Name: Elektroporacja jednokomórkowa w różnych organotypowych kulturach warstwowych mysich neuronów pobudzających hipokampa i specyficznych dla klasy neuronów hamujących (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: Poznaj elektroporację jednokomórkową w organotypowych kulturach hipokampa myszy do badania neuronów pobudzających i hamujących. Ta metoda umożliwia precyzyjną transfekcję genów z wysoką wydajnością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health Grants (R01NS085215 dla K.F., T32 GM107000 i F30MH122146 dla A.C.). Autorzy dziękują Pani Naoe Watanabe za umiejętną pomoc techniczną.

Wszystkie protokoły dla zwierząt zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Szkole Medycznej Uniwersytetu Massachusetts. Przygotowanie kultur warstwowych, przygotowanie plazmidu i elektroporacja są również szczegółowo opisane w naszych wcześniej opublikowanych metodach i można się do nich odwołać w celu uzyskania dodatkowych informacji10.
1. Przygotowanie kultur plasterków
<ol>
	<li>Przygotuj organotypowe kultury plastrów hipokampa myszy, jak opisano wcześniej11, używając pourodzeniowych myszy w wieku od 6 do 7 dni obu płci.
	<ol>
		<li>Przygotować pożywki preparacyjne do organotypowej hodowli plastrów składających się z (w mM): 238 sacharozy, 2,5 KCl, 1 CaCl2, 4 MgCl2, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4 i 11 glukozy w wodzie dejonizowanej, a następnie gaz z 5% CO2/95% O2 do pH 7,4.</li>
		<li>Przygotować organotypową pożywkę hodowlaną w warstwach składającą się z: 78,8% (v/v) minimum niezbędnego podłoża Eagle, 20% (v/v) surowicy końskiej, 17,9 mM NaHCO3, 26,6 mM glukozy, 2 M CaCl2, 2 MMgSO4, 30 mM HEPES, insuliny (1 μg/ml) i 0,06 mM kwasu askorbinowego o pH dostosowanym do 7,3. Dostosuj osmolarność do 310-330 osmol za pomocą osmometru.</li>
		<li>Wypreparuj hipokampy z całego mózgu za pomocą dwóch szpatułek i pokrój (400 μm) za pomocą rozdrabniacza tkanek. Oddzielić plastry za pomocą dwóch kleszczyków i przenieść do 30-milimetrowych wkładek do hodowli komórkowych na 6-dołkowej płytce wypełnionej pożywką hodowlaną (950 μl) pod wkładkami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Organtypowe kultury bakterii w warstwach należy przechowywać w inkubatorze do hodowli tkankowych (35°C, 5% CO2 ) i zmieniać pożywki do hodowli plastrów co dwa dni.</li>
</ol>
2. Przygotowanie plazmidu
<ol>
	<li>Przygotuj plazmid dla interesującego Cię genu.
	<ol>
		<li>Subklonuj gen białka zielonej fluorescencji (EGFP) do wektora pCAG.</li>
		<li>Oczyść plazmid pCAG-EGFP za pomocą zestawu do oczyszczania bez endotoksyn i rozpuść w roztworze wewnętrznym, który składa się z wody uzdatnionej pirowęglanem dietylu zawierającej 140 mM K-metanosulfonianu, 0,2 mM EGTA, 2 mM MgCl2 i 10 mM HEPES, dostosowanego do pH 7,3 za pomocą KOH (stężenie plazmidu: 0,1 μg / μL).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie pipet szklanych
<ol>
	<li>Pociągnij pipety ze szkła borokrzemianowego (4,5 – 8 MΩ) na ściągaczu do mikropipet (<klasa silna="xfig">Rysunek 1A). 
	UWAGA: Szklane pipety używane do nagrań z użyciem zacisków krosowych dla całych komórek są idealne do elektroporacji.</li>
	<li>Piecz szklane pipety przez noc w temperaturze 200°C w celu sterylizacji.</li>
	<li>Sprawdź rozmiar końcówki pipety pod mikroskopem preparacyjnym, aby w przybliżeniu określić opór elektryczny.
	<ol>
		<li>Opcjonalnie: Sprawdź rezystancję pipety, podłączając pipetę do elektrody elektroporacyjnej i za pomocą mikromanipulatora wmanewruj końcówkę pipety w sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy sterylizowany filtrem (aCSF) zawierający (w mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl2, 5 MgCl2, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4 i 11 glukozy w wodzie dejonizowanej, gazowanej 5% CO2 / 95% O2 do pH 7,4. Potwierdź rzeczywistą rezystancję za pomocą odczytu na elektroporatorze. 
		UWAGA: Im ostrzejsza końcówka pipety, tym większy opór elektryczny. Rezystancja pipety powinna być mniejsza niż 10 MΩ. Szklane pipety o wysokiej rezystancji pipet (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1B) często zapychają końcówkę podczas wielokrotnej elektroporacji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Konfiguracja urządzenia do elektroporacji
<ol>
	<li>Zainstaluj elektroporator na standardowym stanowisku do elektrofizjologii całych komórek, wyposażonym w pionowy mikroskop zamontowany na ruchomym stole z mikromanipulatorem i pompą perystaltyczną.</li>
	<li>Zamontuj stopień główny elektroporatora na mikromanipulatorze i podłącz parę głośników do elektroporatora. Podłącz elektroporator do pedału nożnego, który może być użyty do wysłania impulsu, gdy będzie gotowy. 
	UWAGA: Po włączeniu głośniki emitują dźwięk, który jest wskaźnikiem oporu elektrycznego na elektrodzie. Umożliwia to określenie względnych zmian oporności bez odwracania uwagi od zabiegu.</li>
</ol>
5. Przygotowanie do elektroporacji
<ol>
	<li>Przenieś wkładki do kultur plastrowych z płytek 6-dołkowych na 3-centymetrowe szalki Petriego załadowane 900 μl pożywki hodowlanej i przechowuj w stołowym inkubatorze CO2 do momentu przygotowania do przeprowadzenia elektroporacji.
	<ol>
		<li>Wstępnie inkubować świeże wkładki hodowlane z pożywką hodowlaną w plastrach (1 ml) przez co najmniej 30 minut na 3,5 cm szalce Petriego w celu wyhodowania plastrów po elektroporacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyść i przygotuj zestaw do elektroporacji.
	<ol>
		<li>Wypełnij linie 10% wybielaczem przez 5 minut, aby wysterylizować rurkę i komorę przed rozpoczęciem eksperymentu na cały dzień.</li>
		<li>Przetapiaj linie dejonizowaną wodą autoklawowaną przez co najmniej 30 minut, aby całkowicie spłukać.</li>
		<li>Wykonaj fuzję linii za pomocą sterylizowanego filtrem aCSF zawierającego 0,001 mM tetrodotoksyny (TTX). 
		UWAGA: TTX minimalizuje toksyczność komórkową i śmierć z powodu nadmiernego pobudzenia interneuronów10.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw parametry impulsu elektroporatora: amplituda –5 V, impuls prostokątny, ciąg 500 ms, częstotliwość 50 Hz i szerokość impulsu 500 μs.</li>
	<li>Napełnij szklaną pipetę 5 μl roztworu wewnętrznego zawierającego plazmid.
	<ol>
		<li>Usuń wszelkie uwięzione pęcherzyki powietrza z końcówki pipety, kilkakrotnie przesuwając i delikatnie stukając w końcówkę.</li>
		<li>Sprawdzić, czy końcówka nie jest uszkodzona, wizualizując ją pod mikroskopem preparacyjnym lub powtarzając krok 3.3.1 w celu sprawdzenia oporu pipety. 
		UWAGA: Jeśli końcówka jest uszkodzona, szklaną pipetę należy wyrzucić i powtórzyć ten krok z nową szklaną pipetą przygotowaną wcześniej w kroku 3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mocno przymocuj końcówkę pipety do elektrody i włącz głośniki. Zapisz odczyt (rezystancję pipety) elektroporatora, gdy końcówka zetknęła się z medium aCSF.</li>
	<li>Przeciąć membranę wkładki hodowlanej za pomocą ostrego ostrza i wyizolować jedną kulturę plasterkową. Ostrożnie przenieś kulturę plastrów do komory elektroporacyjnej za pomocą ostrych kleszczy kątowych i utrwal jej położenie za pomocą kotwicy do plastrów.
	<ol>
		<li>Nie należy trzymać kultury plastrów poza inkubatorem dłużej niż 30 minut, aby zapobiec skutkom ubocznym, takim jak zmiany w zdrowiu neuronów lub funkcji12.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Interesujące ogniwa elektroporacyjne
<ol>
	<li>Zastosować nadciśnienie w pipecie ustami lub za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml (ciśnienie 0,2 - 0,5 ml) podłączonej do rurki.</li>
	<li>Użyj trójwymiarowego pokrętła mikromanipulatora, aby manewrować końcówką pipety w pobliżu powierzchni kultury plastrów.</li>
	<li>Wybierz komórkę docelową i zbliż się do niej, utrzymując nadciśnienie, aż na powierzchni komórki utworzy się wgłębienie, widoczne pod mikroskopem.</li>
	<li>Wykonuj cykle ciśnieniowe.
	<ol>
		<li>Szybko zastosuj łagodne podciśnienie doustnie, tak aby między końcówką pipety a błoną plazmatyczną utworzyło się luźne uszczelnienie, na co wskazuje wizualnie membrana sięgająca nieco do końcówki pipety. Obserwuj wzrost (~2,5x początkowy opór) oporu pipety, nasłuchując wzrostu tonu dochodzącego z głośników. Szybko ponownie zastosuj nadciśnienie, aby wgłębienie ponownie się uformowało.</li>
		<li>Natychmiast wykonaj co najmniej dwa kolejne cykle ciśnieniowe bez przerwy, a następnie utrzymuj podciśnienie przez 1 s. 
		UWAGA: Przerwy między cyklami, wywieranie zbyt dużego nacisku lub zbyt długie utrzymywanie podciśnienia może spowodować znaczne uszkodzenie ogniwa i spowodować śmierć ogniwa podczas elektroporacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Szybko pulsuj elektroporatorem raz za pomocą pedału nożnego, gdy ton z głośników osiągnie stabilny wierzchołek wysokości, wskazując szczytową rezystancję elektryczną. Nie czekaj na szczytową rezystancję dłużej niż 1 s przed wysłaniem impulsu. 
	UWAGA: Nie zaobserwowaliśmy żadnej elektroporacji poza celem podczas korzystania z tego protokołu10. Transfekcji poddano tylko te komórki, które miały kontakt ze szklaną pipetą podczas cykli ciśnieniowych. Umieszczenie pipety w pobliżu innych neuronów nie powoduje transfekcji genu.</li>
	<li>Delikatnie wycofaj pipetę na około 100 μm z kuwety bez wywierania nacisku.</li>
	<li>Ponownie zastosuj nadciśnienie, sprawdzając, czy rezystancja jest podobna do odczytu zarejestrowanego w kroku 5.5, a następnie zbliż się do następnej komórki.
	<ol>
		<li>Usunąć potencjalne zatkania, sygnalizowane wizualnie lub przez znacznie zwiększoną (o >15% wyższą) rezystancję pipety po elektroporacji, stosując nadciśnienie. 
		UWAGA: Jeśli nie ma widocznego zatkania, a opór jest nadal znacznie wyższy, wyrzuć pipetę i użyj nowej. Średnio pipeta może być używana do maksymalnie 20 zdarzeń elektroporacji, jeśli użytkownik jest ostrożny10.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po elektroporacji przenieś kulturę plastrów na świeżą wkładkę hodowlaną i inkubuj w temperaturze 35°C w inkubatorze przez okres do 3 dni.</li>
</ol>
7. Utrwalanie, barwienie i obrazowanie organtypowych kultur warstw hipokampa
<ol>
	<li>Utrwalić elektroporowane organotypowe kultury plastrów 2 – 3 dni po transfekcji za pomocą 4% paraformaldehydu i 4% sacharozy w 0,01 M buforowanej fosforanem soli fizjologicznej (1x PBS) przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć plastry utrwalacza i inkubować w 30% sacharozie w 0,1 M buforze fosforanowym (1x PB) przez 2 godziny.</li>
	<li>Umieść plastry na szkiełku szkiełkowym i zamroź je, kładąc szklankę na pokruszonym suchym lodzie. Rozmrozić plastry w temperaturze pokojowej i przenieść je na 6-dołkową płytkę wypełnioną 1x PBS.</li>
	<li>Wybarwić plastry mysimi przeciwciałami anty-GFP i króliczymi przeciwciałami anty-RFP w buforze GDB (0,1% żelatyny, 0,3% Triton X-100, 450 mM NaCl i 32% 1x PB, pH 7,4) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj plastry z 1x PBS trzy razy w temperaturze pokojowej przez 10 minut przy każdym praniu.</li>
	<li>Inkubować plastry z przeciwciałem drugorzędowym skoniugowanym z anty-myszem Alexa 488 i przeciwciałem drugorzędowym anty-króliczym Alexa 594 w buforze GDB przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Inkubować plastry z DAPI (4 μg/ml) w 1x PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj plastry z 1x PBS trzy razy w temperaturze pokojowej przez 3 minuty przy każdym praniu.</li>
	<li>Zamontuj plastry na szkiełkach za pomocą podłoża montażowego i wykonaj obrazowanie fluorescencyjne.</li>
</ol>

<ol><li>Washbourne, P., McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+gene+transfer+into+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Techniques for gene transfer into neurons.</a> Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 566-573 (2002).</li>
<li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+transformation+by+direct+microinjection+of+DNA+into+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells.</a> Cell. 22 (2), Pt 2 479-488 (1980).</li>
<li>Rae, J. L., Levis, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archives%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Single-cell electroporation.</a> Pflugers Archives: European Journal of Physiology. 443 (4), 664-670 (2002).</li>
<li>Teruel, M. N., Blanpied, T. A., Shen, K., Augustine, G. J., Meyer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+microporation+technique+for+the+transfection+of+cultured+CNS+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A versatile microporation technique for the transfection of cultured CNS neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 93 (1), 37-48 (1999).</li>
<li>Rathenberg, J., Nevian, T., Witzemann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transfection+of+individual+neurons+using+modified+electrophysiology+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transfection of individual neurons using modified electrophysiology techniques.</a> Journal of Neuroscience Methods. 126 (1), 91-98 (2003).</li>
<li>Tanaka, M., Yanagawa, Y., Hirashima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+small+interfering+RNA+by+single-cell+electroporation+in+cerebellar+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Transfer of small interfering RNA by single-cell electroporation in cerebellar cell cultures.</a> Journal of Neuroscience Methods. 178 (1), 80-86 (2009).</li>
<li>Wiegert, J. S., Gee, C. E., Oertner, T. G. Single-Cell Electroporation of Neurons. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWiegert%2C+JS+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22">Cold Spring Harbor Protocols</a>. 2017 (2), 094904(2017).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robot+for+high+yield+electrophysiology+and+morphology+of+single+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">A robot for high yield electrophysiology and morphology of single neurons in vivo.</a> Nature Communication. 8, 15604(2017).</li>
<li>Steinmeyer, J. D., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+single-cell+manipulation+in+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High-throughput single-cell manipulation in brain tissue.</a> PLoS One. 7 (4), 35603(2012).</li>
<li>Keener, D. G., Cheung, A., Futai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+method+for+single-cell+electroporation+in+mouse+organotypic+hippocampal+slice+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A highly efficient method for single-cell electroporation in mouse organotypic hippocampal slice culture.</a> Journal of Neuroscience Methods. 337, 108632(2020).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).</li>
<li>Ibata, K., Sun, Q., Turrigiano, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+synaptic+scaling+induced+by+changes+in+postsynaptic+firing%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rapid synaptic scaling induced by changes in postsynaptic firing.</a> Neuron. 57 (6), 819-826 (2008).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+on+microchips%3A+the+harmful+effects+of+pH+changes+and+scaling+down%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Electroporation on microchips: the harmful effects of pH changes and scaling down.</a> Science Reports. 5, 17817(2015).</li>
<li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+techniques+for+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transfection techniques for neuronal cells.</a> Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).</li>
<li>Taverna, E., Haffner, C., Pepperkok, R., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+manipulate+the+fate+of+single+neural+stem+cells+in+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">A new approach to manipulate the fate of single neural stem cells in tissue.</a> Nature Neurosciences. 15 (2), 329-337 (2011).</li>
<li>Zhang, Y., Yu, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+microinjection+technology+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Single-cell microinjection technology in cell biology.</a> Bioessays. 30 (6), 606-610 (2008).</li>
<li>De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+rat+CA1+neurones+in+acute+versus+organotypic+slices%3A+role+of+experience+in+synaptic+morphology+and+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity.</a> Journal of Physiology. 550, Pt 1 135-147 (2003).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Opisujemy tutaj metodę elektroporacji, która z wysoką wydajnością i precyzją transfekuje zarówno neurony pobudzające, jak i hamujące. Nasz zoptymalizowany protokół elektroporacji zawiera trzy innowacyjne przełomowe rozwiązania, które pozwalają osiągnąć wysoce wydajną transfekcję genów. Nasza pierwsza modyfikacja polegała na zwiększeniu rozmiaru pipety w porównaniu z poprzednio opublikowanymi protokołami 3,5,6. Ta zmiana umożliwi...

W biologii molekularnej, jednym z najważniejszych zagadnień dla badacza jest to, jak dostarczyć interesujący gen do komórki lub populacji komórek, aby wyjaśnić jego funkcję. Różne metody dostarczania można podzielić na biologiczne (np. wektor wirusowy), chemiczne (np. fosforan wapnia lub lipid) lub fizyczne (np. elektroporacja, mikroiniekcja lub biolistyka)1,2. Metody biologiczne są bardzo skuteczne i mogą być specyficzne dla typu komórki, ale są ograniczone przez rozwój określonych narzędzi genetycznych. Podejścia chemiczne są bardzo skuteczne in vitro, ale transfekcje są na ogół losowe; Co więcej, podejścia te są w większości zarezerwowane tylko dla komórek pierwotnych. Spośród podejść fizycznych, biolistyka jest najprostsza i najłatwiejsza z technicznego punktu widzenia, ale ponownie daje losowe wyniki transfekcji przy stosunkowo niskiej wydajności. W przypadku zastosowań, które wymagają transferu do określonych komórek bez konieczności opracowywania narzędzi genetycznych, zwracamy uwagę na elektroporację pojedynczych komórek3,4.
Podczas gdy elektroporacja odnosiła się tylko do elektroporacji polowej, w ciągu ostatnich dwudziestu lat opracowano wiele protokołów elektroporacji pojedynczych komórek in vitro i in vivo w celu poprawy specyficzności i wydajności5,6,7, co pokazuje, że elektroporacja może być używana do transferu genów do pojedynczych komórek i dlatego może być niezwykle precyzyjna. Procedury te są jednak wymagające technicznie, czasochłonne i stosunkowo mało efektywne. Rzeczywiście, nowsze prace badały wykonalność zmechanizowanych urządzeń do elektroporacji8,9, co może pomóc w wyeliminowaniu kilku z tych barier dla badaczy zainteresowanych instalacją takiej robotyki. Ale dla tych, którzy szukają prostszych środków, problemy z elektroporacją, a mianowicie śmierć komórki, niepowodzenie transfekcji i zatkanie pipety, pozostają problemem.
Niedawno opracowaliśmy metodę elektroporacji, która wykorzystuje szklane pipety z większą końcówką, łagodniejsze parametry impulsów elektrycznych i unikalny krok cyklu ciśnienia, co wygenerowało znacznie wyższą efektywność transfekcji w neuronach pobudzających niż poprzednie metody i umożliwiło nam po raz pierwszy transfekcję genów w interneuronach hamujących, w tym interneuronów hamujących wyrażających somatostatynę w regionie CA1 hipokampa w hodowli organotypowej myszy10. Jednak niezawodność tej metody elektroporacji w różnych typach interneuronów hamujących i etapach rozwoju neuronów nie została poruszona. Tutaj wykazaliśmy, że ta technika elektroporacji jest zdolna do transfekcji genów zarówno do neuronów pobudzających, jak i różnych klas interneuronów. Co ważne, skuteczność transfekcji była wysoka niezależnie od dni testowanych pod kątem wieku hodowli warstwowej in vitro (DIV). Ta sprawdzona i przyjazna dla użytkownika technika jest wysoce zalecana każdemu badaczowi zainteresowanemu zastosowaniem elektroporacji pojedynczych komórek dla różnych typów komórek w kontekście tkanki mózgowej myszy in vitro.

<table><tbody><tr><td>Preparat plazmidowy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania plazmidu</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Organotypowy preparat do hodowli plastrów</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 dołków</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 Kleszcze</td><td>FST</td><td>#5/45</td><td>Kątowe kleszcze preparacyjne do przygotowania organotypowych plastrów</td></tr><tr><td>Jednostka filtrująca kolby</td><td>Millipore</td><td>SCHVU02RE</td><td>Filtracja i przechowywanie pożywek hodowlanych</td></tr><tr><td>Spoiwo</td><td>inkubatora</td><td>BD C150-UL</td><td></td></tr><tr><td>Rozdrabniacz tkanek McIlwain</td><td>TED PELLA, INC.</td><td>10180</td><td>Rozdrabniacz tkanek do organotypowego przygotowania kultur plastrowych</td></tr><tr><td>Wkładka do hodowli komórkowych Millicell, 30 mm</td><td>Millipore</td><td>PIHP03050</td><td>Organotypowe wkładki do hodowli plastrów</td></tr><tr><td>Osmometer</td><td>Precision Systems</td> Szpatułki <td>powlekane PTFE OSMETTE II</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Cole-Parmer</td><td>SK-06369-11</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>FST</td><td>14958-09</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny system filtracji próżniowej</td><td>Millipore</td><td>SCGPT01RE</td><td>Filtracja i przechowywanie aCSF</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przygotowanie elektrody</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Okulary kapilarne</td><td>Warner Instruments</td><td>640796</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Przyrząd</td><td>P-1000</td><td>Ściągacz</td></tr><tr><td>Spoiwo</td><td>do piekarnika</td><td>BD (E2)</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do włókien</td><td>Instrument Sutter</td><td>FB330B</td><td>Ściągacz</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektroporacja jednokomórkowa i obrazowanie fluorescencyjne #1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3,5 mm Szalki Petriego Falcon</td><td>BD Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Kamera CCD Airtable</td><td>TMC</td><td>63-7512E</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Q Obrazowanie</td><td>Kamera Retiga-2000DC</td><td></td></tr><tr><td>System elektroporacji</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Axoporator 800A</td><td>Elektroporator</td></tr><tr><td>System oświetlenia fluorescencyjnego</td><td>Wcześniejszy</td> manipulator <td>Lumen 200</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Instrument Sutter</td><td>Manipulator</td><td>MPC-385</td></tr><tr><td>Metamorf oprogramowanie</td> Urządzenia <td></td><td>molekularne</td><td>Akwizycja obrazu</td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>Rainin</td><td>Dynamax, RP-2</td><td>Pompa perfuzyjna</td></tr><tr><td>Stół przesuwny</td><td>Luigs & Głośnik Neuman</td><td>240 XY</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nieznany</td><td></td><td>Głośniki podłączone do elektroporatora</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Inkubator stołowy Olympus</td><td>SZ30</td><td></td></tr><tr><td></td> Mikroskop pionowy <td>Thermo Scientific</td><td>MIDI 40</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>BX61WI</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><<tr><td>strong>Fluorescence obrazowanie #2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>All-in-One Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Keyence</td><td>BZ-X710</td><td></td></tr></tbody></table>

elektroporacja jednokomórkowa w różnych organotypowych kulturach warstwowych mysich neuronów pobudzających hipokampa i specyficznych dla klasy neuronów hamujących

Single-Cell Electroporation across Different Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Excitatory and Class-Specific Inhibitory Neurons

Elektroporacja stała się kluczową metodą transferu określonych genów do komórek, aby zrozumieć ich funkcję. W tym miejscu opisujemy technikę elektroporacji pojedynczej komórki, która maksymalizuje wydajność (~ 80%) transfekcji genów in vitro w pobudzających i specyficznych dla klasy neuronach hamujących w mysiej organotypowej hodowli plastrów hipokampa. Korzystając z dużych szklanych elektrod, sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego zawierającego tetrodotoksynę i łagodnych impulsów elektrycznych, dostarczyliśmy interesujący nas gen do hodowanych neuronów piramidowych CA1 hipokampa i interneuronów hamujących. Co więcej, elektroporację można przeprowadzić w hodowanych wycinkach hipokampa do 21 dni in vitro bez zmniejszenia wydajności transfekcji, co pozwala na badanie różnych etapów rozwoju kultur warstwowych. Wraz z rosnącym zainteresowaniem badaniem funkcji molekularnych genów w różnych typach komórek, nasza metoda demonstruje niezawodne i proste podejście do transfekcji genów in vitro w tkance mózgowej myszy, które można przeprowadzić przy użyciu istniejącego sprzętu i technik elektrofizjologicznych.

Nasza metoda elektroporacji pojedynczych komórek umożliwia precyzyjne wprowadzanie genów do wizualnie zidentyfikowanych neuronów pobudzających i hamujących. Przeprowadziliśmy elektroporację trzech różnych typów komórek neuronalnych w trzech różnych punktach czasowych. Neurony wykazujące ekspresję parwalbuminy (Pv) lub pęcherzykowego transportera glutaminianu typu 3 (VGT3) wizualizowano poprzez skrzyżowanie linii Pvcre (JAX #008069) lub VGT3cre (JAX #018147) z linią reporterową TdTomato (wariantu cze...

Prezentowany tutaj jest protokół elektroporacji pojedynczej komórki, który może dostarczyć geny zarówno w neuronach pobudzających, jak i hamujących w różnych epokach hodowli in vitro w warstwach hipokampa. Nasze podejście zapewnia precyzyjną i wydajną ekspresję genów w poszczególnych komórkach, które można wykorzystać do badania funkcji autonomicznych i międzykomórkowych.

Elektroporacja jednokomórkowa w różnych organotypowych kulturach warstwowych mysich neuronów pobudzających hipokampa i specyficznych dla klasy neuronów hamujących

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a ...

Transfekcja genów jest kluczowym podejściem do badań neurobiologicznych. Nasza technika elektroporacji umożliwia nam transfekcję interneuronów genów będących przedmiotem zainteresowania w organotypowej kulturze warstwowej hipokampa bez wykrywalnych skutków ubocznych. Protokół ten ma znacznie wyższą wydajność transfekcji w porównaniu z innymi protokołami jednokomórkowymi, ale nadal jest stosunkowo niedrogi i prosty do wykonania.Technika ta będzie przydatna dla naukowców zainteresowanych zrozumieniem specyficznych funkcji molekularnych i fizjologicznych neuronów, w tym mechanizmów autonomicznych komórek i transsynaptycznych interakcji białkowych. Aby przygotować kultury warstwowe do elektroporacji, przenieś interesujące nas wkładki hodowlane na indywidualne trzycentymetrowe szalki Petriego załadowane 900 mikrolitrami pożywki hodowlanej i umieść kultury w stołowym inkubatorze dwutlenku węgla. Następnie wstępnie inkubuj świeże wkładki hodowlane z jednym mililitrem pożywki hodowlanej w plasterkach na wkładkę na 3,5-centymetrowej szalce Petriego przez co najmniej 30 minut i sterylizuj linie urządzenia do elektroporacji 10% wybielaczem przez pięć minut.Pod koniec perfuzji przepłucz linie zjonizowaną wodą autoklawowaną przez co najmniej 30 minut przed perfuzją za pomocą wysterylizowanego filtrem ACSF zawierającego 0,001 milimolowej tetrodotoksyny. Ustaw impuls elektroporatora na amplitudę minus pięć woltów, impuls prostokątny, ciąg 500 milisekund, częstotliwość 50 herców i szerokość impulsu 500 mikrosekund. Napełnij szklaną pipetę pięcioma mikrolitrami roztworu wewnętrznego zawierającego plazmid, a następnie delikatnie strzepnij i postukaj w końcówkę kilka razy, aby usunąć wszelkie uwięzione pęcherzyki.Użyj mikroskopu preparacyjnego, aby upewnić się, że końcówka nie jest uszkodzona, i bezpiecznie przymocuj końcówkę pipety do elektrody. Gdy końcówka zetknie się z ACSF, zapisz odczyt rezystancji pipety z elektroporatora. Aby wyizolować kulturę plastrową, odetnij membranę wkładki hodowlanej ostrym ostrzem i użyj ostrych kleszczyków, aby ostrożnie przenieść kulturę plastrów do komory elektroporacji.Następnie ustal pozycję kultury za pomocą kotwicy do plastrów. W celu elektroporacji interesujących komórek należy zastosować nadciśnienie do pipety doustnie i za pomocą trójwymiarowych pokręteł sterujących manewrować końcówką pipety w pobliżu powierzchni kultury plastrów. Oglądając kulturę pod mikroskopem, zbliż się do komórki docelowej końcówką, utrzymując nadciśnienie przyłożone, aż na powierzchni komórki utworzy się wgłębienie.Po wizualizacji wgłębienia szybko zastosuj doustnie łagodne podciśnienie, aby między końcówką pipety a błoną plazmatyczną utworzyło się luźne uszczelnienie. Membrana nieznacznie wejdzie do pipety. Należy zaobserwować około 2,5-krotny wzrost początkowej rezystancji pipety, na co wskazuje wzrost tonu z głośników.Szybko ponownie zastosuj dodatnie ciśnienie, aby wgłębienie się zreformowało. Następnie natychmiast wykonaj co najmniej dwa kolejne cykle ciśnieniowe, jak właśnie pokazano, bez zatrzymywania się. Po ostatnim impulsie ciśnienia utrzymaj podciśnienie przez jedną sekundę.Gdy ton z głośników osiągnie stabilny szczyt wysokości, użyj pedału nożnego, aby szybko uruchomić elektroporator. Po elektroporacji delikatnie cofnij pipetę na około 100 mikronów od celi bez wywierania nacisku i ponownie zastosuj nadciśnienie, sprawdzając, czy rezystancja jest podobna do odczytu linii bazowej przed zbliżeniem się do następnej celi. Gdy wszystkie interesujące komórki zostaną poddane elektroporacji, przenieś kulturę plastrową do jednej z przygotowanych świeżych wkładek hodowlanych i umieść wkładkę w temperaturze 35 stopni Celsjusza na okres do trzech dni.W tym reprezentatywnym eksperymencie EGFP transfekowano do pięciu do 20 neuronów piramidowych w obszarze CA1 hipokampa przez siedem, 14 i 21 dni w wieku hodowli warstwowej in vitro. Parwalbumina i pęcherzykowe interneurony glutaminianu typu 3 mogą być również z powodzeniem elektroporowane w obszarze CA1 hipokampa. Co ciekawe, na transfekcję nie ma istotnego wpływu dzienny wiek hodowli plastrów in vitro i nie różni się ona od skuteczności transfekcji obserwowanej w neuronach piramidowych CA1.Neurony są bardzo delikatne. Należy zachować szczególną ostrożność i delikatność podczas zbliżania się do komórek i zmieniania nacisku na ogniwa oraz cofania końcówki pipety, aby spowodować poważne uszkodzenia. Po elektroporacji ogniwa można poddać różnym analizom eksperymentalnym, w tym elektrofizjologii i obrazowaniu.

single-cell-electroporation-across-different-organotypic-slice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisujemy metodę przygotowania organotypowych skrawków hipokampa, którą można łatwo dostosować do innych obszarów mózgu. Skrawki mózgu umieszcza się na porowatych membranach, pozwalając na utworzenie interfejsu z pożywką hodowlaną. Metoda ta pozwala zachować ogólną architekturę hipokampa przez okres do 2 tygodni hodowli.

Organotypowe hodowle przekrojów hipokampa

Niniejszy protokół opisuje sposób przygotowania i utrzymania preparatu przekroju nowokory w kulturze organotypowej w celu wykonania rejestracji elektrycznej z neuronów piramidowych.

Rejestracja całokomórkowa z organotypowego preparatu skrawka neokory

W celu przeprowadzenia szybkiej oceny funkcji genów w rozwoju kory mózgu opisujemy metody obejmujące elektroporację ex vivo plazmidów koekspresujących inhibicyjne RNA (RNAi) i GFP w zarodkowej korze mysiej. Protokół ten nadaje się do badania różnych aspektów neurorozwoju, takich jak neurogeneza, migracja neuronów oraz morfogeneza neuronów, w tym wzrost dendrytów i aksonów.

Metody badania morfogenezy neuronalnej: Elektroporacja RNAi ex vivo w embrionalnej korze mózgu myszy

Źródło: Keener, D. G., et al. Elektroporacja pojedynczych komórek w różnych organotypowych kulturach warstwowych mysich neuronów pobudzających hipokampa i specyficznych dla klasy neuronów hamujących. J. Vis. Exp. (2020).Ten film pokazuje proces elektroporacji pojedynczej komórki w celu wprowadzenia plazmidowego DNA do neuronów w hodowlach plastrów hipokampa myszy. Procedura obejmuje precyzyjne pozycjonowanie pipety, regulację ciśnienia i impulsy elektroporacyjne w celu przejściowej...

Ekspresja genów poprzez elektroporację pojedynczych komórek w mysich kulturach warstw hipokampa

Ten film demonstruje protokół elektroporacji pojedynczych komórek genów zarówno w neuronach pobudzających, jak i hamujących w różnych kulturach in vitro w warstwach hipokampa. Technika ta jest przydatna do badania specyficznych funkcji molekularnych i fizjologicznych neuronów, w tym autonomicznych mechanizmów komórkowych i interakcji białek transsynaptycznych.

Elektroporacja pojedynczych komórek w organotypowych kulturach wycinków mózgu: technika in vitro dostarczania plazmidów do docelowych neuronów w wycinkach hipokampa mózgu

Film demonstruje protokół do badania interakcji synaptycznych i odpowiedzi neuronalnych w transfekowanym wycinku mózgu hipokampa myszy. Polega na oświetlaniu neuronów czuciowych dalekiego zasięgu w celu wyzwolenia potencjałów czynnościowych i rejestrowaniu powstałych pobudzających potencjałów postsynaptycznych w zarejestrowanym neuronie za pomocą techniki patch-clamp dla całej komórki.

Fotostymulacja i zapisy klamer całokomórkowych neuronów w wycinkach hipokampa myszy

Nagrania par to równoczesne nagrania klamrów całych komórek z dwóch synaptycznie połączonych neuronów, umożliwiające precyzyjną elektrofizjologiczną i farmakologiczną charakterystykę synaps między poszczególnymi neuronami. Poniżej opisujemy szczegółową metodologię i wymagania dotyczące ustalenia tej techniki w organotypowych kulturach plastrów hipokampa w dowolnym laboratorium wyposażonym do elektrofizjologii.

Sparowane nagrania całych komórek w organotypowych wycinkach hipokampa

Tutaj prezentujemy protokół dostarczający narzędzie do badania mechanizmów regulacyjnych określonych genów podczas rozwoju hipokampa. Zastosowanie elektroporacji ex utero i organotypowej hodowli plastrów pozwala na regulację w górę i w dół ekspresji interesujących genów w pojedynczych komórkach i śledzenie ich losów podczas rozwoju.

Ex Utero Elektroporacja i organotypowa hodowla warstwowa tkanki hipokampa myszy

Ten manuskrypt zawiera protokoły, które wykorzystują elektroporację in utero (IUE) do opisania strukturalnej łączności neuronów na poziomie pojedynczej komórki i pobudliwości neuronów znakowanych fluorescencyjnie. Histologia służy do charakteryzowania projekcji dendrytycznych i aksonalnych. Zapis całych komórek w ostrych wycinkach służy do badania pobudliwości.

In Utero (w macicy) Podejścia elektroporacyjne do badania pobudliwości subpopulacji neuronalnych i połączeń pojedynczych komórek

Ten protokół dostarcza instrukcji do bezpośredniej obserwacji promieniście migrujących neuronów korowych. Elektroporacja in utero, organotypowa hodowla plastrów i poklatkowe obrazowanie konfokalne są łączone w celu bezpośredniego i dynamicznego badania skutków nadekspresji lub regulacji w dół genów będących przedmiotem zainteresowania w migrujących neuronach oraz analizy ich różnicowania podczas rozwoju.

Poklatkowe obrazowanie konfokalne migrujących neuronów w organotypowej kulturze warstwowej embrionalnego mózgu myszy przy użyciu elektroporacji in utero

Tutaj oferujemy tanią i niezawodną metodę generowania elektroporowanych organicznych kultur warstwowych mózgu z mysich zarodków, odpowiednich do mikroskopii konfokalnej i technik obrazowania na żywo.

Ex Utero Elektroporacja i organotypowe kultury warstwowe embrionalnych mózgów myszy do obrazowania na żywo migrujących interneuronów GABA-ergicznych

Poznaj elektroporację jednokomórkową w organotypowych kulturach hipokampa myszy do badania neuronów pobudzających i hamujących. Ta metoda umożliwia precyzyjną transfekcję genów z wysoką wydajnością.

Elektroporacja jednokomórkowa w różnych organotypowych kulturach warstwowych mysich neuronów pobudzających hipokampa i specyficznych dla klasy neuronów hamujących (Wideo) | JoVE Journal

Elektroporacja jednokomórkowa w różnych organotypowych kulturach warstwowych mysich neuronów pobudzających hipokampa i specyficznych dla klasy neuronów hamujących

Przeglądaj więcej filmów