Name: Iniekcja doszklistkowa i ocena ilościowa parametrów infekcji w mysim modelu bakteryjnego zapalenia wnętrza gałki ocznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Poznaj metodę iniekcji doszklistkowej i ilościowej oceny infekcji w mysim modelu bakteryjnego zapalenia wnętrza gałki ocznej. Technika umożliwia badanie patogenezy zakażeń wewnątrzgałkowych oraz skuteczności nowych terapii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Dr. Feng Li i Markowi Dittmarowi (OUHSC P30 Live Animal Imaging Core, Dean A. McGee Eye Institute, Oklahoma City, OK, USA) za pomoc. Nasze badania zostały wsparte grantami National Institutes of Health R01EY028810, R01EY028066, R01EY025947 i R01EY024140. Nasze badania zostały również wsparte przez P30EY21725 (grant NIH CORE na obrazowanie i analizę żywych zwierząt, biologię molekularną i obrazowanie komórkowe). Nasze badania były również wspierane przez program stażowy NEI Vision Science Pre-doctoral Trainee 5T32EY023202, grant Presbyterian Health Foundation Research Support oraz nieograniczony grant dla Dean A. McGee Eye Institute z Research to Prevent Blindness.

Wszystkie procedury zostały wykonane zgodnie z zaleceniami zawartymi w Przewodniku po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych oraz Oświadczeniu Stowarzyszenia Badań nad Wzrokiem i Okulistyką dotyczącą wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych. Protokoły zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Oklahomy (numery protokołów 15-103, 18-043 i 18-087).
1. Sterylne igły szklane
<ol>
	<li>Włącz ściągacz do pipet igłowych.</li>
	<li>Wyreguluj pokrętło grzałki, aż na wyświetlaczu pojawi się 12.6.</li>
	<li>Otwórz drzwi i ręcznie przeprowadź rurkę kapilarną o pojemności 5 μl przez górny zacisk i żarnik grzałki, aż połowa rurki wysunie się poniżej żarnika (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Upewnij się, że rurka kapilarna znajduje się w rowku "V" w górnym zacisku. Dokręcić górny clamp.</li>
	<li>Gdy dolny zacisk otwarty, ręcznie wyreguluj suwak pionowy w górę, aż dolny clamp osiągnie górną granicę. Upewnij się, że rurka znajduje się w rowku "V" w dolnym zacisku. Dokręcić dolny zacisk.</li>
	<li>Zamknij drzwi i upewnij się, że świeci się kontrolka "Gotowy". Naciśnij przycisk Start, aby zainicjować sekwencję grzałki i ciągnięcia (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1B).</li>
	<li>Upewnij się, że grzejnik wyłącza się automatycznie po tym, jak ciepło i grawitacja rozsuną rurkę kapilarną (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C), a suwak przesuwa się w dół.</li>
	<li>Otwórz drzwi. Trzymając górną część rurki kapilarnej, odkręć górny zacisk. Wyjmij górną rurkę kapilarną i odłóż ją na bok.</li>
	<li>Przytrzymaj rurkę kapilarną w dolnym suwaku i odkręć dolny zacisk. Wyjmij dolną rurkę kapilarną i odłóż ją na bok.</li>
	<li>Użyj ukosowarki mikroelektrodowej z płytą szlifierską ze ścierniwa z tlenku glinu 0,05 μm, aby ukosować ciągniętą rurkę kapilarną w celu wytworzenia igieł iniekcyjnych.</li>
	<li>Na płytę mielącą nanieść pipetą odpowiednią ilość wody, aby pokryła powierzchnię (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D).</li>
	<li>Włącz ukosowarkę tak, aby zaczęła się obracać z prędkością 60 obr./min. Umieść wyciągniętą rurkę kapilarną w pipecie clamp w rowku "V". Dokręć zacisk i wyreguluj kąt zacisku pipety na 30°.</li>
	<li>Wyreguluj końcówkę spiczastej krawędzi rurki kapilarnej w odległości około dwóch trzecich od środka obrotu płyty szlifierskiej.</li>
	<li>Opuść zaciśniętą rurkę kapilarną, regulując zgrubne pokrętło sterujące w górnej części manipulatora. Kontynuuj opuszczanie rurki kapilarnej, aż końcówka rurki kapilarnej wysunie się poniżej powierzchni wody i zetknie się z powierzchnią ścierną płyty szlifierskiej.</li>
	<li>Monitoruj postęp ukosowania za pomocą mikroskopu dołączonego do ukosowarki. Po 5 minutach wyreguluj precyzyjną kontrolę, aby podnieść szklaną igłę z płyty mielącej.</li>
	<li>Wyjmij szklaną igłę i umieść ją pod 10-krotnym powiększeniem, aby sprawdzić końcówkę rurki kapilarnej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1E,F).</li>
	<li>Aby upewnić się, że nie ma zatorów, włóż szklaną igłę do uchwytu na pipety na strzykawce i wepchnij powietrze do probówki o pojemności 1 ml zawierającej 99% etanol. Jeśli na końcu igły tworzą się pęcherzyki powietrza, oznacza to, że igła nie ma zatorów i może być używana do mikroiniekcji. Proces ten zapewnia również sterylność szklanych igieł.</li>
	<li>Jedna rurka kapilarna może pomieścić do 5 μl płynu. Oznacz rurkę kapilarną na 10 sekcji, aby obliczyć odległości na igle do oznaczenia objętości 0,5 μl. Zaznacz wagę z tą odległością, która mieści 0,5 μl do przyszłego przygotowania. W przypadku igły o pojemności 5 μl odległości od siebie wynoszące 0,7 mm wynoszą 0,5 μl (<silna klasa="xfig">Rysunek 1G).</li>
</ol>
2. Kultura Bacillus cereus
<ol>
	<li>Wykonaj wszystkie procedury opisane w tej sekcji w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2.</li>
	<li>Zapas B. cereus ATCC 14579 do izolacji pojedynczej kolonii na 5% płytce z agarem z krwią owczą i inkubacji przez noc w temperaturze 37 °C (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Odpipetować 5 ml sterylnego bulionu Brain Heart Infusion (BHI) do sterylnej probówki z zatrzaskiem o pojemności 10 ml (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 2B). Za pomocą sterylnej pętli lub igły wybierz pojedynczą kolonię B. cereus ATCC 14579 z płytki agarowej i zaszczepij płynny BHI.</li>
	<li>Krótko wymieszać próbkę. Umieść rurkę z zatrzaskiem w obrotowym inkubatorze. Ustaw temperaturę na 37 °C i prędkość na 200 obr./min. Po 18 godzinach wyjmij kulturę z inkubatora (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B).</li>
</ol>
3. Rozcieńczenie bakteryjne do iniekcji doszklistkowej
<ol>
	<li>Wykonaj wszystkie procedury opisane w tej sekcji w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2.</li>
	<li>Obliczyć objętość nocnej kultury B. cereus, aby dodać do 10 ml świeżego BHI, aby uzyskać 200 jednostek tworzących kolonie na mikrolitr (jtk/μl). Na przykład, nocna hodowla B. cereus w BHI replikuje się do około 2 x 108 CFU/ml, które następnie można rozcieńczyć do 200 CFU/μL przez pipetowanie 10 μl nocnej hodowli do 10 ml świeżego BHI.</li>
	<li>Odpipetować 1 ml świeżo rozcieńczonej kultury do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Utrzymuj tę rurkę na lodzie do momentu wstrzyknięcia do ciała szklistego. Wykonać iniekcję doszklistkową w ciągu 60 minut od rozcieńczenia kultury bakteryjnej.</li>
</ol>
4. Wstrzyknięcie doszklistkowe myszy
<ol>
	<li>Wykonaj wszystkie procedury opisane w tej sekcji w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2.</li>
	<li>Przygotuj miejsce zabiegu, umieszczając podkładki medyczne na stole operacyjnym.</li>
	<li>Włącz mikrowtryskiwacz i otwórz zawór gazu na zbiorniku sprężonego powietrza podłączonym do mikrowtryskiwacza. Wyreguluj regulator zbiornika, aż dopływ gazu wyniesie około 60 psi.</li>
	<li>Na mikrowtryskiwaczu naciskaj Mode, aż na ekranie pojawi się Balance. Naciśnij przycisk Balance i umieść mysz komputerową na stole operacyjnym. Podłącz uchwyt na pipety ze stali nierdzewnej do rurki podłączonej do "Napełniania/Wyprowadzenia" wtryskiwacza. Ta rurka jest zawsze podłączona do wtryskiwacza.</li>
	<li>Włóż igłę kapilarną do drugiego końca uchwytu pipety, dokręcając mocno łącznik uchwytu pipety wokół igły.</li>
	<li>Włącz mikroskop okulistyczny i włącz jego światło o natężeniu 50%. Ustaw mikroskop nad miejscem zabiegu na stole operacyjnym i ustaw mikroskop na żądaną ostrość.</li>
	<li>Przed rozpoczęciem zabiegu upewnij się, że mysz jest odpowiednio znieczulona, testując odruch wycofania pedału. Pamiętaj, aby postępować zgodnie z zatwierdzonym przez IACUC protokołem znieczulenia. </li>
	<li>Umieść znieczuloną mysz na podkładkach medycznych z nosem skierowanym w prawo i opartym na lewym boku.</li>
	<li>Spójrz na prawe oko myszy przez mikroskop okulistyczny i otwórz powieki, otwierając szczypce kleszczy o odwrotnym działaniu po obu stronach oka, aby odsłonić miejsce wstrzyknięcia (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3C).</li>
	<li>Napełnij igłę kapilarną rozcieńczeniem 200 jtk/μl, klikając lewym przyciskiem myszy podkładkę pod mysz podłączoną do mikrowtryskiwacza (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3D).</li>
	<li>Zabezpiecz głowę zwierzęcia lewą ręką i umieść końcówkę igły na rąbku oka. Trzymając igłę w pozycji skośnej do góry i pod kątem 45°, nakłuć oko myszy, ale upewnić się, że podczas wstrzykiwania wkłada się tylko ostrą końcówkę igły (~0,5 mm).</li>
	<li>Po wkłuciu końcówki igły przesuń lewą rękę od główki myszy do podkładki myszy i kliknij prawym przyciskiem myszy na podkładkę pod mysz, aby wstrzyknąć 0,5 μl rozcieńczenia B. cereus. Aby zapobiec wyciekom, pozostaw końcówkę igły w oku myszy na 2-3 sekundy przed wyjęciem (Rysunek 3E)1,19,26,27,32,34,36,37,38.</li>
	<li>Zwolnij kleszcze i umieść mysz w klatce, która znajduje się na podkładce rozgrzewającej. Monitoruj te myszy, dopóki nie wyzdrowieją ze znieczulenia (<silna klasa="xfig">Ryc. 3F).</li>
	<li>Gdy myszy wyjdą ze znieczulenia, umieść klatkę z powrotem na właściwym stojaku. Jeśli myszy zostaną poddane analizie funkcji siatkówki za pomocą elektroretinografii, klatki powinny zostać przeniesione z powrotem do ciemnego pomieszczenia w celu prawidłowej adaptacji do ciemności.</li>
</ol>
5. Przygotowanie rurki do zbioru
<ol>
	<li>Umieść sterylne szklane koraliki o średnicy 1 mm w probówkach z nakrętką o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Wysterylizuj te probówki w autoklawie na sucho. Przed użyciem pozwól rurkom ostygnąć do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Dodaj 10 ml 1x sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Dodać 1 tabletkę koktajlu inhibitorów proteazy do probówki. Mieszaj przez vortexing19,27,29,34,35.</li>
	<li>Odpipetować 400 μl 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zawierającej inhibitor proteazy do każdej autoklawizowanej probówki do zbioru. Oznacz probówki i umieść na lodzie. (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A).</li>
</ol>
6. Zbieranie oczu
<ol>
	<li>Wykonaj wszystkie procedury opisane w tej sekcji w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2.</li>
	<li>Poddaj mysz eutanazji przez wdychanie CO2 . Użyj metody wtórnej, aby potwierdzić eutanazję.</li>
	<li>Trzymaj uśpioną głowę myszy bezpiecznie i otwórz kleszcze z cienką końcówką po obu stronach zainfekowanego oka. Popchnij w dół w kierunku głowy, aby podeprzeć oko. Gdy szczypce znajdą się za gałką oka, ściśnij szczypce razem. Odciągnij kleszcze od głowy, aby odłączyć gałkę oczną (<silna klasa="xfig">Rysunek 4B).</li>
	<li>Natychmiast umieść gałkę oczną w oznakowanej tubie do zbioru. Umieść probówki na lodzie na nie dłużej niż 60 minut (<silna klasa="xfig">Rysunek 4C).</li>
</ol>
7. Liczba bakterii wewnątrzgałkowych
<ol>
	<li>Wykonaj wszystkie procedury opisane w tej sekcji w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2.</li>
	<li>Upewnij się, że wszystkie probówki do pobierania są szczelnie zamknięte i wyważone, gdy znajdują się w homogenizatorze tkankowym (<klasa silna = "xfig">Rysunek 5A). Włącz homogenizator tkankowy na 1 minutę, aby homogenizować próbki. Odczekaj 30 sekund, a następnie włącz na kolejną minutę. Umieść rurki na lodzie (<silna klasa="xfig">Rysunek 5B,C).</li>
	<li>Seryjnie rozcieńczyć każdą próbkę 10-krotnie, przenosząc kolejno 20 μl homogenatu do 180 μl sterylnego 1x PBS. Rozcieńczać aż do osiągnięcia współczynnika 10-7 (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 5D).</li>
	<li>Oznacz każdy rząd ciepłej, kwadratowej płytki BHI odpowiednimi współczynnikami rozcieńczenia. Przenieść 10 μl każdego rozcieńczenia z rzędu na górną płytkę BHI, która jest nachylona pod kątem około 45°. Pozwól próbce płynąć, aż prawie dotrze do dna płytki, a następnie połóż płytkę płasko (Rysunek 5E)39.</li>
	<li>Gdy próbka zostanie wchłonięta przez agar BHI, przenieść płytkę do inkubatora o temperaturze 37 °C. Kolonie powinny zacząć być widoczne po 8 godzinach od umieszczenia w inkubatorze.</li>
	<li>Wyjmij płytkę z inkubatora, zanim wzrost kolonii B. cereus zakłóci identyfikację poszczególnych kolonii (<silna klasa="xfig">Rysunek 5F).</li>
	<li>Aby uzyskać dokładne odwzorowanie stężenia w próbce, policz wiersz, który ma od 10 do 100 kolonii. Na przykład rząd o frakcji rozcieńczenia 10-4, który ma 45 kolonii, będzie miał stężenie 4,5 x 105 CFU/ml.</li>
	<li>Aby obliczyć całkowitą liczbę bakterii na oko, pomnóż stężenie przez 0,4, co odpowiada mililitrowej objętości 1x PBS użytej do homogenizacji oka. Na przykład stężenie 4,5 x 105 CFU/ml przełożyłoby się na 1,8 x 105 CFU B. cereus na oko.</li>
</ol>
8. Przechowywanie próbek
<ol>
	<li>Umieść próbki homogenatu w oznakowanym pudełku do zamrażania i umieść to pudełko w zamrażarce o temperaturze -80 °C. Próbki te można później wykorzystać do analizy mediatora stanu zapalnego metodą ELISA.</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów finansowych.

Nawet przy dostępności silnych antybiotyków, leków przeciwzapalnych i operacji witrektomii, bakteryjne zapalenie wnętrza gałki ocznej może oślepić pacjenta. Badania kliniczne były przydatne w badaniu zapalenia wnętrza gałki ocznej; Jednak eksperymentalne modele zapalenia wnętrza gałki ocznej zapewniają szybkie i powtarzalne wyniki, które można przełożyć na postęp w standardowej opiece, co skutkuje lepszymi wynikami wizualnymi dla pacjentów.
Objętość ciała szklistego oka myszy wynosi około 7 μL...

Bakteryjne zapalenie wnętrza gałki ocznej to wyniszczająca infekcja, która powoduje stan zapalny, a jeśli nie jest odpowiednio leczona, może spowodować utratę wzroku lub ślepotę. Zapalenie wnętrza gałki ocznej wynika z wnikania bakterii do wnętrza oka1,2,3,4,5. W oku bakterie namnażają się, wytwarzają toksyny i inne szkodliwe czynniki i mogą powodować nieodwracalne uszkodzenia delikatnych komórek i tkanek siatkówki. Uszkodzenie oczu może być również spowodowane stanem zapalnym, z powodu aktywacji szlaków zapalnych prowadzących do napływu komórek zapalnych do wnętrza oka1,5,6. Zapalenie wnętrza gałki ocznej może wystąpić po operacji wewnątrzgałkowej (po operacji), penetrującym urazie oka (pourazowym) lub w wyniku przerzutowego rozprzestrzenienia się bakterii do oka z innego miejsca anatomicznego (endogennego)7,8,9,10. Leczenie bakteryjnego zapalenia wnętrza gałki ocznej obejmuje antybiotyki, leki przeciwzapalne lub interwencję chirurgiczną3,4,11. Nawet przy tych zabiegach może dojść do utraty wzroku lub samego oka. Rokowanie wzrokowe po bakteryjnym zapaleniu wnętrza gałki ocznej na ogół różni się w zależności od skuteczności leczenia, ostrości wzroku w momencie prezentacji i zjadliwości organizmu infekującego.
Bacillus cereus (B. cereus) jest jednym z głównych patogenów bakteryjnych, które powoduje pourazowe zapalenie wnętrza gałki ocznej7,12. Większość przypadków zapalenia wnętrza gałki ocznej B. cereus ma szybki przebieg, który może prowadzić do ślepoty w ciągu kilku dni. Cechy charakterystyczne zapalenia wnętrza gałki ocznej B. cereus obejmują szybko rozwijające się zapalenie wewnątrzgałkowe, ból oka, szybką utratę ostrości wzroku i gorączkę. B. cereus rośnie szybko w oku w porównaniu z innymi bakteriami, które często powodują infekcje oczu2,4,12 i posiada wiele czynników wirulencji. W związku z tym okno na skuteczną interwencję terapeutyczną jest stosunkowo krótkie1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25. Leczenie tej infekcji jest zwykle skuteczne w leczeniu zapalenia wnętrza gałki ocznej wywołanego przez inne, mniej zjadliwe patogeny, ale zapalenie wnętrza gałki ocznej B. cereus zwykle powoduje u ponad 70% pacjentów cierpiących na znaczną utratę wzroku. Około 50% tych pacjentów przechodzi patroszenie lub enukleację zakażonego oka7,16,22,23. Destrukcyjny i szybki charakter B. cereus endophthalmitis wymaga natychmiastowego i odpowiedniego leczenia. Niedawny postęp w rozpoznawaniu mechanizmów leżących u podstaw rozwoju choroby pozwolił zidentyfikować potencjalne cele interwencji19,26,27. Eksperymentalne mysie modele zapalenia wnętrza gałki ocznej B. cereus są nadal przydatne w rozpoznawaniu mechanizmów infekcji i testowaniu potencjalnych środków terapeutycznych, które mogą zapobiegać utracie wzroku.
Eksperymentalne zakażenie wewnątrzgałkowe myszy B. cereus było instrumentalnym modelem do zrozumienia czynników bakteryjnych i gospodarza, a także ich interakcji, podczas zapalenia wnętrza gałki ocznej28. Model ten naśladuje zdarzenie pourazowe lub pooperacyjne, w którym bakterie są wprowadzane do oka podczas urazu. Model ten jest wysoce powtarzalny i okazał się przydatny do testowania eksperymentalnych terapii i dostarczania danych dotyczących poprawy standardu opieki1,6,19,29,30. Podobnie jak wiele innych modeli infekcji, model ten pozwala na niezależną kontrolę wielu parametrów infekcji oraz umożliwia skuteczne i powtarzalne badanie wyników infekcji. Badania przeprowadzone w podobnym modelu na królikach w ciągu ostatnich kilku dekad dotyczyły wpływu czynników wirulencji B. cereus na oko2,4,13,14,31. Poprzez wstrzyknięcie zmutowanych szczepów B. cereus pozbawionych indywidualnych lub wielu czynników wirulencji, udział tych czynników wirulencji w nasileniu choroby można zmierzyć za pomocą takich wyników, jak stężenie bakterii w różnych godzinach po zakażeniu lub utrata funkcji wzrokowych13,14,27,31,32. Ponadto w tym modelu zbadano czynniki gospodarza poprzez zakażenie nokautujących szczepów myszy pozbawionych specyficznych czynników zapalnych gospodarza26,29,33,34,35. Model jest również przydatny do testowania potencjalnych metod leczenia tej choroby poprzez wstrzykiwanie nowych związków do oka po zakażeniu30,36. W tym manuskrypcie opisujemy szczegółowy protokół, który obejmuje zakażenie oka myszy B. cereus, pobranie oka po infekcji, ilościowe określenie wewnątrzgałkowego obciążenia bakteryjnego i zachowanie próbek w celu oznaczenia dodatkowych parametrów ciężkości choroby.

<table><tbody><tr><td>2-20 i mikro; Pipeta</td><td>L Inkubator RANIN</td><td>L0696003G</td><td>NA</td></tr><tr><td>37oC</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-690-625D</td><td>NA</td></tr><tr><td>Bacto Brain Heart Infusion</td><td>BD</td><td>90003-032</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowstrzykiwacz komórek</td> NA <td>MicroData Instrument, Inc.</td><td>PM2000</td><td>NA</td></tr><tr><td>Kleszczyki z cienką końcówką</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-000-122</td><td>NA</td></tr><tr><td>Koraliki szklane 1,0 mm</td><td>BioSpec</td><td>11079110</td><td>NA</td></tr><tr><td>Wytrząsarka do inkubatora</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>NB-I2400</td><td>NA</td></tr><tr><td>Pipety mikrokapilarne 5 mikrolitrów</td><td>Kimble</td><td>71900-5</td><td>NA</td></tr><tr><td>Mikropipeta Beveler</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BV-10</td><td>NA</td></tr><tr><td>Mikroskop Axiostar Plus</td><td>Zeiss</td><td></td><td>NA</td></tr><tr><td>Mikroskop OPMI Lumera</td><td>Zeiss</td><td></td><td>NA</td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater-16</td><td>BioSpec</td><td>Model 607</td><td>NA</td></tr><tr><td>Pipeta wielokanałowa 30-300 &micro; L</td><td>Pipeta wielokanałowa Biohit</td><td>15626090</td><td>NA</td></tr><tr><td>5-100 &mikro; L</td><td>Biohit</td><td>9143724</td><td>NA</td></tr><tr><td>Ściągacz do igieł/pipet</td><td>Kopf</td><td>730</td><td>NA</td></tr><tr><td>PBS</td><td>GIBCO</td><td></td> 1897315 Koktajl inhibitorów proteazy <td>klasy molekularnej</td></tr><tr><td></td><td>Roche</td><td>4693159001</td><td>Klasa molekularna</td></tr><tr><td>Kleszcze o odwrotnym działaniu</td><td>Katena</td><td>K5-8228</td><td>NA</td></tr></tbody></table>

iniekcja doszklistkowa i ocena ilościowa parametrów infekcji w mysim modelu bakteryjnego zapalenia wnętrza gałki ocznej

Intravitreal Injection and Quantitation of Infection Parameters in a Mouse Model of Bacterial Endophthalmitis

Wewnątrzgałkowe infekcje bakteryjne stanowią zagrożenie dla wzroku. Naukowcy wykorzystują modele zwierzęce do zbadania czynników gospodarza i bakterii oraz szlaków odpowiedzi immunologicznej związanych z infekcją, aby zidentyfikować realne cele terapeutyczne i przetestować leki zapobiegające ślepocie. Technika iniekcji doszklistkowej służy do wstrzykiwania organizmów, leków lub innych substancji bezpośrednio do jamy ciała szklistego w tylnym segmencie oka. Tutaj zademonstrowaliśmy tę technikę wstrzykiwania w celu zainicjowania infekcji w oku myszy oraz technikę ilościowego oznaczania bakterii wewnątrzgałkowych. Bacillus cereus hodowano w płynnej pożywce do infuzji mózgu serca przez 18 godzin i ponownie zawieszono do stężenia 100 jednostek tworzących kolonie (CFU)/0,5 μl. Mysz C57BL/6J została znieczulona przy użyciu kombinacji ketaminy i ksylazyny. Za pomocą mikrowstrzykiwacza pikolitra i szklanych igieł kapilarnych wstrzyknięto 0,5 μl zawiesiny Bacillus do środkowego ciała szklistego oka myszy. Do przeciwległego oka kontrolnego wstrzykiwano sterylne podłoże (kontrola chirurgiczna) lub nie wstrzykiwano go (kontrola bezwzględna). Po 10 godzinach od zakażenia myszy poddano eutanazji, a oczy pobrano za pomocą sterylnej pęsety chirurgicznej i umieszczono w probówce zawierającej 400 μl sterylnego PBS i sterylne szklane koraliki o średnicy 1 mm. W przypadku testów ELISA lub mieloperoksydazy do probówek dodano inhibitor proteinazy. Do ekstrakcji RNA dodano odpowiedni bufor do lizy. Oczy homogenizowano w homogenizatorze tkankowym przez 1-2 minuty. Homogenaty rozcieńczano seryjnie 10-krotnie w PBS i rozcieńczano torem na płytkach agarowych. Pozostałe homogenaty przechowywano w temperaturze -80 °C do dodatkowych testów. Płytki inkubowano przez 24 godziny, a CFU na oko określono ilościowo. Techniki te skutkują powtarzalnymi infekcjami w oczach myszy i ułatwiają ilościowe określanie liczby żywotnych bakterii, odpowiedzi immunologicznej gospodarza oraz omiki ekspresji genów gospodarza i bakterii.

Generowanie powtarzalnego inokulum oraz precyzja procedury wstrzykiwania do ciała szklistego są kluczowymi etapami w opracowywaniu modeli mikrobiologicznego zapalenia wnętrza gałki ocznej. W niniejszej pracy zaprezentowaliśmy procedurę wstrzykiwania do ciała szklistego z wykorzystaniem Gram-dodatnich Bacillus cereus. Wstrzyknięto 100 CFU/0.5 μL B. cereus do środkowej części ciała szklistego u pięciu myszy C57BL6. Po 10 h od zakażenia zaobserwowano wzrost wewnątrzgałkowy B. cereus do poziomu oko...

Opisujemy tutaj metodę iniekcji doszklistkowej i późniejszej oceny ilościowej bakterii w mysim modelu bakteryjnego zapalenia wnętrza gałki ocznej. Protokół ten można rozszerzyć o pomiar odpowiedzi immunologicznej gospodarza oraz ekspresji genów bakteryjnych i gospodarza.

Iniekcja doszklistkowa i ocena ilościowa parametrów infekcji w mysim modelu bakteryjnego zapalenia wnętrza gałki ocznej

Intraocular bacterial infections are a danger to the vision. Researchers use animal models to investigate the host and bacterial factors and immune ...

Nasz protokół pozwala na powtarzalne wprowadzenie mikroorganizmów i środków terapeutycznych do oka myszy w celu zbadania patogenezy infekcji wewnątrzgałkowej i nowej skuteczności leczenia. Nasza technika pozwala na ustalenie zakażeń wewnątrzgałkowych w modelu mysim i ułatwia ilościowe określanie mikroorganizmów, odpowiedzi immunologicznych gospodarza, ekspresji genów gospodarza i patogenu związanych z infekcją oraz nowatorskiej skuteczności leczenia. Wizualizacja miejsca wstrzyknięcia, kąta igły i podania ma kluczowe znaczenie dla pomyślnego wykonania tej techniki, a prawidłowe pobranie oka jest niezbędne do ilościowego określenia parametrów infekcji.W obiekcie o drugim poziomie bezpieczeństwa biologicznego dodaj pięć mililitrów bulionu BHI do 10-mililitrowej probówki z zatrzaskiem i użyj sterylnej pętli, aby przenieść pojedynczą kolonię B.cereus z kultury na płytce ślimakowej do pięciu mililitrów bulionu. Po krótkim wirowaniu inkubować próbkę w inkubatorze obrotowym o temperaturze 37 stopni Celsjusza z prędkością 200 obrotów na minutę przez 18 godzin. Pod koniec inkubacji rozcieńczyć kulturę do 200 jednostek tworzących kolonię na mikrolitr stężenia w 10 mililitrach świeżego BHI, a po wirowaniu dodać jeden mililitr świeżo rozcieńczonej kultury do 1,5 mililitrowej probówki wirówki na lodzie.W przypadku iniekcji doszklistkowej należy włączyć mikrowtryskiwacz i otworzyć zawór gazowy na zbiorniku sprężonego powietrza podłączonym do mikrowtryskiwacza. Naciskaj Mode na mikrowtryskiwaczu, aż na ekranie pojawi się Balance. Naciśnij przycisk Balance i umieść mysz komputerową na stole operacyjnym.Podłącz uchwyt na pipety ze stali nierdzewnej do rurki dołączonej do wyjścia napełniania na wtryskiwaczu i mocno przykręć łącznik uchwytu pipety wokół igły ze ściętą szklaną kapilarną końcówką pipety, aby umożliwić włożenie igły kapilarnej do drugiego końca uchwytu na pipety. Włącz mikroskop okulistyczny i ustaw natężenie światła na 50%Ustaw mikroskop nad miejscem zabiegu i ustaw mikroskop na żądaną ostrość. Po potwierdzeniu braku reakcji na odruch pedałowania, połóż znieczuloną mysz na lewym boku na podkładkach medycznych z nosem skierowanym w prawo.Zlokalizuj prawe oko przez obiektyw mikroskopu okulistycznego i umieść szczypce kleszczy o odwrotnym działaniu po obu stronach oka, aby odsłonić miejsce wstrzyknięcia. Kliknij lewym przyciskiem myszy podłączoną do mikrowstrzykiwacza, aby napełnić przygotowaną igłę kapilarną rozcieńczonym roztworem bakterii, a następnie zabezpieczając głowę lewą ręką, umieść końcówkę igły, skośną stroną do góry, na rąbku oka. Trzymając igłę pod kątem 45 stopni, nakłuj oko, uważając, aby włożono tylko 0,5 milimetra ostrej końcówki igły.Po wkłuciu końcówki igły lewą ręką kliknij prawym przyciskiem myszy na podkładkę pod mysz, aby wstrzyknąć 0,5 mikrolitra roztworu B.cereus. Aby zapobiec wyciekowi, pozostaw końcówkę igły w oku myszy na dwie do trzech sekund przed wyjęciem, a następnie zwolnij kleszcze, a oko samo wróci do oczodołu. Przenieś mysz do klatki regeneracyjnej na podkładce rozgrzewającej z monitorowaniem aż do pełnego położenia.W odpowiednim punkcie końcowym doświadczenia dodać 400 mikrolitrów PBS uzupełnionego inhibitorem proteazy w jednej znakowanej, autoklawowanej probówce do pobierania na oko na lodzie i umieścić otwarte kleszcze z cienką końcówką po obu stronach zakażonego oka. Dociśnij końcówki w dół w kierunku głowy, aby podeprzeć oko. Gdy szczypce znajdą się za kulą oka, ściśnij szczypce razem i odciągnij kleszcze od głowy, aby odłączyć gałkę oczną.Następnie natychmiast umieść gałkę oczną w odpowiednio oznakowanej probówce do pobierania. W ciągu 60 minut od pobrania próbki umieścić zamknięte probówki do pobierania w homogenizatorze tkankowym i homogenizować próbki przez dwa, jednominutowe okresy homogenizacji z 30-sekundowym okresem odpoczynku pomiędzy nimi. Po homogenizacji umieścić próbki na lodzie i użyć 20 mikrolitrowych podwielokrotności homogenatu do seryjnego rozcieńczania próbek w 180 mikrolitrach PBS na rozcieńczenie, aż do osiągnięcia współczynnika 10 razy do minus ósemki.Następnie oznaczyć każdy rząd kwadratowej, wstępnie podgrzanej płytki BHI odpowiednim stężeniem rozcieńczenia, a następnie przy płytce nachylonej pod kątem 45 stopni dodać 10 mikrolitrów każdego rozcieńczenia do oddzielnych rzędów na górze płytki. Pozwól każdej próbce biegać, aż prawie dotrze do dna płytki, zanim położysz płytkę płasko. Gdy próbki zostaną wchłonięte przez agar, przenieś płytkę do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza.Kolonie powinny zacząć być widoczne po ośmiu godzinach inkubacji. Aby uzyskać dokładne odwzorowanie stężenia w próbce, policz wiersz, w którym znajduje się od 10 do 100 kolonii. Konstrukcja skośnej szklanej końcówki igły ma kluczowe znaczenie dla dostarczania bakterii do środkowego ciała szklistego oka myszy.Na tych zdjęciach pokazano Bacillus cereus rosnący na płytce z agarem z krwią oraz w probówkach do hodowli bulionu. Jak pokazano na tym wykresie liczby bakterii międzygałkowych z pięciu różnych oczu myszy w ciągu 10 godzin po zakażeniu, między jednym razy 10 do piątego i jeden razy 10 do siódmego kolonii, jednostki tworzące kolonię bakterii można zwykle odzyskać z jednego zainfekowanego oka. Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać podczas próby tej procedury, jest wstrzyknięcie odpowiedniej ilości bakterii do oka myszy.Po tej procedurze możemy badać stan zapalny za pomocą histologii, mediatory stanu zapalnego za pomocą testu ELISA oraz ekspresję genów za pomocą wysokoprzepustowego sekwencjonowania RNA, aby ułatwić lepsze zrozumienie patogenezy tej choroby.

intravitreal-injection-quantitation-infection-parameters-mouse-model

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film opisuje metodę generowania modelu myszy, który naśladuje bakteryjne zapalenie wnętrza gałki ocznej - infekcję wewnątrzgałkową wynikającą z inwazji bakterii do jamy ciała szklistego oka - poprzez doszklistkowe wstrzyknięcie zawiesiny bakteryjnej do oka. Ten mysi model pomaga badać mechanizm choroby i oceniać terapie dla niej.

Mysi model bakteryjnego zapalenia wnętrza gałki ocznej: metoda generowania bakteryjnego zapalenia wnętrza gałki ocznej poprzez doszklistkowe wstrzyknięcie zawiesiny bakteryjnej do oka myszy

Ten film opisuje technikę ilościowego oznaczania infekcji bakteryjnej na podstawie homogenatów oka uzyskanych z mysiego modelu bakteryjnego zapalenia wnętrza gałki ocznej wywołanego przez Bacillus cereus. Technika ta pomaga badać odpowiedź immunologiczną gospodarza i jej zależność od gospodarza oraz ekspresję genów bakteryjnych oka w modelach mysich.

Test ilościowy infekcji bakteryjnych: metoda ilościowego określania wewnątrzgałkowego obciążenia bakteryjnego w mysim modelu bakteryjnego zapalenia wnętrza gałki ocznej

Ten film demonstruje metodę generowania mysiego modelu mysiego zapalenia błony naczyniowej oka (PMU) do badania poinfekcyjnego zapalenia błony naczyniowej oka. Po indukcji PMU przez wstrzyknięcie do ciała szklistego zabitych termicznie Mycobacterium tuberculosis u myszy uprzednio uodpornionej tym samym immunogenem, postęp przewlekłego stanu zapalnego w oku jest analizowany za pomocą obrazowania i badania...

Mysi model prątkowego zapalenia błony naczyniowej oka do badania poinfekcyjnego zapalenia błony naczyniowej oka

Ten film demonstruje technikę obrazowania in vivo do wykrywania i ilościowego określania stanu zapalnego oka w mysim modelu poinfekcyjnego zapalenia błony naczyniowej oka. Technika ta, znana jako optyczna tomografia koherentna (OCT), generuje obrazy przekroju poprzecznego oka o wysokiej rozdzielczości w celu oceny postępu choroby.

Obrazowanie optycznej koherentnej tomografii do oceny zapalenia błony naczyniowej oka w modelu mysim

Ten film demonstruje cytometrię przepływową do pomiaru wychwytu mikrogleju przez fluorescencyjne biocząstki po dostrzodowisku do ciała szklistego w oku myszy. Cytometria przepływowa wykrywa żywe komórki wykazujące ekspresję CD11b i odróżnia fagocytarne komórki mikrogleju wykazujące zieloną fluorescencję od innych komórek szpikowych, w tym monocytów eksprymujących Ly6C i neutrofili wykazujących ekspresję Ly6G.

Pomiar wychwytu mikrogleju przez cząstki fluorescencyjne dostarczane do ciała szklistkowego za pomocą cytometrii przepływowej

Źródło: Park, S. W., et al. Podejście rąbkowe - podsiatkówkowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych do terapii genowej u myszy nabłonek barwnikowy siatkówki. J. Vis. Exp. (2015)Film opisuje metodę podsiatkówkowego wstrzykiwania wektorów wirusowych do nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) w modelu mysim. Szczegółowo opisano w nim procedurę, od znieczulenia i przygotowania oka po precyzyjne dostarczenie wektora lentiwirusowego, zapewniając integrację i ekspresję genów w RPE.

Podsiatkówkowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych do nabłonka barwnikowego siatkówki w modelu mysim

Fagocytoza mikrogleju jest kluczowa dla utrzymania homeostazy tkanek, a nieodpowiednia funkcja fagocytarna została zamieszana w patologię. Jednak ocena funkcji mikrogleju in vivo jest technicznie trudna. Opracowaliśmy prostą, ale solidną technikę precyzyjnego monitorowania i ilościowego określania potencjału fagocytarnego mikrogleju w warunkach fizjologicznych.

Ocena funkcji fagocytarnej mikrogleju siatkówki in vivo przy użyciu testu opartego na cytometrii przepływowej

W tym raporcie prezentujemy protokół, który pozwala badaczowi na wygenerowanie mysiego modelu wewnątrzgałkowego zapalenia błony naczyniowej oka. Ten uznany model, częściej określany jako eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie błony naczyniowej oka (EAU), obejmuje wiele aspektów chorób u ludzi. W tym miejscu opiszemy, jak indukować i monitorować postęp choroby za pomocą kilku odczytów.

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie błony naczyniowej oka: wewnątrzgałkowy model zapalny myszy

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem do badania biologii w zdrowiu i chorobie. Protokół ten opisuje obrazowanie przezźrenicowe siatkówki myszy za pomocą standardowego mikroskopu dwufotonowego. Zademonstrowano również różne metody obrazowania in vivo, które umożliwiają fluorescencyjne znakowanie wielu kohort komórkowych siatkówki.

Przezźrenicowe dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy

Ten protokół opisuje kroki do wywołania Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) u myszy. Ta metoda przedstawia kroki, które pomogą w wytworzeniu niezawodnego i solidnego zapalenia oka w systemie modelu mysiego. Korzystając z tego protokołu, wygenerowaliśmy oczy błony naczyniowej oka i nieobjęte stanem zapalnym inne oczy od pojedynczych zwierząt w celu dalszej oceny za pomocą testów immunologicznych, transkryptomicznych i proteomicznych.

Przygotowanie mykobakteryjnego zapalenia błony naczyniowej oka (PMU) jako model poinfekcyjnego zapalenia błony naczyniowej oka

Ten protokół pokazuje, jak określić ilościowo skuteczność transdukcji AAV w siatkówce myszy za pomocą cyfrowego kropelkowego PCR (dd-PCR) wraz z produkcją AAV na małą skalę, iniekcją doszklistkową, obrazowaniem siatkówki i izolacją genomowego DNA siatkówki.

Cyfrowa metoda kropelkowej PCR do ilościowego oznaczania skuteczności transdukcji AAV w siatkówce myszy

Poznaj metodę iniekcji doszklistkowej i ilościowej oceny infekcji w mysim modelu bakteryjnego zapalenia wnętrza gałki ocznej. Technika umożliwia badanie patogenezy zakażeń wewnątrzgałkowych oraz skuteczności nowych terapii.

Iniekcja doszklistkowa i ocena ilościowa parametrów infekcji w mysim modelu bakteryjnego zapalenia wnętrza gałki ocznej

Przeglądaj więcej filmów