Elektroporacja jednokomórkowa w różnych organotypowych kulturach warstwowych mysich neuronów pobudzających hipokampa i specyficznych dla klasy neuronów hamujących

Prezentowany tutaj jest protokół elektroporacji pojedynczej komórki, który może dostarczyć geny zarówno w neuronach pobudzających, jak i hamujących w różnych epokach hodowli in vitro w warstwach hipokampa. Nasze podejście zapewnia precyzyjną i wydajną ekspresję genów w poszczególnych komórkach, które można wykorzystać do badania funkcji autonomicznych i międzykomórkowych.

Transfekcja genów jest kluczowym podejściem do badań neurobiologicznych. Nasza technika elektroporacji umożliwia nam transfekcję interneuronów genów będących przedmiotem zainteresowania w organotypowej kulturze warstwowej hipokampa bez wykrywalnych skutków ubocznych. Protokół ten ma znacznie wyższą wydajność transfekcji w porównaniu z innymi protokołami jednokomórkowymi, ale nadal jest stosunkowo niedrogi i prosty do wykonania.

Technika ta będzie przydatna dla naukowców zainteresowanych zrozumieniem specyficznych funkcji molekularnych i fizjologicznych neuronów, w tym mechanizmów autonomicznych komórek i transsynaptycznych interakcji białkowych. Aby przygotować kultury warstwowe do elektroporacji, przenieś interesujące nas wkładki hodowlane na indywidualne trzycentymetrowe szalki Petriego załadowane 900 mikrolitrami pożywki hodowlanej i umieść kultury w stołowym inkubatorze dwutlenku węgla. Następnie wstępnie inkubuj świeże wkładki hodowlane z jednym mililitrem pożywki hodowlanej w plasterkach na wkładkę na 3,5-centymetrowej szalce Petriego przez co najmniej 30 minut i sterylizuj linie urządzenia do elektroporacji 10% wybielaczem przez pięć minut.

Pod koniec perfuzji przepłucz linie zjonizowaną wodą autoklawowaną przez co najmniej 30 minut przed perfuzją za pomocą wysterylizowanego filtrem ACSF zawierającego 0,001 milimolowej tetrodotoksyny. Ustaw impuls elektroporatora na amplitudę minus pięć woltów, impuls prostokątny, ciąg 500 milisekund, częstotliwość 50 herców i szerokość impulsu 500 mikrosekund. Napełnij szklaną pipetę pięcioma mikrolitrami roztworu wewnętrznego zawierającego plazmid, a następnie delikatnie strzepnij i postukaj w końcówkę kilka razy, aby usunąć wszelkie uwięzione pęcherzyki.

Użyj mikroskopu preparacyjnego, aby upewnić się, że końcówka nie jest uszkodzona, i bezpiecznie przymocuj końcówkę pipety do elektrody. Gdy końcówka zetknie się z ACSF, zapisz odczyt rezystancji pipety z elektroporatora. Aby wyizolować kulturę plastrową, odetnij membranę wkładki hodowlanej ostrym ostrzem i użyj ostrych kleszczyków, aby ostrożnie przenieść kulturę plastrów do komory elektroporacji.

Następnie ustal pozycję kultury za pomocą kotwicy do plastrów. W celu elektroporacji interesujących komórek należy zastosować nadciśnienie do pipety doustnie i za pomocą trójwymiarowych pokręteł sterujących manewrować końcówką pipety w pobliżu powierzchni kultury plastrów. Oglądając kulturę pod mikroskopem, zbliż się do komórki docelowej końcówką, utrzymując nadciśnienie przyłożone, aż na powierzchni komórki utworzy się wgłębienie.

Po wizualizacji wgłębienia szybko zastosuj doustnie łagodne podciśnienie, aby między końcówką pipety a błoną plazmatyczną utworzyło się luźne uszczelnienie. Membrana nieznacznie wejdzie do pipety. Należy zaobserwować około 2,5-krotny wzrost początkowej rezystancji pipety, na co wskazuje wzrost tonu z głośników.

Szybko ponownie zastosuj dodatnie ciśnienie, aby wgłębienie się zreformowało. Następnie natychmiast wykonaj co najmniej dwa kolejne cykle ciśnieniowe, jak właśnie pokazano, bez zatrzymywania się. Po ostatnim impulsie ciśnienia utrzymaj podciśnienie przez jedną sekundę.

Gdy ton z głośników osiągnie stabilny szczyt wysokości, użyj pedału nożnego, aby szybko uruchomić elektroporator. Po elektroporacji delikatnie cofnij pipetę na około 100 mikronów od celi bez wywierania nacisku i ponownie zastosuj nadciśnienie, sprawdzając, czy rezystancja jest podobna do odczytu linii bazowej przed zbliżeniem się do następnej celi. Gdy wszystkie interesujące komórki zostaną poddane elektroporacji, przenieś kulturę plastrową do jednej z przygotowanych świeżych wkładek hodowlanych i umieść wkładkę w temperaturze 35 stopni Celsjusza na okres do trzech dni.

W tym reprezentatywnym eksperymencie EGFP transfekowano do pięciu do 20 neuronów piramidowych w obszarze CA1 hipokampa przez siedem, 14 i 21 dni w wieku hodowli warstwowej in vitro. Parwalbumina i pęcherzykowe interneurony glutaminianu typu 3 mogą być również z powodzeniem elektroporowane w obszarze CA1 hipokampa. Co ciekawe, na transfekcję nie ma istotnego wpływu dzienny wiek hodowli plastrów in vitro i nie różni się ona od skuteczności transfekcji obserwowanej w neuronach piramidowych CA1.

Neurony są bardzo delikatne. Należy zachować szczególną ostrożność i delikatność podczas zbliżania się do komórek i zmieniania nacisku na ogniwa oraz cofania końcówki pipety, aby spowodować poważne uszkodzenia. Po elektroporacji ogniwa można poddać różnym analizom eksperymentalnym, w tym elektrofizjologii i obrazowaniu.