Name: Izolacja, ekspansja i różnicowanie fibro-adipogennych progenitorów od modelu myszy kolczastej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-15T12:20:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Poznaj izolację fibro-adipogennych progenitorów z mięśni szkieletowych i serca myszy kolczastej Acomys przy użyciu enzymatycznej dysocjacji i sortowania komórek FACS. Metoda umożliwia ekspansję i różnicowanie komórek FAP w myofibroblasty oraz adipocyty.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Andy'emu Johnsonowi i Justinowi Wongowi, rdzeniowi przepływu UBC, za ich ekspertyzę i pomoc w optymalizacji protokołu FACS, a także personelowi Centrum Badań Biomedycznych UBC za opiekę nad myszami kolczastymi. Rysunek 1 został wykonany przy użyciu Biorender. Rysunek 2 został wykonany przy użyciu oprogramowania FlowJo.

Wszystkie procedury utrzymania zwierząt i eksperymentów zostały przeprowadzone zgodnie z aprobatą Komitetu Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Kolumbii Brytyjskiej oraz przepisami Uniwersytetu Kolumbii Brytyjskiej. Zwierzęta trzymano w zamkniętym pomieszczeniu wolnym od patogenów w standardowych warunkach (cykl 12:12 światło-ciemność, 21-23 °C i poziom wilgotności 40%-60%) i zapewniono im bogatą w białko dietę dla myszy i wodę ad libitum. Do tego badania wykorzystano dorosłe (w wieku od 4 do 6 miesięcy, 50-60 g) samice i samce myszy Acomys dimidiatus. Szczegółowe informacje na temat wszystkich używanych odczynników i sprzętu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie roztworu i buforu
<ol>
	<li>Przygotować 1x bufor fosforanowy soli fizjologicznej (PBS).</li>
	<li>Przygotować PBS-EDTA, mieszając 4 ml 0,5 M EDTA (2 mM) i 996 ml 1x PBS, pH = 7,4.</li>
	<li>Przygotuj 250 mM CaCl2, dodając 2,7745 g CaCl2 do 100 ml wody wolnej od nukleaz.</li>
	<li>Przygotuj bufor do wytrawiania: Wymieszaj 50 μg/ml liberazy, 2,5 mM CaCl2 i 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w DMEM/F12.</li>
	<li>Przygotuj bufor FACS, mieszając 488 ml 1x PBS, 2 ml 0,5 M EDTA i 10 ml FBS.</li>
	<li>Przygotować bufor żywotności przez zmieszanie buforu FACS z jodkiem propidyny (PI; 1 μg/ml).</li>
	<li>Przygotuj podłoża podstawowe, mieszając DMEM/F12 z 5% FBS i 1% (v/v) piórem/paciorkowiec.</li>
	<li>Przygotuj pożywkę proliferacyjną, mieszając DMEM/F12 z 10% FBS, 1% (v/v) pen/strep i 2,5 ng/ml bFGF.</li>
	<li>Przygotować pożywkę fibrogeniczną, mieszając pożywkę zasadową i 10 ng/ml rh-TGFβ1,</li>
	<li>Przygotuj pożywkę adipogenną (1x), mieszając DMEM / F12 z 1% piórem / paciorkowcem i dostępnym w handlu 10x mysim suplementem różnicującym adipogeny.</li>
	<li>Przygotuj 4% PFA, dodając 4% paraformaldehydu (w/v) do 1x PBS.</li>
	<li>Przygotuj 0,3% PBS-Triton, mieszając 498,5 ml 1x PBS i 1,5 ml TritonX-100.</li>
	<li>Przygotuj bufor blokujący osła, mieszając 5% (v/v) surowicy osła, 1% BSA (w/v) i 0,3% PBS-Triton.</li>
	<li>Przygotuj bufor blokujący osioł + mama, mieszając 2,5 ml buforu blokującego osła i 2 krople bloku MOM.</li>
	<li>Przygotować roztwór barwiący DAPI, mieszając 600 nM 4′,6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) w 1x PBS.</li>
</ol>
2. Pobieranie tkanek
<ol>
	<li>Poddaj zwierzę eutanazji zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania. W przypadku myszy kolczastych zaleca się izofluran, a następnie CO2 (20% objętości klatki/min) i zwichnięcie kręgosłupa w celu zapewnienia śmierci.</li>
	<li>Umieść mysz na etapie preparacji w pozycji leżącej na plecach i dokładnie spryskaj 70% etanolem, aby zapobiec zanieczyszczeniu sierścią myszy.</li>
	<li>Wykonaj pionowe nacięcie o długości 2-3 cm na brzusznej linii środkowej i odsłoń klatkę piersiową i mięsień brzucha. Przeciąć mięsień w wyrostku mieczykowatym nożyczkami do tkanek i odsłonić przeponę. Wytnij membranę i klatkę piersiową po obu stronach. Użyj hemostatu, aby zacisnąć i odkleić pocięte żeberka.</li>
	<li>Naciąć prawy przedsionek nożyczkami do tkanek, umieścić igłę 23 G przymocowaną do strzykawki o pojemności 20 ml w wierzchołku serca i wykonać perfuzję, powoli wstrzykując 20 ml 2 mM PBS-EDTA.</li>
	<li>Wyciąć serce, opłukać na zimno 1x PBS na szalce Petriego o średnicy 60 mm na lodzie, usunąć przedsionki i oczyścić krew tak bardzo, jak to możliwe.</li>
	<li>Usuń skórę nad stawem kolanowym. Użyj cienkich kleszczy, aby usunąć powięź i odizoluj mięsień czworogłowy uda nożyczkami, używając kości udowej jako przewodnika. Umieścić na osobnej szalce Petriego z zimnym 1x PBS.</li>
	<li>Powtórz krok 2.6 dla drugiej nogi.</li>
</ol>
3. Trawienie tkankowe
<ol>
	<li>Dodać 2 ml buforu wytrawiającego do 5 ml fiolki transportowej dla serca i 4 ml buforu wytrawiającego do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml dla dwóch mięśni czworogłowych.</li>
	<li>Zmielić tkankę nożyczkami do tkanek na pokrywie szalki Petriego na mniejsze niż 1 mm3 kawałki.</li>
	<li>Dodaj zmieloną tkankę do odpowiednich probówek wytrawiających. Wiruj przez 2 sekundy na niskiej prędkości, aby wymieszać.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C, delikatnie obracając i wstrząsając.</li>
	<li>Po 20 minutach zdejmij rurki z rotatora i pozwól kawałkom tkanki osiąść. Zdjąć supernatant z pipetą P1000 do 20 ml lodowatego buforu FACS w probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Uzupełnij probówki wytrawiające odpowiednio 2 ml i 4 ml buforu wytrawiającego do trawienia serca i mięśni, a następnie umieść je z powrotem w temperaturze 37 °C, delikatnie obracając i potrząsając.</li>
	<li>Powtórzyć kroki od 3.5 do 3.6 jeszcze raz po kolejnych 20 minutach. Umieścić supernatant w odpowiedniej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml z kroku 3.5.</li>
	<li>Zatrzymaj trawienie po 60 minutach, gasząc bufor wytrawiający lodowatym buforem FACS.</li>
	<li>Przefiltrować zawiesinę wytrawiania i supernatant przez sitko komórkowe o wielkości 40 μm na wierzchu probówek wirówkowych o pojemności 50 ml. Uzupełnij do 40 ml buforem FACS.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórek w temperaturze 500 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 3 ml buforu do lizy ACK. Inkubować na lodzie przez 5 minut i uzupełnić do 40 ml buforem FACS.</li>
	<li>Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant.</li>
	<li>Zawiesić ponownie w 0,5 ml buforu FACS, pipetując w górę iw dół, aby zapewnić równomierne rozproszenie komórek.</li>
	<li>Przefiltrować zawiesinę przez filtr 40 μm na probówkach okrągłodennych z polistyrenu o pojemności 5 ml z nasadką z sitkiem komórkowym.</li>
</ol>
4. Barwienie do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS)
<ol>
	<li>W przypadku kontroli jednokolorowych i fluorescencji minus jeden (FMO) należy przygotować 30 μl buforu barwiącego (przeciwciała rozcieńczone w buforze FACS) o stężeniu roboczym 2x we wstępnie znakowanych probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z konfiguracją bufora do barwienia przeciwciał.</li>
	<li>Przygotuj osobno pojedyncze kolory i kontrolki FMO dla mięśni i serca.</li>
	<li>Przenieść 30 μl jednokolorowego buforu barwiącego do kontroli FMO na płytkę 96-dołkową. Uzupełnić 20 μl buforu FACS.</li>
	<li>Do barwienia próbki FACS należy przygotować 0,5 ml buforu barwiącego (przeciwciało rozcieńczone w buforze FACS) o stężeniu roboczym 2x w probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Dodać 10 μl zawiesiny komórkowej do studzienek jednokolorowych i kontrolnych FMO. Dodać bufor barwiący do reszty zawiesiny komórek i ponownie zawiesić.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem przez 30 minut.</li>
	<li>Uzupełnić studzienki 100 μl buforu FACS, a probówkę z próbką 2 ml buforu FACS.</li>
	<li>Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.</li>
	<li>Powtórz kroki 4.7 i 4.8.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w buforze żywotności. 100 μl dla próbek jednokolorowych i kontrolnych FMO, 1 ml dla próbek sortujących FACS.</li>
	<li>Przygotować probówki zbiorcze, dodając 300 μl pożywki proliferacyjnej do probówek wirówkowych o pojemności 1,7 ml.</li>
</ol>
5. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją
<ol>
	<li>Strategia bramkowania: Użyj FSC vs. SSC (log) do usuwania gruzu. Użyj FSC-H vs. FSC-A do podkoszulków bramowych. Użyj CD31 vs. PI do bramki na komórkach żywotnych i ujemnych pod względem linii. Użyj PDGFRα do bramki dla FAP (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Sortuj do wcześniej przygotowanych probówek zbiorczych.</li>
</ol>
6. Hodowla tkankowa
<ol>
	<li>Odwirować zebrane komórki przy sile 800 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć supernatant za pomocą pipety P1000. Uważaj, aby nie naruszyć osadu komórkowego.</li>
	<li>Zawiesić osad w pożywce hodowlanej (250 μl/basenik) i wysiać nasiona przy 25 tys. komórek/basenie na 48-dołkowej płytce do hodowli tkankowej.</li>
	<li>Hodowla w inkubatorze (37 °C, 5 % CO2 ). Zmieniaj pożywkę co 3 dni, aż komórki osiągną 80% zbieżności.</li>
</ol>
7. Różnicowanie fibrogenne
<ol>
	<li>Gdy komórki są gotowe do leczenia, przed użyciem umieść podstawowe podłoża i 1x DPBS w ciepłej kąpieli lub w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odessać pożywkę hodowlaną.</li>
	<li>Spłukać dwukrotnie 200 μl 1x DPBS.</li>
	<li>Spłukać jednorazowo 200 μl podłoża zasadowego.</li>
	<li>Dodać 250 μl pożywki fibrogennej lub zasadowej do odpowiednich studzienek.</li>
	<li>Umieścić komórki z powrotem w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ).</li>
	<li>Różnicowanie należy przerwać po 48 godzinach.</li>
</ol>
8. Różnicowanie adipogenne
<ol>
	<li>Gdy komórki są gotowe do leczenia, przed ich użyciem umieść podłoża podstawowe, podłoża adipogenne i 1x DPBS w ciepłej kąpieli lub w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odessać pożywkę hodowlaną.</li>
	<li>Spłukać dwukrotnie 200 μl 1x DPBS.</li>
	<li>Spłukać jednorazowo 200 μl podłoża zasadowego.</li>
	<li>Dodaj 400 μl pożywki adipogenicznej lub zasadowej do odpowiednich studzienek.</li>
	<li>Powrót do inkubatora (37°C, 5% CO2 ).</li>
	<li>Co 2 dni wyjmować pipetą z dołków 200 μl pożywki i dodawać 200 μl świeżej pożywki adipogenicznej lub zasadowej.</li>
	<li>Zatrzymaj różnicowanie w 6 dniu w przypadku FAP mięśni szkieletowych i 14 dnia w przypadku FAP serca.</li>
</ol>
9. Barwienie immunologiczne
<ol>
	<li>Zatrzymać test różnicowania przez zasysanie pożywki i dwukrotne przepłukanie 250 μl 1x PBS. Wszystkie płukania należy wykonywać za pomocą igły 18 G dołączonej do strzykawki o pojemności 3 ml, aby uniknąć odwarstwienia komórek.</li>
	<li>Dodać 250 μl 4% PFA do dołka i inkubować w temperaturze pokojowej przez 7 minut.</li>
	<li>Usuń PFA i płucz 3 razy przez 5 minut za każdym razem 250 μl 1x PBS.</li>
	<li>Podczas ostatniego prania odessać 1x PBS i dodać 250 μL buforu blokującego Donkey + MOM.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 60 minut.</li>
	<li>Przygotować pierwszorzędowy roztwór do barwienia przeciwciał w buforze blokującym osła (anty-SMA i anty-perylipina) na końcową objętość 100 μl na studzienkę.</li>
	<li>Zassać dołki barwiące. Pozostaw bufor blokujący osioł + MOM w dobrym stanie kontrolnym, jeśli ma to zastosowanie.</li>
	<li>Dodaj pierwszorzędowy roztwór barwiący przeciwciała do odpowiednich studzienek.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Następnego dnia umyj 3 razy przez 5 minut za każdym razem 1x PBS.</li>
	<li>Przygotować wtórny roztwór do barwienia przeciwciał w buforze blokującym osła o końcowej objętości 100 μl na studzienkę.</li>
	<li>Odessać ostatnie płukanie i dodać wtórny roztwór barwiący przeciwciała do wszystkich studzienek.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 45 minut (od tego momentu próbki należy chronić przed światłem).</li>
	<li>Umyj 3 razy przez 5 minut za każdym razem za pomocą 1x PBS.</li>
	<li>Odessać ostatnie płukanie i dodać 250 μl roztworu barwiącego DAPI.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
	<li>Usuń roztwór barwiący DAPI i umyj raz przez 5 minut 1x PBS.</li>
	<li>Dodać 100 μl Fluoromount-G do każdej studzienki.</li>
	<li>Uszczelnij płytkę pokrywką i folią parafinową, aby zminimalizować parowanie. Przechowywać w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem do czasu wykonania zdjęcia.</li>
	<li>Obraz pod mikroskopem (<silna klasa="xfig">Rysunek 3 i <silna klasa="xfig">Rysunek 4). 
	UWAGA: Surowica osła jest używana do blokowania bufora jako specyficzny dla gatunku blok przeciwko przeciwciałom drugorzędowym podniesionym przez osła, które są używane w tym protokole. Odczynnik blokujący typu mysz na myszy jest używany przeciwko pierwszorzędowemu przeciwciału anty-SMA, które jest wzniesione u myszy.</li>
</ol>

Mouse Heart and Skeletal Muscle Digestion for Fibro-Adipogenic Progenitor Culture

<ol><li>Gaire, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spiny+mouse+%28Acomys%29%3A+An+emerging+research+organism+for+regenerative+medicine+with+applications+beyond+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Spiny mouse (Acomys): An emerging research organism for regenerative medicine with applications beyond the skin.</a> NPJ Regen Med. 6, 1(2021).</li>
<li>Sandoval, A. G. W., Maden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+in+the+spiny+mouse%2C+Acomys%2C+a+new+mammalian+model%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">Regeneration in the spiny mouse, Acomys, a new mammalian model.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 64, 31-36 (2020).</li>
<li>Judson, R. N., Zhang, R. H., Rossi, F. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+mesenchymal+stem%2Fprogenitor+cells+in+skeletal+muscle%3A+Collaborators+or+saboteurs%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident mesenchymal stem/progenitor cells in skeletal muscle: Collaborators or saboteurs.</a> FEBS J. 280 (17), 4100-4108 (2013).</li>
<li>Uezumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrosis+and+adipogenesis+originate+from+a+common+mesenchymal+progenitor+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Fibrosis and adipogenesis originate from a common mesenchymal progenitor in skeletal muscle.</a> J Cell Sci. 124, 3654-3664 (2011).</li>
<li>Joe, A. W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+injury+activates+resident+fibro%2Fadipogenic+progenitors+that+facilitate+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis.</a> Nat Cell Biol. 12, 153-163 (2010).</li>
<li>Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+progenitors+distinct+from+satellite+cells+contribute+to+ectopic+fat+cell+formation+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle.</a> Nat Cell Biol. 122 (12), 143-152 (2010).</li>
<li>Soliman, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+Potential+of+Hic1-Expressing+Cardiac+Stromal+Progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Pathogenic Potential of Hic1-Expressing Cardiac Stromal Progenitors.</a> Cell Stem Cell. 26 (2), 205-220 (2020).</li>
<li>Hall, C., Gehmlich, K., Denning, C., Pavlovic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+relationship+between+cardiac+fibroblasts+and+cardiomyocytes+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Heart+Assoc%22%5BJournal%5D)">Complex relationship between cardiac fibroblasts and cardiomyocytes in health and disease.</a> J Am Heart Assoc. 10, 1-15 (2021).</li>
<li>Gawriluk, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+ear-hole+closure+identifies+epimorphic+regeneration+as+a+discrete+trait+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of ear-hole closure identifies epimorphic regeneration as a discrete trait in mammals.</a> Nat Commun. 71 (7), 1-16 (2016).</li>
<li>Seifert, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+shedding+and+tissue+regeneration+in+African+spiny+mice+%28Acomys%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Skin shedding and tissue regeneration in African spiny mice (Acomys).</a> Nature. 489, 561(2012).</li>
<li>Koopmans, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemic+tolerance+and+cardiac+repair+in+the+spiny+mouse+%28Acomys%29%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Ischemic tolerance and cardiac repair in the spiny mouse (Acomys).</a> NPJ Regen Med. 6, 78(2021).</li>
<li>Peng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+spiny+mice+%28Acomys%29+exhibit+endogenous+cardiac+recovery+in+response+to+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Adult spiny mice (Acomys) exhibit endogenous cardiac recovery in response to myocardial infarction.</a> NPJ Regen Med. 6, 74(2021).</li>
<li>Maden, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfect+chronic+skeletal+muscle+regeneration+in+adult+spiny+mice%2C+Acomys+cahirinus%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Perfect chronic skeletal muscle regeneration in adult spiny mice, Acomys cahirinus.</a> Sci Rep. 8, 8920(2018).</li>
<li>Riparini, G., Simone, J. M., Sartorelli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS-isolation+and+culture+of+fibro-adipogenic+progenitors+and+muscle+stem+cells+from+unperturbed+and+injured+mouse+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">FACS-isolation and culture of fibro-adipogenic progenitors and muscle stem cells from unperturbed and injured mouse skeletal muscle.</a> J Vis Exp. (184), e63983(2022).</li>
<li>Low, M., Eisner, C., Rossi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibro%2Fadipogenic+progenitors+%28FAPs%29%3A+Isolation+by+FACS+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Fibro/adipogenic progenitors (FAPs): Isolation by FACS and culture.</a> Methods Mol Biol. 1556, 179-189 (2017).</li>
<li>Molina, T., Fabre, P., Dumont, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibro-adipogenic+progenitors+in+skeletal+muscle+homeostasis%2C+regeneration+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biol%22%5BJournal%5D)">Fibro-adipogenic progenitors in skeletal muscle homeostasis, regeneration and diseases.</a> Open Biol. 11 (12), 210110(2021).</li>
<li>Contreras, O., Rossi, F. M. V., Theret, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins%2C+potency%2C+and+heterogeneity+of+skeletal+muscle+fibro-adipogenic+progenitors-time+for+new+definitions%5BTitle%5D)+AND+%22Skelet+Muscle%22%5BJournal%5D)">Origins, potency, and heterogeneity of skeletal muscle fibro-adipogenic progenitors-time for new definitions.</a> Skelet Muscle. 111 (11), 1-25 (2021).</li>
<li>Fitzgerald, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MME%2B+fibro-adipogenic+progenitors+are+the+dominant+adipogenic+population+during+fatty+infiltration+in+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">MME+ fibro-adipogenic progenitors are the dominant adipogenic population during fatty infiltration in human skeletal muscle.</a> Commun Biol. 61 (6), 1-21 (2023).</li>
<li>Babaeijandaghi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DPPIV%2B+fibro-adipogenic+progenitors+form+the+niche+of+adult+skeletal+muscle+self-renewing+resident+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">DPPIV+ fibro-adipogenic progenitors form the niche of adult skeletal muscle self-renewing resident macrophages.</a> Nat Commun. 141 (14), 1-10 (2023).</li>
<li>Schutz, P. W., Cheung, S., Yi, L., Rossi, F. M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+activation+patterns+of+CD10%2B+fibro-adipogenic+progenitors+across+acquired+disease+states+in+human+skeletal+muscle+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Cellular activation patterns of CD10+ fibro-adipogenic progenitors across acquired disease states in human skeletal muscle biopsies.</a> Free Neuropathol. 5, 3-3 (2024).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów.

Kolczaste tkanki myszy są bardziej wrażliwe na stresy związane z dysocjacją tkanek i istnieje kilka aspektów tego protokołu mających na celu zminimalizowanie stresu w celu poprawy żywotności komórek. Technika seryjnej dysocjacji enzymatycznej jest stosowana do przygotowania próbki w celu obniżenia wymaganego stężenia enzymu. W miarę postępu trawienia enzymatycznego aktywność enzymatyczna maleje. Zastępując go świeżymi enzymami, można lepiej osiągnąć stałą aktywność enzymatyczną podczas całego trawienia i uniknąć wysokich...

Początkowo rozpoznawana ze względu na wyjątkowo delikatną skórę i niezwykłą zdolność do naprawiania urazów skóry, mysz kolczasta wykazała wyższą zdolność regeneracyjną w różnych układach narządów, takich jak mięśniowo-szkieletowe, nerkowe, ośrodkowy układ nerwowy i sercowo-naczyniowy, w porównaniu do Mus musculus1,2.
Progenitorzy fibro-adipogenni (FAP) to podzbiór komórek zrębu, które rezydują w różnych tkankach, w tym w mięśniu szkieletowym i sercowym. Komórki te posiadają unikalną zdolność do angażowania się w linie fibrogenne i adipogenne in vivo i in vitro3,4. FAP odgrywają kluczową rolę w regeneracji tkanek poprzez modulację macierzy zewnątrzkomórkowej i wspieranie funkcji innych typów komórek biorących udział w procesie naprawy. W mięśniach szkieletowych FAP aktywują się w odpowiedzi na uraz i ułatwiają różnicowanie komórek macierzystych mięśni oraz miogenezę5,6. W niedokrwiennym uszkodzeniu serca FAP odkładają tkankę bliznowatą, aby utrzymać integralność mięśnia sercowego. W przeciwieństwie do mięśni, FAP serca stają się chronicznie aktywowane i przyczyniają się do patologicznej przebudowy7,8.
Poprzednie badania wykazały, że macierz zewnątrzkomórkowa myszy kolczastej ma inny skład, strukturę i właściwości, które wspierają regenerację w porównaniu do Mus musculus9,10. W urazach mięśni i serca zauważono, że FAP przyczyniają się do lepszego leczenia u kolczastych myszy11,12,13. Zrozumienie zachowania i kontroli regulacyjnej FAP i zrębu myszy kolczastych może rzucić światło na mechanizm stojący za ich zdolnościami regeneracyjnymi. Podczas gdy FAP są szeroko badane w innych modelach zwierzęcych, takich jak mus musculus14,15, obecnie nie ma opublikowanych protokołów izolowania FAP myszy kolczastych. Opracowanie takiego protokołu wypełniłoby istotną lukę w tej dziedzinie i umożliwiłoby naukowcom zbadanie mechanizmów komórkowych i molekularnych leżących u podstaw potencjału regeneracyjnego myszy kolczastej.
Ten protokół opisuje solidny i powtarzalny protokół do izolowania, rozszerzania i różnicowania FAP mięśni szkieletowych i sercowych od myszy kolczastej. Opisany tutaj protokół daje wysokiej jakości zawiesiny pojedynczych komórek, które są odpowiednie do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS). Używając rh-TGFβ1 lub kompatybilnej pożywki dostępnej na rynku, dwóch metod szeroko stosowanych do różnicowania FAP mus musculus16, posortowane kolczaste FAP zachowują zdolność do różnicowania się odpowiednio wzdłuż linii fibrogennej i linii adipogennej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1).

<table><tbody><tr><td>0.5M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575&ndash; 038</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek 1,7 ml</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>15&nbsp; ml probówka wirówkowa</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>1x Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>20 ml strzykawka</td><td>BD</td><td>309661</td><td></td></tr><tr><td>4&prime;,6-diamidyno-2-fenyloindol (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>40&nbsp; &mu; m sitko komórkowe</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>48-dołkowa płaska płytka do hodowli tkankowej</td><td>Falcon</td><td>53078</td><td></td></tr><tr><td>5 ml polipropylen</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>5 ml polistyrenowa probówka okrągłodenna z nasadką sitową</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr> 5 <tr><td>ml strzykawka</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>50&nbsp; ml probówka wirówkowa</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>60 mm szalka Petriego</td><td>Falcon</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka do hodowli tkankowej z dnem w kształcie litery V</td><td>Corning</td><td>3894<</td><td></td></tr><tr><td>em>Acomys dimidiatus myszy (myszy kolczaste)</td><td></td><td></td><td>uprzejmie podarowane przez dr Ashley W. Seifert (University of Kentucky).</td></tr><tr><td>Bufor lizujący chlorek amonu i potasu (ACK)</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>Antyperylipina (1:100)</td><td>Sigma</td><td>P1873</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SMA (1:100)</td><td>Invitrogen</td><td>14-9760-82</td><td></td></tr><tr><td>APC PDGFRa (1:800)</td><td>Abcam</td><td>ab270085</td><td></td></tr><tr><td>BD Igła PrecisionGlide 18 G</td><td>BD</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>Igła BD PrecisionGlide 23 G</td><td>BD</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>A7906-100g</td><td></td></tr><tr><td>BV605 CD31 (1:500)</td><td>BD biosciences</td><td>744359</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Osioł anty-mysz Alexa 555 (1:1000)</td><td>Invitrogen</td><td>A31570</td><td></td></tr><tr><td>Osioł anty-królik Alexa 647 (1:1000)</td><td>Invitrogen</td><td>A31573</td><td></td></tr><tr><td>Serum osła</td><td>Sigma</td><td>S30-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Sorter FACS - MoFlo Astrios 5 laserów</td><td>Redlica Beckman</td><td>B52102</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Gemini</td><td>100-500</td><td></td></tr><tr><td>Drobne nożyczki</td><td>FST</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>FST</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td>Hemostat</td><td>FST</td><td>91308-12</td><td></td></tr><tr><td>ludzkie białko rekombinowane FGF-zasadowe (bFGF)</td><td>Gibco</td><td>13256029</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie białko rekombinowane TGF beta 1 (TGFb1)</td><td>eBiosciences</td><td>14-8348-62</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator - Heracell 160i CO2</td><td>ThermoFisher</td><td>51033557</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony - Revolve</td><td>ECHO</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Liberase</td><td>Roche</td><td>5401127001</td><td></td></tr><tr><td>Mouse MesenCult Adipogenic Differentiation 10x Suplement</td><td>STEMCELL technologies</td><td>5507</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik blokujący mysz na myszy (MOM)</td><td>Vector Laboratories</td><td>MKB-2213</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>P1648-500g</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140&ndash; 122</td><td></td></tr><tr><td>PicoLab Mouse Diet 20</td><td>LabDiet</td><td>3005750-220</td><td></td></tr><tr><td>Jodek propidyny (PI)</td><td>Invitrogen</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>Fiolka transportowa 5mL tubka</td><td>Caplugs Evergreen</td><td>222-3005-080</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>9036-19-5</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja, ekspansja i różnicowanie fibro-adipogennych progenitorów od modelu myszy kolczastej

Fibro-Adipogenic Progenitor Isolation, Expansion, and Differentiation from the Spiny Mouse Model

Ze względu na swój wyjątkowy program naprawczy, mysz kolczasta jest nowym modelem badawczym dla medycyny regeneracyjnej. Drobnoustrojowi przodkowie fibro-adipogenni to komórki rezydujące w tkankach, które są zdolne do różnicowania się w adipocyty, fibroblasty i chondrocyty. Fibroadipogenni progenitorzy mają fundamentalne znaczenie dla orkiestracji regeneracji tkanek, ponieważ są odpowiedzialne za przebudowę macierzy zewnątrzkomórkowej po urazie. Badanie to koncentruje się na zbadaniu specyficznej roli włóknisto-adipogennych komórek progenitorowych w naprawie serca myszy kolczastej i regeneracji mięśni szkieletowych. W tym celu zoptymalizowano protokół oczyszczania kolczastych mięśni progenitorowych włóknisto-adipogennych myszy za pomocą cytometrii przepływowej z enzymatycznie dysocjowanych mięśni szkieletowych i sercowych. Populacja uzyskana z tego protokołu jest zdolna do ekspansji in vitro i może być różnicowana do miofibroblastów i adipocytów. Protokół ten stanowi cenne narzędzie dla naukowców do zbadania charakterystycznych właściwości myszy kolczastej i porównania ich z Mus musculus. Dostarczy to informacji, które mogą przyczynić się do lepszego zrozumienia mechanizmów regeneracyjnych w tym intrygującym modelu.

Schemat tego protokołu izolacji i hodowli FAP mięśni szkieletowych i serca przedstawiono w Rysunku 1. W przypadku pobierania tkanek zmiana koloru wątroby z ciemnoczerwonej na bladożółtą zazwyczaj świadczy o prawidłowym przebiegu perfuzji. Przy określonym przedziale wiekowym myszy kolczastej masa serca wynosi zazwyczaj około 200 mg, natomiast masa mięśnia czworogłowego wynosi około 350 mg.
Podczas każdej wymiany buforu trawiennego w krokach 3.5-3.7 bufor w probówka...

Ten protokół opisuje izolację mięśni szkieletowych i mięśni sercowych włóknisto-adipogennych (FAP) od myszy kolczastej (Acomys) poprzez dysocjację enzymatyczną i sortowanie komórek aktywowane fluorescencją. FAP uzyskane z tego protokołu mogą być skutecznie rozszerzane i różnicowane do miofibroblastów i adipocytów.

Izolacja, ekspansja i różnicowanie fibro-adipogennych progenitorów od modelu myszy kolczastej

Due to its exceptional repair program, the spiny mouse is an emerging research model for regenerative medicine. Fibro-adipogenic progenitors are ...

Naszą nadrzędną wizją jest lepsze zrozumienie i uchwycenie komunikacji komórkowej i zachowania komórek, co prowadzi do homeostazy tkanek i tego, w jaki sposób procesy komórkowe są nieprawidłowo regulowane podczas naprawy FAP. W tym celu używamy różnych modeli, z których jednym jest kolczasta mysz. Jednym z głównych problemów związanych z tym nowym modelem myszy jest brak narzędzi do jego badania.W tym przypadku przedstawiamy nowy protokół, który zawiera niezawodne trawienie enzymatyczne i barwienie przeciwciał, co pozwala nam z powodzeniem sortować włóknisto-adipogenne komórki progenitorowe i hodować je in vitro w celu dalszej analizy ich losu. Przetestowaliśmy różne kombinacje i stężenia enzymów, a także wiele przeciwciał, a nasza metoda stanowi odniesienie dla najbardziej wiarygodnego i solidnego protokołu. Ponieważ mamy teraz niezawodne trawienie enzymatyczne, będziemy nadal testować inne markery i przeciwciała, aby skutecznie analizować komórki śródbłonka, perycyty, komórki odpornościowe i komórki miogenne.Na początek umieść uśpioną mysz na etapie sekcji w pozycji leżącej. Dokładnie spryskaj sierść myszy 70% etanolem. Wykonaj pionowe nacięcie o długości od dwóch do trzech centy

fibro-adipogenic-progenitor-isolation-expansion-differentiation-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Tutaj przedstawiamy metodę izolacji populacji komórek progenitorowych adipocytów (APC) z okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej (PVAT) za pomocą sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MCS). Metoda ta pozwala na zwiększoną izolację APC na gram tkanki tłuszczowej w porównaniu z sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencją (FACS).

Ekspansja i indukcja adipogenezy progenitorów adipocytów z okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej izolowanej przez magnetyczne sortowanie komórek aktywowanych

Ten protokół opisuje techniczne podejście do izolowania subpopulacji komórek zrębu adipogennych i włóknisto-zapalnych z mysich magazynów białej tkanki tłuszczowej (WAT) w jamie brzusznej poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją lub separację kulek immunomagnetycznych.

Izolacja adipogennych i włóknisto-zapalnych subpopulacji komórek zrębu z mysich wewnątrzbrzusznych magazynów tłuszczu

Prezentujemy prostą metodę izolowania wysoce żywotnych komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej z najądrzy myszy za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją.

Preparat komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej tkanki tłuszczowej najądrza myszy

Ten raport opisuje protokół jednoczesnej izolacji pierwotnych brązowych i białych preadipocytów od nowonarodzonych myszy. Wyizolowane komórki można hodować w hodowli i indukować do różnicowania się w pełni dojrzałe białe i brązowe adipocyty. Metoda umożliwia genetyczną, molekularną i funkcjonalną charakterystykę pierwotnych komórek tłuszczowych w hodowli.

Izolacja i różnicowanie pierwotnych białych i brązowych preadipocytów od nowonarodzonych myszy

Ten protokół opisuje izolację preadipocytów myszy z podskórnego tłuszczu, ich różnicowanie na dojrzałe adipocyty oraz indukcję insulinooporności. Działanie insuliny ocenia się na podstawie fosforylacji/aktywacji członków szlaku sygnałowego insuliny przez western blot. Metoda ta pozwala na bezpośrednie określenie insulinooporności/wrażliwości w adipocytach pierwotnych.

Zróżnicowane adipocyty myszy w hodowli pierwotnej: model insulinooporności

Precyzyjna identyfikacja fibro-adipogennych komórek progenitorowych (FAP) i komórek macierzystych mięśni (MuSCs) jest kluczowa dla badania ich funkcji biologicznej w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Protokół ten zawiera wytyczne dotyczące izolacji, oczyszczania i hodowli FAP i MuSC z mięśni dorosłych myszy.

FACS-Izolacja i hodowla włóknisto-adipogennych progenitorów i mięśniowych komórek macierzystych z niezakłóconych i uszkodzonych mięśni szkieletowych myszy

Preadipocyty są izolowane z frakcji naczyniowej zrębu międzyłopatkowej brązowej tkanki tłuszczowej od nowonarodzonych myszy i różnicowane w komórki, które gromadzą kropelki lipidów, wyrażają markery molekularne i pokazują morfologię mitochondriów dojrzałych brązowych adipocytów. Komórki te są dalej analizowane za pomocą immunofluorescencji i transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Różnicowanie i obrazowanie brązowych adipocytów z frakcji zrębowej naczyniowej tkanki tłuszczowej śródłopatkowej od nowonarodzonych myszy

Ten protokół opisuje półautomatyczną izolację frakcji zrębu naczyniowego (SVF) z mysiej tkanki tłuszczowej w celu uzyskania preadipocytów i osiągnięcia różnicowania adipocytów in vitro. Użycie dysocjatora tkankowego do trawienia kolagenazy zmniejsza zmienność eksperymentalną i zwiększa odtwarzalność.

Półautomatyczna izolacja zrębu frakcji naczyniowej z mysiej białej tkanki tłuszczowej za pomocą dysocjatora tkankowego

Tutaj opisujemy izolację, hodowlę i indukcję adipogenną preadipocytów pochodzących z frakcji naczyniowej zrębu z mysiej tkanki tłuszczowej okołoaortalnej, co pozwala na badanie funkcji okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej i jej związku z komórkami naczyniowymi.

Izolacja, hodowla i indukcja adipogenna preadipocytów pochodzących z frakcji zrębu naczyniowego z mysiej tkanki tłuszczowej okołooortalnej

Rozmiar i kruchość dojrzałych adipocytów ograniczyły dostępne techniki i narzędzia do ich badania i izolacji. W tym miejscu opisano protokół izolacji dojrzałych mysich adipocytów, który można łatwo dostosować do różnych magazynów tłuszczowych i diety myszy.

Izolacja i hodowla pierwotnych mysich adipocytów od myszy chudych i otyłych

Poznaj izolację fibro-adipogennych progenitorów z mięśni szkieletowych i serca myszy kolczastej Acomys przy użyciu enzymatycznej dysocjacji i sortowania komórek FACS. Metoda umożliwia ekspansję i różnicowanie komórek FAP w myofibroblasty oraz adipocyty.

Izolacja, ekspansja i różnicowanie fibro-adipogennych progenitorów od modelu myszy kolczastej

Przeglądaj więcej filmów