Bezznacznikowy przepływ pracy proteomiki ilościowej dla interakcji gospodarz-patogen opartych na odkryciach

Tutaj prezentujemy protokół do profilowania interakcji między gospodarzem a patogenem podczas infekcji za pomocą proteomiki opartej na spektrometrii mas. Protokół ten wykorzystuje kwantyfikację bez znaczników do pomiaru zmian w obfitości białek zarówno gospodarza (np. Makrofagi), jak i patogenu (np. Cryptococcus neoformans) w jednym eksperymencie.

Nasz protokół bada infekcję grzybiczą zarówno z perspektywy gospodarza, jak i patogenu, aby zidentyfikować interakcje między systemami biologicznymi, które mają kluczowe znaczenie dla choroby. W jednym eksperymencie możemy wykryć zarówno białka grzyba, jak i gospodarza oraz zidentyfikować białka grzybów wytwarzane tylko podczas infekcji, reprezentujące nowe białka związane z infekcją. Chociaż koncentrujemy się na leczeniu zakażeń grzybiczych poprzez odkrywanie nowych strategii leczenia przeciwzjadliwego, nasza linia produkcyjna w zakresie proteomiki i bioinformatyki jest uniwersalna i może być stosowana w wielu systemach biologicznych.

Nasze podejście stanowi podstawę do badań nad różnymi patogenami i licznymi odpowiedziami immunologicznymi i może być wykorzystane do uzyskania nowych informacji na temat związku między kryptokokiem a wrodzonym układem odpornościowym. Ważna jest reakcja makrofagów na patogeny i wykrywanie wystarczającej ilości białek grzybów. Dlatego zaleca się testowanie i optymalizację MOI i punktów czasowych dla każdego gatunku.

Ponieważ hodowla makrofagów i komórek grzybów może być trudna, ważne jest, aby wiedzieć, czego można się spodziewać po kokulturze. Wizualizacja daje badaczowi pewność w realizacji procedury. Aby przygotować komórki grzybów do infekcji makrofagami, należy zebrać i odwirować komórki C neoformans z hodowli średnio-długofazowej, a następnie trzy delikatne przemycia jednym mililitrem PBS o temperaturze pokojowej w tych samych warunkach wirówki.

Po ostatnim płukaniu ponownie zawieś komórki grzybów w ilości 1,2 razy 10 do 8 komórek na mililitr hodowli komórkowej wolnej od antybiotyków, o średnim stężeniu i dodaj jeden mililitr zawiesiny komórek grzyba do każdej z czterech studzienek z 70% do 80% zlewającą się sześciodołkową płytką do hodowli makrofagów. Następnie umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na trzy godziny. Ostrożnie przechyl płytkę, aby umożliwić trzykrotne delikatne umycie każdej studzienki jednym mililitrem PBS na studzienkę na mycie.

Aby zmierzyć skuteczność infekcji po ostatnim myciu, dodaj jeden mililitr pożywki wolnej od antybiotyków do każdej studzienki na płytce sześciodołkowej i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych. W odpowiednich eksperymentalnych punktach czasowych zebrać supernatant z każdej studzienki i zmierzyć ilość LDH w każdym dołku zgodnie ze standardowymi protokołami. W tym samym czasie należy przeprowadzić lizę niezakażonych komórek makrofagów, aby określić wartość maksymalnej cytotoksyczności.

Cytotoksyczność można następnie obliczyć przy użyciu wskazanego wzoru. W przypadku niezakażonego zbierania makrofagów i wspólnej hodowli dodaj jeden mililitr zimnego PBS do każdej studzienki niezakażonych makrofagów. Po minucie delikatnie postukaj w płytkę, aby odłączyć komórki od dna studzienek i zebrać zawiesiny komórek w jednej 15-mililitrowej probówce.

Zebrać komórki przez odwirowanie i całkowicie usunąć supernatant, aby umożliwić natychmiastowe błyskawiczne zamrożenie osadu w ciekłym azocie do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni. Analiza głównych składowych procesu w odniesieniu do zbiorów danych pokazuje, że zgodnie z oczekiwaniami największym składnikiem separacji danych są próbki zakażone i niezainfekowane. Drugą cechą wyróżniającą próbki jest ich zmienność biologiczna.

Połączenie korelacji Pearsona z hierarchicznym grupowaniem według odległości euklidesowej pokazuje wyraźne grupowanie zakażonych i niezakażonych próbek z odtwarzalnością replikacji w zakresie od 95% do 96%Test T Students'T skorygowany o testowanie wielu hipotez przy użyciu wskaźnika fałszywych odkryć Benjaminiego-Hochberga można przeprowadzić w celu zidentyfikowania białek o znaczących różnicach w liczebności podczas infekcji w porównaniu z niezakażonymi kontrolami. W tej analizie zidentyfikowano 117 białek gospodarza wykazujących znaczącą zmianę ekspresji po zakażeniu. Warto zauważyć, że zaobserwowano również znaczny wzrost liczebności białek grzybów, zgodnie z oczekiwaniami podczas infekcji.

Ważne jest, aby delikatnie obchodzić się z makrofagami podczas hodowli, mycia i pobierania próbek. Określając, w jaki sposób patogen przystosowuje się do gospodarza i jak gospodarz broni się przed zakażeniem, uzyskuje się nowe informacje w dziedzinie mikrobiologii i immunologii.