazji nowotworowej 1, 2. Podczas migracji kierunkowej komórki przemieszczają się szybko w odpowiedzi na zewnątrzkomórkowy sygnał chemotaktyczny lub w odpowiedzi na wewnętrzne sygnały 3 dostarczane przez podstawowy aparat ruchowy. Migracja losowa występuje, gdy komórka wykazuje niską kierunkowość wewnętrzną, co pozwala komórkom na eksplorację lokalnego środowiska.
Migracja komórek jest złożonym procesem; w początkowej fazie odpowiedzi komórka ulega polaryzacji i wysuwa wypustki w kierunku migracji 2. Tradycyjne metody pomiaru migracji, takie jak test migracji w komorze Boydena, stanowią prosty sposób pomiaru chemotaksji in vitro, co pozwala na określenie migracji jako wyniku końcowego. Jednak podejście to nie umożliwia ani pomiaru poszczególnych parametrów migracji, ani wizualizacji zmian morfologicznych, jakim ulega komórka podczas migracji.
W niniejszej pracy przedstawiamy metodę umożliwiającą monitorowanie migrujących komórek w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem mikroskopii poklatkowej (video - time lapse microscopy). Ponieważ migracja i inwazja komórek są cechami charakterystycznymi nowotworów, metoda ta znajdzie zastosowanie w badaniach migracji i inwazji komórek rakowych in vitro. Losową migrację płytek krwi uznaje się za jeden z parametrów funkcji płytek 4, zatem metoda ta może być również pomocna w badaniu funkcji płytek krwi. Przewagą tego testu jest szybkość, niezawodność oraz powtarzalność, a ponadto nie wymaga on optymalizacji liczby komórek. Aby utrzymać fizjologicznie odpowiednie warunki dla komórek, mikroskop jest wyposażony w zasilanie CO2 oraz termostat. Ruch komórek jest monitorowany poprzez wykonywanie zdjęć za pomocą kamery zamontowanej w mikroskopie w regularnych odstępach czasu. Migrację komórek można obliczyć, mierząc średnią prędkość oraz średnie przemieszczenie, co jest realizowane przez oprogramowanie Slidebook.

Ta metoda pozwala na monitorowanie komórek w czasie rzeczywistym oraz ilościowe pomiary różnych parametrów migracji komórkowej, takich jak prędkość, przemieszczenie i wektor prędkości. W przeciwieństwie do metod tradycyjnych, to podejście w czasie rzeczywistym nie opiera się na ilościowych pomiarach migracji w punkcie końcowym; zamiast tego umożliwia ciągłe monitorowanie i obliczanie różnych parametrów.

Ilościowa analiza przypadkowej migracji komórek z wykorzystaniem mikroskopii wideo time-lapse

Migracja komórek jest procesem dynamicznym, który odgrywa istotną rolę w rozwoju embrionalnym, naprawie tkanek, funkcjonowaniu układu odpornościowego oraz inwazji nowotworowej 1, 2. Podczas...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest ilościowy pomiar migracji komórek w czasie rzeczywistym przy użyciu mikroskopii time-lapse. Osiąga się to poprzez najpierw pokrycie płytki hodowlanej z sześcioma studzienkami kolagenem, a następnie rzadkie wysianie badanych komórek na tak przygotowaną płytkę. W drugim kroku, za pomocą końcówki pipety, w płytce tworzy się ranę, zapewniając w ten sposób odpowiednią przestrzeń do migracji.Następnie przygotowuje się mikroskop i wykonuje zdjęcia w regularnych odstępach czasu, wykorzystując system kontroli temperatury w celu ciągłego monitorowania w czasie rzeczywistym migrujących komórek. Ostatecznie protokół śledzenia cząstek służy do oceny różnic w średniej prędkości oraz całkowitym przemieszczeniu komórek badanych i kontrolnych. Główną zaletą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak test migracji w komorze unikowej, jest fakt, że nie opiera się ona na ilościowych pomiarach migracji w punkcie końcowym.Zamiast tego pozwala ona na ciągłe monitorowanie i obliczanie różnych parametrów. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny biologii nowotworów, takie jak: w jaki sposób konkretne geny lub leki wpływają na mi

quantitative-analysis-random-migration-cells-using-time-lapse-video

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza ilościowa losowego przemieszczania się komórek za pomocą mikroskopii wideo time-lapse

Opisano ilościową metodę badania spontanicznej migracji komórek w jednowymiarowym, zamkniętym mikrośrodowisku. Metoda ta wykorzystuje mikrofabrykowane kanały i może być stosowana do badania migracji dużej liczby komórek w różnych warunkach w pojedynczych eksperymentach.

Badanie migracji komórek w kanałach mikroprefabrykowanych

Migracja komórek to zjawisko biologiczne, które bierze udział w wielu procesach fizjologicznych, takich jak gojenie się ran i reakcje immunologiczne oraz procesy patofizjologiczne, takie jak rak. Test migracji macierzy kolagenu 3D jest wszechstronnym narzędziem do analizy właściwości migracyjnych różnych typów komórek w środowisku fizjologicznym 3D.

Analiza migracji komórek w obrębie trójwymiarowej matrycy kolagenowej

Łącząc transplantację komórek, znakowanie cytoszkieletu i podejście do utraty/wzmocnienia funkcji, ten protokół opisuje, w jaki sposób migrująca prospektywna płytka przedstrunowa danio pręgowanego może być wykorzystana do analizy funkcji genu kandydującego w migracji komórek in vivo.

Analiza migracji komórek in vivo przy użyciu przeszczepów komórek i obrazowania poklatkowego w zarodkach danio pręgowanego

Szczegółowo opisano protokoły hodowli ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC), przejściowej transfekcji znakowanych fluorescencyjnie markerów wzrostu mikrotubul, obrazowania żywych komórek i automatycznej analizy dynamiki wzrostu mikrotubul międzyfazowych.

Obrazowanie poklatkowe w wysokiej rozdzielczości i automatyczna analiza dynamiki mikrotubul w żywych ludzkich komórkach śródbłonka żyły pępowinowej

Ten protokół szczegółowo opisuje konfigurowalną metodę pomiaru migracji komórek w odpowiedzi na chemoatraktanty, które mogą być również użyte do określenia szybkości dyfuzji leku z matrycy polimerowej.

Konfigurowalna komora do pomiaru migracji komórek

Mikroskopia wideo bez soczewek umożliwia nam monitorowanie kultur komórkowych bezpośrednio w inkubatorze. Tutaj opisujemy pełny protokół używany do pozyskiwania i analizowania trwającego 2,7 dnia pozyskiwania hodowanych komórek HeLa, co prowadzi do zestawu danych 2,2 x 106 pomiarów morfologii poszczególnych komórek i 10584 ścieżek cyklu komórkowego.

Bezsoczewkowa mikroskopia wideo do dynamicznej i ilościowej analizy przylegających kultur komórkowych

Uśpione i aktywne fenotypy komórek nowotworowych zostały scharakteryzowane za pomocą ilościowego obrazowania fazowego. Testy proliferacji, migracji i morfologii komórek zostały zintegrowane i przeanalizowane w jednej prostej metodzie.

Poklatkowe, bezznacznikowe, ilościowe badanie obrazowania fazowego uśpionych i aktywnych ludzkich komórek nowotworowych

Komórki strefy brzeżnej B (MZB) reagują na siłę przepływu ścinającego, reorientując swoją ścieżkę migracji w górę przepływu. Protokół ten pokazuje, jak rejestrować i analizować migrację za pomocą jednostki fluidyki, pompy, systemu obrazowania mikroskopowego i bezpłatnego oprogramowania.

Analiza indukowanej przepływem ścinającym migracji mysich komórek brzeżnej strefy B in vitro

Ta procedura opisuje, jak wizualizować, śledzić i określać ilościowo Acanthamoeba spp. Ruchliwość.

Oznaczanie ilościowe Acanthamoeba spp. Ruchliwość

Ten protokół zapewnia metodę pierwotnej izolacji mysich limfocytów T i mikroskopii poklatkowej migracji limfocytów T w określonych warunkach środowiskowych z analizą ilościową.

Test migracji in vitro w czasie rzeczywistym dla pierwotnych mysich limfocytów T CD8 +

Ten protokół opisuje bezznacznikowy przepływ pracy oparty na optycznej tomografii dyfrakcyjnej do obrazowania w czasie rzeczywistym i ilościowej analizy morfodynamiki makrofagów. Metoda umożliwia ciągłe śledzenie morfologii pojedynczych komórek i ich migracji, zapewniając pomiary w czasie rzeczywistym powierzchni rzutowanych, obwodu i średniej prędkości migracji podczas długotrwałego obrazowania żywych komórek.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym bez etykiet i analizy ilościowej morfodynamiki makrofagów z wykorzystaniem tomografii dyfrakcyjnej optycznej

Poznaj metodę ilościowej analizy migracji komórek w czasie rzeczywistym za pomocą poklatkowej mikroskopii wideo. Technika ta umożliwia ciągłe monitorowanie prędkości i przemieszczenia komórek, zapewniając szczegółowe dane w porównaniu do pomiarów punktowych.

Ilościowa analiza przypadkowej migracji komórek z wykorzystaniem mikroskopii wideo time-lapse

Przeglądaj więcej filmów