Name: Mapowanie zależności struktura-funkcja zaburzonych onkogennych czynników transkrypcyjnych za pomocą analizy transkryptomicznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Poznaj analizę transkryptomiczną do mapowania zależności struktura-funkcja onkogennych czynników transkrypcyjnych z domenami nieuporządkowanymi w Ewing sarcoma. Metoda umożliwia wykrywanie częściowych funkcji białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez High Performance Computing Facility w Instytucie Badawczym Abigail Wexner w Nationwide Children's Hospital. Prace te były wspierane przez National Institutes of Health National Cancer Institute [U54 CA231641 do SLL, R01 CA183776 do SLL]; Alex's Lemonade Stand Foundation [Nagroda dla Młodego Badacza dla ERT]; Pelotonia [Stypendium do ERT]; oraz National Health and Medical Research Council CJ Martin Overseas Biomedical Fellowship [APP1111032 do KIP].

<ol><li>Miettinen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+fusion+sarcomas%3A+histopathology+and+clinical+significance+of+selected+entities%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Pathology%22%5BJournal%5D)">New fusion sarcomas: histopathology and clinical significance of selected entities.</a> Human Pathology. 86, 57-65 (2019).</li>
<li>Knott, M. M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+undruggable%3A+exploiting+neomorphic+features+of+fusion+oncoproteins+in+childhood+sarcomas+for+innovative+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+and+Metastasis+Reviews%22%5BJournal%5D)">Targeting the undruggable: exploiting neomorphic features of fusion oncoproteins in childhood sarcomas for innovative therapies.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 38, 625-642 (2019).</li>
<li>Yoshihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+and+therapeutic+relevance+of+cancer-associated+transcript+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The landscape and therapeutic relevance of cancer-associated transcript fusions.</a> Oncogene. 34, 4845-4854 (2015).</li>
<li>Duesberg, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+genes+generated+by+rare+chromosomal+rearrangements+rather+than+activation+of+oncogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Oncology+and+Tumor+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Cancer genes generated by rare chromosomal rearrangements rather than activation of oncogenes.</a> Medical Oncology and Tumor Pharmacotherapy. 4, 163-175 (1987).</li>
<li>Dupain, C., Harttrampf, A. C., Urbinati, G., Geoerger, B., Massaad-Massade, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relevance+of+Fusion+Genes+in+Pediatric+Cancers%3A+Toward+Precision+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Relevance of Fusion Genes in Pediatric Cancers: Toward Precision Medicine.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 6, 315-326 (2017).</li>
<li>Mitelman, F., Johansson, B., Mertens, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+translocations+and+gene+fusions+on+cancer+causation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">The impact of translocations and gene fusions on cancer causation.</a> Nature Reviews Cancer. 7, 233-245 (2007).</li>
<li>Smith, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profiling+of+EWS%2FFLI+identifies+NKX2.2+as+a+critical+target+gene+in+Ewing%27s+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Expression profiling of EWS/FLI identifies NKX2.2 as a critical target gene in Ewing's sarcoma.</a> Cancer Cell. 9, 405-416 (2006).</li>
<li>Davicioni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+PAX-FKHR+gene+expression+signature+that+defines+molecular+classes+and+determines+the+prognosis+of+alveolar+rhabdomyosarcomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of a PAX-FKHR gene expression signature that defines molecular classes and determines the prognosis of alveolar rhabdomyosarcomas.</a> Cancer Research. 66, 6936-6946 (2006).</li>
<li>Gröbner, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+of+genomic+alterations+across+childhood+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The landscape of genomic alterations across childhood cancers.</a> Nature. 555, 321-327 (2018).</li>
<li>Kim, J., Pelletier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetics+of+chromosome+translocations+involving+EWS+and+related+family+members%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Molecular genetics of chromosome translocations involving EWS and related family members.</a> Physiological Genomics. 1, 127-138 (1999).</li>
<li>Boulay, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-Specific+Retargeting+of+BAF+Complexes+by+a+Prion-like+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer-Specific Retargeting of BAF Complexes by a Prion-like Domain.</a> Cell. 171, 163-178 (2017).</li>
<li>Lessnick, S. L., Braun, B. S., Denny, C. T., May, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+domains+mediate+transformation+by+the+Ewing%E2%80%99s+sarcoma+EWS%2FFLI-1+fusion+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Multiple domains mediate transformation by the Ewing’s sarcoma EWS/FLI-1 fusion gene.</a> Oncogene. 10, 423-431 (1995).</li>
<li>Leach, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemia+fusion+target+AF9+is+an+intrinsically+disordered+transcriptional+regulator+that+recruits+multiple+partners+via+coupled+folding+and+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Leukemia fusion target AF9 is an intrinsically disordered transcriptional regulator that recruits multiple partners via coupled folding and binding.</a> Structure. 21, 176-183 (2013).</li>
<li>Ng, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+aromatic+side+chains+within+a+disordered+structure+are+critical+for+transcription+and+transforming+activity+of+EWS+family+oncoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Multiple aromatic side chains within a disordered structure are critical for transcription and transforming activity of EWS family oncoproteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 104, 479-484 (2007).</li>
<li>Riggi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EWS-FLI1+Divergent+Chromatin+Remodeling+Mechanisms+to+Directly+Activate+or+Repress+Enhancer+Elements+in+Ewing+Sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">EWS-FLI1 Divergent Chromatin Remodeling Mechanisms to Directly Activate or Repress Enhancer Elements in Ewing Sarcoma.</a> Cancer Cell. 26, 668-681 (2014).</li>
<li>Tomazou, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenome+Mapping+Reveals+Distinct+Modes+of+Gene+Regulation+and+Widespread+Enhancer+Reprogramming+by+the+Oncogenic+Fusion+Protein+EWS-FLI1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Epigenome Mapping Reveals Distinct Modes of Gene Regulation and Widespread Enhancer Reprogramming by the Oncogenic Fusion Protein EWS-FLI1.</a> Cell Reports. 10, 1082-1095 (2015).</li>
<li>Sankar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+and+relevance+of+EWS%2FFLI-mediated+transcriptional+repression+in+Ewing+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Mechanism and relevance of EWS/FLI-mediated transcriptional repression in Ewing sarcoma.</a> Oncogene. 32, 5089-5100 (2013).</li>
<li>Gangwal, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsatellites+as+EWS%2FFLI+response+elements+in+Ewing%27s+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Microsatellites as EWS/FLI response elements in Ewing's sarcoma.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 105, 10149-10154 (2008).</li>
<li>Gangwal, K., Close, D., Enriquez, C. A., Hill, C. P., Lessnick, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergent+Properties+of+EWS%2FFLI+Regulation+via+GGAA+Microsatellites+in+Ewing%27s+Sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Cancer%22%5BJournal%5D)">Emergent Properties of EWS/FLI Regulation via GGAA Microsatellites in Ewing's Sarcoma.</a> Genes & Cancer. 1, 177-187 (2010).</li>
<li>Guillon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Oncogenic+EWS-FLI1+Protein+Binds+In+Vivo+GGAA+Microsatellite+Sequences+with+Potential+Transcriptional+Activation+Function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The Oncogenic EWS-FLI1 Protein Binds In Vivo GGAA Microsatellite Sequences with Potential Transcriptional Activation Function.</a> PLoS One. 4, 4932(2009).</li>
<li>Chong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+dynamic+and+selective+low-complexity+domain+interactions+that+control+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging dynamic and selective low-complexity domain interactions that control gene transcription.</a> Science. 361, (2018).</li>
<li>Johnson, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+the+EWS+domain+of+EWS%2FFLI+in+binding+GGAA-microsatellites+required+for+Ewing+sarcoma+anchorage+independent+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Role for the EWS domain of EWS/FLI in binding GGAA-microsatellites required for Ewing sarcoma anchorage independent growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 114, 9870-9875 (2017).</li>
<li>Theisen, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+analysis+functionally+maps+the+intrinsically+disordered+domain+of+EWS%2FFLI+and+reveals+novel+transcriptional+dependencies+for+oncogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Cancer%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic analysis functionally maps the intrinsically disordered domain of EWS/FLI and reveals novel transcriptional dependencies for oncogenesis.</a> Genes & Cancer. 10, 21-38 (2019).</li>
<li>Chen, J., Bardes, E. E., Aronow, B. J., Jegga, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ToppGene+Suite+for+gene+list+enrichment+analysis+and+candidate+gene+prioritization%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">ToppGene Suite for gene list enrichment analysis and candidate gene prioritization.</a> Nucleic Acids Research. 37, 305-311 (2009).</li>
<li>Johnson, K. M., Taslim, C., Saund, R. S., Lessnick, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+two+types+of+GGAA-microsatellites+and+their+roles+in+EWS%2FFLI+binding+and+gene+regulation+in+Ewing+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of two types of GGAA-microsatellites and their roles in EWS/FLI binding and gene regulation in Ewing sarcoma.</a> PLOS One. 12, 0186275(2017).</li>
<li>Kim, P., Ballester, L. Y., Zhao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+retention+in+transcription+factor+fusion+genes+and+its+biological+and+clinical+implications%3A+a+pan-cancer+study%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Domain retention in transcription factor fusion genes and its biological and clinical implications: a pan-cancer study.</a> Oncotarget. 8, 110103-110117 (2017).</li>
<li>de Mendíbil, I. O., Vizmanos, J. L., Novo, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signatures+of+Selection+in+Fusion+Transcripts+Resulting+from+Chromosomal+Translocations+in+Human+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Signatures of Selection in Fusion Transcripts Resulting from Chromosomal Translocations in Human Cancer.</a> PLOS One. 4, 4805(2009).</li>
<li>Frenkel-Morgenstern, M., Valencia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+domain+combinations+in+proteins+encoded+by+chimeric+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Novel domain combinations in proteins encoded by chimeric transcripts.</a> Bioinformatics. 28, 67-74 (2012).</li>
<li>Hegyi, H., Buday, L., Tompa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+Structural+Disorder+Confers+Cellular+Viability+on+Oncogenic+Fusion+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Intrinsic Structural Disorder Confers Cellular Viability on Oncogenic Fusion Proteins.</a> PLoS Computational Biology. 5, 1000552(2009).</li>
<li>Latysheva, N. S., Babu, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+and+understanding+oncogenic+gene+fusions+through+data+intensive+computational+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Discovering and understanding oncogenic gene fusions through data intensive computational approaches.</a> Nucleic Acids Research. 44, 4487-4503 (2016).</li>
<li>Deneen, B., Denny, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+p16+pathways+stabilizes+EWS%2FFLI1+expression+and+complements+EWS%2FFLI1+mediated+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Loss of p16 pathways stabilizes EWS/FLI1 expression and complements EWS/FLI1 mediated transformation.</a> Oncogene. 20, 6731-6741 (2001).</li>
<li>Kendall, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAX3-FOXO1+transgenic+zebrafish+models+identify+HES3+as+a+mediator+of+rhabdomyosarcoma+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">PAX3-FOXO1 transgenic zebrafish models identify HES3 as a mediator of rhabdomyosarcoma tumorigenesis.</a> eLife. 7, 33800(2018).</li>
</ol>

SLL deklaruje konflikt interesów jako członek rady doradczej i udziałowiec Salarius Pharmaceuticals. SLL jest również wynalazcą wpisanym na listę patentów Stanów Zjednoczonych nr. US 7,393,253 B2, "Metody i kompozycje do diagnozowania i leczenia mięsaka Ewinga" oraz US 8,557,532, "Diagnoza i leczenie lekoopornego mięsaka Ewinga". Nie zmienia to naszego przestrzegania zasad JoVE dotyczących udostępniania danych i materiałów.

Badanie mechanizmów biochemicznych onkogennych czynników transkrypcyjnych jest niezwykle ważne dla zrozumienia wywoływanych przez nie chorób i zaprojektowania nowych strategii terapeutycznych. Jest to szczególnie prawdziwe w nowotworach złośliwych charakteryzujących się translokacjami chromosomowymi skutkującymi fuzyjnymi czynnikami transkrypcyjnymi. Domeny zawarte w tych chimerycznych białkach mogą nie mieć znaczących interakcji z domenami regulatorowymi obecnymi w białkach typu dzikiego, co komplikuje zdolność do interpretacji informacji o strukturze i funkcji w kontekście fuzji 26,27,28. Co więcej, wiele z tych fuzji onkogennych charakteryzuje się wewnętrznie nieuporządkowanymi domenami o niskiej złożoności 10,13,29,30.
Domena EWS jest przykładem takiej wewnętrznie nieuporządkowanej domeny, która jest zaangażowana w różne fuzje onkogenne10. Z natury nieuporządkowana i powtarzalna natura utrudnia wysiłki zmierzające do zrozumienia mechanizmów molekularnych wykorzystywanych w domenie EWS. Wcześniejsze wysiłki mające na celu zbadanie struktury i funkcji w dużej mierze ograniczały się do stosowania różnych mutantów w kontekście testów genów reporterowych lub w tłach komórkowych, które nie są w stanie oddać odpowiedniego kontekstu komórkowego lub nie mają żadnych zmian strukturalnych, które dają znaczącą funkcję cząstkową 11,17,25. Przedstawiona tutaj metoda rozwiązuje te problemy. Mapowanie struktura-funkcja odbywa się w kontekście komórki istotnym dla choroby, a sekwencjonowanie nowej generacji umożliwia profilowanie transkryptomiczne w celu oceny funkcji czynnika transkrypcyjnego w warunkach natywnej chromatyny. W konkretnym przypadku mutanta DAF EWS / FLI, DAF wykazał niewielką aktywność w testach reporterowych wykorzystujących izolowane elementy odpowiedzi, ale wykazywał aktywność w kontekście pełnego promotora genu, albo w teście reporterowym, albo w natywnej chromatynie, co sugeruje interesujący fenotyp23. Zastosowanie opisanej tutaj metody bardziej bezpośrednio rozwiązuje pytanie, który rodzaj elementów regulatorowych w całym genomie jest najbardziej wrażliwy w środowisku chorobowym. Testując jednocześnie wszystkie potencjalne geny docelowe w ich natywnym kontekście chromatyny, podejście transkryptomiczne z większym prawdopodobieństwem pozwoli zidentyfikować konstrukty o częściowej funkcji.
Nieodłączna siła wykorzystania tła komórkowego istotnego dla choroby jest prawdopodobnie największym ograniczeniem tej techniki. Jednym z najważniejszych czynników jest wybór odpowiedniego układu komórkowego do tych eksperymentów. Wiele linii komórkowych pochodzących z nowotworów złośliwych z patognomonicznymi czynnikami transkrypcyjnymi nie toleruje łatwo knockdownu tego czynnika transkrypcyjnego, a w wielu przypadkach, szczególnie w przypadku nowotworów dziecięcych, prawdziwa komórka pochodzenia pozostaje kontrowersyjna, a ekspresja onkogenu w innych tłach komórkowych jest zbyt toksyczna31,32. W takich przypadkach pomocne może być przeprowadzenie eksperymentów na innym tle komórkowym, o ile badacz zachowa ostrożność w interpretacji wyników i odpowiednio zweryfikuje wszelkie istotne wyniki w bardziej istotnym dla choroby typie komórki.
Niezwykle ważne jest, aby dokładnie zweryfikować stabilność i fenotypowe konsekwencje ekspresji onkogenu i przesyłać do sekwencjonowania tylko te próbki, które spełniają ścisłe kryteria. W tym przypadku obejmowało to western blot w celu potwierdzenia knockdown i rescue, oraz qRT-PCR niewielkiej liczby znanych genów docelowych w celu walidacji kontroli pozytywnej (Figura 2). Równie ważne jest zmniejszenie jak największej zmienności partii poprzez staranne przeprowadzanie preparatów komórek i RNA w jak najpodobny sposób w każdej partii.
Opisana tutaj metoda staje się szczególnie skuteczna w połączeniu z innymi typami danych genomowych, które mówią o funkcji badanego czynnika transkrypcyjnego w całym genomie. Przyszłe kierunki tego typu analizy struktura-funkcja zostaną rozszerzone o ChIP-seq i ATAC-seq w celu określenia wiązania czynnika transkrypcyjnego i wszelkich indukowanych zmian w dostępności chromatyny. Jako zestaw, tego typu dane mogą wskazywać, gdzie różne składniki strukturalne onkogennego czynnika transkrypcyjnego przyczyniają się do różnych aspektów funkcji (tj. wiązanie DNA vs. modyfikacja chromatyny vs. rekrutacja koregulatora). Ogólnie rzecz biorąc, zastosowanie podejść opartych na NGS do mapowania zależności struktura-funkcja czynników transkrypcyjnych fuzji może dostarczyć nowych informacji na temat biochemicznych uwarunkowań onkogennej funkcji tych białek. Jest to ważne, aby pogłębić naszą wiedzę na temat chorób, które powodują, i umożliwić opracowanie nowych strategii terapeutycznych.

Podzbiór nowotworów, w tym wiele nowotworów złośliwych wieku dziecięcego i młodzieńczego, charakteryzuje się translokacjami chromosomalnymi, które generują nowe onkogeny fuzji1,2,3,4,5,6. Powstałe w ten sposób białka fuzyjne często funkcjonują jako onkogenne czynniki transkrypcyjne, koordynując rozległe zmiany w regulacji transkrypcji w celu promowania nowotworzenia7,8. Nowotwory z tymi translokacjami zwykle mają spokojny krajobraz mutacyjny, z kilkoma powtarzającymi się aberracjami genomowymi poza patognomoniczną fuzją4,9. W związku z tym bezpośrednie ukierunkowanie na białko fuzyjne jest atrakcyjną strategią terapeutyczną w tych chorobach. Jednak te onkogenne czynniki transkrypcyjne zwykle składają się z domeny o niskiej złożoności, wewnętrznie nieuporządkowanej, aktywującej transkrypcję połączonej z domeną wiążącą DNA (DBD)10,11,12,13,14. Zarówno wewnętrznie nieuporządkowane domeny (IDD), jak i DBD tych białek okazały się trudne do ukierunkowania za pomocą konwencjonalnych podejść farmakologicznych. Opracowanie nowych podejść terapeutycznych wymaga zatem bardziej szczegółowego zrozumienia molekularnego mechanizmów wykorzystywanych przez te fuzje do nieprawidłowej regulacji ekspresji genów.
N-końcowa część IDD EWSR1 jest często łączona z DBD w raku, w tym EWS/FLI w mięsaku Ewinga, EWS/WT1 w rozlanym guzie drobnokomórkowym i EWS/ATF1 w mięsaku jasnokomórkowym części miękkich10. Mechanistyczna rola EWS IDD w każdej z tych fuzji nie jest w pełni poznana. Rodzina fuzji EWS/ETS, w szczególności EWS/FLI, jest jak dotąd najbardziej funkcjonalnie scharakteryzowana. EWS/FLI koordynuje zmiany epigenetyczne i transkrypcyjne w całym genomie, prowadzące do aktywacji i represji tysięcy genów7,11,15,16. Badania wykazały, że IDD jest ważny dla rekrutacji zarówno koaktywatorów transkrypcji (takich jak p300, WDR5 i kompleks BAF), jak i korepresorów (takich jak kompleks NuRD)11,15,17. Fuzja EWS IDD z C-końcową częścią FLI1 nadaje nową specyficzność wiązania DNA ETS DBD FLI1, tak że onkoproteina fuzyjna (EWS/FLI) wiąże się z powtarzającymi się regionami mikrosatelitarnymi GGAA genomu oprócz motywu konsensusu ETS18,19,20. W połączeniu z funkcją rekrutacji koaktywatora, ta powstająca aktywność wiązania DNA EWS / FLI sprzyja tworzeniu wzmacniacza de novo w mikrosatelitach GGAA dystalnie do miejsc rozpoczęcia transkrypcji (TSS) (mikrosatelity "enhancer-like") i rekrutuje polimerazę RNA II do promowania transkrypcji w mikrosatelitach GGAA proksymalnych do TSS (mikrosatelity "podobne do promotora")11,15,16,21.
Razem wzięte, te dane doprowadziły nas do postawienia hipotezy, że dyskretne elementy w domenie EWS przyczyniają się do rekrutacji różnych współregulatorów do różnych typów miejsc wiązania EWS/FLI. Jednak dostrzeżenie tych elementów w części EWS EWS/FLI i sposobu ich funkcjonowania było utrudnione przez wysoce powtarzalną i nieuporządkowaną naturę tej domeny. Tutaj wykorzystujemy wcześniej opublikowany system ratunkowy knockdown-rescue w komórkach mięsaka Ewinga, aby funkcjonalnie zmapować te elementy w EWS IDD. W tym systemie EWS/FLI jest zubożony za pomocą shRNA ukierunkowanego na 3'UTR genu FLI1, a ekspresja jest ratowana za pomocą różnych zmutowanych konstruktów cDNA EWS/FLI pozbawionych 3'UTR7,17,22. Eksperymenty te koncentrowały się na konstruktach z różnymi delecjami w celu zmapowania relacji struktura-funkcja między EWS IDD a ważnymi fenotypami onkogennymi, w tym aktywacji konstruktu reporterowego GGAA-mikrosatelitarnego, testach tworzenia kolonii i ukierunkowanej walidacji genów aktywowanych i represjonowanych przez EWS/FLI7,17,22. Jednak w badaniach tych nie udało się znaleźć dyskretnych subdomen w obrębie EWS IDD w EWS/FLI, które są wyjątkowo ważne dla aktywacji lub represji. Wszystkie testowane konstrukty były albo zdolne zarówno do aktywacji, jak i tłumienia określonych genów docelowych, co prowadziło do efektywnego tworzenia kolonii, albo nie były w stanie regulować żadnego z docelowych genów EWS/FLI, co prowadziło do utraty tworzenia kolonii7,17,22.
Analizy transkryptomiczne, które są możliwe dzięki powszechnemu zastosowaniu sekwencjonowania nowej generacji, są powszechnie używane do porównywania sygnatur ekspresji genów w dwóch warunkach, często w kontekście badań przesiewowych lub opisowych. Zamiast tego chcieliśmy wykorzystać możliwość przechwytywania danych o ekspresji całego genomu za pomocą sekwencjonowania RNA (sekwencjonowania RNA), aby scharakteryzować wkład IDD w funkcję czynnika transkrypcyjnego. W tym przypadku sekwencja RNA jest sparowana z systemem knockdown-rescue w celu zbadania relacji struktura-funkcja domeny EWS. Podejście to ma zastosowanie do innych fuzyjnych czynników transkrypcyjnych, w tym innych fuzji EWS lub czynników transkrypcyjnych typu dzikiego o słabo poznanej funkcji, i ma wiele zalet w porównaniu z innymi testami stosowanymi w badaniach mapowania funkcjonalnego, takimi jak testy reporterowe lub celowany qRT-PCR. Obejmują one testowanie strukturalnych determinantów funkcji w odpowiednim kontekście chromatyny, zdolność do testowania wielu typów elementów odpowiedzi w jednym teście (tj. aktywowane i represjonowane, GGAA-mikrosatelitarne i niemikrosatelitarne itp.) oraz wynikającą z tego zdolność do lepszego wykrywania częściowej funkcji.
Pomyślne wdrożenie tego podejścia zależy od systemu opartego na komórkach, który wychwytuje interesujące nas fenotypy (w tym przypadku komórki A673 z detryfikacją EWS/FLI za pośrednictwem shRNA) oraz panelu zmutowanych konstruktów w wektorze ekspresyjnym odpowiednim dla systemu opartego na komórkach (w tym przypadku, pMSCV-hygro z różnymi mutantami EWS/FLI oznaczonymi 3x-FLAG, które mają być dostarczone przez transdukcję retrowirusową). Transdukcja wirusowa konstruktów zubożenia opartych na CRISPR, konstruktów zubożenia opartych na shRNA i konstruktów ekspresji cDNA z odpowiednią selekcją w celu wygenerowania stabilnych linii komórkowych jest zalecana zamiast transfekcji przejściowej. Dalsza interpretacja wyników jest wzmocniona, gdy dane transkryptomiczne można połączyć z innymi danymi związanymi z lokalizacją czynnika transkrypcyjnego i innymi odczytami fenotypowymi, jeśli są dostępne.
W tym artykule stosujemy to podejście, aby scharakteryzować aktywność mutanta DAF EWS/FLI14. Mutant DAF ma 17 mutacji tyrozyny do alaniny w powtarzających się regionach EWS IDD EWS/FLI14. Ten konkretny mutant EWS został wcześniej zgłoszony i nie jest w stanie aktywować ekspresji genu reporterowego po fuzji z ATF1 DBD14. Jednak wstępne dane qRT-PCR sugerowały, że ten mutant był w stanie aktywować transkrypcję docelowego EWS/FLI NR0B123. Opisane tutaj podejście transkryptomiczne umożliwiło skuteczne wykrycie częściowej funkcji mutanta DAF. Łącząc te dane transkryptomiczne z informacjami o motywach wiązania i rozpoznawania EWS/FLI, pokazujemy ponadto, że mutant DAF zachowuje funkcję w powtórzeniach mikrosatelitarnych GGAA. Wyniki te identyfikują DAF jako pierwszy częściowo funkcjonalny mutant EWS/FLI i podkreślają funkcję genów niemikrosatelitarnych jako ważną dla onkogenezy (jak podano23). Pokazuje to moc tego transkryptomicznego podejścia do mapowania struktury-funkcji w celu zapewnienia wglądu w funkcję onkogennych czynników transkrypcyjnych.

<table><tbody><tr><td>Wet Lab Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-FLI królik pAb</td><td>Abcam</td><td>ab15289</td><td>1:500</td></tr><tr><td>anty-lamina B1 królik pAb</td><td>Abcam</td><td>ab16048</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>Komórkowy system wprowadzania zmutowanych konstruktów</td><td></td><td></td><td>Określony przez zastosowany system komórkowy</td></tr><tr><td>Krioprobówki</td><td></td><td></td><td>Dla podwielokrotności wirusowych</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td>Do produkcji wirusów</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Gibco</td><td>16000-044</td><td>Do produkcji wirusów</td></tr><tr><td>G418</td><td>ThermoFisher</td><td>10131027</td><td>Do produkcji wirusów</td></tr><tr><td>HEK293-EBNAs</td><td>ATCC</td><td>CRL-10852</td><td>Do produkcji wirusów</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycyna B</td><td>ThermoFisher</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>M2 mysi mAb anty-FLAG</td><td>Sigma</td><td>F3165</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>Przeciwciała wtórne w pobliżu IR</td><td>Li-Cor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optimem</td><td>Gibco</td><td>31985062</td><td>Do produkcji wirusa</td></tr><tr><td>Penicylina / Streptomycyna / Glutamina</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td>Do produkcji wirusa</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma</td><td>TR-1003-G</td><td>Do transdukcji wirusa</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma</td><td>P8833</td><td>Przechowywany w zapasie 2 mg / ml</td></tr><tr><td>Zestaw RNeasy Plus</td><td>Qiagen</td><td>74136</td><td>Posiada kolumny do usuwania gDNA</td></tr><tr><td>Odczynniki</td><td></td><td></td> selekcyjne <td>Zgodnie z zastosowanym systemem komórkowym</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>Do produkcji wirusów</td></tr><tr><td>Pożywki</td><td></td><td></td> <td>do hodowli tkankowychOkreślone przez zastosowany system komórkowy</td></tr><tr><td>TransIT-LT1</td><td>Mirus</td><td>MIR 2304</td><td>Do produkcji</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> wirusów<tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr>Access <tr><td>to HPC environment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AnnotationDbi</td><td></td><td></td><td>1.38.2</td></tr><tr><td>Cairo</td><td></td><td></td><td>1.5-10</td></tr><tr><td>DESeq2</td><td></td><td></td><td>1.16.1</td></tr><tr><td>Filtr</td><td></td><td></td> genetyczny <td>1.58.1</td></tr><tr><td>ggbiplot</td><td></td><td></td><td>0.55</td></tr><tr><td>ggplot2</td><td></td><td></td><td>3.1.1</td></tr><tr><td>org. </td><td></td><td></td> Hs.eg.db <td>3.4.1</td></tr><tr><td>mapa</td><td></td><td></td> do oszukiwania <td>1.0.12</td></tr><tr><td>PuTTY</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>R</td><td></td><td></td><td>3.4.0</td></tr><tr><td>RColorBrewer</td><td></td><td></td><td>1.1-2</td></tr><tr><td>przekształcenie2</td><td></td><td></td><td>1.4.3</td></tr><tr><td>rgl</td><td></td><td></td><td>0.100.19</td></tr><tr><td>R-studio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>STAR</td><td></td><td></td><td>Wersja 2.6 lub nowsza</td></tr><tr><td>sva</td><td></td><td></td><td>3.24.4</td></tr><tr><td>TrimGalore!</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>WinSCP (oprogramowanie WinSCP</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>)

mapowanie zależności struktura-funkcja zaburzonych onkogennych czynników transkrypcyjnych za pomocą analizy transkryptomicznej

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

Wiele nowotworów charakteryzuje się translokacjami chromosomalnymi, które skutkują ekspresją onkogennych czynników transkrypcyjnych fuzji. Zazwyczaj białka te zawierają wewnętrznie nieuporządkowaną domenę (IDD) połączoną z domeną wiążącą DNA (DBD) innego białka i koordynują rozległe zmiany transkrypcyjne w celu promowania nowotworu złośliwego. Fuzje te są często jedyną powtarzającą się aberracją genomową w wywoływanych przez nie nowotworach, co czyni je atrakcyjnymi celami terapeutycznymi. Jednak ukierunkowanie na onkogenne czynniki transkrypcyjne wymaga lepszego zrozumienia mechanistycznej roli, jaką IDD o niskiej złożoności odgrywają w swojej funkcji. Domena N-końcowa EWSR1 jest IDD zaangażowanym w różne onkogenne czynniki transkrypcyjne fuzji, w tym EWS / FLI, EWS / ATF i EWS / WT1. Tutaj używamy sekwencjonowania RNA do zbadania cech strukturalnych domeny EWS ważnych dla funkcji transkrypcyjnej EWS / FLI w mięsaku Ewinga. Po raz pierwszy przeprowadza się zubożenie endogennej fuzji z komórek mięsaka Ewinga za pośrednictwem shRNA w połączeniu z ektopową ekspresją różnych zmutowanych konstruktów EWS. Następnie sekwencjonowanie RNA służy do analizy transkryptomów komórek wyrażających te konstrukty w celu scharakteryzowania deficytów funkcjonalnych związanych z mutacjami w domenie EWS. Integrując analizy transkryptomiczne z wcześniej opublikowanymi informacjami na temat motywów wiążących EWS/FLI DNA i lokalizacji genomowej, a także testów funkcjonalnych zdolności transformacji, byliśmy w stanie zidentyfikować cechy strukturalne EWS/FLI ważne dla onkogenezy i zdefiniować nowy zestaw genów docelowych EWS/FLI krytycznych dla mięsaka Ewinga. W artykule przedstawiono zastosowanie sekwencjonowania RNA jako metody mapowania zależności struktura-funkcja wewnętrznie nieuporządkowanej domeny onkogennych czynników transkrypcyjnych.

Wstępne dane qRT-PCR sugerowały, że mutant EWS/FLI nazwany DAF, posiadający specyficzne mutacje tyrozyny na alaninę w regionie powtarzalnym i nieuporządkowanym białka EWS, zachował zdolność do aktywacji genów docelowych EWS/FLI, ale nie był w stanie represować krytycznych genów docelowych23. Aby lepiej zrozumieć związek między tymi resztami w domenie EWS a funkcją EWS/FLI, zastosowano protokół opisany powyżej i przedstawiony na Rysunku 1. Komórki mięsaka Ewinga A673 poddano transdukcji wirusowej shRNA celującym w 3’UTR genu FLI1, co doprowadziło do wyczerpania endogennego EWS/FLI. Po czterech dniach selekcji funkcję EWS/FLI przywrócono poprzez transdukcję wirusową różnych mutantów EWS/FLI z tagiem 3XFLAG, stosując pusty wektor jako kontrolę braku przywrócenia funkcji. Jako kontrolę negatywną wykorzystano niefunkcjonalny mutant pozbawiony domeny EWS, nazwany Δ22, natomiast jako kontrolę pozytywną wykorzystano EWS/FLI typu dzikiego, nazwany wtEF (Rysunek 2A). Jako konstrukt testowy zastosowano DAF, choć w razie potrzeby można użyć więcej niż jednego konstruktu testowego. Komórki selekcjonowano przez dodatkowe 10 dni, aby umożliwić stabilizację ekspresji konstruktów, a następnie zebrano je do analiz RNA (z etapem usuwania gDNA), białek oraz testów tworzenia kolonii. Zebrano cztery powtórzenia, a reprezentatywne wyniki qRT-PCR i western blot wykazujące skuteczne wyciszenie i przywrócenie funkcji przedstawiono na Rysunku 2B-D. Należy zauważyć, że komórki z przywróconą funkcją DAF nie tworzyły kolonii, co pokazano na Rysunku 2E, co sugeruje upośledzenie transformacji onkogennej.
Po zakończeniu walidacji powtórzeń i analiz fenotypowych, RNA przekazano do Institute for Genomic Medicine w Nationwide Children’s Hospital w celu przygotowania bibliotek i sekwencjonowania nowej generacji, w wyniku czego zebrano około 50 milionów par końców odczytów o długości 150 bp. Dane zwrócono w plikach fastq.gz. Odczyty o niskiej jakości zostały usunięte z tych plików za pomocą programu TrimGalore, a program STAR posłużył do dopasowania odczytów do ludzkiego genomu hg19 oraz zliczenia odczytów dla każdego genu. Wykorzystano hg19 w celu zapewnienia kompatybilności z innymi kuratowanymi zbiorami danych dla EWS/FLI użytymi w dalszej analizie. Liczby odczytów połączono w jedną macierz zliczeń dla wszystkich próbek, której pierwsze 6 wierszy przedstawiono na Rysunku 3.
Obliczenia liczby odczytów przeprowadzono początkowo za pomocą programu DESeq2 bez normalizacji partii; jednak wizualna inspekcja odległości między próbkami wykazała potencjalne zakłócające efekty partii, zaznaczone czerwonymi strzałkami na Rysunku 4A. Prawdopodobnie wynikało to ze zmienności biologicznej wprowadzonej przez pasażowanie komórek w hodowli oraz różnice w procesowaniu każdej partii. Normalizacja efektów partii została wykonana za pomocą narzędzia ComBat, co jest rozwiązaniem ogólnie zalecanym. Odległości między próbkami dla danych znormalizowanych pod kątem partii przedstawiono na Rysunku 4B. Po normalizacji partii wykorzystano DESeq2 do wygenerowania profili transkrypcyjnych dla trzech konstruktów (wtEF, Δ22 i DAF) w stosunku do poziomu bazowego. Należy zauważyć, że choć w analizie różnicowej uwzględniono „rodzicielskie” komórki A673 (mock knockdown i mock rescue, nazwane tutaj „iLuc”), referencją dla tego eksperymentu są komórki z wyciszonym EWS/FLI, nazwane komórkami iEF. Profil transkrypcyjny dla białka endogennego można wygenerować, porównując próbkę iLuc z iEF, co może być istotne dla zrozumienia działania systemu rescue, jednak nie jest to celem niniejszej analizy. Profile transkrypcyjne wygenerowane dla mutantów obejmują kontrole pozytywną (wtEF) i negatywną (Δ22) względem iEF, tak aby mogły one służyć jako punkty odniesienia dla pozostałych mutantów. Jest to istotne, ponieważ kontrola pozytywna w tym przykładzie nie odtworzyła w pełni funkcji endogennego EWS/FLI, co omówiono w innych publikacjach7,23.
Analiza głównych składowych (PCA) w Rysunek 5 sugeruje, że profil transkrypcyjny DAF ma charakter pośredni między wtEF a &#916;22, co potwierdza częściową funkcjonalność. Ponadto hierarchiczna analiza skupień 1000 genów o największej zmienności w badanych próbkach wykazała, że DAF nie zdołał zahamować ekspresji genów docelowych EWS/FLI i zachował jedynie częściową aktywność w aktywacji genów, co przedstawiono w Rycina 6A i Rycina S5Analiza ToppGene sugeruje, że klasy genów aktywowanych przez DAF różnią się funkcjonalnie od genów docelowych aktywowanych przez EWS/FLI w przypadku, gdy DAF nie jest funkcjonalny (Rycina 6B). Co ciekawe, funkcje genów aktywowanych, których ekspresja została przywrócona przez wtEF, ale nie przez DAF, wydają się być związane z kontrolą transkrypcyjną i regulacją chromatyny. W oparciu o wyniki testów tworzenia kolonii, geny z tego podstawowego zestawu sygnatur genowych powinny zostać poddane dalszej analizie pod kątem ich roli w onkogenezie indukowanej przez EWS/FLI. Znaczenie represji genów pośredniczonej przez EWS/FLI zostało opisane we wcześniejszych publikacjach.17.
Znane jest, że EWS/FLI wykazuje unikalne powinowactwo wiązania do elementów powtórzeń mikrosatelitarnych GGAA19,22, a wiązanie w tych elementach napędza regulację genów w dół nurtu11,15,18,20,22. Mikrosatelity te zostały scharakteryzowane jako związane albo z aktywacją, albo z represją, oraz położone albo proksymalnie (&#60; 5 kb) względem TSS, albo dystalnie (&#62; 5 kb) względem TSS25. Ponadto istnieją geny regulowane przez EWS/FLI z motywami ETS o wysokim powinowactwie (HA) proksymalnie do TSS23. Aby dalej przeanalizować charakterystykę funkcji DAF oraz to, jakie typy genów aktywowanych przez EWS/FLI DAF był w stanie przywrócić, przeanalizowano różnicową ekspresję genów związanych z tymi różnymi klasami. Co ciekawe, DAF najskuteczniej przywracał ekspresję genów aktywowanych przez mikrosatelity GGAA, ale nie był w stanie przywrócić ekspresji genów aktywowanych w pobliżu miejsca HA, co pokazano na Rysunku 7. Jak wynika z klasteryzacji hierarchicznej, DAF nie przywraca represji zapośredniczonej przez EWS/FLI we wszystkich klasach motywów. Dane te sugerują, że DAF zachowuje wystarczające cechy strukturalne EWS, aby wiązać się i aktywować z mikrosatelitów GGAA, zarówno proksymalnie, jak i dystalnie względem TSS. Prawdopodobnie wynika to z nienaruszonej domeny SYGQ, którą uważa się za istotną dla aktywności EWS/FLI w powtórzeniach GGAA11. Dane te sugerują również, że specyficzne tyrozyny zmutowane w DAF pełnią istotną, choć słabo poznaną rolę w regulacji genów zapośredniczonej przez EWS/FLI w miejscach HA, a także w represji genów, co wskazuje na ważny obszar dalszych badań.
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61564/61564fig01.jpg" /> 
Rysunek 1: Schemat pracy.&#160;Przedstawienie procedury krok po kroku w celu wykonania mapowania struktura-funkcja za pomocą transkryptomiki. W pierwszej kolejności przygotowano komórki do ekspresji zestawu konstruktów wymaganych do mapowania struktura-funkcja. Po ekspresji komórki zebrano w celu izolacji RNA i białek oraz poddano analizie pod kątem fenotypów korelacyjnych. Zweryfikowano ekspresję konstruktów, a proces ten powtórzono 3-4 razy w celu uzyskania niezależnych replik biologicznych. Następnie RNA przekazano do sekwencjonowania nowej generacji (NGS). Po otrzymaniu danych przeprowadzono ich przycinanie pod kątem jakości, zmapowano sekwencje i obliczono liczbę odczytów na transkrypt. Skorygowano efekty seryjne, a sygnatury transkryptomiczne oraz różnicową ekspresję określono przy użyciu DESeq2. Można włączyć grupowanie hierarchiczne oraz dalsze analizy integrujące inne zestawy danych omiczne oraz różne analizy szlaków lub funkcjonalne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564fig01large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61564/61564fig02.jpg" /> 
Rysunek 2: Walidacja ekspresji konstruktów i testy korelacyjne.&#160;(A) Schemat przedstawiający konstrukty testowane w tym przykładzie. (B) Walidacja wyciszenia endogennego EWS/FLI oraz ekspresji konstruktów z tagiem 3X-FLAG za pomocą immunoblottingu. (C,D) Walidacja aktywności konstruktów w odniesieniu do genu docelowego aktywowanego przez EWS/FLI (C), NR0B1, oraz genu docelowego represowanego przez EWS/FLI (D), TGFBR2, za pomocą qRT-PCR. Dane przedstawiono jako średnia +/- odchylenie standardowe. Wartości p obliczono za pomocą testu istotności Tukeya. * p &#60; 0.05, ** p &#60; 0.01, *** p &#60; 0.005 (E) Liczba kolonii z testów w miękkim agarze przeprowadzonych w celu oceny aktywności transformującej konstruktów. Wartości p obliczono za pomocą testu istotności Tukeya. * p &#60; 0.05, ** p &#60; 0.01, *** p &#60; 0.005. Rysunek zaadaptowano z Theisen, et al.23 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61564/61564fig03.jpg" /> 
Rycina 3: Końcowe zestawienie danych liczbowych do analizy.&#160;Zrzut ekranu pierwszych 6 wierszy pliku z liczbami odczytów genów dla wszystkich próbek przeznaczonych do normalizacji serii i analizy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564fig03large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61564/61564fig04v3.jpg" /> 
Rycina 4: Mapy ciepła odległości między próbkami.&#160;(A) Wykres odległości między próbkami przedstawiający grupowanie próbek na podstawie surowych danych liczbowych. Próbki grupujące się zarówno według serii, jak i według próbki, zostały oznaczone czerwonymi strzałkami. (B) Wykres odległości między próbkami po normalizacji serii za pomocą ComBat. Tutaj próbki ze wszystkich powtórzeń grupują się razem, niezależnie od serii. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564fig04large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Rysunek 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61564/61564fig05.jpg" /> 
Rysunek 5: Wyniki analizy ekspresji różnicowej.&#160;(A) Wykres analizy głównych składowych (PCA) sygnatur transkrypcyjnych wygenerowanych dla wszystkich próbek wykazuje silne grupowanie wewnątrzpróbkowe i pokazuje, że DAF znajduje się pomiędzy kontrolą dodatnią (wtEF) a ujemną (Δ22). (B) Wykresy wulkaniczne przedstawiające -log(p-value) w funkcji log2FoldChange dla genów w każdym konstrukcie. Geny z dopasowaną wartością p < 0,05 i |log2(FoldChange)| > 1 są uznawane za istotne i zaznaczono je na czerwono. Panel 5B został zaadaptowany z Theisen i wsp.23 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61564/61564fig06.jpg" /> 
Rysunek 6: Grupowanie hierarchiczne w celu zidentyfikowania klas genów.&#160;(A) Grupowanie hierarchiczne 1000 najbardziej zmiennych genów we wszystkich konstruktach oraz w linii bazowej, iEF, pokazuje, że DAF częściowo znosi aktywację genów indukowaną przez EWS/FLI. (B) Wyniki ontologii genów (funkcja molekularna) z ToppGene wykazujące wzbogacenie funkcjonalne genów aktywowanych przez EWS/FLI, które zostały zniesione lub nie zostały zniesione przez DAF. Panel 6B został zaadaptowany z Theisen, et al.23 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61564/61564fig07.jpg" /> 
Rysunek 7: Szczegółowa analiza różnych elementów odpowiedzi czynników transkrypcyjnych na różne konstrukty:&#160;(A) Schemat przedstawiający przetwarzanie danych wykorzystane do wygenerowania paneli (B) i (C) poprzez włączenie innych dostępnych zbiorów danych do profilów transkrypcyjnych przedstawionych w niniejszej pracy. (B,C) Zestawienie wykazujące przywrócenie funkcji różnych klas bezpośrednich celów aktywowanych (B) i represowanych (C) przez EWS/FLI. Uwzględnione zostały tylko te geny, w których stwierdzono różnicową ekspresję wywołaną przez endogenny EWS/FLI. Na każdym wykresie kołowym kolor szary oznacza część genów, których funkcja nie została przywrócona przez konstrukt. Kolor czerwony oznacza część genów różnicowo aktywowanych, a kolor niebieski oznacza część genów różnicowo represowanych. Rysunek został zaadaptowany z pracy Theisen i wsp.23 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Rycina S1: Przesyłanie plików fastq.gz do środowiska HPC, trimowanie i dopasowanie. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564supfig01.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę figurę.</a>
Rycina S2: Zestawianie liczby odczytów z różnych próbek i przeprowadzanie normalizacji partii za pomocą ComBat. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564supfig02.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę rycinę.</a>
Rysunek S3: Uruchamianie programu DESeq2 i wyodrębnianie wyników analizy różnicowej ekspresji. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564supfig03.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.</a>
Rycina S4: Analiza wyników. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564supfig04.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę figurę.</a>
Rysunek S5: Grupowanie hierarchiczne w celu identyfikacji klas genów: Grupowanie hierarchiczne 1000 najbardziej zmiennych genów we wszystkich konstruktach i w linii bazowej, iEF, podzielonych na k klastrów. W tym przypadku k=7, jednak parametr ten jest ustawiany przez użytkownika, co pokazano na Rysunku S4D. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564supfig05.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.</a>
Tabela S1: Lista genów (Ensembl gene ID) z adnotacją klastrów. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61564/Table_S1.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Domeny wewnętrznie nieuporządkowane są ważne dla funkcji czynnika transkrypcyjnego fuzji onkogennej. Aby terapeutycznie ukierunkować te białka, konieczne jest bardziej szczegółowe zrozumienie mechanizmów regulacyjnych stosowanych przez te domeny. Tutaj używamy transkryptomiki do mapowania ważnych cech strukturalnych wewnętrznie nieuporządkowanej domeny EWS w mięsaku Ewinga.

Mapowanie zależności struktura-funkcja zaburzonych onkogennych czynników transkrypcyjnych za pomocą analizy transkryptomicznej

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...

Przeprowadzenie analizy funkcji struktury na powtarzających się i nieuporządkowanych czynnikach transkrypcyjnych jest trudne. Łącząc transkryptomikę z odpowiednim kontekstem komórkowym, podejście to pozwala lepiej odkryć ważne zależności między funkcjami struktury. Wykorzystanie sekwencjonowania RNA jako funkcjonalnego wyniku pozwala na skuteczną ocenę wszystkich genów regulowanych przez pojedyncze białko w jednym eksperymencie, co zwiększa prawdopodobieństwo częściowego wykrycia funkcji.Częściowe wykrywanie funkcji jest szczególnie ważne w przypadku onkogennych czynników transkrypcyjnych fuzji, ponieważ nie wiemy, jak działają te białka, a ich sekwencjonowanie może prowadzić do lepszych terapii w nowotworach wywołanych fuzją. Chociaż skupimy się na nieuporządkowanej domenie EWS w EWS/FLI EWS bierze udział w innych fuzjach, które zawierają domeny nieuporządkowane ze słabo zdefiniowanymi funkcjami. Aby uzyskać transdukcję konstruktu ekspresji cDNA, najpierw szybko rozmrozić zamrożonego wirusa za pomocą konstruktów cDNA w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i delikatnie wymieszać 2,5 mikrolitra po osiem miligramów na mililitr polibrenu z każdym podłością.Następnie usuń pożywkę z jednej 50 do 70% zlewającej się 10-centymetrowej płytki do hodowli komórek na konstrukt fiolki i delikatnie omiń całą dwumililitrową objętość konstruktu z boku płytki. Kołysz płytką, aby równomiernie rozprowadzić wirusa po komórkach i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych o temperaturze 37 stopni Celsjusza na dwie godziny, kołysząc płytką co 30 minut, aby zapobiec wysychaniu jakichkolwiek obszarów płytki. Pod koniec inkubacji dodać pięć mililitrów pożywki uzupełnionej płodową surowicą bydlęcą, antybiotykami, pirogronianem sodu i polibrenem.Po całonocnej inkubacji w inkubatorze do hodowli komórkowych zastąp supernatant pożywką selekcyjną i zwróć komórki do inkubatora hodowli komórkowych na dodatkowe siedem do 10 dni, aby umożliwić selekcję i ekspresję konstruktu cDNA. Pod koniec okresu selekcji zbierz komórki do 15-mililitrowej stożkowej probówki do liczenia i przydziel pięć do 10 razy 10 do piątej komórki do nowej probówki do sekwencjonowania RNA i dwa razy 10 do sześciu komórek do innej nowej probówki w celu ekstrakcji białka. Osadź komórki przez odwirowanie i ponownie zawieś granulki w jednym mililitrze zimnego PBS lub pięciominutowym wirowaniu.Następnie błyskawicznie zamroź zarówno granulki, jak i ciekły azot i przechowuj komórki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby zwalidować knockdown białek będących przedmiotem zainteresowania i ekspresję panelu konstruktów, należy osuszyć próbki lizatu białkowego odpowiednimi przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi zgodnie ze standardowymi protokołami analizy Western blot. Aby ocenić jakość i ilość RNA, użyj buforu do lizy z zestawu do ekstrakcji opartego na kolumnie wirowej krzemionki, aby poddać lizie próbki komórek sekwencjonowania RNA i nanieść lizaty na kolumnę do usuwania genomowego DNA z prędkością większą niż 13 000 obrotów na minutę przez 30 do 60 sekund.Następnie przystąp do oczyszczania kolumny wirowej krzemionki i umyj RNA na kolumnie zgodnie z instrukcją zestawu. Następnie eluuj RNA w 30 mikrolitrach buforu elucyjnego i przeanalizuj co najmniej 2,5 mikrograma RNA na spektrofotometrze w stosunku 260 do 280 nanometrów, aby ocenić ilość RNA i jakość próbki. Do analizy plików fastq użyj Putty, aby otworzyć terminal do środowiska obliczeniowego o wysokiej wydajności i utworzyć katalog analizy o nazwie project.Przejdź do ścieżki do katalogu projektu i utwórz katalog dla skompresowanych plików fastq. gz nieprzetworzonych o nazwie fastq i drugiego katalogu o nazwie trimmed. Nas odpowiedni bezpieczny program do przesyłania plików do przesyłania skompresowanego surowego fastq.gz z pamięci lokalnej do ścieżki do katalogu Project FastQ i sprawdź, czy dla każdej próbki istnieje plik R1 i R2. Przejdź do ścieżki do projektu fastq i użyj polecenia w trim galore, jak wskazano, aby przyciąć odczyty o niskiej jakości z fastq. gz plików.Przejdź do ścieżki do katalogu projektu i utwórz nowy katalog o nazwie STAR output. Przejdź do ścieżki do katalogu trim projektu i użyj polecenia, jak wskazano, aby uruchomić STAR w celu wyrównania przyciętego fastq. gz plików.Zlokalizuj wymagane dane wyjściowe dla następnych kroków, które zawierają liczby na transkrypt we wskazanej lokalizacji i użyj polecenia, aby wczytać każdy plik karty odczytów na gen. W pierwszej kolumnie należy używać tylko znaków przed kropką w kolumnie identyfikatora genu ENSEMBL, aby ułatwić dalsze przetwarzanie. Następnie użyj polecenia, aby skompilować liczby wszystkich próbek w ramce danych o nazwie totcts i zapisać tę nową tabelę nieprzetworzonych danych zliczania jako plik tekstowy rozdzielany tabulatorami.Aby zdefiniować profil wyrażenia różnicowego dla każdej konstrukcji przy użyciu algorytmu DESeq2, należy wprowadzić eksperymentalny projekt DESeq2 i użyć zestawu danych DESeq z funkcji macierzowej w celu skonstruowania zestawu danych DESeq w celu oszacowania współczynników rozmiaru i uruchomienia funkcji DESeq2. Aby ocenić jakość analizy, należy użyć protokołu DESeq2 w celu wyodrębnienia regularnej liczby normalizacji logarytmu. Podczas wyodrębniania wyników dla każdego profilu transkrypcyjnego z wyników DESeq2 należy wykonać porównania parami w odniesieniu do stanu knockdown lub pustego wektora linii bazowej.Dalej zmień te wyniki za pomocą symboli genów HGNC i wyodrębnij dane z danych DESeq2 jako pojedynczy plik z identyfikatorem genu ENSEMBL, symbolem HGNC, wyrażeniem baseMean i danymi wyrażenia różnicowego dla wszystkich konstruktów z logarytmiczną podwójną zmianą oraz surowymi i skorygowanymi wartościami P. Oceń pomyślną normalizację partii i podobieństwo próbki zainteresowania, a następnie użyj kodu, aby użyć regularnych, znormalizowanych liczb logarytmicznych, aby sprawdzić grupowanie próbek z analizą głównych składników i wykresami odległości między próbkami. Użyj uregularyzowanych zliczeń logarytmicznych, aby wyodrębnić 1 000 najbardziej zmiennych genów do macierzy i użyj mapy cieplnej, aby przeprowadzić nienadzorowane hierarchiczne grupowanie próbek na podstawie tych genów.Aby wyodrębnić klastry zainteresowań z dendrogramu, zdecyduj, na jakim poziomie pojawiają się klastry zainteresowań dendrogramu i ustaw K jako równe liczbie klastrów na tym poziomie. Aby określić, które klastry są interesujące, ponownie narysuj mapę cieplną uporządkowaną według klastrów i wyeksportuj listę genów powiązanych z każdym klastrem w tabeli, a następnie użyj odpowiedniego narzędzia bioinformatycznego w celu zidentyfikowania ról biologicznych dla różnych klastrów genów zidentyfikowanych i porównanych między klasami. W tej reprezentatywnej analizie można zaobserwować skuteczne powalenie i ratunek z pozytywnymi i negatywnymi konstruktami.Należy zauważyć, że komórki uratowane przez DAF nie zdołały utworzyć kolonii, co sugeruje upośledzoną transformację onkogenną. Po zakończeniu walidacji replikantów można uzyskać testy fenotypowe i dane przetwarzania danych wstępnego sekwencjonowania RNA dotyczące liczby genów dla wszystkich próbek w celu normalizacji i analizy partii. DESeq2 bez normalizacji partii może powodować mylące wady partii, prawdopodobnie z powodu zmienności biologicznej wprowadzonej przez przejście komórek w hodowli i różnic w przetwarzaniu każdej partii.Po normalizacji partii DESeq2 może służyć do generowania profili transkrypcyjnych dla konstrukcji będących przedmiotem zainteresowania w stosunku do linii bazowej. Analiza głównych składowych tych danych sugeruje, że profil transkrypcyjny DAF jest pośredni, między EWS/FLI typu dzikiego a Delta 22, co potwierdza częściową funkcję. Co więcej, hierarchiczne grupowanie 1000 najbardziej zmiennych genów w próbkach pokazuje, że DAF nie jest w stanie stłumić docelowych genów EWS / FLI i tylko częściowo zachowuje aktywność aktywacji genów.Analiza genów sugeruje, że klasy genów aktywowanych przez DAF są funkcjonalnie różne od tych celów aktywowanych przez EWS/FLI, w których DAF nie jest funkcjonalny. Co ciekawe, DAF jest najbardziej zdolny do ratowania genów aktywowanych przez mikrosatelity GGAA, ale nie jest w stanie uratować aktywowanych genów w pobliżu miejsca o wysokim powinowactwie. Sprzężenie danych transkryptomicznych z odpowiednimi testami fenotypowymi kończy analizę funkcji struktury.Naukowcy mogą również wykorzystać inne techniki do badania mechanistycznych czynników wpływających na różne funkcje transkrypcyjne.

mapping-structure-function-relationships-disordered-oncogenic

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Tutaj proponujemy strategię badania wpływu interesującego czynnika transkrypcyjnego na transkryptom mikroRNA, korzystając z publicznie dostępnych danych, zasobów obliczeniowych i danych o wysokiej przepustowości z macierzy mikroRNA po transfekcji komórek z małą spinką do włosów (sh)RNA ukierunkowaną na interesujący czynnik transkrypcyjny.

Opisywanie zależnej od czynnika transkrypcyjnego regulacji transkryptomu mikroRNA

Tutaj opisujemy zoptymalizowany protokół sekwencjonowania ChIP o wysokiej przepustowości oraz potok analiz obliczeniowych do określania wzorców stanu chromatyny w całym genomie z zamrożonych tkanek nowotworowych i linii komórkowych.

Zintegrowana platforma do mapowania stanów chromatyny w całym genomie przy użyciu wysokoprzepustowego sekwencjonowania ChIP w tkankach nowotworowych

Pętla chromatyny odgrywa znaczącą rolę w regulacji genów; jednak nie ma postępu technologicznego, który pozwalałby na selektywną i odwracalną modyfikację pętli chromatyny. W tym miejscu opisujemy potężny system reorganizacji pętli chromatyny za pomocą CRISPR-dCas9 (CLOuD9), który wykazano, że selektywnie i odwracalnie moduluje ekspresję genów w docelowych loci.

Reorganizacja struktury pętli chromatyny za pośrednictwem CRISPR

Tutaj prezentujemy ulepszony protokół badań przesiewowych drożdży z jedną hybrydą, aby zidentyfikować czynniki transkrypcyjne (TF), które mogą wiązać się z interesującym nas regionem ludzkiego DNA. Ta metoda wykorzystuje potok przesiewowy o wysokiej przepływności, który może badać wiązanie &gt;1 000 TF w jednym eksperymencie.

Ulepszone badania przesiewowe hybryd drożdży w celu identyfikacji powiązania czynnika transkrypcyjnego z sekwencjami ludzkiego DNA

Przedstawiamy portal internetowy CorExplorer, zasób do eksploracji czynników sekwencjonowania RNA nowotworów znalezionych przez algorytm uczenia maszynowego CorEx (Correlation Explanation) i pokazujemy, jak można analizować czynniki związane z przeżyciem, adnotacjami w bazie danych, interakcjami białko-białko i sobą nawzajem, aby uzyskać wgląd w biologię nowotworu i interwencje terapeutyczne.

Analiza czynników ekspresji genów nowotworowych za pomocą portalu internetowego CorExplorer

Aby zidentyfikować nowe regulatory czynników transkrypcyjnych, opracowaliśmy podejście do badania przesiewowego bibliotek RNAi lentiwirusowych lub retrowirusowych za pomocą testu reporterowego opartego na podwójnej lucyferazie. Takie podejście oferuje szybki i stosunkowo niedrogi sposób na przebadanie przesiewowe setek kandydatów w jednym eksperymencie.

Identyfikacja regulatorów czynników transkrypcyjnych za pomocą średnioprzepustowego badania przesiewowego bibliotek tablicowych i reportera opartego na podwójnej lucyferazie

Tutaj prezentujemy protokół przeprowadzania nokautów genów, które są embrionalne śmiertelne in vivo w genetycznie modyfikowanych mysich modelach nowotworów, a następnie oceniamy wpływ nokautu na wzrost, proliferację, przeżycie, migrację, inwazję i transkryptom in vitro i in vivo.

Definiowanie funkcji genów w nowotworzeniu poprzez ablację ex vivo floksowanych alleli w złośliwych komórkach nowotworowych osłonki nerwów obwodowych

Tutaj wprowadzamy protokół do przekształcania danych transkryptomicznych w widok mqTrans, umożliwiając identyfikację ciemnych biomarkerów. Chociaż biomarkery te nie są wyrażane różnicowo w konwencjonalnych analizach transkryptomicznych, wykazują różnicową ekspresję w ujęciu mqTrans. Podejście to służy jako technika uzupełniająca tradycyjne metody, odsłaniając wcześniej pomijane biomarkery.

Generowanie widoku regulacji transkrypcji cech transkryptomicznych na potrzeby zadania predykcyjnego i wykrywania ciemnych biomarkerów na małych zestawach danych

Ukierunkowana edycja genów za pomocą CRISPR/Cas9 znacznie ułatwiła zrozumienie biologicznych funkcji genów. W tym przypadku wykorzystujemy metodologię CRISPR/Cas9 do modelowania mutacji kalretykuliny w komórkach krwiotwórczych zależnych od cytokin w celu zbadania ich aktywności onkogennej.

Wykorzystanie edycji genów CRISPR/Cas9 do zbadania onkogennej aktywności zmutowanej kalretykuliny w komórkach krwiotwórczych zależnych od cytokin

Uzyskanie wysokiej jakości genomowego DNA z tkanek nowotworowych jest niezbędnym pierwszym krokiem do analizy zmian genetycznych za pomocą sekwencjonowania nowej generacji. W tym artykule przedstawiamy prostą i szybką metodę wzbogacania komórek nowotworowych i uzyskiwania nienaruszonego DNA z próbek cytologicznych odcisku dotykowego.

Prosta i szybka metoda uzyskiwania wysokiej jakości DNA guza z próbek kliniczno-patologicznych za pomocą cytologii odcisku dotykowego

Poznaj analizę transkryptomiczną do mapowania zależności struktura-funkcja onkogennych czynników transkrypcyjnych z domenami nieuporządkowanymi w Ewing sarcoma. Metoda umożliwia wykrywanie częściowych funkcji białek.

Mapowanie zależności struktura-funkcja zaburzonych onkogennych czynników transkrypcyjnych za pomocą analizy transkryptomicznej

Przeglądaj więcej filmów