Ocena funkcji fagocytarnej mikrogleju siatkówki in vivo przy użyciu testu opartego na cytometrii przepływowej

Ogólnym celem tej procedury jest ocena funkcji fagocytarnych mikrogleju siatkówki in vivo. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie okulistyki, np. czy określone związki zmieniają funkcję fagocytarną mikrogleju w warunkach fizjologicznych. Główną zaletą tej techniki jest wykorzystanie cytometrii przepływowej, co umożliwia szybką i precyzyjną analizę ilościową fagocytozy mikrogleju.

W zademonstrowaniu procedury pomoże mi Susumu Sakimoto, postdoc z mojego laboratorium. Należy rozpocząć od nabrania do strzykawki z igłą o rozmiarze 33G 0,5 µl roztworu cząsteczek znakowanych fluorescencyjnie. Następnie zaniesioną mysz ułożyć bokiem na miękkim materiale pod mikroskopem chirurgicznym i potwierdzić odpowiedni poziom sedacji poprzez brak reakcji na uciśnięcie palca u stopy.

Następnie za pomocą pęsety należy ostrożnie wywrzeć nacisk wokół jednej powieki, tak aby gałka oczna lekko wysunęła się z oczodołu. Następnie należy chwycić głowę dwoma palcami tuż nad uchem oraz za żuchwę zwierzęcia i delikatnie naciągnąć skórę równolegle do powiek, aby utrzymać oko w lekkim wysunięciu z oczodołu. Iniekcje dopłuczne są wymagające i jeśli nie zostaną wykonane prawidłowo, doprowadzą do stronniczych i zmiennych wyników.

Aby zminimalizować uraz oka, należy utrzymać zwierzę w stabilnej pozycji, ograniczając ruchy głowy do minimum. W celu nakłucia gałki ocznej, delikatnie chwyć mysz jedną ręką. Następnie zlokalizuj limbus rogówki, miejsce połączenia rogówki z twardówką, który u myszy pigmentowanych jest widoczny jako szary okrąg.

Trzymając strzykawkę w drugiej ręce, wprowadź igłę do obrąbka rogówki. Następnie lekko wycofaj igłę, aby pobrać niewielką objętość ciała szklistego, i powoli dociśnij tłok, aby wstrzyknąć cząsteczki. Po podaniu wszystkich kuleczek powoli wyjmij strzykawkę, aby uniknąć refluksu wstrzykniętego materiału, a następnie zastosuj krople nawilżające, aby utrzymać nawilżenie oka po jego powrocie na miejsce.

Następnie umieść zwierzę w jego klatce na podkładce grzewczej i monitoruj jego stan aż do pełnego wyzdrowienia. Trzy godziny po iniekcji do ciała szklistego użyj pęsety pod kątem 45 stopni, aby delikatnie nacisnąć powiekę i doprowadzić do proptozy gałki ocznej. Umieść pęsetę za gałką oczną i pociągnij.

Następnie przenieś gałkę oczną pod mikroskop stereoskopowy do suchego obszaru szalki Petriego zawierającej niewielką objętość PBS z wapniem i magnezem. Użyj jednej końcówki superprecyzyjnych pęsety, aby przebić oko w obrębie limbusa rogówki. Następnie, trzymając gałkę oczną za pomocą precyzyjnej pęsety wygiętej pod kątem 45 stopni, użyj nożyczek sprężynowych, aby wyciąć obszar wokół limbusa rogówki, aż zostanie wycięte około połowy obwodu.

Przenieś gałkę oczną do PBS i za pomocą drugiej pary precyzyjnych pęset kątowych 45 stopni rozdziel rogówkę od twardówki. Soczewka i siatkówka zostaną wyjęte w całości. Upewnij się, że soczewka i siatkówka są odseparowane, a następnie przenieś siatkówkę do polistyrenowej probówki o pojemności 5,4 ml, zawierającej dwa mililitry PBS z wapniem i magnezem.

Aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek siatkówki, należy zastosować zestaw do dysocjacji tkanki neuronalnej zgodnie z instrukcją producenta, a następnie resuspendować komórki w 200 µL buforu barwiącego. Następnie próbkę przenosi się do jednego dołka płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery U. Po odwirowaniu należy odwrócić płytkę, aby usunąć nadsącz, a następnie zablokować receptory FC, dodając 25 µL buforu barwiącego zawierającego przeciwciała CD16 i CD32 do każdego dołka i inkubując przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Następnie należy znakować komórki odpowiednimi przeciwciałami przez 15 minut w temperaturze pokojowej, w ciemności. Potem należy odwirować komórki i przeprowadzić przemywanie w 200 µL świeżego buforu do barwienia na studzienkę. Teraz należy resuspender osad w 200 µL buforu do barwienia z dodatkiem barwnika żywotności i przenieść próbki do mikroprobówek o objętości 1,2 mL.

Następnie należy przemyć studzienki dodatkowymi 100 µL buforu barwiącego i barwnika żywotności, a następnie połączyć płukania z odpowiadającymi im próbkami w celu analizy metodą cytometrii przepływowej. Metodę tę można stosować u myszy postnatalnych w wieku od 10 do 20 dni lub u myszy dorosłych, a także dostosować do badania wpływu związków i/lub manipulacji genetycznych na fagocytozę mikrogleju. Na przykład w niniejszym doświadczeniu, po wyzwaniu wewnątrzbrzusznym różnymi dawkami LPS, stwierdzono, że dawka 1,42 mg/kg LPS indukuje statystycznie istotny wzrost odsetka fagocytujących mikroglejów w porównaniu z grupą kontrolną poddaną działaniu nośnika.

Po opanowaniu ta technika może zostać zrealizowana w ciągu sześciu godzin, pod warunkiem właściwego jej wykonania. Po zastosowaniu tej procedury można wykorzystać inne metody, takie jak sortowanie komórek z późniejszą analizą qPCR lub analiza proteomiczna, aby odpowiedzieć na dalsze pytania dotyczące różnic między mikroglejem fagocytującym a niefagocytującym w siatkówce. Opracowując tę technikę, zakładamy, że umożliwimy badaczom wzroku i neuronauk dalsze zgłębianie funkcji fagocytycznej mikrogleju in situ oraz w kontekście fizjologicznie istotnym.