Bezznacznikowy przepływ pracy proteomiki ilościowej dla interakcji gospodarz-patogen opartych na odkryciach
October 20th, 2020
Tutaj prezentujemy protokół do profilowania interakcji między gospodarzem a patogenem podczas infekcji za pomocą proteomiki opartej na spektrometrii mas. Protokół ten wykorzystuje kwantyfikację bez znaczników do pomiaru zmian w obfitości białek zarówno gospodarza (np. Makrofagi), jak i patogenu (np. Cryptococcus neoformans) w jednym eksperymencie.
Nasz protokół bada infekcję grzybiczą zarówno z perspektywy gospodarza, jak i patogenu, aby zidentyfikować interakcje między systemami biologicznymi, które mają kluczowe znaczenie dla choroby. W jednym eksperymencie możemy wykryć zarówno białka grzyba, jak i gospodarza oraz zidentyfikować białka grzybów wytwarzane tylko podczas infekcji, reprezentujące nowe białka związane z infekcją. Chociaż koncentrujemy się na leczeniu zakażeń grzybiczych poprzez odkrywanie nowych strategii leczenia przeciwzjadliwego, nasza linia produkcyjna w zakresie proteomiki i bioinformatyki jest uniwersalna i może być stosowana w wielu systemach biologicznych.
Nasze podejście stanowi podstawę do badań nad różnymi patogenami i licznymi odpowiedziami immunologicznymi i może być wykorzystane do uzyskania nowych informacji na temat związku między kryptokokiem a wrodzonym układem odpornościowym. Ważna jest reakcja makrofagów na patogeny i wykrywanie wystarczającej ilości białek grzybów. Dlatego zaleca się testowanie i optymalizację MOI i punktów czasowych dla każdego gatunku.
Ponieważ hodowla makrofagów i komórek grzybów może być trudna, ważne jest, aby wiedzieć, czego można się spodziewać po kokulturze. Wizualizacja daje badaczowi pewność w realizacji procedury. Aby przygotować komórki grzybów do infekcji makrofagami, należy zebrać i odwirować komórki C neoformans z hodowli średnio-długofazowej, a następnie trzy delikatne przemycia jednym mililitrem PBS o temperaturze pokojowej w tych samych warunkach wirówki.
Po ostatnim płukaniu ponownie zawieś komórki grzybów w ilości 1,2 razy 10 do 8 komórek na mililitr hodowli komórkowej wolnej od antybiotyków, o średnim stężeniu i dodaj jeden mililitr zawiesiny komórek grzyba do każdej z czterech studzienek z 70% do 80% zlewającą się sześciodołkową płytką do hodowli makrofagów. Następnie umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na trzy godziny. Ostrożnie przechyl płytkę, aby umożliwić trzykrotne delikatne umycie każdej studzienki jednym mililitrem PBS na studzienkę na mycie.
Aby zmierzyć skuteczność infekcji po ostatnim myciu, dodaj jeden mililitr pożywki wolnej od antybiotyków do każdej studzienki na płytce sześciodołkowej i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych. W odpowiednich eksperymentalnych punktach czasowych zebrać supernatant z każdej studzienki i zmierzyć ilość LDH w każdym dołku zgodnie ze standardowymi protokołami. W tym samym czasie należy przeprowadzić lizę niezakażonych komórek makrofagów, aby określić wartość maksymalnej cytotoksyczności.
Cytotoksyczność można następnie obliczyć przy użyciu wskazanego wzoru. W przypadku niezakażonego zbierania makrofagów i wspólnej hodowli dodaj jeden mililitr zimnego PBS do każdej studzienki niezakażonych makrofagów. Po minucie delikatnie postukaj w płytkę, aby odłączyć komórki od dna studzienek i zebrać zawiesiny komórek w jednej 15-mililitrowej probówce.
Zebrać komórki przez odwirowanie i całkowicie usunąć supernatant, aby umożliwić natychmiastowe błyskawiczne zamrożenie osadu w ciekłym azocie do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni. Analiza głównych składowych procesu w odniesieniu do zbiorów danych pokazuje, że zgodnie z oczekiwaniami największym składnikiem separacji danych są próbki zakażone i niezainfekowane. Drugą cechą wyróżniającą próbki jest ich zmienność biologiczna.
Połączenie korelacji Pearsona z hierarchicznym grupowaniem według odległości euklidesowej pokazuje wyraźne grupowanie zakażonych i niezakażonych próbek z odtwarzalnością replikacji w zakresie od 95% do 96%Test T Students'T skorygowany o testowanie wielu hipotez przy użyciu wskaźnika fałszywych odkryć Benjaminiego-Hochberga można przeprowadzić w celu zidentyfikowania białek o znaczących różnicach w liczebności podczas infekcji w porównaniu z niezakażonymi kontrolami. W tej analizie zidentyfikowano 117 białek gospodarza wykazujących znaczącą zmianę ekspresji po zakażeniu. Warto zauważyć, że zaobserwowano również znaczny wzrost liczebności białek grzybów, zgodnie z oczekiwaniami podczas infekcji.
Ważne jest, aby delikatnie obchodzić się z makrofagami podczas hodowli, mycia i pobierania próbek. Określając, w jaki sposób patogen przystosowuje się do gospodarza i jak gospodarz broni się przed zakażeniem, uzyskuje się nowe informacje w dziedzinie mikrobiologii i immunologii.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół bada współdziałanie między gospodarzem a patogenem podczas infekcji grzybiczej za pomocą proteomiki opartej na spektrometrii masowej. Umożliwia wykrywanie białek zarówno gospodarza, jak i patogenu w jednym eksperymencie, dostarczając informacji o białkach związanych z infekcją.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Choroby zakaźne
- Proteomika
Tło
- Rozumienie interakcji gospodarz-patogen jest kluczowe dla badań nad chorobami.
- Infekcje grzybicze stanowią znaczne zagrożenie zdrowotne, wymagając nowych strategii leczenia.
- Proteomika może ujawniać zmiany w obfitości białek podczas infekcji.
- Makrofagi odgrywają kluczowa rolę w odpowiedzi immunologicznej na patogeny.
Cel badania
- Aby opisać interakcje między makrofagami gospodarza a patogenem Cryptococcus neoformans.
- Aby zidentyfikować nowe białka związane z infekcją wytwarzane podczas infekcji grzybiczej.
- Aby ustanowić uniwersalny przepływ proteomiki i bioinformatyki mający zastosowanie do różnych systemów biologicznych.
Zastosowane metody
- Proteomika oparta na spektrometrii masowej do wykrywania białek.
- Ilościowanie bez etykietowania do pomiaru zmian w obfitości białek.
- Optymalizacja liczby zakażeń (MOI) i punktów czasowych dla dokładnych wyników.
- Analiza bioinformatyczna do interpretacji danych proteomicznych.
Główne wyniki
- Identyfikacja białek grzybów specyficznie wytwarzanych podczas infekcji.
- Wgląd w reakcję makrofagów na Cryptococcus neoformans.
- Ustanowienie ram dla badania różnych patogenów i odpowiedzi immunologicznych.
- Wykazanie zastosowania protokołu do różnych systemów biologicznych.
Wnioski
- Protokół zapewnia kompleksowe podejście do badania interakcji gospodarz-patogen.
- Stanowi podstawę dla przyszłych badań nad infekcjami grzybiczymi i odpowiedziami immunologicznymi.
- Zaleca się dalszą optymalizację warunków eksperymentalnych dla różnych gatunków.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This label-free quantitative proteomics workflow enables simultaneous profiling of host and pathogen proteomes during infection, providing unbiased protein abundance data critical for target validation in infectious disease research. By identifying infection-associated fungal proteins and host response signatures, the method supports mechanistic de-risking of anti-virulence strategies and informs preclinical target selection. Its transferability across host-pathogen systems enhances portfolio-wide applicability for antifungal and immunomodulatory discovery programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by identifying pathogen proteins exclusively produced during infection, representing novel virulence-associated targets.
- Scientific Value: Clarifies host-pathogen interaction pathways through correlated abundance changes in both proteomes, supporting functional target validation.
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing quantitative, reproducible infection-state proteomic profiles for de-risking target hypotheses.
Screening & Assay Development
- Operational Value: Prepares validated biological systems (infected macrophages) for downstream assay development with standardized infection conditions and MOI optimization.
- Operational Value: Generates quantitative, label-free proteomic outputs suitable for assay standardization and reproducibility assessment in screening campaigns.
- Operational Value: Supports scalable platform reuse across diverse pathogens due to the universal proteomics and bioinformatics pipeline design.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Identifies disease-relevant host proteins responding to microbial invasion, enabling biomarker alignment for preclinical validation.
- Translational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical work by linking infection-state proteomic shifts to pathogenic mechanisms.
- Translational Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by highlighting proteins essential for virulence and host defense mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
The workflow integrates into early discovery biology through host-pathogen interaction profiling, supports screening readiness via standardized infection models, and enables translational research by connecting proteomic changes to virulence and immune response mechanisms.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying infection-induced changes in both pathogen and host proteomes.
- Screening: Delivers assay-ready biological systems with optimized MOI and time points, ensuring reproducible infection models for compound evaluation.
- Analytics: Provides label-free quantitative measurements and statistical outputs (e.g., Benjamini-Hochberg corrected t-tests) to compare conditions and identify significantly altered proteins.
- Translational Research: Links proteomic signatures to pathogenic mechanisms and host defense responses, supporting biomarker discovery and preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable proteomics and bioinformatics pipeline applicable to multiple pathogens and immune systems, reducing redundant method development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation through unbiased, quantitative infection-state proteomic profiling.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via optimized coculture, washing, and lysis protocols with validated QC metrics (PCA, clustering, 95-96% replicate reproducibility).
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by revealing critical virulence factors and host response networks, reducing late-stage biological risk in antifungal programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on infection-specific protein expression and pathway involvement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian and fungal cell culture, proteomics sample preparation, and mass spectrometry data analysis.
- Dependent on access to LC-MS/MS instrumentation, label-free quantification software, and bioinformatics tools for PCA, clustering, and differential expression analysis.
- Necessitates cross-team standardization of infection parameters (MOI, time points) and sample handling to ensure reproducibility across studies.
- Involves adaptation considerations for different pathogen-host systems, including optimization of fungal cell preparation and macrophage confluency.
- Practical limitations include the technical challenge of detecting low-abundance fungal proteins amid high background host signals, requiring sufficient infection depth and sensitivity.
