Bezznacznikowa spektrometria mas immunoprecypitacji do profilowania interaktomii jądrowej na dużą skalę

Opisany jest proces proteomiki do identyfikacji partnerów interakcji białkowych z frakcji subkomórkowej jądrowej za pomocą wzbogacenia immunopowinowactwa danego białka i bezznacznikowej spektrometrii mas. Przepływ pracy obejmuje frakcjonowanie subkomórkowe, immunoprecypitację, przygotowywanie próbek wspomagane filtrem, oczyszczanie offline, spektrometrię mas i dalszy potok bioinformatyczny.

Ten przebieg proteomiki umożliwia bezstronną identyfikację i mapowanie endogennych interakcji białko-białko z rozdzielczością subkomórkową. Technika ta jest szczególnie korzystna w przypadku badania białek przynęty, które są wrażliwe na dawkowanie, mają niską liczebność lub mają wiele lokalizacji subkomórkowych. Metodę tę można zastosować do mapowania endogennych interakcji białkowych, zakładając, że dostępny jest odpowiedni odczynnik powinowactwa.

Jest to szczególnie ważne w przypadku wielu z tysięcy białek, które mają nieznaną funkcję, z których wiele zostało powiązanych z chorobami u ludzi. Metodę tę można dostosować do dowolnej linii komórkowej lub tkanki podatnej na frakcjonowanie subkomórkowe. Każde białko z odpowiednim odczynnikiem powinowactwa może być celowane.

Częstym wynikiem eksperymentów z oczyszczaniem powinowactwa jest często brak wyniku. Naprawdę dobre odczynniki, zbieranie danych QC przez cały czas i ograniczanie obsługi próbek są naprawdę ważne. Wiedz, że masz próbkę.

Na początek rozmrażaj przygotowane granulki komórkowe przez 15 minut w 1X objętości granulki zimnego buforu A z inhibitorami proteazy lub inhibitorami fosfatazy. Umieść probówkę zawierającą osad komórkowy na nutatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby ułatwić ponowne zawieszenie przez 30 minut. Następnie umieść probówkę w wirówce na 2 000 razy g i czterech stopniach Celsjusza na 10 minut, aby się osadzały.

Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić komórki z 5-krotnością objętości upakowanych komórek z buforem A. Inkubować na lodzie przez 20 minut. Następnie ponownie osadzaj w temperaturze 2 000 razy g i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Zdekantować bufor i ponownie zawiesić z 2X oryginalnie upakowanym buforem objętości komórki A z inhibitorami proteazy lub inhibitorami fosfatazy.

Odbić około siedem razy luźnym tłuczkiem A. Wirować lizat przez 10 minut w temperaturze 2 000 razy g i czterech stopniach Celsjusza. Ostrożnie przenieść supernatant do nowej probówki i błyskawicznie zamrozić go ciekłym azotem. Przechowuj lizat w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Zawiesić osad z 0,9 razy większą objętością buforu B z inhibitorami proteazy lub inhibitorami fosfatazy i mieszać na nutatorze przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby lizować jądra, odbić 20 razy tłuczkiem do miana B. Mieszaj lizat jądrowy na nutatorze przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby był jednorodny. Następnie odwirować lizat jądrowy przez 30 minut w temperaturze 21 000 razy g w czterech stopniach Celsjusza.

Odpipetować supernatant i zachować jako rozpuszczalny ekstrakt białka jądrowego. Aby dializować rozpuszczalny ekstrakt jądrowy, należy najpierw przeciąć rurkę dializacyjną o odpowiedniej długości i szerokości 24 milimetrów z odcięciem masy cząsteczkowej wynoszącej osiem kilodaltonów. Zaciśnij jedną stronę rurki i załaduj nukleoplazmę do rurki.

Po załadowaniu lizatu zacisnąć drugi koniec i zanurzyć w czystym szklanym pojemniku zawierającym bufor C z inhibitorami proteazy. Dializuj przez trzy godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przenieś zdializowaną nukleoplazmę ekstraktu jądrowego do probówki i odwiruj pod ciśnieniem 21 000 g w czterech stopniach Celsjusza przez 30 minut.

Przenieść trzy 20-mikrolitrowe podwielokrotności ekstraktu jądrowego do nowych probówek do mikrowirówek w celu walidacji frakcjonowania za pomocą western blot. Używając końcówek pipet, które zostały przecięte na końcówce, przygotuj mieszaninę kulek białka A/G dla każdej kontrpróby, łącząc 12,5 mikrolitra objętości kulki białka A Sepharose z 12,5 mikrolitrami sefarozy białka G w probówkach do mikrowirówek. Przemyć mieszaninę kulek białkowych A/G dwukrotnie 300 mikrolitrami buforu IP I. Wirować kulki w temperaturze 1 500 razy g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną minutę i zdekantować bufor.

Następnie przygotuj kulki białka przeciwciała A/G. Aby związać przeciwciało z kulkami, dodaj do probówki 300 mikrolitrów buforu IP I i 10 mikrogramów pożądanego przeciwciała. Pozwól, aby mieszanina kulek i przeciwciał kołysała się na nutatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.

Teraz należy rozdzielić odpowiednie objętości lizatów jądrowych do probówek wirówek do mikrowirówek o niskiej retencji na jeden miligram białka wejściowego na kontrpróbę. Wirować lizat z prędkością 16 000 g przez 30 minut i przenieść supernatant do nowej probówki. Dodaj jeden mikrolitr benzonazy w ilości 250 jednostek na mikrolitr na każdy miligram lizatu jądrowego i kołysz na nutatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 do 15 minut.

Aby przygotować kulki do wstępnego oczyszczenia lizatu, dodaj 12,5 mikrolitra każdego białka A i kulki białka G do 1,5 mililitrowych probówek o niskiej retencji. Przemyć dwa razy buforem do płukania IP I z inhibitorami proteazy. Zdekantować bufor i dodać jeden miligram przygotowanego lizatu jądrowego do kulek.

Inkubować, kołysząc się na nutatorze przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odwirować wstępnie oczyszczone lizaty w temperaturze 1 500 g i czterech stopniach Celsjusza przez jedną minutę. Następnie przemyj dwukrotnie kulki białka przeciwciała A lub G buforem IP I z inhibitorami proteazy.

Po odwirowaniu w temperaturze 1 500 g i czterech stopniach Celsjusza przez jedną minutę, zdekantować bufor. Teraz przenieś wstępnie oczyszczony lizat jądrowy na kulki białka przeciwciała A lub G. Inkubuj, kołysząc się na nutatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez cztery godziny.

Po inkubacji odwirować w temperaturze 1 500 g i czterech stopniach Celsjusza przez jedną minutę. Przenieść supernatant do probówek oznaczonych jako przepływ dla każdej kontrpróby. Przemyć kulki białka przeciwciała A lub G czterokrotnie jednym mililitrem buforu IP II z inhibitorami proteazy.

Następnie umyj kulki dwa razy jednym mililitrem buforu IP I z inhibitorami proteazy. Upewnij się, że cały bufor został usunięty po ostatnim praniu. Eluować białko z kulek przez inkubację z 20 mikrolitrami glicyny molowej o pH 2,75 każdy przez 30 minut na nutatorze.

Następnie wirować w temperaturze 750 razy g i w czterech stopniach Celsjusza przez jedną minutę i odpipetować supernatant. Powtórzyć tę inkubację z buforem elucyjnym po raz drugi. Po przygotowaniu osadu białkowego należy go ponownie zawiesić 30 mikrolitrami buforu alkilacyjnego SDS.

Inkubować próbkę w bloku grzewczym o temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie pozwól mu ostygnąć w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Do każdej próbki dodać 300 mililitrów roztworu UA i 30 mikrolitrów 100-milimolowego TCEP.

Załaduj roztwór do filtra odśrodkowego 30K. Po obróceniu filtra odśrodkowego na 21 000 razy g w temperaturze pokojowej przez 10 minut, utrzymuj przepływ na wypadek problemu z filtrem. Po umyciu filtra zgodnie z rękopisem dodać trzy mikrolitry po jednym mikrogramie na mikrolitr lizy C zawieszonej w 0,1 molowym Tris pH 8,5.

Napełnij filtry do znaku 100 mikrolitrów 0,1 molowym Tris pH 8,5. Pozostaw do strawienia przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, kołysząc się na nutatorze. Następnie dodaj jeden mikrolitr jednego mikrograma na mikrolitr trypsyny klasy MS.

Delikatnie wymieszaj i pozwól trypsynie inkubować się z próbką przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza, kołysząc się na nutatorze. Rano odwirować wiele razy po 21 000 g przez 20 minut, aby wymyć peptydy z filtra do czystej probówki mikrowirówkowej o niskiej retencji. Po odsoleniu peptydów za pomocą kolumn wirujących C18, ponownie zawieś liofilizowane peptydy w siedmiu mikrolitrach 0,1% TFA w 5% acetonitrylu.

Sonikować próbkę przez trzy minuty, aby upewnić się, że peptydy zostały ponownie zawieszone, a następnie wirować w dół z prędkością 14 000 g przez 10 minut. Załaduj od 15 do 30% próbki do systemu spektrometrii mas chromatografii cieczowej w celu analizy. W tym badaniu przeanalizowano potrójne immunoprecypitacje z pięciu miligramów ekstraktu jądrowego HeLa, wykorzystując kontrolę tylko z kulkami.

Przynęta DYRK1A znalazła się wśród trzech najwyżej wzbogaconych białek w porównaniu z grupą kontrolną, co wskazuje, że przeprowadzony eksperyment IP-MS był wiarygodny. Wykazano wyraźną separację między interaktorami o wysokim poziomie ufności i ponad 95% oczyszczonych białek zidentyfikowano jako niespecyficzne. W przypadku przykładowego zestawu danych DYRK1A partnerzy biorący udział w interakcjach IREF przedstawili wartości FC-A tak niskie, jak 0,45, co oznacza bardzo niskie wzbogacenie w stosunku do kontroli.

W związku z tym wiele z tych wcześniej zgłoszonych interakcji to wyniki fałszywie ujemne w tym zestawie danych, spadając poniżej progu FC-A wynoszącego trzy. Obliczona bezwzględna liczba kopii każdej interakcji IREF nie wykazała korelacji z poziomami wykrywania partnera interakcji przez IP-MS. Łączne zastosowanie FC-A większego niż trzy i saint większego niż 0,9 zredukowało listę interaktorów o wysokim poziomie ufności do sześciu białek.

Jednak po zastosowaniu punktu odcięcia FC-A większego niż trzy w izolacji, do sieci dodano osiem dodatkowych białek. Najważniejszą częścią tego protokołu jest wybór odczynnika przeciwciał do immunoprecypitacji. Przed zakończeniem tego przepływu pracy zaleca się walidację selektywności metodą Western blot lub Coomassie.

Dowody potwierdzające interakcje białko-białko można uzyskać z co-IP western blot zidentyfikowanych interaktorów. Sieciowanie chemiczne białek, choć bardziej złożone, może ujawnić domeny interakcji interaktorów. Korzystając z tej metody, moja grupa badawcza odkryła nowe funkcje DYRK1A, kinazy białkowej niezbędnej do rozwoju mózgu ssaków i powiązanej z neuropatologią choroby Alzheimera.