Name: Bezznacznikowy przepływ pracy proteomiki ilościowej dla interakcji gospodarz-patogen opartych na odkryciach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 37 s
Description: Odkryj bezetykietową proteomikę ilościową do badania interakcji gospodarz-patogen z wykorzystaniem spektrometrii masowej. Ta metoda pozwala identyfikować białka związane z infekcją Cryptococcus neoformans i makrofagów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Dr. Jonathanowi Kriegerowi z Bioinformatics Solutions Inc. za obsługę spektrometru mas do reprezentatywnych eksperymentów, a także członkom grupy Geddes-McAlister za pomoc w przygotowaniu eksperymentu i informacji zwrotnej na temat manuskryptu. Autorzy potwierdzają wsparcie finansowe, częściowo, ze strony Banting Research Foundation – The Jarislowsky Fellowship Discovery Award, New Frontiers Research Fund – Exploration (NFRFE-2019-00425) oraz Canadian Foundation for Innovation (JELF 38798) dla J.G.M., a także NSERC Canada Graduate Scholarship – Masters and Ontario Graduate Scholarship dla B.B. oraz Queen Elizabeth II Graduate Scholarship in Science and Technology dla AS.

<ol><li>Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R., Denning, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+and+Multi-National+Prevalence+of+Fungal+Diseases-Estimate+Precision%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fungi%22%5BJournal%5D)">Global and Multi-National Prevalence of Fungal Diseases-Estimate Precision.</a> Journal of Fungi. , (2017).</li>
<li>Tugume, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-Associated+cryptococcal+meningitis+occurring+at+relatively+higher+CD4+counts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">HIV-Associated cryptococcal meningitis occurring at relatively higher CD4 counts.</a> Journal of Infectious Diseases. 219 (6), 877-883 (2019).</li>
<li>Rajasingham, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+burden+of+disease+of+HIV-associated+cryptococcal+meningitis%3A+an+updated+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Global burden of disease of HIV-associated cryptococcal meningitis: an updated analysis.</a> The Lancet Infectious Diseases. , (2017).</li>
<li>Perfect, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antifungal+pipeline%3A+A+reality+check%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">The antifungal pipeline: A reality check.</a> Nature Reviews Drug Discovery. , (2017).</li>
<li>Bermas, A., Geddes-McAlister, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combatting+the+evolution+of+anti-fungal+resistance+in+Cryptococcus+neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Combatting the evolution of anti-fungal resistance in Cryptococcus neoformans.</a> Molecular Microbiology. , 1-14 (2020).</li>
<li>Geddes-McAlister, J., Shapiro, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+pathogens%2C+new+tricks%3A+Emerging%2C+drug-resistant+fungal+pathogens+and+future+prospects+for+antifungal+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">New pathogens, new tricks: Emerging, drug-resistant fungal pathogens and future prospects for antifungal therapeutics.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. , (2018).</li>
<li>Ball, B., Bermas, A., Carruthers-Lay, D., Geddes-McAlister, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometry-Based+Proteomics+of+Fungal+Pathogenesis%2C+Host-Fungal+Interactions%2C+and+Antifungal+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fungi%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometry-Based Proteomics of Fungal Pathogenesis, Host-Fungal Interactions, and Antifungal Development.</a> Journal of Fungi. , (2019).</li>
<li>Sukumaran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+communication+patterns+of+the+innate+immune+system+by+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukocyte+Biol%22%5BJournal%5D)">Decoding communication patterns of the innate immune system by quantitative proteomics.</a> J Leukocyte Biol. , (2019).</li>
<li>Salas, D., Stacey, R. G., Akinlaja, M., Foster, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+interactomics%3A+Considerations+for+the+use+of+co-elution+to+measure+protein+interaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Next-generation interactomics: Considerations for the use of co-elution to measure protein interaction networks.</a> Molecular and Cellular Proteomics. , (2020).</li>
<li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometric+exploration+of+proteome+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function.</a> Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).</li>
<li>Mann, M., Kulak, N. A., Nagaraj, N., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Coming+Age+of+Complete%2C+Accurate%2C+and+Ubiquitous+Proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The Coming Age of Complete, Accurate, and Ubiquitous Proteomes.</a> Molecular Cell. 49 (4), 583-590 (2013).</li>
<li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+Proteome-wide+Label-free+Quantification+by+Delayed+Normalization+and+Maximal+Peptide+Ratio+Extraction%2C+Termed+MaxLFQ%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Accurate Proteome-wide Label-free Quantification by Delayed Normalization and Maximal Peptide Ratio Extraction, Termed MaxLFQ.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).</li>
<li>Ankney, J. A., Muneer, A., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+and+Absolute+Quantitation+in+Mass+Spectrometry-Based+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Relative and Absolute Quantitation in Mass Spectrometry-Based Proteomics.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. , (2018).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li>
<li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+%28prote%29omics+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).</li>
<li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Andromeda%3A+A+peptide+search+engine+integrated+into+the+MaxQuant+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Andromeda: A peptide search engine integrated into the MaxQuant environment.</a> Journal of Proteome Research. , (2011).</li>
<li>Zhong, Z., Pirofski, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opsonization+of+Cryptococcus+neoformans+by+human+anticryptococcal+glucuronoxylomannan+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Opsonization of Cryptococcus neoformans by human anticryptococcal glucuronoxylomannan antibodies.</a> Infection and Immunity. , (1996).</li>
<li>Nicola, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+autophagy+in+immunity+to+Cryptococcus+neoformans+and+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Macrophage autophagy in immunity to Cryptococcus neoformans and Candida albicans.</a> Infection and Immunity. , (2012).</li>
<li>Ball, B., Geddes-McAlister, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Proteomic+Profiling+of+Cryptococcus+neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Quantitative Proteomic Profiling of Cryptococcus neoformans.</a> Current Protocols in Microbiology. , (2019).</li>
<li>Geddes-McAlister, J., Gadjeva, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectromerty-based+quantitative+proteomics+of+murine-derived+polymorphonuclear+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mass spectromerty-based quantitative proteomics of murine-derived polymorphonuclear neutrophils.</a> Current Protocols in Immunology. , (2019).</li>
<li>Geddes, J. M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretome+profiling+of+Cryptococcus+neoformans+reveals+regulation+of+a+subset+of+virulence-associated+proteins+and+potential+biomarkers+by+protein+kinase+A%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Secretome profiling of Cryptococcus neoformans reveals regulation of a subset of virulence-associated proteins and potential biomarkers by protein kinase A.</a> BMC Microbiology. , (2015).</li>
<li>Geddes, J. M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+protein+kinase+a-regulated+proteome+of+Cryptococcus+neoformans+identifies+a+role+for+the+ubiquitin-proteasome+pathway+in+capsule+formation%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Analysis of the protein kinase a-regulated proteome of Cryptococcus neoformans identifies a role for the ubiquitin-proteasome pathway in capsule formation.</a> mBio. 7 (1), 1-15 (2016).</li>
<li>Al Shweiki, M. H. D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Label-Free+Quantification+in+Discovery+Proteomics+and+Impact+of+Technological+Factors+and+Natural+Variability+of+Protein+Abundance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Assessment of Label-Free Quantification in Discovery Proteomics and Impact of Technological Factors and Natural Variability of Protein Abundance.</a> Journal of Proteome Research. , (2017).</li>
<li>Ong, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+Isotope+Labeling+by+Amino+Acids+in+Cell+Culture%2C+SILAC%2C+as+a+Simple+and+Accurate+Approach+to+Expression+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).</li>
<li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+mass+tags%3A+A+novel+quantification+strategy+for+comparative+analysis+of+complex+protein+mixtures+by+MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS.</a> Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).</li>
<li>Borner, G. H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organellar+Maps+Through+Proteomic+Profiling+-+A+Conceptual+Guide%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Organellar Maps Through Proteomic Profiling - A Conceptual Guide.</a> Molecular & Cellular Proteomics. , (2020).</li>
<li>Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+know+the+neighborhood%3A+using+proximity-dependent+biotinylation+to+characterize+protein+complexes+and+map+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles.</a> Current Opinion in Chemical Biology. , (2019).</li>
<li>Kugadas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frontline+Science%3A+Employing+enzymatic+treatment+options+for+management+of+ocular+biofilm-based+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Frontline Science: Employing enzymatic treatment options for management of ocular biofilm-based infections.</a> Journal of Leukocyte Biology. , (2019).</li>
<li>Yeung, J., Gadjeva, M., Geddes-McAlister, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-Free+Quantitative+Proteomics+Distinguishes+General+and+Site-Specific+Host+Responses+to+Pseudomonas+aeruginosa+Infection+at+the+Ocular+Surface%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Label-Free Quantitative Proteomics Distinguishes General and Site-Specific Host Responses to Pseudomonas aeruginosa Infection at the Ocular Surface.</a> Proteomics. , (2020).</li>
<li>Yeung, J., Lamb, J., Krieger, J. R., Gadjeva, M., Geddes-McAlister, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Proteomic+Profiling+ofMurine+Ocular+Tissue+and+theExtracellular+Environment%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Mouse+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative Proteomic Profiling ofMurine Ocular Tissue and theExtracellular Environment.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 10 (83), (2020).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Kluczowe kroki w protokole obejmują przygotowanie komórek makrofagów i pobranie próbek z kohodowli do przetwarzania białek przy minimalnym zakłóceniu komórek. Ważne jest, aby delikatnie i ostrożnie wykonywać etapy mycia, zaszczepiania i usuwania przylegających komórek makrofagów, aby zapobiec niepotrzebnej lizie komórek przed pobraniem. Ustalenie prawidłowego MOI dla eksperymentu ma również kluczowe znaczenie, ponieważ inokulacja zbyt wysokim MOI może spowodować szybką śmierć komórek makrofagów oraz trudności w pobierani...

Częstość występowania inwazyjnych infekcji grzybiczych znacznie wzrasta i jest skorelowana z niedopuszczalnie wysokimi wskaźnikami śmiertelności, najczęściej zgłaszanymi u osób z predyspozycjami do niedoboru odporności1. Cryptococcus neoformans jest znanym oportunistycznym patogenem grzybowym zdolnym do przetrwania wewnątrzkomórkowego w komórkach makrofagów gospodarza. Nieodpowiednia interwencja przeciwgrzybicza powoduje rozprzestrzenianie się grzybicy i zagrażające życiu objawy kryptokokowego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych i zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych2,3. Globalny wzrost statusu osób z obniżoną odpornością wymagał równoległego wzrostu stosowania środków przeciwgrzybiczych, w których wiele gatunków grzybów, w tym C. neoformans, w coraz większym stopniu rozwinęło odporność na 4,5,6. Dlatego konieczne jest wdrożenie solidnych i wydajnych technologii, aby odpowiedzieć na kluczowe pytania biologiczne dotyczące odpowiedzi obronnej gospodarza i patogenezy drobnoustrojów.
Nowa era postępu technologicznego w spektrometrii mas (MS), w tym generowanie potężnych potoków obliczeniowych i bioinformatycznych, stanowi podstawę dla integracyjnej wizji dla wielkoskalowej analizy badań nad patogenami gospodarza7,8. Konwencjonalna analiza proteomiczna oparta na patogenezie zwykle profiluje widok infekcji z perspektywy gospodarza lub patogenu, w tym kompleksowe metodologie, takie jak profilowanie korelacji białek, chromatografia powinowactwa w połączeniu z proteomiką i interaktomika9. Badania nad zjadliwością niebezpiecznych patogenów w systemie gospodarza mają ogromne znaczenie kliniczne; Jednak zastosowanie analizy podwójnej perspektywy w jednym eksperymencie było wcześniej uważane za nieosiągalne. Na przykład, perspektywa patogenu wobec infekcji jest często przytłoczona przez bardzo obfite białka gospodarza, co skutkuje zmniejszoną czułością wykrywania mało obfitych białek grzybów7. Co więcej, wysoka złożoność próbki zachęca do zbadania wielu celów w jednym systemie eksperymentalnym i okazuje się wyzwaniem w wyjaśnieniu mechanizmów działania określonego białka patogenu.
Proteomika oddolna to popularna technika MS, która umożliwia łatwe przygotowanie próbki, w której peptydy są generowane przez specyficzne dla sekwencji trawienie enzymatyczne, a następnie separację metodą chromatografii cieczowej, identyfikację i kwantyfikację przez MS10,11. W tym miejscu przedstawiamy metodę demonstrującą strategię pozyskiwania zależną od danych, której celem jest osiągnięcie bezstronnego pokrycia proteomu lub "infektomu" opartego na infekcji. W szczególności kwantyfikacja bez znaczników (LFQ) zmniejsza zależność od etykiet chemicznych lub metabolicznych w celu solidnej i dokładnej identyfikacji zmian poziomu białka w wielu proteomach, redukując etapy obsługi i przetwarzania próbki12,13. To uniwersalne zastosowanie bada białka wytworzone w danym momencie w komórce, niezależnie od oczekiwanej produkcji białka; W ten sposób można odkryć nowe informacje, które mają kluczowe znaczenie dla infekcji.
Opisany tutaj przepływ pracy jest zoptymalizowany do badania zmian poziomu białka C. neoformans podczas warunków naśladujących infekcję z komórkami odpornościowymi gospodarza (Rysunek 1). Zamiast polegać na izolacji i separacji typów komórek, podejście to polega na ekstrakcji proteomu gospodarza i patogenu razem oraz wykorzystaniu separacji bioinformatycznej przy użyciu dwóch specyficznych dla organizmu baz danych w celu rozróżnienia produkcji białek specyficznych dla gatunku. Metoda ta oferuje korzyści w postaci nieograniczonej liczby próbek, które można przetworzyć bez dodatkowych kosztownych etapów przygotowania niezbędnych w badaniach znakowania izotopowego lub frakcjonowaniu. Co więcej, ten przepływ pracy obsługuje zoptymalizowane protokoły ekstrakcji białek, które można przenieść do szerokiej gamy patogenów grzybowych i bakteryjnych, zdolnych do celowania w komórki odpornościowe gospodarza i infekowania ich. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten przedstawia kroki prowadzące do zakończenia bezstronnej ekstrakcji białek i przetwarzania próbek dla stwardnienia rozsianego o wysokiej rozdzielczości, a następnie dane i analizę statystyczną, które mogą dostarczyć bogactwa wiedzy na temat białek grzybów istotnych dla infekcji w połączeniu z kompleksowym profilowaniem odpowiedzi obronnej gospodarza.

<table><tbody><tr><td>100 mM Tris-HCl, pH 8,5</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>Utrzymuj na poziomie 4&deg; </td></tr><tr><td>C 60 x 15 mm Talerz, Nunclon Delta</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>174888</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka do hodowli komórkowych</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl, klasa MS</td><td>Pierce</td><td>TS-51101</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1099510001</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34850-1L</td><td></td></tr><tr><td>Amon wodorowęglan (ABC)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A643-500</td><td>Przygotuj podstawowy roztwór ABC o stężeniu 50 mM, stabilny w temperaturze pokojowej przez okres do jednego miesiąca.</td></tr><tr><td>Bel-Art i handel; System pobierania aspiratora próżniowego HiFlow</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-717-300</td><td>Nie jest to konieczne, do usuwania pożywki można używać pipet serologicznych.</td></tr><tr><td>Żywica C18</td><td>Skrobaki do komórek 3M Empore</td><td>3M2215</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>10062-906</td><td>Nie jest to konieczne, można zastosować inne metody uwalniania komórek makrofagów.</td></tr><tr><td>Odśrodkowy koncentrator próżni</td><td>Eppendorf</td><td>07-748-15</td><td></td></tr><tr><td>Kompletna jednostka filtrująca</td><td>VWR</td><td>10040-436</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowe rurki sokoła (15 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny licznik komórek Countess II</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td>Nie jest to konieczne, hemocytometr może być używany jako alternatywa.</td></tr><tr><td>CytoTox 96 Nieradioaktywny test cytotoksyczności</td><td>Promega</td><td>G1780</td><td></td></tr><tr><td>Ditiothreitol (DTT)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0861</td><td>Przygotować masowy roztwór podstawowy 1 M DTT, błyskawicznie zamrożony i przechowywany w temperaturze -20 & stopni; C do momentu użycia. Wyrzuć po każdym użyciu (nie zamrażaj i nie rozmrażaj wielokrotnie).</td></tr><tr><td>DMEM, wysoka zawartość glukozy, suplement GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10566016</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>ThermoFisher Scientific 12483020</td><td></td><td>Inaktywacja ciepła przez inkubację w temperaturze 60& C przez 30 minut. Przygotować 50 ml porcji i błyskawicznie zamrozić. Rozmrozić przed przygotowaniem pożywki</td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>VWR</td><td>15170-208</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td>Przygotować 40 mM HEPES/8 M mocznika w roztworze podstawowym luzem, zamrożony błyskawicznie, przechowywać w temperaturze -20&deg; C do momentu użycia. Wyrzuć po każdym użyciu (nie zamrażaj i nie rozmrażaj wielokrotnie).</td></tr><tr><td>Wysokowydajny system chromatografii cieczowej</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC140</td><td>Długość gradientu jest oparta na złożoności próbki, zalecany gradient 120 minut dla próbek zakaźnych.</td></tr><tr><td>Spektrometr masowy o wysokiej rozdzielczości</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>726042</td><td></td></tr><tr><td>Jodoacetamid (IAA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6125</td><td>Przygotować 0,55 M roztwór podstawowy luzem, zamrożony błyskawicznie, przechowywać w temperaturze -20&deg; C do momentu użycia. Wyrzuć po każdym użyciu (nie zamrażaj i nie rozmrażaj wielokrotnie).</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030081</td><td>Może być porcjowana i zamrożona do przechowywania. Rozmrozić przed przygotowaniem pożywki.</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek LoBind</td><td>Eppendorf</td><td>13-698-794</td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant</td><td>https://maxquant.org/</td><td></td> <td>MaxQuant to publiczna platforma oferująca samouczki, takie jak Letnia Szkoła MaxQuant, przedstawiające etapy analizy obliczeniowej dużych zbiorów danych MS</td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Eppendorf</td><td>13864457</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina : Streptomycyna 10k/10k</td><td>VWR</td><td>CA12001-692</td><td>Może być podwielokrotny i zamrożony do przechowywania. Rozmrozić przed przygotowaniem pożywki.</td></tr><tr><td>Kolumny do separacji peptydów</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ES803</td><td></td></tr><tr><td>Perseus Software</td><td>http://maxquant.net/perseus/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>VWR</td><td>CA12001-676</td><td>Kupowanie nie jest wymagane. Można również przygotować PBS, ale przed użyciem należy przeprowadzić sterylną filtrację.</td></tr><tr><td>Test białka Pierce BCA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>&nbsp; 23225</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta, jednorazowa serologiczna (10 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta, jednorazowa serologiczna (25 mL) Sonda Basix</td><td>Fisher Scientific</td><td>14955235</td><td></td></tr><tr><td>Sonciator ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>100-132-894</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor proteazy w tabletce koktajlowej</td><td>Roche</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28364</td><td>20% (w/v)</td></tr><tr><td>Spektrofotometr (Nanodrop)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>STAGE Wirówka z wywrotem</td><td>Sonation</td><td>STC-V2</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka termiczna</td><td>VWR</td><td>NO89232-908</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>85183</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanina proteazy trypsyny/Lys-C, Klasa MS</td><td>Pierce</td><td>A40007</td><td>Utrzymuj w temperaturze -20 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Kąpiel ultradźwiękowa</td><td>Bransonic</td><td>A89375-450</td><td>Przechowywana w chłodni (4C)</td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U1250-1KG</td><td>Przygotować 40 mM HEPES/8 M mocznik w roztworze podstawowym luzem, zamrożony błyskawicznie, przechowywać w temperaturze -20 &deg; C do momentu użycia. Wyrzuć po każdym użyciu (nie zamrażaj i nie rozmrażaj wielokrotnie).</td></tr><tr><td>Ekstrakt z drożdży, bulion dekstrozowy peptonowy</td><td>BD Difco</td><td>BM20</td><td></td></tr></tbody></table>

bezznacznikowy przepływ pracy proteomiki ilościowej dla interakcji gospodarz-patogen opartych na odkryciach

Label-Free Quantitative Proteomics Workflow for Discovery-Driven Host-Pathogen Interactions

Technologiczne osiągnięcia proteomiki ilościowej opartej na spektrometrii mas (MS) otwierają wiele nieodkrytych możliwości analizy globalnego proteomu organizmu w różnych warunkach. Ta potężna strategia zastosowana do interakcji patogenów mikrobiologicznych z pożądanym gospodarzem kompleksowo charakteryzuje obie perspektywy wobec infekcji. W niniejszym artykule opisano bezznacznikową kwantyfikację (LFQ) infektomu Cryptococcus neoformans, grzybowego fakultatywnego patogenu wewnątrzkomórkowego, który jest czynnikiem sprawczym śmiertelnej choroby kryptokokozy, w obecności unieśmiertelnionych komórek makrofagów. Protokół szczegółowo opisuje właściwe techniki przygotowania białek zarówno dla komórek patogenów, jak i ssaków w ramach jednego eksperymentu, co skutkuje odpowiednim zgłoszeniem peptydu do analizy metodą chromatografii cieczowej (LC)-MS/MS. Wysokoprzepustowy ogólny charakter LFQ pozwala na szeroki zakres dynamiczny identyfikacji i kwantyfikacji białek, a także możliwość przenoszenia do dowolnego środowiska infekcji gospodarz-patogen, przy zachowaniu ekstremalnej czułości. Metoda jest zoptymalizowana pod kątem katalogowania obszernych, bezstronnych profili obfitości białek patogenu w warunkach naśladujących infekcję. W szczególności zademonstrowana tutaj metoda dostarcza istotnych informacji na temat patogenezy C. neoformans, takich jak produkcja białek niezbędnych do wirulencji i identyfikacji krytycznych białek gospodarza reagujących na inwazję drobnoustrojów.

Opisany powyżej protokół umożliwia identyfikację i kwantyfikację białek pochodzących zarówno z grzybiczego patogenu, C. neoformans, jak i z gospodarza, czyli makrofagów, w ramach jednego eksperymentu. Po kokulturze komórki są zbierane i przetwarzane wspólnie, a następnie rozdzielane bioinformatycznie na podstawie profili peptydowych specyficznych dla każdego gatunku. Jest to potężne podejście do definiowania interakcji w relacji gospodarz-patogen podczas infekcji. Liczba białek zidentyfikowanych w eksperymencie ...

Tutaj prezentujemy protokół do profilowania interakcji między gospodarzem a patogenem podczas infekcji za pomocą proteomiki opartej na spektrometrii mas. Protokół ten wykorzystuje kwantyfikację bez znaczników do pomiaru zmian w obfitości białek zarówno gospodarza (np. Makrofagi), jak i patogenu (np. Cryptococcus neoformans) w jednym eksperymencie.

Bezznacznikowy przepływ pracy proteomiki ilościowej dla interakcji gospodarz-patogen opartych na odkryciach

The technological achievements of mass spectrometry (MS)-based quantitative proteomics opens many undiscovered avenues for analyzing an organism&#8217;s ...

Nasz protokół bada infekcję grzybiczą zarówno z perspektywy gospodarza, jak i patogenu, aby zidentyfikować interakcje między systemami biologicznymi, które mają kluczowe znaczenie dla choroby. W jednym eksperymencie możemy wykryć zarówno białka grzyba, jak i gospodarza oraz zidentyfikować białka grzybów wytwarzane tylko podczas infekcji, reprezentujące nowe białka związane z infekcją. Chociaż koncentrujemy się na leczeniu zakażeń grzybiczych poprzez odkrywanie nowych strategii leczenia przeciwzjadliwego, nasza linia produkcyjna w zakresie proteomiki i bioinformatyki jest uniwersalna i może być stosowana w wielu systemach biologicznych.Nasze podejście stanowi podstawę do badań nad różnymi patogenami i licznymi odpowiedziami immunologicznymi i może być wykorzystane do uzyskania nowych informacji na temat związku między kryptokokiem a wrodzonym układem odpornościowym. Ważna jest reakcja makrofagów na patogeny i wykrywanie wystarczającej ilości białek grzybów. Dlatego zaleca się testowanie i optymalizację MOI i punktów czasowych dla każdego gatunku.Ponieważ hodowla makrofagów i komórek grzybów może być trudna, ważne jest, aby wiedzieć, czego można się spodziewać po kokulturze. Wizualizacja daje badaczowi pewność w realizacji procedury. Aby przygotować komórki grzybów do infekcji makrofagami, należy zebrać i odwirować komórki C neoformans z hodowli średnio-długofazowej, a następnie trzy delikatne przemycia jednym mililitrem PBS o temperaturze pokojowej w tych samych warunkach wirówki.Po ostatnim płukaniu ponownie zawieś komórki grzybów w ilości 1,2 razy 10 do 8 komórek na mililitr hodowli komórkowej wolnej od antybiotyków, o średnim stężeniu i dodaj jeden mililitr zawiesiny komórek grzyba do każdej z czterech studzienek z 70% do 80% zlewającą się sześciodołkową płytką do hodowli makrofagów. Następnie umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na trzy godziny. Ostrożnie przechyl płytkę, aby umożliwić trzykrotne delikatne umycie każdej studzienki jednym mililitrem PBS na studzienkę na mycie.Aby zmierzyć skuteczność infekcji po ostatnim myciu, dodaj jeden mililitr pożywki wolnej od antybiotyków do każdej studzienki na płytce sześciodołkowej i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych. W odpowiednich eksperymentalnych punktach czasowych zebrać supernatant z każdej studzienki i zmierzyć ilość LDH w każdym dołku zgodnie ze standardowymi protokołami. W tym samym czasie należy przeprowadzić lizę niezakażonych komórek makrofagów, aby określić wartość maksymalnej cytotoksyczności.Cytotoksyczność można następnie obliczyć przy użyciu wskazanego wzoru. W przypadku niezakażonego zbierania makrofagów i wspólnej hodowli dodaj jeden mililitr zimnego PBS do każdej studzienki niezakażonych makrofagów. Po minucie delikatnie postukaj w płytkę, aby odłączyć komórki od dna studzienek i zebrać zawiesiny komórek w jednej 15-mililitrowej probówce.Zebrać komórki przez odwirowanie i całkowicie usunąć supernatant, aby umożliwić natychmiastowe błyskawiczne zamrożenie osadu w ciekłym azocie do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni. Analiza głównych składowych procesu w odniesieniu do zbiorów danych pokazuje, że zgodnie z oczekiwaniami największym składnikiem separacji danych są próbki zakażone i niezainfekowane. Drugą cechą wyróżniającą próbki jest ich zmienność biologiczna.Połączenie korelacji Pearsona z hierarchicznym grupowaniem według odległości euklidesowej pokazuje wyraźne grupowanie zakażonych i niezakażonych próbek z odtwarzalnością replikacji w zakresie od 95% do 96%Test T Students'T skorygowany o testowanie wielu hipotez przy użyciu wskaźnika fałszywych odkryć Benjaminiego-Hochberga można przeprowadzić w celu zidentyfikowania białek o znaczących różnicach w liczebności podczas infekcji w porównaniu z niezakażonymi kontrolami. W tej analizie zidentyfikowano 117 białek gospodarza wykazujących znaczącą zmianę ekspresji po zakażeniu. Warto zauważyć, że zaobserwowano również znaczny wzrost liczebności białek grzybów, zgodnie z oczekiwaniami podczas infekcji.Ważne jest, aby delikatnie obchodzić się z makrofagami podczas hodowli, mycia i pobierania próbek. Określając, w jaki sposób patogen przystosowuje się do gospodarza i jak gospodarz broni się przed zakażeniem, uzyskuje się nowe informacje w dziedzinie mikrobiologii i immunologii.

label-free-quantitative-proteomics-workflow-for-discovery-driven-host

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten artykuł skupia się na identyfikacji wysoce pewnych zestawów danych interakcji między białkami gospodarza i patogenu przy użyciu kombinacji dwóch ortogonalnych metod: drożdży dwuhybrydowych, a następnie wysokoprzepustowego testu interakcji w komórkach ssaków o nazwie HT-GPCA.

Podejście porównawcze do scharakteryzowania krajobrazu interakcji białko-białko gospodarz-patogen

Przedstawiamy protokół do dokładnego oznaczania ilościowego białek za pomocą znakowania izobarycznego, intensywnego frakcjonowania, narzędzi bioinformatycznych i etapów kontroli jakości w połączeniu z chromatografią cieczową połączoną ze spektrometrem masowym o wysokiej rozdzielczości.

Głębokie profilowanie proteomu za pomocą znakowania izobarycznego, rozległej chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i kwantyfikacji wspomaganej programowo

Opisany jest proces proteomiki do identyfikacji partnerów interakcji białkowych z frakcji subkomórkowej jądrowej za pomocą wzbogacenia immunopowinowactwa danego białka i bezznacznikowej spektrometrii mas. Przepływ pracy obejmuje frakcjonowanie subkomórkowe, immunoprecypitację, przygotowywanie próbek wspomagane filtrem, oczyszczanie offline, spektrometrię mas i dalszy potok bioinformatyczny.

Bezznacznikowa spektrometria mas immunoprecypitacji do profilowania interaktomii jądrowej na dużą skalę

Protokół przedstawiony tutaj opisuje kompletny potok do analizy danych transkryptomu sekwencjonowania RNA, od surowych odczytów do analizy funkcjonalnej, w tym etapy kontroli jakości i wstępnego przetwarzania do zaawansowanych metod analizy statystycznej.

Wysokoprzepustowa analiza transkryptomu do badania interakcji gospodarz-patogen

Prezentujemy narzędzie do biologii systemów JUMPn do przeprowadzania i wizualizacji analizy sieci dla ilościowych danych proteomicznych, ze szczegółowym protokołem obejmującym wstępne przetwarzanie danych, grupowanie koekspresji, wzbogacanie szlaków i analizę sieci interakcji białko-białko.

JUMPn: Usprawniona aplikacja do grupowania koekspresji białek i analizy sieci w proteomice

Metaproteomika kliniczna oferuje wgląd w ludzki mikrobiom i jego wpływ na choroby. Wykorzystaliśmy moc obliczeniową platformy Galaxy do opracowania modułowego przepływu pracy bioinformatycznego, który ułatwia złożoną analizę metaproteomiczną opartą na spektrometrii mas i charakteryzację różnych typów próbek klinicznych istotnych dla badań nad chorobami.

Przepływ pracy metaproteomiki klinicznej wdrożony w ramach platformy bioinformatycznej Galaxy w celu analizy interakcji gospodarz-mikrobiom leżących u podstaw chorób człowieka

Tutaj tworzymy metodę proteomiczną opartą na spektrometrii mas, używając izolowanych obszarów zainteresowania w utrwalonych formaliną, zatopionych w parafinie skrawkach tkanki. Protokół ten służy do analizy proteomu z określonych obszarów tkanek w zarchiwizowanych odcinkach tkanek utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie.

Uproszczone podejście do proteomiki opartej na spektrometrii mas z wykorzystaniem wybranych regionów tkanek

Dane proteomiczne oparte na spektrometrii mas są dostępne w otwartych bazach danych i dostępne za pomocą bezpłatnych narzędzi. Biorąc pod uwagę złożoność przeszukiwania i opisywania baz danych, wielu biologom brakuje wiedzy, aby wykorzystać te zestawy danych. W tym miejscu przedstawiamy przewodnik dotyczący korzystania z bezpłatnych narzędzi do podstawowego wyszukiwania danych proteomicznych.

Poruszanie się po danych proteomicznych opartych na spektrometrii mas przy użyciu bezpłatnych narzędzi obliczeniowych

Przedstawiamy protokół umożliwiający wychwytywanie i identyfikację specyficznych dla choroby interakcji białko-białko z komórek i tkanek rodzimych za pomocą sond chemicznych i spektrometrii mas. Uzyskane zbiory danych interakcji są analizowane za pomocą dedykowanej platformy internetowej, aby ujawnić dynamiczne dysfunkcje sieci oraz zmiany w ścieżkach związane z chorobą.

Mapowanie dysfunkcyjnych interakcji białko-białko w chorobach

Opisano metodę indywidualnego wyboru, manipulowania i obrazowania żywych patogenów przy użyciu pułapki optycznej sprzężonej z mikroskopem dyskowym (spinning disk). Pułapka optyczna zapewnia przestrzenną i czasową kontrolę nad organizmami i pozwala na umieszczenie ich w bezpośrednim sąsiedztwie komórek gospodarza. Mikroskopia fluorescencyjna pozwala na rejestrację dynamicznych interakcji międzykomórkowych przy minimalnym zaburzeniu stanu komórek.

Wykorzystanie pułapki optycznej do badania oddziaływań gospodarz-patogen w dynamicznym obrazowaniu żywych komórek

Odkryj bezetykietową proteomikę ilościową do badania interakcji gospodarz-patogen z wykorzystaniem spektrometrii masowej. Ta metoda pozwala identyfikować białka związane z infekcją Cryptococcus neoformans i makrofagów.

Bezznacznikowy przepływ pracy proteomiki ilościowej dla interakcji gospodarz-patogen opartych na odkryciach

Przeglądaj więcej filmów