Name: Ocena funkcji fagocytarnej mikrogleju siatkówki in vivo przy użyciu testu opartego na cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Poznaj metodę oceny fagocytozy mikrogleju siatkówki in vivo przy użyciu cytometrii przepływowej. Technika umożliwia szybką i precyzyjną analizę ilościową, co jest kluczowe dla badań nad homeostazą tkankową i patologią siatkówki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Salome Murinello jest wspierana przez grant Amerykańskiego Towarzystwa Diabetologicznego #1-16-PDF-072. Prace te były wspierane przez granty dla Martina Friedlandera z National Institutes of Health (National Eye Institute EY11254 i EY22025) oraz Lowy Medical Research Institute.

Wszystkie zwierzęta były leczone zgodnie z wytycznymi etycznymi ustalonymi przez Instytut Badawczy Scripps.
1. Przygotowanie materiałów do iniekcji
<ol>
	<li>Wysterylizować igłę i strzykawkę o strzale 33 G: zdemontować i sterylizować w autoklawie w temperaturze 115 οC. Przygotować igły do wstrzykiwań, podnosząc je w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
	<li>Rozmrażać fluorescencyjnie znakowane cząstki w temperaturze pokojowej przez 5 - 10 minut. Przygotować roztwór cząstek do wstrzykiwań, rozpuszczając do roztworu 50 mg/ml w sterylnym PBS z Ca2+/Mg2+, 
	UWAGA: Cząstki pochodzenia grzybowego znakowane AF488, które zostały zwalidowane do testów fagocytozy, są używane w tym protokole21-23. Aby uzyskać optymalne wchłanianie, należy przygotować cząsteczki świeże i bezpośrednio przed wstrzyknięciem. 
	Uwaga 2: Stężenia cząstek mogą być zoptymalizowane dla każdego konkretnego eksperymentu.</li>
</ol>
2. Doszklistkowe wstrzykiwanie roztworu kulek
UWAGA: Do wykonania wstrzyknięcia wymagane są dwie osoby w taki sposób, aby osoba wykonująca wstrzyknięcie mogła trzymać mysz i utrzymywać ostrość na gałce ocznej, podczas gdy druga osoba podaje załadowaną strzykawkę i naciska tłok.
<ol>
	<li>Znieczulić gryzonia przez wstrzyknięcie dootrzewnowe 100 mg/ml ketaminy i 10 mg/ml ksylazyny w dawce 20 μl/10 g masy ciała. Przed wstrzyknięciem należy użyć szczypania palca u nogi, aby ocenić poziom znieczulenia. 
	UWAGA: Izofluran ma głęboki wpływ na funkcję komórek szpikowych, dlatego należy unikać jego stosowania w tym teście24,25.</li>
	<li>Załadować igłę 0,5 μl znakowanego fluorescencyjnie roztworu cząstek.</li>
	<li>Połóż mysz bokiem pod mikroskopem chirurgicznym (ryc. 1A-B). Użyj miękkiego materiału, np. wkładu żelowego, dla lepszego ułożenia myszy. W przypadku młodych myszy, u których oczy nie są jeszcze otwarte, delikatnie otwórz powieki za pomocą cienkich kleszczy pod kątem 45o, tworząc szczelinę wzdłuż szczeliny, z której powieki ostatecznie się otworzą.
	<ol>
		<li>Za pomocą cienkich kleszczyków ustawionych pod kątem 45o ostrożnie dociśnij okolice powieki, tak aby gałka oczna lekko wyskoczyła z oczodołu. Przytrzymaj głowę dwoma palcami tuż nad uchem i za szczękę i delikatnie rozciągnij skórę równolegle do powiek, aby oko było lekko poza oczodołem. Uważaj, aby nie chwycić zbyt blisko gardła (Rysunek 1B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby przebić gałkę oczną, należy włożyć igłę strzykawki w rąbek rogówki (w miejscu, w którym rogówka i twardówka łączą się). Jest to widoczne jako szare kółko u pigmentowanych myszy. Lekko wycofać igłę, aby usunąć niewielką objętość płynu szklistego, a następnie wstrzyknąć. Osoba wykonująca wstrzyknięcie powinna delikatnie trzymać jedną ręką mysz, a drugą igłę; Druga osoba powinna powoli naciskać tłok.</li>
	<li>Powoli wycofać strzykawkę. Stosuj krople nawilżające do oczu, aby utrzymać nawilżenie oka.</li>
	<li>Pozwól gryzoniowi dojść do siebie w klatce nad poduszką grzewczą i kontynuuj monitorowanie zwierzęcia. Jeśli pracujesz ze szczeniętami, nie umieszczaj zwierzęcia w klatce z innymi czujnymi zwierzętami, dopóki nie zacznie oddychać i nie będzie zdolne do spontanicznych ruchów. Jeśli pracujesz z dorosłymi, nie umieszczaj gryzonia w klatce z innymi czujnymi zwierzętami, dopóki nie odzyska pozycji mostka.</li>
</ol>
3. Pobieranie tkanki siatkówki
UWAGA: Tkanka siatkówki z oczu, do której nie wstrzyknięto cząstek znakowanych fluorescencyjnie, powinna być pobrana jako kontrola do analizy cytometrii przepływowej. Chociaż test można wykonać przy użyciu pojedynczej siatkówki, aby uzyskać najlepszą wydajność, dwie siatkówki powinny być połączone razem.
<ol>
	<li>Pobrać tkankę siatkówki 3 godziny po wstrzyknięciu do ciała szklistego fluorescencyjnie znakowanych cząstek. 
	UWAGA: Chociaż czas po wstrzyknięciu roztworu cząstek może być zoptymalizowany dla każdego konkretnego eksperymentu, stwierdziliśmy, że 3 godziny po wstrzyknięciu wychwyt cząstek można było zaobserwować w większości warstw siatkówki (ryc. 1C-D).</li>
	<li>Ofiaruj myszy przez zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	<li>Zbierz gałki oczne, delikatnie naciskając na powiekę za pomocą cienkich kleszczy pod kątem 45o, aby podeprzeć gałkę oczną. Umieść kleszcze za gałką oczną i pociągnij.</li>
	<li>Wypreparuj siatkówkę pod mikroskopem preparacyjnym. Przenieść gałkę oczną na szalkę Petriego zawierającą niewielką ilość PBS z Ca2+/Mg2+. W suchym miejscu szalki Petriego przebij gałkę oczną w rąbku rogówki końcówką bardzo cienkich kleszczyków.</li>
	<li>Przytrzymaj gałkę oczną za pomocą cienkich kleszczy pod kątem 45o i użyj nożyczek sprężynowych, aby przeciąć wokół rąbka rogówki, aż zostanie przecięta mniej więcej połowa obwodu rąbka rogówki.</li>
	<li>Przytrzymaj gałkę oczną cienkimi kleszczami pod kątem 45o i wprowadź gałkę oczną do PBS. Drugą parą cienkich kleszczy pod kątem 45o rozerwij rogówkę i twardówkę. Soczewka i siatkówka wyjdą nienaruszone.</li>
	<li>Oddziel soczewkę i siatkówkę. Zebrać siatkówkę i przenieść do probówki z polistyrenu o pojemności 5,4 ml zawierającej 2 ml PBS z Ca2 + / Mg2 +.</li>
</ol>
4. Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej
<ol>
	<li>Przygotuj zawiesiny pojedynczych komórek za pomocą zestawu do dysocjacji tkanek nerwowych z niewielkimi modyfikacjami w stosunku do instrukcji producenta. Krótko mówiąc, rozcierać siatkówki, pipetując w górę i w dół pipetą P1000 i przeprowadzając trawienie enzymatyczne w temperaturze 37 oC bez wstrząsania.</li>
</ol>
5. Barwienie zawiesin pojedynczych komórek do analizy cytometrycznej przepływowej
<ol>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu barwiącego (sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco z 0,2% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) i 0,09% azydkiem sodu) i przenieść na 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery U. Wirować przez 5 minut przy 130 x g. 
	UWAGA: Azydek sodu jest szkodliwy dla ludzi i środowiska. Używaj odpowiednich środków ochrony osobistej i wyrzucaj odpady zgodnie z lokalnymi przepisami.</li>
	<li>Odwróć talerz nad zlewem, aby wyrzucić supernatant. Aby zablokować receptory Fc, należy ponownie zawiesić komórki w 25 μl buforu barwiącego zawierającego 5 μg/ml przeciwciała anty-mysiego CD16/CD32 na dołek. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać 25 μl buforu barwiącego zawierającego 0,5 μg/ml anty-mysiego Ly6C-APC-Cy7, 0,5 μg/ml anty-mysiego Ly6G-Pe-Cy7 i 2,5 μg/ml anty-mysiego CD11b-AF650. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Wirować przez 5 minut przy 130 x g. Odwrócić płytkę, aby odrzucić supernatant. Przemyć przez ponowne zawieszenie komórek w 200 μl buforu barwiącego.</li>
	<li>Wirować przez 5 minut przy 130 x g. Zawiesić w 200 μl buforu barwiącego zawierającego 0,5 μg/ml jodku propidyny (PI). Przenieść do probówek do mikromiareczkowania o pojemności 1,2 ml.</li>
	<li>Przemyć studzienki dodatkowymi 100 μl buforu barwiącego zawierającego 0,5 μg/ml PI i połączyć poprzednie 200 μl w probówkach do mikromiareczkowania o pojemności 1,2 ml. Uzyskuje się całkowitą objętość 300 μl barwionych komórek.</li>
</ol>
6. Analiza cytometryczna przepływowa
<ol>
	<li>Używając konwencjonalnych trzech laserów (fioletowego, niebieskiego i czerwonego lasera), unikaj barwników PE, PerCP-Cy5.5, BV510 i PI ze względu na znaczne rozlanie się niezwykle jasnych cząstek fluorescencyjnych AF488. Użyj czwartego (żółtego) lasera, aby zoptymalizować ten test, ponieważ pozwala on na użycie przeciwciał znakowanych PE i PI (w kanale mCherry zamiast kanału PerCP-Cy5.5) (Figura 2). 
	UWAGA: Jeśli żółty laser nie jest dostępny, użyj barwnika wykluczającego martwe komórki w innym kanale.</li>
	<li>Bramka na komórkach ujemnych PI (PI-), aby wykluczyć martwe komórki (Figura 2B).</li>
	<li>Po wykluczeniu martwych komórek, bramka na komórkach dodatnich CD11b (CD11b +), obejmie to wszystkie komórki szpikowe (Figura 2C).</li>
	<li>W populacji CD11b+, brama na Ly6C-/Ly6G- w celu wykluczenia neutrofili (CD11b+/Ly6G+) i monocytów (CD11b+/Ly6C+; Rysunek 2D). Po bramkowaniu na mikrogleju (tutaj zdefiniowanym jako CD11b+/Ly6C-/Ly6G- dla uproszczenia) powinny być widoczne dwie wyraźne populacje; jeden ujemny i jeden dodatni dla cząstek znakowanych fluorescencyjnie. Komórki fagocytarne będą pobierać cząstki i dlatego są AF488+ (Figura 2E). 
	UWAGA: Populacje Ly6C dodatnie lub Ly6G dodatnie mogą być również analizowane w celu zmierzenia wychwytu cząstek przy użyciu tego podejścia do barwienia. Odsetek komórek fagocytarnych CD11b + dobrze koreluje z odsetkiem mikrogleju fagocytarnego (Figura 2F). Dla badaczy bez doświadczenia w cytometrii przepływowej można przeprowadzić prostszą analizę z samym barwieniem CD11b, choć będzie to obejmować neutrofile fagocytarne i monocyty, a także mikroglej. W tej populacji CD11b+/Ly6C-/Ly6G- komórki te są > 99% mikrogleju, co oceniano na podstawie barwienia markerami F4/80 i CX3CR1; Te markery można dodawać, ale nie są one konieczne w naszych rękach.</li>
</ol>

<ol><li>Gomez-Nicola, D., Perry, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+dynamics+and+role+in+the+healthy+and+diseased+brain%3A+a+paradigm+of+functional+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">Microglial dynamics and role in the healthy and diseased brain: a paradigm of functional plasticity.</a> Neuroscientist. 21, 169-184 (2015).</li>
<li>Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+interactions+with+synapses+are+modulated+by+visual+experience%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience.</a> PLoS Biol. 8, e1000527(2010).</li>
<li>Schafer, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+sculpt+postnatal+neural+circuits+in+an+activity+and+complement-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner.</a> Neuron. 74, 691-705 (2012).</li>
<li>Sierra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+shape+adult+hippocampal+neurogenesis+through+apoptosis-coupled+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Microglia shape adult hippocampal neurogenesis through apoptosis-coupled phagocytosis.</a> Cell Stem Cell. 7, 483-495 (2010).</li>
<li>Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Janus-faced+microglia%3A+beneficial+and+detrimental+consequences+of+microglial+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis.</a> Front Cell Neurosci. 7 (6), (2013).</li>
<li>Chan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD33+modulates+TREM2%3A+convergence+of+Alzheimer+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">CD33 modulates TREM2: convergence of Alzheimer loci.</a> Nat Neurosci. 18, 1556-1558 (2015).</li>
<li>Murinello, S., Mullins, R. F., Lotery, A. J., Perry, V. H., Teeling, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fcgamma+receptor+upregulation+is+associated+with+immune+complex+inflammation+in+the+mouse+retina+and+early+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Fcgamma receptor upregulation is associated with immune complex inflammation in the mouse retina and early age-related macular degeneration.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 247-258 (2014).</li>
<li>Ransohoff, R. M., Perry, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+physiology%3A+unique+stimuli%2C+specialized+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses.</a> Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).</li>
<li>Derecki, N., Cronk, J., Kipnis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+phagocytic+function+in+primary+murine+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Protoc+Exchange%22%5BJournal%5D)">Assay of phagocytic function in primary murine microglia.</a> Protoc Exchange. , (2012).</li>
<li>Fricker, M., Oliva-Martin, M. J., Brown, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+phagocytosis+of+viable+neurons+by+microglia+activated+with+LPS+or+Abeta+is+dependent+on+calreticulin%2FLRP+phagocytic+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Primary phagocytosis of viable neurons by microglia activated with LPS or Abeta is dependent on calreticulin/LRP phagocytic signalling.</a> J Neuroinflammation. 9, 196(2012).</li>
<li>Koenigsknecht-Talboo, J., Landreth, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+phagocytosis+induced+by+fibrillar+beta-amyloid+and+IgGs+are+differentially+regulated+by+proinflammatory+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglial phagocytosis induced by fibrillar beta-amyloid and IgGs are differentially regulated by proinflammatory cytokines.</a> J Neurosci. 25, 8240-8249 (2005).</li>
<li>Neher, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+microglial+phagocytosis+is+sufficient+to+prevent+inflammatory+neuronal+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of microglial phagocytosis is sufficient to prevent inflammatory neuronal death.</a> J Immunol. 186, 4973-4983 (2011).</li>
<li>Fricker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MFG-E8+mediates+primary+phagocytosis+of+viable+neurons+during+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">MFG-E8 mediates primary phagocytosis of viable neurons during neuroinflammation.</a> J Neurosci. 32, 2657-2666 (2012).</li>
<li>Mildner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+and+non-redundant+roles+of+microglia+and+myeloid+subsets+in+mouse+models+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease.</a> J Neurosci. 31, 11159-11171 (2011).</li>
<li>Neher, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+executes+delayed+neuronal+death+after+focal+brain+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis executes delayed neuronal death after focal brain ischemia.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E4098-E4107 (2013).</li>
<li>Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+pattern+of+expression+and+colocalization+of+microglia%2Fmacrophage+phenotype+markers+following+brain+ischemic+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice.</a> J Neuroinflammation. 8, 174-174 (2011).</li>
<li>Preissler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+microglial+phagocytosis+in+GPR34-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Altered microglial phagocytosis in GPR34-deficient mice.</a> Glia. 63, 206-215 (2015).</li>
<li>Hughes, M. M., Field, R. H., Perry, V. H., Murray, C. L., Cunningham, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+the+degenerating+brain+are+capable+of+phagocytosis+of+beads+and+of+apoptotic+cells%2C+but+do+not+efficiently+remove+PrP%28Sc%29%2C+even+upon+LPS+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia in the degenerating brain are capable of phagocytosis of beads and of apoptotic cells, but do not efficiently remove PrP(Sc), even upon LPS stimulation.</a> Glia. 58, 2017-2030 (2010).</li>
<li>Westenskow, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+flow+cytometry+to+compare+the+dynamics+of+photoreceptor+outer+segment+phagocytosis+in+iPS-derived+RPE+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Using flow cytometry to compare the dynamics of photoreceptor outer segment phagocytosis in iPS-derived RPE cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 6282-6290 (2012).</li>
<li>London, A., Benhar, I., Schwartz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retina+as+a+window+to+the+brain-from+eye+research+to+CNS+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">The retina as a window to the brain-from eye research to CNS disorders.</a> Nat Rev Neurol. 9, 44-53 (2013).</li>
<li>Fritzenwanger, M., Jung, C., Goebel, B., Lauten, A., Figulla, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+short-term+systemic+hypoxia+on+phagocytosis%2C+cytokine+production%2C+and+transcription+factor+activation+in+peripheral+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+Inflamm%22%5BJournal%5D)">Impact of short-term systemic hypoxia on phagocytosis, cytokine production, and transcription factor activation in peripheral blood cells.</a> Mediators Inflamm. , 429501(2011).</li>
<li>Ragsdale, R. L., Grasso, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+spectrofluorometric+assay+for+quantitating+yeast+phagocytosis+in+cultures+of+murine+peritoneal+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved spectrofluorometric assay for quantitating yeast phagocytosis in cultures of murine peritoneal macrophages.</a> J Immunol Methods. 123, 259-267 (1989).</li>
<li>Stokes, L., Surprenant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+regulation+of+the+P2X4+receptor+in+alveolar+macrophages+by+phagocytosis+and+classical+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dynamic regulation of the P2X4 receptor in alveolar macrophages by phagocytosis and classical activation.</a> Eur J Immunol. 39, 986-995 (2009).</li>
<li>Kotani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraoperative+modulation+of+alveolar+macrophage+function+during+isoflurane+and+propofol+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Intraoperative modulation of alveolar macrophage function during isoflurane and propofol anesthesia.</a> Anesthesiology. 89, 1125-1132 (1998).</li>
<li>Xu, X., Feng, J., Zuo, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoflurane+preconditioning+reduces+the+rat+NR8383+macrophage+injury+induced+by+lipopolysaccharide+and+interferon+gamma%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Isoflurane preconditioning reduces the rat NR8383 macrophage injury induced by lipopolysaccharide and interferon gamma.</a> Anesthesiology. 108, 643-650 (2008).</li>
<li>abd-el-Basset, E., Fedoroff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+bacterial+wall+lipopolysaccharide+%28LPS%29+on+morphology%2C+motility%2C+and+cytoskeletal+organization+of+microglia+in+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of bacterial wall lipopolysaccharide (LPS) on morphology, motility, and cytoskeletal organization of microglia in cultures.</a> J Neurosci Res. 41, 222-237 (1995).</li>
<li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> J Vis Exp. , (2014).</li>
<li>Jackson, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+vulnerability+to+neurodegenerative+disease%3A+the+curious+case+of+Prion+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Selective vulnerability to neurodegenerative disease: the curious case of Prion Protein.</a> Dis Model Mech. 7, 21-29 (2014).</li>
<li>O'Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+reveals+that+microglia+and+recruited+monocyte-derived+macrophages+are+definitively+distinguishable+by+phenotype+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina.</a> Sci Rep. 6, 20636(2016).</li>
<li>Usui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+and+Eye+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Vision%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis and Eye Disease.</a> Annu Rev Vision. 1, 155-184 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tej metodzie istnieją trzy kluczowe etapy: (1) wstrzyknięcie do ciała szklistego fluorescencyjnie znakowanych cząstek; 2) pobieranie i preparacja tkanki siatkówki; oraz (3) analiza metodą cytometrii przepływowej. Zalecamy, aby badacze przećwiczyli iniekcje doszklistkowe przed wykonaniem metody, którą tutaj prezentujemy. Myszy albinosy (np. BALB/c) i kolorowy roztwór (np. cząstki znakowane fluorescencyjnie) mogą być używane do łatwej wizualizacji igły i wstrzykniętego roztworu. Wstrzyknięcia do ciała s...

Ogólnym celem tej metody jest dokładna ocena i ilościowe określenie fagocytozy mikrogleju in vivo. Mikroglej to rezydujące w tkankach makrofagi ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Pełnią one różnorodne funkcje zapewniające utrzymanie homeostazy tkanek. Należą do nich nadzór immunologiczny, wydzielanie czynników neurotroficznych i, co ma kluczowe znaczenie, fagocytoza1. Fagocytoza mikrogleju ma kluczowe znaczenie w kilku ważnych wydarzeniach podczas rozwoju mózgu i siatkówki, takich jak fagocytoza nieistotnych synaps (przycinanie synaptyczne) i usuwanie neuronów apoptotycznych2-4. Ponadto wykazano, że fagocytoza mikrogleju uszkodzonych lub apoptotycznych neuronów, szczątków komórkowych i inwazyjnych drobnoustrojów jest niezbędna do utrzymania homeostazy OUN w wieku dorosłym5. Wreszcie, fagocytoza mikrogleju jest zaangażowana w patogenezę kilku chorób neurodegeneracyjnych, w tym choroby Alzheimera i zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem, gdzie zasugerowano, że wadliwa lub niewystarczająca zdolność fagocytarna może przyczyniać się do gromadzenia się blaszek β amyloidu (Aβ) i druz, odpowiednio6,7.
Funkcja mikrogleju jest ściśle regulowana przez ich mikrośrodowisko, zwłaszcza przez rozpuszczalne czynniki, takie jak czynnik wzrostu nowotworu β lub interakcje komórka-komórka. Neurony konstytutywnie wyrażają kilka ligandów powierzchniowych komórek, takich jak CD200 i CX3CL1, podczas gdy mikroglej wyraża wyłącznie odpowiednie receptory CD200R i CX3CR1. Receptory te zawierają immunoreceptorowe motywy hamowania oparte na tyrozynie (ITIMs) w swojej części wewnątrzkomórkowej. Te receptory inhibitorów mają kluczowe znaczenie dla zapobiegania nadmiernej stymulacji mikrogleju, która może przyczyniać się do zapalenia nerwów. Tak więc w normalnych warunkach fizjologicznych interakcje komórka-komórka między neuronami a mikroglejem utrzymują mikroglej w stanie spoczynku. Jednak podczas uszkodzenia tkanki neurony mogą zmniejszać ekspresję tych ligandów, usuwając ich hamujący wpływ na aktywację mikrogleju. Funkcja mikrogleju (w tym fagocytoza) jest zatem ściśle związana z ich mikrośrodowiskiem8. Niemniej jednak do tej pory nie ma standaryzowanych testów do badania fagocytozy mikrogleju w kontekście fizjologicznym lub w sposób, który w pełni replikuje ich mikrośrodowisko OUN.
Opracowano kilka testów do pomiaru aktywności fagocytarnej mikrogleju in vitro, gdzie pierwotne linie komórkowe mikrogleju lub mikrogleju są hodowane z komórkami docelowymi (np. neuronami apoptotycznymi) lub fluorescencyjnie znakowanymi kulkami. Wychwyt docelowy jest następnie oceniany za pomocą mikroskopii obrazowania fluorescencyjnego lub cytometrii przepływowej9-12. Testy te pozwalają na sprawdzenie, w jaki sposób manipulacja farmakologiczna lub genetyczna może wpływać na fagocytozę mikrogleju i, choć dostarcza informacji, nie jest w stanie w pełni odtworzyć złożonego środowiska in vivo. Opisano pośrednie metody badania fagocytozy mikrogleju in vivo: osiąga się je poprzez barwienie cząsteczek uważanych za zaangażowane w fagocytozę (np. CD68), ocenę fizycznej bliskości mikrogleju i celów fagocytozy (np. Uszkodzone neurony lub elementy synaptyczne) lub przez immunohistochemiczne wykrywanie celów fagocytarnych w komórkach mikrogleju (np. Aβ)13-17. W dwóch badaniach zastosowano bardziej bezpośrednie podejścia do oceny fagocytozy mikrogleju in vivo. Hughes i współpracownicy wykorzystali techniki obrazowania do pomiaru wychwytu mikrogleju przez kulki dostarczane drogą wewnątrzczaszkową18. Sierra i wsp. Opracowano udoskonaloną metodę ilościowej oceny fagocytozy mikrogleju komórek apoptotycznych przy użyciu złożonych technik obrazowania4. Jednak metody te obejmują skomplikowane protokoły przygotowania tkanek, cięcia, obrazowania i analizy. Wcześniej stosowaliśmy analizę cytometrii przepływowej do oceny fagocytozy zewnętrznych segmentów fotoreceptorów przez komórki nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) w hodowli19. W tym miejscu opisujemy protokół szybkiej oceny wychwytu cząstek znakowanych fluorescencyjnie przez mikroglej siatkówki jako ilościową miarę fagocytozy mikrogleju in vivo.
Protokół, który tutaj opisujemy, pozwala na wiarygodny i ilościowy pomiar fagocytozy mikrogleju siatkówki w ciągu niecałych sześciu godzin w trzech kluczowych krokach: (1) doszklistkowe dostarczanie fluorescencyjnie znakowanych cząstek, (2) pobieranie i przygotowanie tkanki siatkówki oraz (3) analiza cytometryczna przepływowa. Opracowana przez nas metoda jest solidną metodą oceny fagocytozy mikrogleju w siatkówce i może być z powodzeniem stosowana do testowania, w jaki sposób różne związki lub manipulacje genetyczne zmieniają tę kluczową funkcję mikrogleju w warunkach fizjologicznych. Jako wyspecjalizowany obszar OUN, siatkówka jest łatwo dostępnym systemem modelowym do badania funkcji mikrogleju20. Chociaż metoda ta została opracowana w oku, uważamy, że może być przydatna dla wszystkich neurobiologów badających funkcję fagocytarną mikrogleju.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Nikon</td><td>wycofany z produkcji</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton&nbsp; strzykawka, seria 600</td><td>Sigma</td><td>26702</td><td></td></tr><tr><td>33 gauge, Small Hub RN NDL, 0,5 cala, typ punktowy 4 - 12o</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td></td></tr><tr><td>Zymosan A (S. cerevisiae) BioParticles, koniugat Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Z-23373</td><td>Przygotować bezpośrednio przed wstrzyknięciem</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 Kleszcze</td><td>Narzędzia do nauki</td> pięknej <td>11251-35</td><td>Potrzebujesz dwóch</td></tr><tr><td>kleszczyków Dumont #5SF</td><td>Narzędzia do nauki o sztuce</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe Vannas - 3 mm Krawędź tnąca</td><td>Narzędzia do nauki o wysokiej</td> jakości <td>15000-10</td><td>Zestaw do</td></tr><tr><td>dysocjacji zakrzywionej tkanki nerwowej &ndash; Neurony poporodowe</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-802</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Polistyrenowa probówka okrągłodenna</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka denna w kształcie litery U</td><td>Bufor</td> do barwienia Falcon <td>353077</td><td></td></tr><tr><td>(BSA)</td><td>BD Biosciences</td><td>554657</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-BV650 Przeciwciało</td><td>BioLegend</td><td>101259</td><td></td></tr><tr><td>Ly6C-APC-Cy7</td><td>BioLegend</td><td></td><td></td>128025</tr><tr><td>Ly6G-PE-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>127617</td><td></td></tr><tr><td>Jodek Propidium</td><td>BD Biosciences</td><td>556463</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczone przeciwciało anty-mysie CD16/32</td><td>BioLegend</td><td>101301</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena funkcji fagocytarnej mikrogleju siatkówki in vivo przy użyciu testu opartego na cytometrii przepływowej

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Mikroglej to makrofagi rezydujące w tkankach ośrodkowego układu nerwowego (OUN) i pełnią różne funkcje wspierające homeostazę OUN, w tym fagocytozę uszkodzonych synaps lub komórek, szczątków i/lub atakujących patogenów. Upośledzona funkcja fagocytarna jest zaangażowana w patogenezę chorób, takich jak choroba Alzheimera i zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem, w których gromadzi się odpowiednio blaszka β amyloidem i druzy. Pomimo swojego znaczenia, fagocytoza mikrogleju jest trudna do oceny in vivo. W tym miejscu opisujemy prostą, ale solidną technikę precyzyjnego monitorowania i ilościowego określania potencjału fagocytarnego mikrogleju siatkówki in vivo. Poprzednie metody opierały się na barwieniu immunohistochemicznym i technikach obrazowania. Nasza metoda wykorzystuje cytometrię przepływową do pomiaru wychwytu mikrogleju przez cząstki znakowane fluorescencyjnie po podaniu do ciała szklistego do oka u żywych gryzoni. Metoda ta zastępuje konwencjonalne praktyki, które obejmują pracochłonne cięcie tkanek, barwienie immunologiczne i obrazowanie, pozwalając na bardziej precyzyjne określenie ilościowe funkcji fagocytarnej mikrogleju w niecałe sześć godzin. Procedura ta może być również dostosowana do testowania, jak różne związki zmieniają fagocytozę mikrogleju w warunkach fizjologicznych. Chociaż technika ta została opracowana w oku, jej zastosowanie nie ogranicza się do badań nad wzrokiem.

W niniejszej pracy opisujemy metodę szybkiego i wiarygodnego oznaczania liczby fagocytujących mikroglejów siatkówki w warunkach fizjologicznych z wykorzystaniem analizy cytometrycznej (Rysunek 2). Metoda ta może zostać zaadaptowana do badania wpływu związków chemicznych i/lub manipulacji genetycznych na zdolność fagocytarną mikrogleju (Rysunki 3A, 3B). Można ją również zastosować u młodych (10–20 dni po urodzeniu) lub dorosłych myszy (Rys...

Fagocytoza mikrogleju jest kluczowa dla utrzymania homeostazy tkanek, a nieodpowiednia funkcja fagocytarna została zamieszana w patologię. Jednak ocena funkcji mikrogleju in vivo jest technicznie trudna. Opracowaliśmy prostą, ale solidną technikę precyzyjnego monitorowania i ilościowego określania potencjału fagocytarnego mikrogleju w warunkach fizjologicznych.

Ocena funkcji fagocytarnej mikrogleju siatkówki in vivo przy użyciu testu opartego na cytometrii przepływowej

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Ogólnym celem tej procedury jest ocena funkcji fagocytarnych mikrogleju siatkówki in vivo. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie okulistyki, np. czy określone związki zmieniają funkcję fagocytarną mikrogleju w warunkach fizjologicznych. Główną zaletą tej techniki jest wykorzystanie cytometrii przepływowej, co umożliwia szybką i precyzyjną analizę ilościową fagocytozy mikrogleju.W zademonstrowaniu procedury pomoże mi Susumu Sakimoto, postdoc z mojego laboratorium. Należy rozpocząć od nabrania do strzykawki z igłą o rozmiarze 33G 0,5 µl roztworu cząsteczek znakowanych fluorescencyjnie. Następnie zaniesioną mysz ułożyć bokiem na miękkim materiale pod mikroskopem chirurgicznym i potwierdzić odpowiedni poziom sedacji poprzez brak reakcji na uciśnięcie palca u stopy.Następnie za pomocą pęsety należy ostrożnie wywrzeć nacisk wokół jednej powieki, tak aby gałka oczna lekko wysunęła się z oczodołu. Następnie należy chwycić głowę dwoma palcami tuż nad uchem oraz za żuchwę zwierzęcia i delikatnie naciągnąć skórę równolegle do powiek, aby utrzymać oko w lekkim wysunięciu z oczodołu. Iniekcje dopłuczne są wymagające i jeśli nie zostaną wykonane prawidłowo, doprowadzą do stronniczych i zmiennych wyników.Aby zminimalizować uraz oka, należy utrzymać zwierzę w stabilnej pozycji, ograniczając ruchy głowy do minimum. W celu nakłucia gałki ocznej, delikatnie chwyć mysz jedną ręką. Następnie zlokalizuj limbus rogówki, miejsce połączenia rogówki z twardówką, który u myszy pigmentowanych jest widoczny jako szary okrąg.Trzymając strzykawkę w drugiej ręce, wprowadź igłę do obrąbka rogówki. Następnie lekko wycofaj igłę, aby pobrać niewielką objętość ciała szklistego, i powoli dociśnij tłok, aby wstrzyknąć cząsteczki. Po podaniu wszystkich kuleczek powoli wyjmij strzykawkę, aby uniknąć refluksu wstrzykniętego materiału, a następnie zastosuj krople nawilżające, aby utrzymać nawilżenie oka po jego powrocie na miejsce.Następnie umieść zwierzę w jego klatce na podkładce grzewczej i monitoruj jego stan aż do pełnego wyzdrowienia. Trzy godziny po iniekcji do ciała szklistego użyj pęsety pod kątem 45 stopni, aby delikatnie nacisnąć powiekę i doprowadzić do proptozy gałki ocznej. Umieść pęsetę za gałką oczną i pociągnij.Następnie przenieś gałkę oczną pod mikroskop stereoskopowy do suchego obszaru szalki Petriego zawierającej niewielką objętość PBS z wapniem i magnezem. Użyj jednej końcówki superprecyzyjnych pęsety, aby przebić oko w obrębie limbusa rogówki. Następnie, trzymając gałkę oczną za pomocą precyzyjnej pęsety wygiętej pod kątem 45 stopni, użyj nożyczek sprężynowych, aby wyciąć obszar wokół limbusa rogówki, aż zostanie wycięte około połowy obwodu.Przenieś gałkę oczną do PBS i za pomocą drugiej pary precyzyjnych pęset kątowych 45 stopni rozdziel rogówkę od twardówki. Soczewka i siatkówka zostaną wyjęte w całości. Upewnij się, że soczewka i siatkówka są odseparowane, a następnie przenieś siatkówkę do polistyrenowej probówki o pojemności 5,4 ml, zawierającej dwa mililitry PBS z wapniem i magnezem.Aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek siatkówki, należy zastosować zestaw do dysocjacji tkanki neuronalnej zgodnie z instrukcją producenta, a następnie resuspendować komórki w 200 µL buforu barwiącego. Następnie próbkę przenosi się do jednego dołka płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery U. Po odwirowaniu należy odwrócić płytkę, aby usunąć nadsącz, a następnie zablokować receptory FC, dodając 25 µL buforu barwiącego zawierającego przeciwciała CD16 i CD32 do każdego dołka i inkubując przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Następnie należy znakować komórki odpowiednimi przeciwciałami przez 15 minut w temperaturze pokojowej, w ciemności. Potem należy odwirować komórki i przeprowadzić przemywanie w 200 µL świeżego buforu do barwienia na studzienkę. Teraz należy resuspender osad w 200 µL buforu do barwienia z dodatkiem barwnika żywotności i przenieść próbki do mikroprobówek o objętości 1,2 mL.Następnie należy przemyć studzienki dodatkowymi 100 µL buforu barwiącego i barwnika żywotności, a następnie połączyć płukania z odpowiadającymi im próbkami w celu analizy metodą cytometrii przepływowej. Metodę tę można stosować u myszy postnatalnych w wieku od 10 do 20 dni lub u myszy dorosłych, a także dostosować do badania wpływu związków i/lub manipulacji genetycznych na fagocytozę mikrogleju. Na przykład w niniejszym doświadczeniu, po wyzwaniu wewnątrzbrzusznym różnymi dawkami LPS, stwierdzono, że dawka 1,42 mg/kg LPS indukuje statystycznie istotny wzrost odsetka fagocytujących mikroglejów w porównaniu z grupą kontrolną poddaną działaniu nośnika.Po opanowaniu ta technika może zostać zrealizowana w ciągu sześciu godzin, pod warunkiem właściwego jej wykonania. Po zastosowaniu tej procedury można wykorzystać inne metody, takie jak sortowanie komórek z późniejszą analizą qPCR lub analiza proteomiczna, aby odpowiedzieć na dalsze pytania dotyczące różnic między mikroglejem fagocytującym a niefagocytującym w siatkówce. Opracowując tę technikę, zakładamy, że umożliwimy badaczom wzroku i neuronauk dalsze zgłębianie funkcji fagocytycznej mikrogleju in situ oraz w kontekście fizjologicznie istotnym.

assessing-retinal-microglial-phagocytic-function-vivo-using-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje cytometrię przepływową do pomiaru wychwytu mikrogleju przez fluorescencyjne biocząstki po dostrzodowisku do ciała szklistego w oku myszy. Cytometria przepływowa wykrywa żywe komórki wykazujące ekspresję CD11b i odróżnia fagocytarne komórki mikrogleju wykazujące zieloną fluorescencję od innych komórek szpikowych, w tym monocytów eksprymujących Ly6C i neutrofili wykazujących ekspresję Ly6G.

Pomiar wychwytu mikrogleju przez cząstki fluorescencyjne dostarczane do ciała szklistkowego za pomocą cytometrii przepływowej

Źródło: Bosco, A., et al.  In Vivo Dynamika aktywacji mikrogleju siatkówki podczas neurodegeneracji: konfokalne obrazowanie oftalmoskopowe i morfometria komórkowa w jaskrze myszy. J. Vis. Exp. (2015) Ten film przedstawia obrazowanie in vivo mikrogleju siatkówki w mysim modelu jaskry. Transgeniczna mysz z mikroglejem siatkówki wykazującym ekspresję białka fluorescencyjnego jest umieszczana pod oftalmoskopem. Oświetlenie w podczerwieni służy do zlokalizowania głowy nerwu wzrokowego (ONH), a...

Obrazowanie in vivo mikrogleju siatkówki w mysim modelu jaskry

Aktywacja mikrogleju i mikroglejoza są kluczowymi odpowiedziami na przewlekłą neurodegenerację. W tym miejscu przedstawiamy metody długoterminowej wizualizacji in vivo komórek mikrogleju CX3CR1-GFP+ siatkówki za pomocą oftalmoskopii konfokalnej oraz analiz progowych i morfometrycznych w celu identyfikacji i ilościowego określenia ich aktywacji. Monitorujemy zmiany mikrogleju we wczesnych stadiach jaskry związanej z wiekiem.

In vivo (in vivo)Dynamika aktywacji mikrogleju siatkówki podczas neurodegeneracji: konfokalne obrazowanie oftalmoskopowe i morfometria komórkowa w jaskrze myszy

Ten protokół zapewnia metodę trawienia całych oczu do pojedynczej zawiesiny komórkowej w celu wieloparametrowej analizy cytometrycznej przepływu w celu identyfikacji specyficznych jednojądrzastych populacji fagocytarnych oczu, w tym monocytów, mikrogleju, makrofagów i komórek dendrytycznych.

Trawienie całych oczu myszy do wieloparametrowej analizy cytometrycznej przepływowej fagocytów jednojądrzastych

Tutaj prezentujemy dwa protokoły do ilościowego oznaczania pochłaniania mikrogleju przez synapsy vGLUT1-dodatnie oraz surowych synaptosomów pHRodo znakowanych na czerwono za pomocą cytometrii przepływowej.

Kwantyfikacja pochłaniania mikrogleju przez materiał synaptyczny za pomocą cytometrii przepływowej

Obecny protokół został opracowany do oceny wpływu powtarzalnej stymulacji magnetycznej na zdolność mikrogleju do fagocytozy resztek mieliny. W tym celu stworzono system kohodowli mikrogleju i szczątków mieliny in vitro.

Ocena fagocytozy mikrogleju resztek mieliny in vitro pod wpływem wielokrotnej stymulacji magnetycznej

Niniejszy artykuł demonstruje metodę wizualizacji i ilościowej ruchliwości mikrogleju oraz kontaktu z postsynaptycznymi punktami siatkówki za pomocą obracającej się mikroskopii konfokalnej dysku.

Obrazowanie na żywo i charakteryzacja dynamiki mikrogleju oraz interakcji z synapsami w chorej siatkówce myszy

Protokół ten łączy cytometrię przepływową i sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki w celu wyizolowania i scharakteryzowania stanów komórek mikrogleju w móżdżku wczesnych postnatalnych mózgów myszy. Wykorzystuje dysocjację enzymatyczną, wirowanie Percoll i barwienie immunologiczne, aby ujawnić heterogeniczność mikrogleju i poprawić zrozumienie ich roli w rozwoju i chorobie móżdżku.

Cytometria przepływowa i analiza pojedynczych komórek w celu scharakteryzowania aktywacji mikrogleju we wczesnym pourodzeniowym rozwoju mózgu myszy

Wiele infekcji wywołuje silną odpowiedź CTL, jednak sporadycznie liczba komórek odpowiadających nie koreluje z kontrolą patogenu1. Jedną z miar jakości CTL jest ich zdolność do specyficznego zabijania2. Oznakowanie komórek docelowych za pomocą CFSE może być wykorzystane do zbadania jakości tej odpowiedzi CTL in vivo3,4.

Swoisty dla antygenu In vivo Test zabijania z użyciem komórek docelowych znakowanych CFSE

W przeciwieństwie do bezkomórkowych cząsteczek HIV-1, zakażone limfocyty T CD4+ są skutecznie wykrywane przez plazmocytoidalne komórki dendrytyczne (pDC). Niniejszy manuskrypt opisuje metodę, w której jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) lub izolowane pDC są hodowane wspólnie z limfocytami T zakażonymi wirusem HIV-1 w celu oceny wrodzonego wykrywania przez pDC, oceniane przez uwalnianie IFN typu I.

Ocena wrodzonego wyczuwania limfocytów T CD4 + zakażonych wirusem HIV-1 przez plazmocytoidalne komórki dendrytyczne przy użyciu systemu kohodowli ex vivo.

Poznaj metodę oceny fagocytozy mikrogleju siatkówki in vivo przy użyciu cytometrii przepływowej. Technika umożliwia szybką i precyzyjną analizę ilościową, co jest kluczowe dla badań nad homeostazą tkankową i patologią siatkówki.

Ocena funkcji fagocytarnej mikrogleju siatkówki in vivo przy użyciu testu opartego na cytometrii przepływowej

Przeglądaj więcej filmów