Mapowanie zależności struktura-funkcja zaburzonych onkogennych czynników transkrypcyjnych za pomocą analizy transkryptomicznej

Przeprowadzenie analizy funkcji struktury na powtarzających się i nieuporządkowanych czynnikach transkrypcyjnych jest trudne. Łącząc transkryptomikę z odpowiednim kontekstem komórkowym, podejście to pozwala lepiej odkryć ważne zależności między funkcjami struktury. Wykorzystanie sekwencjonowania RNA jako funkcjonalnego wyniku pozwala na skuteczną ocenę wszystkich genów regulowanych przez pojedyncze białko w jednym eksperymencie, co zwiększa prawdopodobieństwo częściowego wykrycia funkcji.

Częściowe wykrywanie funkcji jest szczególnie ważne w przypadku onkogennych czynników transkrypcyjnych fuzji, ponieważ nie wiemy, jak działają te białka, a ich sekwencjonowanie może prowadzić do lepszych terapii w nowotworach wywołanych fuzją. Chociaż skupimy się na nieuporządkowanej domenie EWS w EWS/FLI EWS bierze udział w innych fuzjach, które zawierają domeny nieuporządkowane ze słabo zdefiniowanymi funkcjami. Aby uzyskać transdukcję konstruktu ekspresji cDNA, najpierw szybko rozmrozić zamrożonego wirusa za pomocą konstruktów cDNA w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i delikatnie wymieszać 2,5 mikrolitra po osiem miligramów na mililitr polibrenu z każdym podłością.

Następnie usuń pożywkę z jednej 50 do 70% zlewającej się 10-centymetrowej płytki do hodowli komórek na konstrukt fiolki i delikatnie omiń całą dwumililitrową objętość konstruktu z boku płytki. Kołysz płytką, aby równomiernie rozprowadzić wirusa po komórkach i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych o temperaturze 37 stopni Celsjusza na dwie godziny, kołysząc płytką co 30 minut, aby zapobiec wysychaniu jakichkolwiek obszarów płytki. Pod koniec inkubacji dodać pięć mililitrów pożywki uzupełnionej płodową surowicą bydlęcą, antybiotykami, pirogronianem sodu i polibrenem.

Po całonocnej inkubacji w inkubatorze do hodowli komórkowych zastąp supernatant pożywką selekcyjną i zwróć komórki do inkubatora hodowli komórkowych na dodatkowe siedem do 10 dni, aby umożliwić selekcję i ekspresję konstruktu cDNA. Pod koniec okresu selekcji zbierz komórki do 15-mililitrowej stożkowej probówki do liczenia i przydziel pięć do 10 razy 10 do piątej komórki do nowej probówki do sekwencjonowania RNA i dwa razy 10 do sześciu komórek do innej nowej probówki w celu ekstrakcji białka. Osadź komórki przez odwirowanie i ponownie zawieś granulki w jednym mililitrze zimnego PBS lub pięciominutowym wirowaniu.

Następnie błyskawicznie zamroź zarówno granulki, jak i ciekły azot i przechowuj komórki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby zwalidować knockdown białek będących przedmiotem zainteresowania i ekspresję panelu konstruktów, należy osuszyć próbki lizatu białkowego odpowiednimi przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi zgodnie ze standardowymi protokołami analizy Western blot. Aby ocenić jakość i ilość RNA, użyj buforu do lizy z zestawu do ekstrakcji opartego na kolumnie wirowej krzemionki, aby poddać lizie próbki komórek sekwencjonowania RNA i nanieść lizaty na kolumnę do usuwania genomowego DNA z prędkością większą niż 13 000 obrotów na minutę przez 30 do 60 sekund.

Następnie przystąp do oczyszczania kolumny wirowej krzemionki i umyj RNA na kolumnie zgodnie z instrukcją zestawu. Następnie eluuj RNA w 30 mikrolitrach buforu elucyjnego i przeanalizuj co najmniej 2,5 mikrograma RNA na spektrofotometrze w stosunku 260 do 280 nanometrów, aby ocenić ilość RNA i jakość próbki. Do analizy plików fastq użyj Putty, aby otworzyć terminal do środowiska obliczeniowego o wysokiej wydajności i utworzyć katalog analizy o nazwie project.

Przejdź do ścieżki do katalogu projektu i utwórz katalog dla skompresowanych plików fastq. gz nieprzetworzonych o nazwie fastq i drugiego katalogu o nazwie trimmed. Nas odpowiedni bezpieczny program do przesyłania plików do przesyłania skompresowanego surowego fastq.

gz z pamięci lokalnej do ścieżki do katalogu Project FastQ i sprawdź, czy dla każdej próbki istnieje plik R1 i R2. Przejdź do ścieżki do projektu fastq i użyj polecenia w trim galore, jak wskazano, aby przyciąć odczyty o niskiej jakości z fastq. gz plików.

Przejdź do ścieżki do katalogu projektu i utwórz nowy katalog o nazwie STAR output. Przejdź do ścieżki do katalogu trim projektu i użyj polecenia, jak wskazano, aby uruchomić STAR w celu wyrównania przyciętego fastq. gz plików.

Zlokalizuj wymagane dane wyjściowe dla następnych kroków, które zawierają liczby na transkrypt we wskazanej lokalizacji i użyj polecenia, aby wczytać każdy plik karty odczytów na gen. W pierwszej kolumnie należy używać tylko znaków przed kropką w kolumnie identyfikatora genu ENSEMBL, aby ułatwić dalsze przetwarzanie. Następnie użyj polecenia, aby skompilować liczby wszystkich próbek w ramce danych o nazwie totcts i zapisać tę nową tabelę nieprzetworzonych danych zliczania jako plik tekstowy rozdzielany tabulatorami.

Aby zdefiniować profil wyrażenia różnicowego dla każdej konstrukcji przy użyciu algorytmu DESeq2, należy wprowadzić eksperymentalny projekt DESeq2 i użyć zestawu danych DESeq z funkcji macierzowej w celu skonstruowania zestawu danych DESeq w celu oszacowania współczynników rozmiaru i uruchomienia funkcji DESeq2. Aby ocenić jakość analizy, należy użyć protokołu DESeq2 w celu wyodrębnienia regularnej liczby normalizacji logarytmu. Podczas wyodrębniania wyników dla każdego profilu transkrypcyjnego z wyników DESeq2 należy wykonać porównania parami w odniesieniu do stanu knockdown lub pustego wektora linii bazowej.

Dalej zmień te wyniki za pomocą symboli genów HGNC i wyodrębnij dane z danych DESeq2 jako pojedynczy plik z identyfikatorem genu ENSEMBL, symbolem HGNC, wyrażeniem baseMean i danymi wyrażenia różnicowego dla wszystkich konstruktów z logarytmiczną podwójną zmianą oraz surowymi i skorygowanymi wartościami P. Oceń pomyślną normalizację partii i podobieństwo próbki zainteresowania, a następnie użyj kodu, aby użyć regularnych, znormalizowanych liczb logarytmicznych, aby sprawdzić grupowanie próbek z analizą głównych składników i wykresami odległości między próbkami. Użyj uregularyzowanych zliczeń logarytmicznych, aby wyodrębnić 1 000 najbardziej zmiennych genów do macierzy i użyj mapy cieplnej, aby przeprowadzić nienadzorowane hierarchiczne grupowanie próbek na podstawie tych genów.

Aby wyodrębnić klastry zainteresowań z dendrogramu, zdecyduj, na jakim poziomie pojawiają się klastry zainteresowań dendrogramu i ustaw K jako równe liczbie klastrów na tym poziomie. Aby określić, które klastry są interesujące, ponownie narysuj mapę cieplną uporządkowaną według klastrów i wyeksportuj listę genów powiązanych z każdym klastrem w tabeli, a następnie użyj odpowiedniego narzędzia bioinformatycznego w celu zidentyfikowania ról biologicznych dla różnych klastrów genów zidentyfikowanych i porównanych między klasami. W tej reprezentatywnej analizie można zaobserwować skuteczne powalenie i ratunek z pozytywnymi i negatywnymi konstruktami.

Należy zauważyć, że komórki uratowane przez DAF nie zdołały utworzyć kolonii, co sugeruje upośledzoną transformację onkogenną. Po zakończeniu walidacji replikantów można uzyskać testy fenotypowe i dane przetwarzania danych wstępnego sekwencjonowania RNA dotyczące liczby genów dla wszystkich próbek w celu normalizacji i analizy partii. DESeq2 bez normalizacji partii może powodować mylące wady partii, prawdopodobnie z powodu zmienności biologicznej wprowadzonej przez przejście komórek w hodowli i różnic w przetwarzaniu każdej partii.

Po normalizacji partii DESeq2 może służyć do generowania profili transkrypcyjnych dla konstrukcji będących przedmiotem zainteresowania w stosunku do linii bazowej. Analiza głównych składowych tych danych sugeruje, że profil transkrypcyjny DAF jest pośredni, między EWS/FLI typu dzikiego a Delta 22, co potwierdza częściową funkcję. Co więcej, hierarchiczne grupowanie 1000 najbardziej zmiennych genów w próbkach pokazuje, że DAF nie jest w stanie stłumić docelowych genów EWS / FLI i tylko częściowo zachowuje aktywność aktywacji genów.

Analiza genów sugeruje, że klasy genów aktywowanych przez DAF są funkcjonalnie różne od tych celów aktywowanych przez EWS/FLI, w których DAF nie jest funkcjonalny. Co ciekawe, DAF jest najbardziej zdolny do ratowania genów aktywowanych przez mikrosatelity GGAA, ale nie jest w stanie uratować aktywowanych genów w pobliżu miejsca o wysokim powinowactwie. Sprzężenie danych transkryptomicznych z odpowiednimi testami fenotypowymi kończy analizę funkcji struktury.

Naukowcy mogą również wykorzystać inne techniki do badania mechanistycznych czynników wpływających na różne funkcje transkrypcyjne.