Ocena funkcji fagocytarnej mikrogleju siatkówki in vivo przy użyciu testu opartego na cytometrii przepływowej
October 18th, 2016
Fagocytoza mikrogleju jest kluczowa dla utrzymania homeostazy tkanek, a nieodpowiednia funkcja fagocytarna została zamieszana w patologię. Jednak ocena funkcji mikrogleju in vivo jest technicznie trudna. Opracowaliśmy prostą, ale solidną technikę precyzyjnego monitorowania i ilościowego określania potencjału fagocytarnego mikrogleju w warunkach fizjologicznych.
Ogólnym celem tej procedury jest ocena funkcji fagocytarnej mikrogleju siatkówki in vivo. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie okulistyki, takie jak to, czy niektóre związki zmieniają funkcję fagocytarną mikrogleju w warunkach fizjologicznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje cytometrię przepływową, umożliwiając szybką i precyzyjną analizę ilościową fagocytozy mikrogleju.
W zademonstrowaniu procedury pomoże mi Susumu Sakimoto, doktor habilitowany z mojego laboratorium. Zacznij od załadowania igły i strzykawki o rozmiarze 33 z 0,5 mikrolitra fluorescencyjnie znakowanego roztworu cząstek. Następnie umieść znieczuloną mysz bokiem na miękkim materiale pod mikroskopem chirurgicznym i potwierdź odpowiedni poziom sedacji poprzez brak reakcji na uszczypnięcie palca.
Następnie za pomocą kleszczy ostrożnie dociśnij okolice jednej powieki, tak aby gałka oczna lekko wysunęła się z oczodołu. Następnie chwyć głowę dwoma palcami tuż nad uchem i za szczękę zwierzęcia i delikatnie rozciągnij skórę równolegle do powiek, aby oko było lekko wybrzuszone z oczodołu. Zastrzyki doszklistkowe są trudne, a jeśli nie zostaną wykonane prawidłowo, doprowadzą do stronniczych i zmiennych wyników.
Aby zmniejszyć uraz oka, trzymaj zwierzę w stabilnej pozycji przy minimalnym ruchu głowy. Aby przebić gałkę oczną, delikatnie chwyć mysz jedną ręką. Następnie zlokalizuj rąbek rogówki, w którym łączą się rogówka i twardówka, co jest widoczne jako szare kółko u myszy pigmentowanych.
Trzymając strzykawkę w drugiej ręce, wbić igłę w rąbek. Następnie lekko cofnąć igłę, aby usunąć niewielką objętość płynu szklistego, i powoli wcisnąć tłok, aby wstrzyknąć cząstki. Po dostarczeniu wszystkich kulek powoli wyjmij strzykawkę, aby uniknąć refluksu wstrzykniętego materiału i nałóż krople nawilżające, aby utrzymać nawilżenie oka, gdy oko cofnie się z powrotem na miejsce.
Następnie umieść zwierzę na poduszce grzewczej we własnej klatce z monitorowaniem, aż w pełni wyzdrowieje. Trzy godziny po wstrzyknięciu do ciała szklistego należy użyć kleszczyków pod kątem 45 stopni, aby delikatnie docisnąć do powieki, aby podeprzeć gałkę oczną. Umieść kleszcze za gałką oczną i pociągnij.
Następnie przenieś gałkę oczną do suchego obszaru płytki Petriego, zawierającej niewielką objętość PBS z wapniem i magnezem pod mikroskopem preparacyjnym. I użyj jednej końcówki bardzo cienkich kleszczy, aby przebić oko w rąbku rogówki. Następnie, trzymając gałkę oczną cienkimi kleszczami pod kątem 45 stopni, użyj nożyczek sprężynowych, aby przeciąć wokół rąbka rogówki, aż zostanie przecięta mniej więcej połowa obwodu.
Przenieś gałkę oczną do PBS i użyj drugiej pary cienkich kleszczy pod kątem 45 stopni, aby rozerwać rogówkę i twardówkę. Soczewka i siatkówka wyjdą nienaruszone. Upewnij się, że soczewka i siatkówka są oddzielone i przenieś siatkówkę do 5.4 mililitrowej probówki z polistyrenu, zawierającej dwa mililitry PBS z wapniem i magnezem.
Aby uzyskać jednokomórkową zawiesinę komórek siatkówki, należy użyć zestawu do dysocjacji tkanki neuronalnej zgodnie z instrukcjami producenta i ponownie zawiesić komórki w 200 mikrolitrach buforu barwiącego. Następnie przenieść próbkę do jednego dołka z 96-dołkowej płytki dolnej w kształcie litery U. Po odwirowaniu odwrócić płytkę, aby odrzucić supernatant i zablokować receptory FC za pomocą 25 mikrolitrów buforu barwiącego zawierającego przeciwciało CD16, CD32 na studzienkę przez pięć minut w temperaturze pokojowej.
Następnie znakuj komórki interesującymi je przeciwciałami przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Następnie otocz komórki, a następnie przemyj je w 200 mikrolitrach świeżego buforu barwiącego na studzienkę. Teraz ponownie zawieś granulki w 200 mikrolitrach buforu barwiącego i barwnika żywotności, a następnie przenieś próbki do 1,2 mililitrowych probówek do mikromiareczkowania.
Następnie umyj studzienki dodatkowymi 100 mikrolitrami buforu barwiącego i barwnika żywotności, a następnie połącz popłuczyny z odpowiednimi próbkami do analizy za pomocą cytometrii przepływowej. Metoda ta może być stosowana u myszy w wieku od 10 do 20 dni po urodzeniu lub dorosłych i może być dostosowana do testowania wpływu związków i / lub manipulacji genetycznej fagocytozy mikrogleju. Na przykład w tym eksperymencie po prowokacji dootrzewnowej z różnymi dawkami LPS, określono dawkę 1,42 miligrama LPS na kilogram, aby wywołać statystycznie istotny wzrost odsetka mikrogleju fagocytarnego w porównaniu z kontrolami z podłożem.
Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w ciągu sześciu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak sortowanie komórek, a następnie qPCR lub analiza proteomiczna, aby odpowiedzieć na dalsze pytania dotyczące różnic między mikroglejem fagocytarnym i niefagocytarnym w siatkówce. Spodziewamy się, że opracowując tę technikę, będziemy mogli umożliwić naukowcom zajmującym się wzrokiem i neurologią dalsze badanie funkcji fagocytarnych mikrogleju in situ i w fizjologicznie istotnym kontekście.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
W tym artykule przedstawiona jest nowa technika oceny funkcji fagocytarnej mikrogleju siatkówki in vivo. Wykorzystując cytometrię przepływową, badacze mogą osiągnąć szybką i precyzyjną analizę ilościową fagocytozy mikrogleju, co jest niezbędne do zrozumienia homeostazy tkanki i patologii.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Oftalmologia
- Biologia komórkowa
Wprowadzenie
- Fagocytoza mikrogleju jest niezbędna do utrzymania homeostazy tkanki.
- Niewystarczająca funkcja fagocytarna wiąże się z różnymi patologiami.
- Ocena funkcji mikrogleju in vivo stwarza wyzwania techniczne.
- Cytometria przepływowa oferuje solidną metodę analizy.
Cel badania
- Ocena funkcji fagocytarnej mikrogleju siatkówki w warunkach fizjologicznych.
- Określenie wpływu specyficznych związków na fagocytozę mikrogleju.
- Dostarczenie niezawodnej metody do przyszłych badań w oftalmologii.
Wykorzystane metody
- Napełnianie igłą o średnicy 33 gauge roztworem oznaczonych fluorescencyjnie cząstek.
- Wykorzystanie mikroskopu chirurgicznego do precyzyjnej obserwacji.
- Monitorowanie unieśpionego myszy w celu zapewnienia prawidłowego sedacji.
- Zastosowanie cytometrii przepływowej do analizy ilościowej.
Główne wyniki
- Technika umożliwia dokładny pomiar fagocytozy mikrogleju.
- Cytometria przepływowa zapewnia szybkie wyniki w porównaniu z tradycyjnymi metodami.
- Można ocenić potencjalny wpływ związków na funkcję fagocytarną.
- Metoda ta zwiększa zrozumienie roli mikrogleju w zdrowiu i chorobie.
Wnioski
- Opracowana technika stanowi znaczący postęp w badaniu funkcji mikrogleju.
- Otwiera nowe możliwości badań w neurozapaleniu i zdrowiu siatkówki.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać tę metodę do badania interwencji terapeutycznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of retinal microglial phagocytic function using flow cytometry addresses a critical gap in CNS target validation and mechanistic de-risking for neuroinflammatory and neurodegenerative disease pipelines. This approach enables precise, reproducible measurement of microglial activity in physiologically relevant settings, supporting predictive confidence in early discovery and translational research. The method's adaptability and speed facilitate robust compound evaluation and portfolio triage for CNS and ophthalmology programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of microglial phagocytic function in vivo for target validation.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying functional responses to genetic or pharmacological perturbations.
- Facilitates predictive confidence in CNS and retinal disease models by providing quantitative readouts.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, physiologically relevant microglial systems for downstream compound screening.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative phagocytosis measurements via flow cytometry.
- Enables rapid assessment of compound effects on microglial function, supporting scalable screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for translational biomarker development in neurodegeneration and retinal disorders.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling in vivo functional assays.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on quantitative microglial activity data.
Pipeline & Workflow Integration
This flow cytometry-based assay integrates into the discovery-to-preclinical continuum, enabling hypothesis testing, compound screening, and translational research in CNS and ophthalmology pipelines.
- Discovery Biology: Quantifies microglial phagocytosis to clarify pathway function and de-risk biological hypotheses.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for compound evaluation in validated in vivo systems.
- Analytics: Generates statistically robust measurements for comparing experimental conditions and compound effects.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical studies by enabling functional biomarker alignment in disease-relevant models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform adaptable to various CNS and retinal research applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in microglial target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, rapid, and scalable phagocytosis assays for cross-team use.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust functional data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of CNS and ophthalmology assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in rodent ocular procedures and flow cytometry analysis.
- Needs access to surgical microscopes, flow cytometers, and validated antibody panels.
- Demands cross-team standardization of injection and analysis protocols for reproducibility.
- Adaptable to different rodent ages and potentially other CNS tissues with protocol optimization.
- Dependent on precise intravitreal injection technique to minimize variability and bias.
