Iniekcja doszklistkowa i ocena ilościowa parametrów infekcji w mysim modelu bakteryjnego zapalenia wnętrza gałki ocznej

Nasz protokół pozwala na powtarzalne wprowadzenie mikroorganizmów i środków terapeutycznych do oka myszy w celu zbadania patogenezy infekcji wewnątrzgałkowej i nowej skuteczności leczenia. Nasza technika pozwala na ustalenie zakażeń wewnątrzgałkowych w modelu mysim i ułatwia ilościowe określanie mikroorganizmów, odpowiedzi immunologicznych gospodarza, ekspresji genów gospodarza i patogenu związanych z infekcją oraz nowatorskiej skuteczności leczenia. Wizualizacja miejsca wstrzyknięcia, kąta igły i podania ma kluczowe znaczenie dla pomyślnego wykonania tej techniki, a prawidłowe pobranie oka jest niezbędne do ilościowego określenia parametrów infekcji.

W obiekcie o drugim poziomie bezpieczeństwa biologicznego dodaj pięć mililitrów bulionu BHI do 10-mililitrowej probówki z zatrzaskiem i użyj sterylnej pętli, aby przenieść pojedynczą kolonię B.cereus z kultury na płytce ślimakowej do pięciu mililitrów bulionu. Po krótkim wirowaniu inkubować próbkę w inkubatorze obrotowym o temperaturze 37 stopni Celsjusza z prędkością 200 obrotów na minutę przez 18 godzin. Pod koniec inkubacji rozcieńczyć kulturę do 200 jednostek tworzących kolonię na mikrolitr stężenia w 10 mililitrach świeżego BHI, a po wirowaniu dodać jeden mililitr świeżo rozcieńczonej kultury do 1,5 mililitrowej probówki wirówki na lodzie.

W przypadku iniekcji doszklistkowej należy włączyć mikrowtryskiwacz i otworzyć zawór gazowy na zbiorniku sprężonego powietrza podłączonym do mikrowtryskiwacza. Naciskaj Mode na mikrowtryskiwaczu, aż na ekranie pojawi się Balance. Naciśnij przycisk Balance i umieść mysz komputerową na stole operacyjnym.

Podłącz uchwyt na pipety ze stali nierdzewnej do rurki dołączonej do wyjścia napełniania na wtryskiwaczu i mocno przykręć łącznik uchwytu pipety wokół igły ze ściętą szklaną kapilarną końcówką pipety, aby umożliwić włożenie igły kapilarnej do drugiego końca uchwytu na pipety. Włącz mikroskop okulistyczny i ustaw natężenie światła na 50%Ustaw mikroskop nad miejscem zabiegu i ustaw mikroskop na żądaną ostrość. Po potwierdzeniu braku reakcji na odruch pedałowania, połóż znieczuloną mysz na lewym boku na podkładkach medycznych z nosem skierowanym w prawo.

Zlokalizuj prawe oko przez obiektyw mikroskopu okulistycznego i umieść szczypce kleszczy o odwrotnym działaniu po obu stronach oka, aby odsłonić miejsce wstrzyknięcia. Kliknij lewym przyciskiem myszy podłączoną do mikrowstrzykiwacza, aby napełnić przygotowaną igłę kapilarną rozcieńczonym roztworem bakterii, a następnie zabezpieczając głowę lewą ręką, umieść końcówkę igły, skośną stroną do góry, na rąbku oka. Trzymając igłę pod kątem 45 stopni, nakłuj oko, uważając, aby włożono tylko 0,5 milimetra ostrej końcówki igły.

Po wkłuciu końcówki igły lewą ręką kliknij prawym przyciskiem myszy na podkładkę pod mysz, aby wstrzyknąć 0,5 mikrolitra roztworu B.cereus. Aby zapobiec wyciekowi, pozostaw końcówkę igły w oku myszy na dwie do trzech sekund przed wyjęciem, a następnie zwolnij kleszcze, a oko samo wróci do oczodołu. Przenieś mysz do klatki regeneracyjnej na podkładce rozgrzewającej z monitorowaniem aż do pełnego położenia.

W odpowiednim punkcie końcowym doświadczenia dodać 400 mikrolitrów PBS uzupełnionego inhibitorem proteazy w jednej znakowanej, autoklawowanej probówce do pobierania na oko na lodzie i umieścić otwarte kleszcze z cienką końcówką po obu stronach zakażonego oka. Dociśnij końcówki w dół w kierunku głowy, aby podeprzeć oko. Gdy szczypce znajdą się za kulą oka, ściśnij szczypce razem i odciągnij kleszcze od głowy, aby odłączyć gałkę oczną.

Następnie natychmiast umieść gałkę oczną w odpowiednio oznakowanej probówce do pobierania. W ciągu 60 minut od pobrania próbki umieścić zamknięte probówki do pobierania w homogenizatorze tkankowym i homogenizować próbki przez dwa, jednominutowe okresy homogenizacji z 30-sekundowym okresem odpoczynku pomiędzy nimi. Po homogenizacji umieścić próbki na lodzie i użyć 20 mikrolitrowych podwielokrotności homogenatu do seryjnego rozcieńczania próbek w 180 mikrolitrach PBS na rozcieńczenie, aż do osiągnięcia współczynnika 10 razy do minus ósemki.

Następnie oznaczyć każdy rząd kwadratowej, wstępnie podgrzanej płytki BHI odpowiednim stężeniem rozcieńczenia, a następnie przy płytce nachylonej pod kątem 45 stopni dodać 10 mikrolitrów każdego rozcieńczenia do oddzielnych rzędów na górze płytki. Pozwól każdej próbce biegać, aż prawie dotrze do dna płytki, zanim położysz płytkę płasko. Gdy próbki zostaną wchłonięte przez agar, przenieś płytkę do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Kolonie powinny zacząć być widoczne po ośmiu godzinach inkubacji. Aby uzyskać dokładne odwzorowanie stężenia w próbce, policz wiersz, w którym znajduje się od 10 do 100 kolonii. Konstrukcja skośnej szklanej końcówki igły ma kluczowe znaczenie dla dostarczania bakterii do środkowego ciała szklistego oka myszy.

Na tych zdjęciach pokazano Bacillus cereus rosnący na płytce z agarem z krwią oraz w probówkach do hodowli bulionu. Jak pokazano na tym wykresie liczby bakterii międzygałkowych z pięciu różnych oczu myszy w ciągu 10 godzin po zakażeniu, między jednym razy 10 do piątego i jeden razy 10 do siódmego kolonii, jednostki tworzące kolonię bakterii można zwykle odzyskać z jednego zainfekowanego oka. Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać podczas próby tej procedury, jest wstrzyknięcie odpowiedniej ilości bakterii do oka myszy.

Po tej procedurze możemy badać stan zapalny za pomocą histologii, mediatory stanu zapalnego za pomocą testu ELISA oraz ekspresję genów za pomocą wysokoprzepustowego sekwencjonowania RNA, aby ułatwić lepsze zrozumienie patogenezy tej choroby.