Elektroporacja jednokomórkowa w różnych organotypowych kulturach warstwowych mysich neuronów pobudzających hipokampa i specyficznych dla klasy neuronów hamujących
6 października 2020
Prezentowany tutaj jest protokół elektroporacji pojedynczej komórki, który może dostarczyć geny zarówno w neuronach pobudzających, jak i hamujących w różnych epokach hodowli in vitro w warstwach hipokampa. Nasze podejście zapewnia precyzyjną i wydajną ekspresję genów w poszczególnych komórkach, które można wykorzystać do badania funkcji autonomicznych i międzykomórkowych.
Transfekcja genów jest kluczowym podejściem do badań neurobiologicznych. Nasza technika elektroporacji umożliwia nam transfekcję interneuronów genów będących przedmiotem zainteresowania w organotypowej kulturze warstwowej hipokampa bez wykrywalnych skutków ubocznych. Protokół ten ma znacznie wyższą wydajność transfekcji w porównaniu z innymi protokołami jednokomórkowymi, ale nadal jest stosunkowo niedrogi i prosty do wykonania.
Technika ta będzie przydatna dla naukowców zainteresowanych zrozumieniem specyficznych funkcji molekularnych i fizjologicznych neuronów, w tym mechanizmów autonomicznych komórek i transsynaptycznych interakcji białkowych. Aby przygotować kultury warstwowe do elektroporacji, przenieś interesujące nas wkładki hodowlane na indywidualne trzycentymetrowe szalki Petriego załadowane 900 mikrolitrami pożywki hodowlanej i umieść kultury w stołowym inkubatorze dwutlenku węgla. Następnie wstępnie inkubuj świeże wkładki hodowlane z jednym mililitrem pożywki hodowlanej w plasterkach na wkładkę na 3,5-centymetrowej szalce Petriego przez co najmniej 30 minut i sterylizuj linie urządzenia do elektroporacji 10% wybielaczem przez pięć minut.
Pod koniec perfuzji przepłucz linie zjonizowaną wodą autoklawowaną przez co najmniej 30 minut przed perfuzją za pomocą wysterylizowanego filtrem ACSF zawierającego 0,001 milimolowej tetrodotoksyny. Ustaw impuls elektroporatora na amplitudę minus pięć woltów, impuls prostokątny, ciąg 500 milisekund, częstotliwość 50 herców i szerokość impulsu 500 mikrosekund. Napełnij szklaną pipetę pięcioma mikrolitrami roztworu wewnętrznego zawierającego plazmid, a następnie delikatnie strzepnij i postukaj w końcówkę kilka razy, aby usunąć wszelkie uwięzione pęcherzyki.
Użyj mikroskopu preparacyjnego, aby upewnić się, że końcówka nie jest uszkodzona, i bezpiecznie przymocuj końcówkę pipety do elektrody. Gdy końcówka zetknie się z ACSF, zapisz odczyt rezystancji pipety z elektroporatora. Aby wyizolować kulturę plastrową, odetnij membranę wkładki hodowlanej ostrym ostrzem i użyj ostrych kleszczyków, aby ostrożnie przenieść kulturę plastrów do komory elektroporacji.
Następnie ustal pozycję kultury za pomocą kotwicy do plastrów. W celu elektroporacji interesujących komórek należy zastosować nadciśnienie do pipety doustnie i za pomocą trójwymiarowych pokręteł sterujących manewrować końcówką pipety w pobliżu powierzchni kultury plastrów. Oglądając kulturę pod mikroskopem, zbliż się do komórki docelowej końcówką, utrzymując nadciśnienie przyłożone, aż na powierzchni komórki utworzy się wgłębienie.
Po wizualizacji wgłębienia szybko zastosuj doustnie łagodne podciśnienie, aby między końcówką pipety a błoną plazmatyczną utworzyło się luźne uszczelnienie. Membrana nieznacznie wejdzie do pipety. Należy zaobserwować około 2,5-krotny wzrost początkowej rezystancji pipety, na co wskazuje wzrost tonu z głośników.
Szybko ponownie zastosuj dodatnie ciśnienie, aby wgłębienie się zreformowało. Następnie natychmiast wykonaj co najmniej dwa kolejne cykle ciśnieniowe, jak właśnie pokazano, bez zatrzymywania się. Po ostatnim impulsie ciśnienia utrzymaj podciśnienie przez jedną sekundę.
Gdy ton z głośników osiągnie stabilny szczyt wysokości, użyj pedału nożnego, aby szybko uruchomić elektroporator. Po elektroporacji delikatnie cofnij pipetę na około 100 mikronów od celi bez wywierania nacisku i ponownie zastosuj nadciśnienie, sprawdzając, czy rezystancja jest podobna do odczytu linii bazowej przed zbliżeniem się do następnej celi. Gdy wszystkie interesujące komórki zostaną poddane elektroporacji, przenieś kulturę plastrową do jednej z przygotowanych świeżych wkładek hodowlanych i umieść wkładkę w temperaturze 35 stopni Celsjusza na okres do trzech dni.
W tym reprezentatywnym eksperymencie EGFP transfekowano do pięciu do 20 neuronów piramidowych w obszarze CA1 hipokampa przez siedem, 14 i 21 dni w wieku hodowli warstwowej in vitro. Parwalbumina i pęcherzykowe interneurony glutaminianu typu 3 mogą być również z powodzeniem elektroporowane w obszarze CA1 hipokampa. Co ciekawe, na transfekcję nie ma istotnego wpływu dzienny wiek hodowli plastrów in vitro i nie różni się ona od skuteczności transfekcji obserwowanej w neuronach piramidowych CA1.
Neurony są bardzo delikatne. Należy zachować szczególną ostrożność i delikatność podczas zbliżania się do komórek i zmieniania nacisku na ogniwa oraz cofania końcówki pipety, aby spowodować poważne uszkodzenia. Po elektroporacji ogniwa można poddać różnym analizom eksperymentalnym, w tym elektrofizjologii i obrazowaniu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół elektroporacji pojedynczych komórek, który umożliwia dostarczanie genów zarówno do neuronów pobudzających, jak i hamujących w organotypowych kulturach skrawków hipokampa. Technika ta pozwala na precyzyjną kontrolę ekspresji genów, co ułatwia badanie zarówno mechanizmów autonomicznych komórkowo, jak i interakcji międzykomórkowych na różnych etapach rozwoju.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Transfekcja genów
- Elektrofizjologia
Wstęp
- Transfekcja genów jest kluczowa dla badań neurobiologicznych.
- Elektroporacja zapewnia wysoką wydajność transfekcji przy minimalnych efektach ubocznych.
- Metoda ta jest stosunkowo prosta i niedroga w porównaniu z innymi technikami.
- Zrozumienie funkcji molekularnych i fizjologicznych w neuronach jest niezbędne dla neurobiologii.
Cel badania
- Opracowanie skutecznej metody transfekcji genów w populacjach neuronalnych.
- Badanie specyficznych funkcji i mechanizmów molekularnych w neuronach pobudzających oraz hamujących.
- Ocena wydajności transfekcji w zależności od wieku kultur plastrów.
Zastosowane metody
- Elektroporację przeprowadzono na organotypowych kulturach przekrojów hipokampa.
- Kluczowymi modelami biologicznymi były neurony piramidalne i interneurony.
- Transfekcję oceniano w przekrojach w różnym wieku (7, 14 i 21 dni in vitro).
- Szczegółowe etapy obejmują przygotowanie, techniki pipetowania oraz monitorowanie zmian oporności.
- Uszkodzenia komórek podczas procesu ograniczono do minimum dzięki ostrożnej manipulacji.
Główne wyniki
- Osiągnięto wysoką wydajność transfekcji genów w neuronach docelowych, bez istotnych różnic w zależności od wieku kultur plastrów.
- Elektroporacja nie wpłynęła negatywnie na żywotność komórek, utrzymując ich integralność po transfekcji.
- Metoda ta umożliwiła szczegółowe badania nad odpowiedziami fizjologicznymi i potencjalnymi mechanizmami interakcji między neuronami.
- Wykazano również skuteczną transfekcję interneuronów typu pars oraz interneuronów glutaminianowych pęcherzykowych typu 3.
Wnioski
- Niniejsze badanie przedstawia solidny protokół transfekcji genów w kulturach neuronalnych, zwiększając możliwości badawcze w dziedzinie neurobiologii.
- Opisana metoda stanowi podstawę do dalszych badań nad mechanizmami neuronalnymi i funkcjami międzykomórkowymi.
- Zrozumienie tych procesów jest kluczowe dla uzyskania wiedzy na temat plastyczności neuronalnej oraz potencjalnych zastosowań terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Elektroporacja pojedynczych komórek w organotypowych kulturach skrawków hipokampa umożliwia precyzyjne dostarczanie genów do neuronów pobudzających i hamujących, wspierając walidację celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w badaniach nad odkryciami z zakresu neuronauk. Metoda ta zapewnia wysoką wydajność transfekcji (~80%) na różnych etapach rozwoju, co pozwala na spójne przesiewanie fenotypowe i opracowywanie testów do badania szlaków sygnałowych. Podejście to zmniejsza niepewność biologiczną podczas wczesnego testowania hipotez dotyczących celów terapeutycznych, umożliwiając powtarzalne, ilościowe badania ekspresji genów w systemach neuronalnych istotnych dla danej jednostki chorobowej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych w pobudzających oraz specyficznych dla danej klasy neuronach hamujących hipokampa.
- Wartość naukowa: Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez powiązanie ekspresji genów z odczytami fizjologicznymi w nienaruszonych mikroustrojach.
- Wartość operacyjna: Zapewnia wysoką wydajność transfekcji bez wykrywalnych efektów ubocznych, co redukuje zmienność eksperymentalną.
- Wartość operacyjna: Działa w różnych przedziałach wieku kultur skrawków (7–21 dni in vitro), co pozwala na badania przebiegu czasowego oddziaływania na cel.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy neuronalne do dalszych analiz elektrofizjologicznych i obrazowania.
- Wartość naukowa: Dostarcza ilościowych danych o funkcji genów i interakcjach białek z rozdzielczością pojedynczej komórki.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje standardowy sprzęt do elektrofizjologii, co umożliwia skalowalną integrację z istniejącymi schematami pracy.
- Wartość operacyjna: Utrzymuje wydajność transfekcji przez przedłużone okresy hodowli, wspierając podłużne kampanie przesiewowe.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Dostarcza istotnych z punktu widzenia choroby obwodów hipokampa do badania mechanizmów docelowych w kontekstach patofizjologicznych.
- Wartość naukowa: Umożliwia ocenę transsynaptycznych oddziaływań białek oraz mechanizmów autonomicznych komórkowych.
- Wartość operacyjna: Ułatwia przejście od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej poprzez zachowanie żywotności neuronów po transfekcji.
- Wartość operacyjna: Wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka dzięki niezawodnemu i powtarzalnemu dostarczaniu genów do pierwotnych kultur neuronów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkrywania leków, od testowania hipotez dotyczących celu po identyfikację związku wiodącego, umożliwiając redukcję ryzyka mechanistycznego przed przesiewaniem związków.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych w populacjach neuronów hipokampa.
- Przesiewy: Dostarcza systemy gotowe do analiz, z powtarzalną transfekcją i ilościowymi wynikami do oceny związków.
- Analityka: Umożliwia monitorowanie oparte na odporności oraz odczyty elektrofizjologiczne w celu skorelowania ekspresji genów z fenotypami funkcjonalnymi.
- Badania translacyjne: Łączy badania nad funkcją genów z ciągłością przedkliniczną poprzez stabilną transfekcję w skrawkach organotypowych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Wykorzystuje istniejącą infrastrukturę elektrofizjologiczną, pozycjonując metodę jako platformę wielokrotnego użytku do walidacji celów neuronalnych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Pewność predykcyjna w walidacji celu dzięki wysokowydajnemu i niskotoksycznemu dostarczaniu genów do neuronów pierwotnych.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja i powtarzalność dzięki spójnym parametrom impulsów oraz protokołowi cykli ciśnieniowych.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go poprzez ograniczenie niejednoznaczności mechanistycznej w angażowaniu celu neuronalnego.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko dzięki niezawodnej ocenie funkcji genów w różnych klasach neuronów i stadiach rozwojowych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie elektrofizjologii i manipulowania mikropipetami w celu precyzyjnego celowania w pojedyncze komórki.
- Zależne od zastosowania elektrod szklanych, elektroporatora oraz sterylnego roztworu ACSF z tetrodotoksyną w celu utrzymania żywotności neuronów.
- Wymaga standaryzacji sekwencji impulsów ciśnieniowych oraz monitorowania rezystancji przez wszystkich użytkowników.
- Kwestie adaptacyjne obejmują dostosowanie stężenia plazmidu i szerokości impulsu dla różnych typów neuronów lub rozmiarów genów.
- Ograniczenie praktyczne: Kruchość neuronów wymaga niezwykle precyzyjnej techniki, aby uniknąć przerwania błony podczas cykli ciśnieniowych.
