Bezznacznikowy przepływ pracy proteomiki ilościowej dla interakcji gospodarz-patogen opartych na odkryciach
20 października 2020
Tutaj prezentujemy protokół do profilowania interakcji między gospodarzem a patogenem podczas infekcji za pomocą proteomiki opartej na spektrometrii mas. Protokół ten wykorzystuje kwantyfikację bez znaczników do pomiaru zmian w obfitości białek zarówno gospodarza (np. Makrofagi), jak i patogenu (np. Cryptococcus neoformans) w jednym eksperymencie.
Nasz protokół bada infekcję grzybiczą zarówno z perspektywy gospodarza, jak i patogenu, aby zidentyfikować interakcje między systemami biologicznymi, które mają kluczowe znaczenie dla choroby. W jednym eksperymencie możemy wykryć zarówno białka grzyba, jak i gospodarza oraz zidentyfikować białka grzybów wytwarzane tylko podczas infekcji, reprezentujące nowe białka związane z infekcją. Chociaż koncentrujemy się na leczeniu zakażeń grzybiczych poprzez odkrywanie nowych strategii leczenia przeciwzjadliwego, nasza linia produkcyjna w zakresie proteomiki i bioinformatyki jest uniwersalna i może być stosowana w wielu systemach biologicznych.
Nasze podejście stanowi podstawę do badań nad różnymi patogenami i licznymi odpowiedziami immunologicznymi i może być wykorzystane do uzyskania nowych informacji na temat związku między kryptokokiem a wrodzonym układem odpornościowym. Ważna jest reakcja makrofagów na patogeny i wykrywanie wystarczającej ilości białek grzybów. Dlatego zaleca się testowanie i optymalizację MOI i punktów czasowych dla każdego gatunku.
Ponieważ hodowla makrofagów i komórek grzybów może być trudna, ważne jest, aby wiedzieć, czego można się spodziewać po kokulturze. Wizualizacja daje badaczowi pewność w realizacji procedury. Aby przygotować komórki grzybów do infekcji makrofagami, należy zebrać i odwirować komórki C neoformans z hodowli średnio-długofazowej, a następnie trzy delikatne przemycia jednym mililitrem PBS o temperaturze pokojowej w tych samych warunkach wirówki.
Po ostatnim płukaniu ponownie zawieś komórki grzybów w ilości 1,2 razy 10 do 8 komórek na mililitr hodowli komórkowej wolnej od antybiotyków, o średnim stężeniu i dodaj jeden mililitr zawiesiny komórek grzyba do każdej z czterech studzienek z 70% do 80% zlewającą się sześciodołkową płytką do hodowli makrofagów. Następnie umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na trzy godziny. Ostrożnie przechyl płytkę, aby umożliwić trzykrotne delikatne umycie każdej studzienki jednym mililitrem PBS na studzienkę na mycie.
Aby zmierzyć skuteczność infekcji po ostatnim myciu, dodaj jeden mililitr pożywki wolnej od antybiotyków do każdej studzienki na płytce sześciodołkowej i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych. W odpowiednich eksperymentalnych punktach czasowych zebrać supernatant z każdej studzienki i zmierzyć ilość LDH w każdym dołku zgodnie ze standardowymi protokołami. W tym samym czasie należy przeprowadzić lizę niezakażonych komórek makrofagów, aby określić wartość maksymalnej cytotoksyczności.
Cytotoksyczność można następnie obliczyć przy użyciu wskazanego wzoru. W przypadku niezakażonego zbierania makrofagów i wspólnej hodowli dodaj jeden mililitr zimnego PBS do każdej studzienki niezakażonych makrofagów. Po minucie delikatnie postukaj w płytkę, aby odłączyć komórki od dna studzienek i zebrać zawiesiny komórek w jednej 15-mililitrowej probówce.
Zebrać komórki przez odwirowanie i całkowicie usunąć supernatant, aby umożliwić natychmiastowe błyskawiczne zamrożenie osadu w ciekłym azocie do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni. Analiza głównych składowych procesu w odniesieniu do zbiorów danych pokazuje, że zgodnie z oczekiwaniami największym składnikiem separacji danych są próbki zakażone i niezainfekowane. Drugą cechą wyróżniającą próbki jest ich zmienność biologiczna.
Połączenie korelacji Pearsona z hierarchicznym grupowaniem według odległości euklidesowej pokazuje wyraźne grupowanie zakażonych i niezakażonych próbek z odtwarzalnością replikacji w zakresie od 95% do 96%Test T Students'T skorygowany o testowanie wielu hipotez przy użyciu wskaźnika fałszywych odkryć Benjaminiego-Hochberga można przeprowadzić w celu zidentyfikowania białek o znaczących różnicach w liczebności podczas infekcji w porównaniu z niezakażonymi kontrolami. W tej analizie zidentyfikowano 117 białek gospodarza wykazujących znaczącą zmianę ekspresji po zakażeniu. Warto zauważyć, że zaobserwowano również znaczny wzrost liczebności białek grzybów, zgodnie z oczekiwaniami podczas infekcji.
Ważne jest, aby delikatnie obchodzić się z makrofagami podczas hodowli, mycia i pobierania próbek. Określając, w jaki sposób patogen przystosowuje się do gospodarza i jak gospodarz broni się przed zakażeniem, uzyskuje się nowe informacje w dziedzinie mikrobiologii i immunologii.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół bada oddziaływanie między gospodarzem a patogenem podczas infekcji grzybiczej z wykorzystaniem proteomiki opartej na spektrometrii mas. Pozwala on na detekcję białek zarówno gospodarza, jak i patogenu w ramach jednego eksperymentu, dostarczając informacji na temat białek powiązanych z infekcją.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- neuronauka
- choroby zakaźne
- proteomika
Wprowadzenie
- Zrozumienie interakcji między gospodarzem a patogenem jest kluczowe dla badań nad chorobami.
- Zakażenia grzybicze stanowią znaczne zagrożenie dla zdrowia, co sprawia, że konieczne jest opracowanie nowych strategii terapeutycznych.
- Proteomika pozwala na ujawnienie zmian w obrębie poziomu białek podczas infekcji.
- Makrofagi odgrywają kluczową rolę w odpowiedzi odpornościowej na patogeny.
Cel badania
- Profilowanie interakcji między makrofagami gospodarza a patogenem Cryptococcus neoformans.
- Identyfikacja nowych białek związanych z infekcją, produkowanych podczas zakażenia grzybiczego.
- Opracowanie uniwersalnego potoku proteomicznego i bioinformatycznego, który można zastosować w różnych systemach biologicznych.
Zastosowane metody
- Proteomika oparta na spektrometrii mas w celu detekcji białek.
- Kwantyfikacja bez znakowania w celu pomiaru zmian w obfitości białek.
- Optymalizacja wielokrotności infekcji (MOI) oraz punktów czasowych dla uzyskania dokładnych wyników.
- Analiza bioinformatyczna w celu interpretacji danych proteomicznych.
Główne wyniki
- Identyfikacja białek grzybowych produkowanych specyficznie podczas infekcji.
- Wgląd w odpowiedź makrofagów na *Cryptococcus neoformans*.
- Ustanowienie ram badawczych do analizy różnych patogenów i odpowiedzi immunologicznych.
- Demonstracja przydatności protokołu w różnych systemach biologicznych.
Wnioski
- Protokół zapewnia kompleksowe podejście do badania interakcji gospodarz-patogen.
- Stanowi on podstawę dla przyszłych badań nad infekcjami grzybiczymi i odpowiedziami immunologicznymi.
- Zaleca się dalszą optymalizację warunków eksperymentalnych dla różnych gatunków.
Najczęściej zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
Ten przepływ pracy w zakresie ilościowej proteomiki bez znakowania umożliwia jednoczesne profilowanie proteomów gospodarza i patogenu podczas infekcji, dostarczając bezstronnych danych o obfitości białek, które są kluczowe dla walidacji celów w badaniach nad chorobami zakaźnymi. Poprzez identyfikację białek grzybowych związanych z infekcją oraz sygnatur odpowiedzi gospodarza, metoda ta wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka strategii antywirulentnych i dostarcza informacji niezbędnych do przedklinicznego wyboru celów. Jej przenaszalność pomiędzy różne układy gospodarz-patogen zwiększa możliwość zastosowania w całym portfolio programów odkrywania leków przeciwgrzybiczych i immunomodulujących.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez identyfikację białek patogenu produkowanych wyłącznie podczas infekcji, które stanowią nowe cele powiązane z wirulencją.
- Wartość naukowa: Wyjaśnia ścieżki interakcji gospodarz-patogen poprzez skorelowane zmiany w zawartości obu proteomów, co wspiera walidację funkcjonalną celów.
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną poprzez dostarczenie ilościowych, powtarzalnych profili proteomicznych stanu infekcji w celu zmniejszenia ryzyka związanych z hipotezami dotyczącymi celów.
Przesiew i opracowywanie testów
- Wartość użytkowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne (zakażone makrofagi) do dalszego opracowywania testów dzięki standaryzacji warunków infekcji i optymalizacji MOI.
- Wartość użytkowa: Generuje ilościowe, bezznakowe dane proteomiczne, odpowiednie do standaryzacji testów i oceny powtarzalności w kampaniach przesiewowych.
- Wartość użytkowa: Wspiera skalowalne ponowne wykorzystanie platformy dla różnych patogenów dzięki uniwersalnemu projektowi potoku proteomicznego i bioinformatycznego.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość translacyjna: Identyfikacja białek gospodarza istotnych dla przebiegu choroby, które reagują na inwazję drobnoustrojów, co umożliwia dopasowanie biomarkerów do walidacji przedklinicznej.
- Wartość translacyjna: Zapewnienie ciągłości od etapu odkryć po badania przedkliniczne poprzez powiązanie zmian proteomicznych w stanie infekcji z mechanizmami patogennymi.
- Wartość translacyjna: Dostarczenie informacji dla decyzji o dalszym rozwoju projektu z uwzględnieniem analizy ryzyka poprzez wskazanie białek niezbędnych dla wirulencji i mechanizmów obronnych gospodarza.
Integracja potoku i przepływu pracy
Przepływ pracy integruje się z wczesnymi etapami biologicznych odkryć poprzez profilowanie interakcji gospodarz-patogen, wspiera przygotowanie do badań przesiewowych za pomocą zestandaryzowanych modeli infekcji oraz umożliwia badania translacyjne, łącząc zmiany proteomiczne z mechanizmami wirulencji i odpowiedzi immunologicznej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez ilościowe określanie zmian indukowanych infekcją w proteomach zarówno patogenu, jak i gospodarza.
- Screening: Dostarcza gotowe do analizy systemy biologiczne z optymalną wartością MOI i punktami czasowymi, zapewniając powtarzalne modele infekcji do oceny związków.
- Analityka: Zapewnia bezetykietowe pomiary ilościowe oraz wyniki statystyczne (np. testy t skorygowane metodą Benjamini-Hochberg) w celu porównania warunków i zidentyfikowania białek istotnie zmienionych.
- Badania translacyjne: Łączy sygnatury proteomiczne z mechanizmami patogennymi i odpowiedziami obronnymi gospodarza, wspierając odkrywanie biomarkerów i ciągłość badań przedklinicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia wielokrotnego użytku potok proteomiczny i bioinformatyczny, który można zastosować do wielu patogenów i układów odpornościowych, co ogranicza redundantny rozwój metod.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów terapeutycznych dzięki bezstronnemu, ilościowemu profilowaniu proteomicznemu stanu infekcji.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację poprzez zoptymalizowane protokoły kokultury, przemywania i lizy z zatwierdzonymi metrykami kontroli jakości (PCA, klastrowanie, 95-96% powtarzalność replikatów).
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji typu go/no-go poprzez ujawnianie krytycznych czynników wirulencji i sieci odpowiedzi gospodarza, co redukuje ryzyko biologiczne na późnych etapach programów przeciwgrzybiczych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o specyficzną dla infekcji ekspresję białek i zaangażowanie szlaków sygnałowych.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymagana jest wiedza z zakresu hodowli komórek ssaków i grzybów, przygotowania próbek do proteomiki oraz analizy danych ze spektrometrii mas.
- Metoda jest zależna od dostępu do aparatury LC-MS/MS, oprogramowania do kwantyfikacji bez znakowania oraz narzędzi bioinformatycznych do analizy PCA, klastrowania i analizy różnicowej ekspresji.
- Niezbędna jest standaryzacja parametrów infekcji (MOI, punkty czasowe) oraz obchodzenia się z próbkami pomiędzy zespołami w celu zapewnienia powtarzalności badań.
- Wymaga rozważenia adaptacji dla różnych systemów patogen-gospodarz, w tym optymalizacji przygotowania komórek grzybów oraz konfluencji makrofagów.
- Ograniczenia praktyczne obejmują wyzwanie techniczne związane z wykrywaniem niskobiałkowych białek grzybowych na tle silnych sygnałów gospodarza, co wymaga odpowiedniej głębokości infekcji i czułości.
