Izolacja, ekspansja i różnicowanie fibro-adipogennych progenitorów od modelu myszy kolczastej

Naszą nadrzędną wizją jest lepsze zrozumienie i uchwycenie komunikacji komórkowej i zachowania komórek, co prowadzi do homeostazy tkanek i tego, w jaki sposób procesy komórkowe są nieprawidłowo regulowane podczas naprawy FAP. W tym celu używamy różnych modeli, z których jednym jest kolczasta mysz. Jednym z głównych problemów związanych z tym nowym modelem myszy jest brak narzędzi do jego badania.

W tym przypadku przedstawiamy nowy protokół, który zawiera niezawodne trawienie enzymatyczne i barwienie przeciwciał, co pozwala nam z powodzeniem sortować włóknisto-adipogenne komórki progenitorowe i hodować je in vitro w celu dalszej analizy ich losu. Przetestowaliśmy różne kombinacje i stężenia enzymów, a także wiele przeciwciał, a nasza metoda stanowi odniesienie dla najbardziej wiarygodnego i solidnego protokołu. Ponieważ mamy teraz niezawodne trawienie enzymatyczne, będziemy nadal testować inne markery i przeciwciała, aby skutecznie analizować komórki śródbłonka, perycyty, komórki odpornościowe i komórki miogenne.

Na początek umieść uśpioną mysz na etapie sekcji w pozycji leżącej. Dokładnie spryskaj sierść myszy 70% etanolem. Wykonaj pionowe nacięcie o długości od dwóch do trzech centymetrów na brzusznej linii środkowej.

Odsłoń klatkę piersiową i mięsień brzucha. Następnie użyj nożyczek do tkanek, aby przeciąć mięsień w wyrostku mieczykowatym i odsłonić przeponę. Teraz przetnij membranę i klatkę piersiową po obu stronach.

Zaciśnij i obierz pokrojone żeberka za pomocą hemostatu. Naciąć prawy przedsionek nożyczkami do tkanek. Następnie włóż igłę o rozmiarze 23 przymocowaną do strzykawki o pojemności 20 ml do wierzchołka serca.

Powoli wstrzyknąć 20 ml 2 mM PBS EDTA do serca. Odciąć go i umieścić na szalce Petriego o średnicy 60 mm zawierającej zimny PBS na lodzie. Usuń przedsionki i wypłucz jak najwięcej krwi.

Następnie usuń skórę nad stawem kolanowym myszy. Za pomocą cienkich kleszczy usuń powięź. Użyj nożyczek, aby odizolować mięsień czworogłowy uda z kością udową jako prowadnicą.

Następnie przenieś mięsień czworogłowy uda na oddzielną szalkę Petriego zawierającą zimny PBS. Na początek dodaj dwa ml buforu wytrawiającego do 5 ml fiolki transportowej zawierającej tkankę serca myszy i 4 ml buforu trawiennego do 15 ml probówki wirówkowej zawierającej tkankę szkieletową myszy. Umieść tkankę mięśnia sercowego i mięśnia czworogłowego wyizolowaną od myszy kolczastej na pokrywie szalki Petriego.

Za pomocą nożyczek do tkanek zmiel go na kawałki mniejsze niż 1 mm sześcienny. Przenieś zmieloną tkankę do odpowiednich probówek wytrawiających. Wiruj zawartość probówek przez dwie sekundy z małą prędkością.

Po 20 minutach wyjmij rurki z rotatora. Pozwól, aby kawałki tkanki opadły. Użyj pipety P1000 do zasysania supernatantu.

Przenieść supernatant do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml zawierających 20 ml lodowatego buforu FACS. Uzupełnić probówki wytrawiające odpowiednią objętością buforu wytrawiającego. Ponownie wysiaduj je na rotatorze.

Po poddaniu mięśni kolejnej rundzie trawienia dodaj lodowaty bufor FACS, aby ugasić trawienie. Umieść sitko o pojemności 40 mikrometrów na probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Przefiltrować zawiesinę wytrawiającą i supernatant przez sitko.

Odwirować zawiesinę komórek o stężeniu 500 G przez osiem minut w temperaturze 4 °C. Po usunięciu supernatantu dodać 3 ml buforu do lizy ACK do osadu i ponownie zawiesić. Inkubować zawiesinę przez pięć minut na lodzie. Uzupełnij objętość do 40 ml buforem FACS.

Ponownie odwirować próbki w temperaturze 500 G przez pięć minut w temperaturze 4 °C. Po dekantacji supernatantu ponownie zawiesić osad w 0,5 ml buforu FACS. Na koniec przefiltruj zawiesinę przez 40-mikrometrową nasadkę sitową umieszczoną na probówce z okrągłym dnem z polistyrenu o pojemności 5 ml. Na początek przygotuj 30 l buforu barwiącego o 2-krotnych stężeniach roboczych do kontroli jednokolorowych i FMO.

Przenieś jednokolorowy i kontrolny bufor barwiący FMO do dołków 96-dołkowej płytki. Uzupełnij objętość 20 litrami bufora FACS. Aby zabarwić próbkę, należy przygotować 0,5 ml 2x buforu barwiącego FACS w probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml.

Odpipetować 10 L zawiesiny celi do studzienek jednokolorowych i kontrolnych FMO. Następnie dodaj 2x bufor barwiący FACS do reszty zawiesiny komórek i inkubuj. Następnie dodać 100 l buforu FACS do studzienek i dwa ml buforu do probówek z próbkami.

Odwirować w stężeniu 500 g przez pięć minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant, a następnie ponownie zawiesić osad komórkowy w buforze żywotności. Dodać 300 l pożywki proliferacyjnej do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml. Będą one działać jako probówki zbiorcze do sortowania komórek.

Po posortowaniu komórek za pomocą FACS, odwirować zebrane komórki w temperaturze 800 G przez 10 minut w temperaturze 4 C. Użyć pipety P1000, aby ostrożnie usunąć supernatant bez naruszania osadu. Ponownie zawiesić osad w pożywce proliferacyjnej do końcowej gęstości 100 komórek na mikrolitr. Wysiew zawiesinę komórkową do dołków 48-dołkowej płytki do hodowli tkankowej.

Na koniec przenieść płytkę do inkubatora w temperaturze 37 °C pod odpowiednią suplementacją gazem, aż komórki zaczną się zlewać. Zlewające się komórki o typowej morfologii fibroblastów uzyskano w ciągu pięciu dni hodowli.