Ocena funkcji fagocytarnej mikrogleju siatkówki in vivo przy użyciu testu opartego na cytometrii przepływowej

Ogólnym celem tej procedury jest ocena funkcji fagocytarnej mikrogleju siatkówki in vivo. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie okulistyki, takie jak to, czy niektóre związki zmieniają funkcję fagocytarną mikrogleju w warunkach fizjologicznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje cytometrię przepływową, umożliwiając szybką i precyzyjną analizę ilościową fagocytozy mikrogleju.

W zademonstrowaniu procedury pomoże mi Susumu Sakimoto, doktor habilitowany z mojego laboratorium. Zacznij od załadowania igły i strzykawki o rozmiarze 33 z 0,5 mikrolitra fluorescencyjnie znakowanego roztworu cząstek. Następnie umieść znieczuloną mysz bokiem na miękkim materiale pod mikroskopem chirurgicznym i potwierdź odpowiedni poziom sedacji poprzez brak reakcji na uszczypnięcie palca.

Następnie za pomocą kleszczy ostrożnie dociśnij okolice jednej powieki, tak aby gałka oczna lekko wysunęła się z oczodołu. Następnie chwyć głowę dwoma palcami tuż nad uchem i za szczękę zwierzęcia i delikatnie rozciągnij skórę równolegle do powiek, aby oko było lekko wybrzuszone z oczodołu. Zastrzyki doszklistkowe są trudne, a jeśli nie zostaną wykonane prawidłowo, doprowadzą do stronniczych i zmiennych wyników.

Aby zmniejszyć uraz oka, trzymaj zwierzę w stabilnej pozycji przy minimalnym ruchu głowy. Aby przebić gałkę oczną, delikatnie chwyć mysz jedną ręką. Następnie zlokalizuj rąbek rogówki, w którym łączą się rogówka i twardówka, co jest widoczne jako szare kółko u myszy pigmentowanych.

Trzymając strzykawkę w drugiej ręce, wbić igłę w rąbek. Następnie lekko cofnąć igłę, aby usunąć niewielką objętość płynu szklistego, i powoli wcisnąć tłok, aby wstrzyknąć cząstki. Po dostarczeniu wszystkich kulek powoli wyjmij strzykawkę, aby uniknąć refluksu wstrzykniętego materiału i nałóż krople nawilżające, aby utrzymać nawilżenie oka, gdy oko cofnie się z powrotem na miejsce.

Następnie umieść zwierzę na poduszce grzewczej we własnej klatce z monitorowaniem, aż w pełni wyzdrowieje. Trzy godziny po wstrzyknięciu do ciała szklistego należy użyć kleszczyków pod kątem 45 stopni, aby delikatnie docisnąć do powieki, aby podeprzeć gałkę oczną. Umieść kleszcze za gałką oczną i pociągnij.

Następnie przenieś gałkę oczną do suchego obszaru płytki Petriego, zawierającej niewielką objętość PBS z wapniem i magnezem pod mikroskopem preparacyjnym. I użyj jednej końcówki bardzo cienkich kleszczy, aby przebić oko w rąbku rogówki. Następnie, trzymając gałkę oczną cienkimi kleszczami pod kątem 45 stopni, użyj nożyczek sprężynowych, aby przeciąć wokół rąbka rogówki, aż zostanie przecięta mniej więcej połowa obwodu.

Przenieś gałkę oczną do PBS i użyj drugiej pary cienkich kleszczy pod kątem 45 stopni, aby rozerwać rogówkę i twardówkę. Soczewka i siatkówka wyjdą nienaruszone. Upewnij się, że soczewka i siatkówka są oddzielone i przenieś siatkówkę do 5.4 mililitrowej probówki z polistyrenu, zawierającej dwa mililitry PBS z wapniem i magnezem.

Aby uzyskać jednokomórkową zawiesinę komórek siatkówki, należy użyć zestawu do dysocjacji tkanki neuronalnej zgodnie z instrukcjami producenta i ponownie zawiesić komórki w 200 mikrolitrach buforu barwiącego. Następnie przenieść próbkę do jednego dołka z 96-dołkowej płytki dolnej w kształcie litery U. Po odwirowaniu odwrócić płytkę, aby odrzucić supernatant i zablokować receptory FC za pomocą 25 mikrolitrów buforu barwiącego zawierającego przeciwciało CD16, CD32 na studzienkę przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Następnie znakuj komórki interesującymi je przeciwciałami przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Następnie otocz komórki, a następnie przemyj je w 200 mikrolitrach świeżego buforu barwiącego na studzienkę. Teraz ponownie zawieś granulki w 200 mikrolitrach buforu barwiącego i barwnika żywotności, a następnie przenieś próbki do 1,2 mililitrowych probówek do mikromiareczkowania.

Następnie umyj studzienki dodatkowymi 100 mikrolitrami buforu barwiącego i barwnika żywotności, a następnie połącz popłuczyny z odpowiednimi próbkami do analizy za pomocą cytometrii przepływowej. Metoda ta może być stosowana u myszy w wieku od 10 do 20 dni po urodzeniu lub dorosłych i może być dostosowana do testowania wpływu związków i / lub manipulacji genetycznej fagocytozy mikrogleju. Na przykład w tym eksperymencie po prowokacji dootrzewnowej z różnymi dawkami LPS, określono dawkę 1,42 miligrama LPS na kilogram, aby wywołać statystycznie istotny wzrost odsetka mikrogleju fagocytarnego w porównaniu z kontrolami z podłożem.

Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w ciągu sześciu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak sortowanie komórek, a następnie qPCR lub analiza proteomiczna, aby odpowiedzieć na dalsze pytania dotyczące różnic między mikroglejem fagocytarnym i niefagocytarnym w siatkówce. Spodziewamy się, że opracowując tę technikę, będziemy mogli umożliwić naukowcom zajmującym się wzrokiem i neurologią dalsze badanie funkcji fagocytarnych mikrogleju in situ i w fizjologicznie istotnym kontekście.