Name: Bezznacznikowa spektrometria mas immunoprecypitacji do profilowania interaktomii jądrowej na dużą skalę (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Poznaj metodę bezznacznikowej spektrometrii mas immunoprecypitacji do mapowania interakcji białkowych w jądrze komórkowym. Technika ta umożliwia identyfikację endogennych partnerów interakcyjnych o niskiej zawartości.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant Grand Challenge dla W.M.O. z Linda Crnic Institute for Down syndrome oraz przez umowę o współpracy DARPA 13-34-RTA-FP-007. Chcielibyśmy podziękować Jessemu Kurlandowi i Kirze Cozzolino za ich wkład w czytanie i komentowanie manuskryptu.

<ol><li>Varjosalo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+interaction+landscape+of+the+human+CMGC+kinase+group%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The protein interaction landscape of the human CMGC kinase group.</a> Cell Reports. 3, 1306-1320 (2013).</li>
<li>Kimple, M. E., Brill, A. L., Pasker, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+Affinity+Tags+for+Protein+Purification%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Overview of Affinity Tags for Protein Purification.</a> Current Protocols in Protein Science. 73, (2013).</li>
<li>Mahmood, N., Xie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+endogenous+%27nonspecific%27+protein+detected+by+a+His-tag+antibody+is+human+transcription+regulator+YY1%5BTitle%5D)+AND+%22Data+in+Brief%22%5BJournal%5D)">An endogenous 'nonspecific' protein detected by a His-tag antibody is human transcription regulator YY1.</a> Data in Brief. 2, 52(2015).</li>
<li>Zordan, R. E., Beliveau, B. J., Trow, J. A., Craig, N. L., Cormack, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avoiding+the+ends%3A+internal+epitope+tagging+of+proteins+using+transposon+Tn7%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Avoiding the ends: internal epitope tagging of proteins using transposon Tn7.</a> Genetics. 200, 47-59 (2015).</li>
<li>Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transience+of+transient+overexpression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The transience of transient overexpression.</a> Nature Methods. 10, 715-721 (2013).</li>
<li>Bronicki, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten+new+cases+further+delineate+the+syndromic+intellectual+disability+phenotype+caused+by+mutations+in+DYRK1A%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Ten new cases further delineate the syndromic intellectual disability phenotype caused by mutations in DYRK1A.</a> European Journal of Human Genetics. 23, 1482-1487 (2015).</li>
<li>Antonarakis, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down+syndrome+and+the+complexity+of+genome+dosage+imbalance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Down syndrome and the complexity of genome dosage imbalance.</a> Nature Reviews Genetics. , (2016).</li>
<li>Dowjat, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trisomy-driven+overexpression+of+DYRK1A+kinase+in+the+brain+of+subjects+with+Down+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Trisomy-driven overexpression of DYRK1A kinase in the brain of subjects with Down syndrome.</a> Neuroscience Letters. 413, 77-81 (2007).</li>
<li>Fotaki, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dyrk1A+haploinsufficiency+affects+viability+and+causes+developmental+delay+and+abnormal+brain+morphology+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Dyrk1A haploinsufficiency affects viability and causes developmental delay and abnormal brain morphology in mice.</a> Molecular and Cellular Biology. 22, 6636-6647 (2002).</li>
<li>Hämmerle, B., Elizalde, C., Tejedor, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spatio-temporal+and+subcellular+expression+of+the+candidate+Down+syndrome+gene+Mnb%2FDyrk1A+in+the+developing+mouse+brain+suggests+distinct+sequential+roles+in+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The spatio-temporal and subcellular expression of the candidate Down syndrome gene Mnb/Dyrk1A in the developing mouse brain suggests distinct sequential roles in neuronal development.</a> European Journal of Neuroscience. 27, 1061-1074 (2008).</li>
<li>Funakoshi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+the+human+MNB%2FDYRK1A+gene+induces+formation+of+multinucleate+cells+through+overduplication+of+the+centrosome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Overexpression of the human MNB/DYRK1A gene induces formation of multinucleate cells through overduplication of the centrosome.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 4, 12(2003).</li>
<li>Yu, D., Cattoglio, C., Xue, Y., Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complex+between+DYRK1A+and+DCAF7+phosphorylates+the+C-terminal+domain+of+RNA+polymerase+II+to+promote+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A complex between DYRK1A and DCAF7 phosphorylates the C-terminal domain of RNA polymerase II to promote myogenesis.</a> Nucleic Acids Research. , 1-14 (2019).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).</li>
<li>Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature Methods. 6, 359-362 (2009).</li>
<li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11, 2301-2319 (2016).</li>
<li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+%28prote%29omics+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13, 731-740 (2016).</li>
<li>Mellacheruvu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRAPome%3A+A+contaminant+repository+for+affinity+purification-mass+spectrometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The CRAPome: A contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data.</a> Nature Methods. 10, 730-736 (2013).</li>
<li>Choi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAINT%3A+Probabilistic+scoring+of+affinity+purificationg-mass+spectrometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">SAINT: Probabilistic scoring of affinity purificationg-mass spectrometry data.</a> Nature Methods. 8, 70-73 (2011).</li>
<li>Shannon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoscape%3A+a+software+environment+for+integrated+models+of+biomolecular+interaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Cytoscape: a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks.</a> Genome Research. 13, 2498-2504 (2003).</li>
<li>Szklarczyk, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+STRING+database+in+2017%3A+quality-controlled+protein-protein+association+networks%2C+made+broadly+accessible%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The STRING database in 2017: quality-controlled protein-protein association networks, made broadly accessible.</a> Nucleic Acids Research. 45, 362-368 (2017).</li>
<li>Bindea, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClueGO%3A+a+Cytoscape+plug-in+to+decipher+functionally+grouped+gene+ontology+and+pathway+annotation+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ClueGO: a Cytoscape plug-in to decipher functionally grouped gene ontology and pathway annotation networks.</a> Bioinformatics. 25, 1091-1093 (2009).</li>
<li>Guard, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+interactome+of+DYRK1A+reveals+a+functional+role+in+DNA+damage+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The nuclear interactome of DYRK1A reveals a functional role in DNA damage repair.</a> Scientific Reports. 9, 6539(2019).</li>
<li>Razick, S., Magklaras, G., Donaldson, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iRefIndex%3A+A+consolidated+protein+interaction+database+with+provenance%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">iRefIndex: A consolidated protein interaction database with provenance.</a> BMC Bioinformatics. 9, 405(2008).</li>
<li>Kulak, N. A., Pichler, G., Paron, I., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal%2C+encapsulated+proteomic-sample+processing+applied+to+copy-number+estimation+in+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Minimal, encapsulated proteomic-sample processing applied to copy-number estimation in eukaryotic cells.</a> Nature Methods. 11, 319-324 (2014).</li>
<li>Liu, Y., Beyer, A., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+Dependency+of+Cellular+Protein+Levels+on+mRNA+Abundance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">On the Dependency of Cellular Protein Levels on mRNA Abundance.</a> Cell. 165, 535-550 (2016).</li>
<li>Hughes, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+proteome+analysis+using+paramagnetic+bead+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology.</a> Molecular Systems Biology. 10, 757(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany tutaj przepływ pracy proteomiki zapewnia skuteczną metodę identyfikacji interaktorów białkowych o wysokim poziomie ufności dla białka będącego przedmiotem zainteresowania. Takie podejście zmniejsza złożoność próbki poprzez frakcję subkomórkową i koncentruje się na zwiększeniu partnerów interakcji identyfikacyjnych poprzez solidne przygotowanie próbki, czyszczenie próbki w trybie offline i rygorystyczną kontrolę jakości systemu LC-MS. Opisana tutaj dalsza analiza danych pozwala na prostą ocenę statystyczną białek zidentyfikowanych jako współoczyszczające się z przynętą. Jednak ze względu na dużą liczbę zmiennych eksperymentalnych (skala, linia komórkowa, wybór przeciwciał), każdy eksperyment wymaga innych punktów odcięcia i rozważań dotyczących wizualizacji i wzbogacania danych.
Pierwszym założeniem projektowym w eksperymencie IP-MS jest wybór przeciwciał, które zostaną wykorzystane do kooczyszczania białka będącego przedmiotem zainteresowania wraz z jego oddziałującymi partnerami. Chociaż w ciągu ostatnich kilku dekad dostępność komercyjnych przeciwciał rozszerzyła się na większe części ludzkiego proteomu, nadal istnieje wiele białek, dla których odczynniki są ograniczone. Co więcej, przeciwciała, które zostały zwalidowane do zastosowań takich jak wykrywanie western blot, mogą nie być zdolne do selektywnego wzbogacania białka docelowego w eksperymencie immunoprecypitacyjnym. Przed przeprowadzeniem eksperymentu proteomicznego interakcji na dużą skalę sugeruje się wykonanie IP z 90% zlewającej się 10-centymetrowej płytki lub równoważnej liczby komórek i sondowanie docelowego białka za pomocą western blotting. Jeśli do immunoprecypitacji dostępne jest więcej niż jedno przeciwciało, sugeruje się dodatkowo wybór wielu przeciwciał rozpoznających epitopy w różnych częściach białka. Wiązanie przeciwciała z białkiem przynęty może zablokować niezbędny interfejs wiązania dla domniemanych partnerów oddziałujących. Wybór wtórnego epitopu dla białka przynęty zwiększy pokrycie profilu interakcji zidentyfikowanego w eksperymencie opartym na spektrometrii mas.
Drugą ważną kwestią jest wybór odpowiedniej kontroli w celu odróżnienia interakcji o wysokim poziomie ufności od interakcji o niskim poziomie ufności lub interakcji niespecyficznych od tych zidentyfikowanych jako oczyszczające za pomocą przynęty. Najbardziej rygorystyczną kontrolą w eksperymencie IP-MS jest zakończenie immunoprecypitacji z linii komórkowej CRISPR KO przynęty. Taka kontrola umożliwia identyfikację i odfiltrowanie niespecyficznych białek, które wiążą się bezpośrednio z przeciwciałem, a nie z białkiem przynęty. W przypadkach, w których wytworzenie linii komórkowej CRISPR KO każdego białka przynęty nie jest możliwe, można zastosować kontrolę kulek IgG tego samego izotypu przeciwciała przynęty. W eksperymentach wykorzystujących panel przeciwciał reprezentujących wiele gatunków, użycie kontroli tylko kulek może być właściwe, ale zwiększy odsetek wyników fałszywie dodatnich zidentyfikowanych jako interaktorzy o wysokim poziomie zaufania.
Wybór linii komórkowej użytej w eksperymencie IP-MS zależy od kilku kluczowych czynników. Ekspresja i lokalizacja białek są w dużej mierze zależne od typu komórki. Podczas gdy szacunki ekspresji RNA można znaleźć dla większości genów w wielu powszechnie stosowanych liniach komórkowych, ekspresja białka jest słabo skorelowana z ekspresją RNA i musi być określona eksperymentalnie25. Należy unikać linii komórkowych, w których białko przynęty ulega ekspresji w bardzo niskiej liczbie kopii, aby uniknąć problemów związanych z drastycznym wzrostem skali hodowli komórkowej, który może być wymagany. Należy jednak zauważyć, że przygotowanie próbki można zoptymalizować pod kątem wykrywania białek o bardzo niskiej liczebności. Metoda przygotowania próbki wspomaganej filtrem (FASP), choć solidna, może spowodować ponad 50% utratę peptydu w próbce. Jednogarnkowe przygotowanie próbek ze wzmocnieniem fazy stałej (SP3) to wydajna metoda generowania próbek do analizy spektrometrii mas, która minimalizuje straty próbek26. Zwiększony odzysk możliwy dzięki metodzie przygotowania próbki SP3 może być użyteczną alternatywą w tym procesie oznaczania ilościowego białek, które znajdują się w pobliżu granicy wykrywalności.
Ten przepływ pracy proteomiki został zastosowany w wielu przynętach jądrowych, w tym kinazach, ligazach ubikwityny E3 i rusztowaniach kompleksów wielopodjednostkowych. Zakładając prawidłową walidację odczynników przeciwciał, pomyślne wykonanie tego procesu pracy spowoduje wykrycie partnerów interakcji jądrowej białek o wysokim poziomie ufności dla białka będącego przedmiotem zainteresowania.

Ludzki proteom wykazuje ogromną różnorodność strukturalną i biochemiczną poprzez tworzenie stabilnych kompleksów wielopodjednostkowych i przejściowe interakcje białko-białko. W związku z tym identyfikacja partnerów interakcji dla białka będącego przedmiotem zainteresowania jest powszechnie wymagana w badaniach mających na celu rozwikłanie mechanizmu molekularnego. Niedawne postępy w protokołach oczyszczania powinowactwa i pojawienie się oprzyrządowania do szybkiej spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości umożliwiły łatwe mapowanie krajobrazów interakcji białek w jednym bezstronnym eksperymencie.
Protokoły interakcji białek często wykorzystują ektopowe systemy ekspresji z konstruktami fuzyjnymi oznaczonymi powinowactwem do identyfikacji interakcji białkowych bez konieczności wysokiej jakości przeciwciał rozpoznających interesujące białko1,2. Jednak metody oparte na znacznikach epitopów mają kilka wad. Fizyczne interakcje z epitopem mogą prowadzić do wykrycia niespecyficznych białek oczyszczających3. Dodatkowo, fuzja tych znaczników epitopów z N- lub C-końcem białka może blokować natywne interakcje białko-białko lub zakłócać fałdowanie białek, aby promować niefizjologiczne konformacje4. Co więcej, ektopowe systemy ekspresji zazwyczaj wykazują nadekspresję białka przynęty w stężeniach suprafizjologicznych, co może prowadzić do identyfikacji sztucznych interakcji białkowych, szczególnie w przypadku genów wrażliwych na dawkę5. Aby obejść te problemy, endogenne białko przynęty może być immunoprecypitowane wraz z powiązanymi oddziałującymi białkami ofiary, zakładając dostępność wysokiej jakości przeciwciała, które rozpoznaje białko natywne.
Tu znajduje się proces proteomiki interakcji do wykrywania interaktomu jądrowego białka endogennego na przykładzie kinazy białkowej CMGC DYRK1A. Zakłócenie liczby kopii, poziomu aktywności lub ekspresji DYRK1A może spowodować poważną niepełnosprawność intelektualną u ludzi i śmiertelność zarodka u myszy6,7,8,9. DYRK1A wykazuje dynamiczną regulację czasoprzestrzenną10, oraz compartmentalized protein interactions11,12, wymagając podejść zdolnych do wykrywania partnerów interakcji o niskiej liczebności specyficznych dla różnych przedziałów subkomórkowych.
Ten protokół wykorzystuje frakcjonowanie komórkowe ludzkich komórek HeLa na frakcje cytozolu i nukleoplazmy, immunoprecypitację, przygotowanie próbki do spektrometrii mas oraz przegląd bioinformatycznego potoku do oceny jakości danych i wizualizacji wyników, z skryptami R dostarczonymi do analizy i wizualizacji (Rysunek 1). Wszystkie pakiety oprogramowania proteomicznego wykorzystywane w tym przepływie pracy są dostępne bezpłatnie do pobrania lub można uzyskać do nich dostęp za pośrednictwem interfejsu internetowego. Aby uzyskać dodatkowe informacje na temat oprogramowania i metod obliczeniowych, szczegółowe samouczki i instrukcje są dostępne pod podanymi linkami.

<table><tbody><tr><td>0,25% trypsyna, 0,1% EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml probówki do mikrowirówek o niskim czynszu</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-320</td><td></td></tr><tr><td>4-20% Mini PROTEAN TGX Prefabrykowane żele białkowe</td><td>Bio-Rad</td><td>4561096</td><td></td></tr><tr><td>aceton (HPLC)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A949SK-4</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0,5 ml 30k kolumna</td> <td>filtracyjnaMillipore Sigma</td><td>UFC503096</td><td></td></tr><tr><td>Benzamidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12072</td><td></td></tr><tr><td>benzonaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014</td><td></td></tr><tr><td>Chloroacetamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0267</td><td></td></tr><tr><td>Zamknięcie rurki do dializy</td><td>Caroline Biological Supply Company</td><td>684239</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>Sc-47724</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>887845</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>HeLa QC tryptic digest</td><td>Pierce</td><td>88329</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ1692630</td><td></td></tr><tr><td>insulina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12585014</td><td></td></tr><tr><td>jodoacetamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>KONTES Homogenizator do odbłąk 7 ml</td><td>VWR</td><td>KT885300-0007</td><td></td></tr><tr><td>Tłuczek o dużym prześwicie 7ml</td><td>VWR</td><td>KT885301-0007</td><td></td></tr><tr><td>Endopeptydaza lizylowa C</td><td>VWR</td><td>125-05061</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek</td> <td>magnezuSigma-Aldrich</td><td>208337</td><td></td></tr><tr><td>Microcystin</td><td>enzo nauki przyrodnicze</td><td>ALX-350-012-C100</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P 40 Roztwór zastępczy</td><td>Przeciwciało Sigma-Aldrich</td><td>98379</td><td></td></tr><tr><td>p84</td><td>GeneTex</td><td>GTX70220</td><td></td></tr> Zestaw do oznaczania białek BCA <tr><td>buforowanych</td><td></td><td></td><td></td>fosforanami</tr><tr><td>Pierce</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BSA Protein Digest, klasa MS</td><td>Kolumny wirujące Thermo Fisher Scientific</td><td>88341</td><td>LCMS QC</td></tr><tr><td>Pierce C18</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI-89873</td><td></td></tr><tr><td>Proteaza Pierce Trypsyna, MS Grade</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>90057</td><td>Do przygotowania próbek spektrometrii mas</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek</td> <td>potasuSigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Białko A Sepharoza CL-4B</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences</td><td>17-0780-01</td><td></td></tr><tr><td>Białko G Sepharose 4 Fast Flow</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences</td><td>17-0618-01</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Końcówka emitera krzemionki</td><td>Pico TIP</td><td>FS360-20-10</td><td></td></tr><tr><td>Tłuczek mały Clearance 7ml</td><td>VWR</td><td>KT885302-0007</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Fluorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>201154</td><td></td></tr><tr><td>Pirosiarczyn sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31448</td><td></td></tr><tr><td>Ortowanadan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>Spectra/ Por 8 kDa 24 mm rurka do dializy</td><td>Thomas Scientific</td><td>3787K17</td><td></td></tr><tr><td>TC Dish 150, Standard</td><td>Sarstedt</td><td>83.3903</td><td>Naczynie do hodowli tkankowych dla komórek adherentnych</td></tr><tr><td>TCA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9159</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Thermo Scientific</td><td>PG82080</td><td></td></tr><tr><td>TFA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28904</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Orbitrap Fusion MS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>29700</td><td></td></tr><tr><td>Wody ACQUITY Klasa M Wody UPLC</td><td>Wody</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC M-Class Kolumna odwrócona faza 1,7 i mikro; m Sferyczna hybryda (1,7 &mikro; m, 75 i mikro; m x 250 mm)</td><td>Wody</td><td>186007484</td><td>kolumnie nanoflow C18</td></tr></tbody></table>

bezznacznikowa spektrometria mas immunoprecypitacji do profilowania interaktomii jądrowej na dużą skalę

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Spektrometria mas oczyszczania immunopowinowactwa (IP-MS) stała się solidną ilościową metodą identyfikacji interakcji białko-białko. Niniejsza publikacja przedstawia kompletny przebieg proteomiki interakcji, przeznaczony do identyfikacji interakcji białko-białko o niskiej liczebności z jądra, które można również zastosować do innych przedziałów subkomórkowych. Ten przepływ pracy obejmuje frakcjonowanie subkomórkowe, immunoprecypitację, przygotowanie próbek, czyszczenie offline, spektrometrię mas bez znaczników w jednym ujęciu oraz dalszą analizę obliczeniową i wizualizację danych. Nasz protokół jest zoptymalizowany pod kątem wykrywania przedziałowych interakcji o niskiej liczebności, które są trudne do zidentyfikowania na podstawie lizatów całych komórek (np. interakcji czynników transkrypcyjnych w jądrze) poprzez immunoprecypitację endogennych białek z frakcjonowanych przedziałów subkomórkowych. Przedstawiony tutaj proces przygotowania próbki zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące przygotowania ekstraktu jądrowego z komórek HeLa, oczyszczania powinowactwa immunologicznego endogennego białka przynęty oraz ilościowej analizy spektrometrii mas. Omawiamy również kwestie metodologiczne dotyczące przeprowadzania immunoprecypitacji na dużą skalę w eksperymentach profilowania interakcji opartych na spektrometrii mas i podajemy wytyczne dotyczące oceny jakości danych w celu odróżnienia prawdziwie dodatnich interakcji białkowych od interakcji niespecyficznych. Podejście to zostało zademonstrowane poprzez badanie interaktomu jądrowego kinazy CMGC, DYRK1A, kinazy białkowej o niskiej liczebności ze słabo zdefiniowanymi oddziaływaniami w jądrze.

Większość masy białek zidentyfikowanej w eksperymencie IP-MS składa się z białek nieswoistych. Z tego względu jednym z kluczowych wyzwań w eksperymencie IP-MS jest interpretacja tego, które białka są interaktorami o wysokim stopniu pewności, a które interaktorami nieswoistymi. Aby zademonstrować kluczowe parametry wykorzystywane w ocenie jakości danych, w badaniu przeanalizowano potrójne immunoprecypitacje z 5 mg ekstraktu jądrowego HeLa z wykorzystaniem kontroli z samymi kuleczkami. Pierwszą wewnętrzną weryfikacją zapewniającą wiarygodność eksperymentu IP-MS jest sprawdzenie, czy białko przynęty (bait) znajduje się wśród białek o najwyższym stopniu wzbogacenia, zidentyfikowanych zarówno na podstawie krotności zmiany (fold-change) względem kontroli, jak i prawdopodobieństwa SAINT. W tym przypadku przynęta DYRK1A znalazła się wśród trzech najsilniej wzbogaconych białek względem kontroli (Rysunek 2A,B). W badaniu interaktomu jądrowego DYRK1A z wykorzystaniem czterech niezależnych przeciwciał, próg FC-A &gt;3,0 oraz próg prawdopodobieństwa SAINT &gt;0,7 stanowiły rygorystyczne kryteria identyfikacji zarówno nowych, jak i wcześniej zwalidowanych interaktorów2. Po zastosowaniu tych kryteriów w niniejszym eksperymencie zaobserwowano wyraźne oddzielenie interaktorów o wysokim stopniu pewności od &gt;95% współoczyszczonych białek zidentyfikowanych jako nieswoiste (Rysunek 2A,B). Zastosowanie zarówno progu wzbogacenia (fold change), jak i progu prawdopodobieństwa zwiększa rygorystyczność analizy, wymagając spójnie wysokiego wzbogacenia identyfikatorów białek we wszystkich powtórzeniach biologicznych.
Oprócz punktacji statystycznej, przepływ analizy CRAPome mapuje również wcześniej zgłoszone interakcje na dane przynęta-ofiara (bait-prey)23. Choć takie mapowanie może być przydatne przy wyznaczaniu progów dla interakcji o wysokiej i niskiej wiarygodności, wcześniej zgłoszone interakcje mogą uzyskać niskie wyniki w zakresie FC-A i prawdopodobieństwa SAINT, co potencjalnie wskazuje, że wiele znanych interakcji danej przynęty może występować tylko w konkretnych typach komórek, kontekstach lub organellach. Dla przykładowego zbioru danych DYRK1A wartości FC-A interaktorów iREF były tak niskie jak 0,45, co oznacza bardzo niski poziom wzbogacenia w stosunku do kontroli (Rysunek 2C). Aby uniknąć wzrostu liczby wyników fałszywie dodatnich, progowanie statystyczne powinno być przeprowadzane w sposób, który priorytetyzuje rygorystyczność nad redukcją wyników fałszywie ujemnych. Należy zauważyć, że wykrycie tych interakcji było niezależne od poziomu obfitości białek (Rysunek 2C). Obliczona bezwzględna liczba kopii każdej interakcji iREF w komórkach HeLa nie wykazała korelacji z poziomami wykrycia partnera interakcji metodą IP-MS24.
Cytoscape służy jako skuteczne narzędzie do wizualizacji wielu warstw danych o oddziaływaniach19. W opisanym tutaj eksperymencie immunoprecypitacji DYRK1A, połączone zastosowanie FC-A &gt; 3.0 oraz SAINT &gt; 0.9 zredukowało listę wysokoufałych interaktorów do sześciu białek (Rycina 2D). Jednakże przy zastosowaniu samego progu FC-A &gt; 3.0 do sieci dodano osiem dodatkowych białek. Te dodatkowe białka interaktory wykazują wysoką łączność z interaktorami już obecnymi w sieci, co sugeruje, że są one powiązane w podobnych kompleksach lub pełnią podobne role funkcjonalne. W tym celu do sieci włączono dowody z bazy STRING-DB dotyczące oddziaływań białko-białko, przedstawione jako niebieskie przerywane linie20. Choć ten eksperyment z pojedynczą przynętą przeprowadzony w trzech powtórzeniach dostarcza ograniczonej próbki pełnej sieci oddziaływań DYRK1A, zastosowanie dodatkowych przynęt, powtórzeń oraz integracja dużych publicznych zbiorów danych mogą posłużyć do rozszerzenia sieci wysokoufałych oddziaływań. Progi statystyczne będą zatem specyficzne dla każdego pojedynczego eksperymentu i będą wymagały dokładnej oceny.
<img alt="Przebieg pracy z ekstraktami jądrowymi; schemat; immunoprecypitacja, spektrometria mas, analiza danych, badania białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60432/60432fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Reprezentatywny schemat proteomiczny dla subkomórkowej immunoprecypitacji połączonej ze spektrometrią mas (IP-MS). Komórki hoduje się w 4-litrowych kolbach o okrągłym dnie lub w 15-centymetrowych naczyniach do hodowli tkanek, a następnie zbiera się je w tym samym czasie w celu frakcjonowania subkomórkowego. Komórki frakcjonuje się na frakcję cytozolową, jądrową oraz osad jądrowy, a immunoprecypitacje przeprowadza się z 1–10 mg lizatu jądrowego, wykorzystując jedno lub wiele przeciwciał rozpoznających tę samą białkową przynętę (bait). Przed analizą metodą spektrometrii mas w trybie single shot przeprowadza się przygotowanie próbek z użyciem filtracji (FASP) oraz offline’owe oczyszczanie próbek. Do przetwarzania danych w celu uzyskania interpretowalnych wyników oddziaływań wykorzystuje się odpowiedni potok obliczeniowy (computational pipeline). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60432/60432fig01large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza oddziaływań białkowych z DYRK1A; wykresy, wykresy punktowe, diagram sieci dla danych białkowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60432/60432fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2: Reprezentatywne dane dla eksperymentu IP-MS z użyciem jednej przynęty i jednego przeciwciała. (A) Wyniki FC-A oraz prawdopodobieństwa SAINT z przepływu analizy CRAPome dla optymalnego eksperymentu z wykorzystaniem pojedynczego przeciwciała przeciwko kinazie DYRK1A (n = 3). Do porównania wykorzystano kontrole zawierające wyłącznie kuleczki. Czerwone linie ciągłe reprezentują wartości progowe ustalone dla FC-A &gt; 3.0 oraz SAINT &gt; 0.7. (B) Wyjściowe szacunki zawartości białek z programu MaxQuant (iBAQ) w funkcji stosunku log2 zawartości białek w próbce IP DYRK1A do kontroli, z kolorowaniem według zakresu skorygowanej wartości p z analizy empirycznego Bayesa dla intensywności bezetykietowych. (C) FC-A i szacowana liczba kopii białek wymienionych jako białka oddziałujące w bazie danych iRef23,24(D) Wizualizacja sieci interaktorów DYRK1A w programie Cytoscape. Węzły niebieskie = FC-A &gt; 3.0, SAINT &gt; 0.7. Pomarańczowe węzły = FC-A &gt; 3.0. Czarne krawędzie = białka zidentyfikowane jako interaktory w eksperymencie IPMS. Niebieska przerywana krawędzie = interakcja SAINT między białkiem ofiarą (poziom ufności &gt; .150). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60432/60432fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej figury.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Mieszanina inhibitorów proteaz (PI)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>Stężenie końcowe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pirosiarczyn sodu</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidyna</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ditiotreitol (DTT)</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorek fenylometanosulfonylowy (PMSF)</td>
			<td>0,25 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">mieszanina inhibitorów fosfataz (PhI)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>Stężenie końcowe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mikrocystyna LR</td>
			<td>1 µM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ortowanadan sodu</td>
			<td>0,1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorek sodu</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Bufory do frakcjonowania subkomórkowego:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Bufor A pH 7,9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>Stężenie końcowe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>1,5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Bufor B pH 7,9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>Stężenie końcowe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>1,5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>420 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td>
			<td>0,4 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glicerol</td>
			<td>25% (v/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Bufor C pH 7,9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>Stężenie końcowe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td>
			<td>0,4 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glicerol</td>
			<td>20% (v/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Bufory do immunoprecypitacji:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Bufor IP 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>Stężenie końcowe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>150 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>0,1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>0,1% (v/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glicerol</td>
			<td>10% (v/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Bufor do immunoprecypitacji (IP) 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>Stężenie końcowe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>50 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>0,1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>0,1% (v/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glicerol</td>
			<td>10% (v/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Bufor do alkilowania z SDS o pH 8,5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>Stężenie końcowe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>4% (v/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroacetamid</td>
			<td>40 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">UA pH 8,5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>Stężenie końcowe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mocznik</td>
			<td>8 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>0,1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">* należy użyć H2O klasy HPLC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Składy buforów
Dodatkowe pliki kodu.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60432/Supplemental_Coding_Files.zip" target="_blank">Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.</a>

Opisany jest proces proteomiki do identyfikacji partnerów interakcji białkowych z frakcji subkomórkowej jądrowej za pomocą wzbogacenia immunopowinowactwa danego białka i bezznacznikowej spektrometrii mas. Przepływ pracy obejmuje frakcjonowanie subkomórkowe, immunoprecypitację, przygotowywanie próbek wspomagane filtrem, oczyszczanie offline, spektrometrię mas i dalszy potok bioinformatyczny.

Bezznacznikowa spektrometria mas immunoprecypitacji do profilowania interaktomii jądrowej na dużą skalę

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

Ten przebieg proteomiki umożliwia bezstronną identyfikację i mapowanie endogennych interakcji białko-białko z rozdzielczością subkomórkową. Technika ta jest szczególnie korzystna w przypadku badania białek przynęty, które są wrażliwe na dawkowanie, mają niską liczebność lub mają wiele lokalizacji subkomórkowych. Metodę tę można zastosować do mapowania endogennych interakcji białkowych, zakładając, że dostępny jest odpowiedni odczynnik powinowactwa.Jest to szczególnie ważne w przypadku wielu z tysięcy białek, które mają nieznaną funkcję, z których wiele zostało powiązanych z chorobami u ludzi. Metodę tę można dostosować do dowolnej linii komórkowej lub tkanki podatnej na frakcjonowanie subkomórkowe. Każde białko z odpowiednim odczynnikiem powinowactwa może być celowane.Częstym wynikiem eksperymentów z oczyszczaniem powinowactwa jest często brak wyniku. Naprawdę dobre odczynniki, zbieranie danych QC przez cały czas i ograniczanie obsługi próbek są naprawdę ważne. Wiedz, że masz próbkę.Na początek rozmrażaj przygotowane granulki komórkowe przez 15 minut w 1X objętości granulki zimnego buforu A z inhibitorami proteazy lub inhibitorami fosfatazy. Umieść probówkę zawierającą osad komórkowy na nutatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby ułatwić ponowne zawieszenie przez 30 minut. Następnie umieść probówkę w wirówce na 2 000 razy g i czterech stopniach Celsjusza na 10 minut, aby się osadzały.Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić komórki z 5-krotnością objętości upakowanych komórek z buforem A. Inkubować na lodzie przez 20 minut. Następnie ponownie osadzaj w temperaturze 2 000 razy g i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Zdekantować bufor i ponownie zawiesić z 2X oryginalnie upakowanym buforem objętości komórki A z inhibitorami proteazy lub inhibitorami fosfatazy.Odbić około siedem razy luźnym tłuczkiem A. Wirować lizat przez 10 minut w temperaturze 2 000 razy g i czterech stopniach Celsjusza. Ostrożnie przenieść supernatant do nowej probówki i błyskawicznie zamrozić go ciekłym azotem. Przechowuj lizat w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Zawiesić osad z 0,9 razy większą objętością buforu B z inhibitorami proteazy lub inhibitorami fosfatazy i mieszać na nutatorze przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby lizować jądra, odbić 20 razy tłuczkiem do miana B. Mieszaj lizat jądrowy na nutatorze przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby był jednorodny. Następnie odwirować lizat jądrowy przez 30 minut w temperaturze 21 000 razy g w czterech stopniach Celsjusza.Odpipetować supernatant i zachować jako rozpuszczalny ekstrakt białka jądrowego. Aby dializować rozpuszczalny ekstrakt jądrowy, należy najpierw przeciąć rurkę dializacyjną o odpowiedniej długości i szerokości 24 milimetrów z odcięciem masy cząsteczkowej wynoszącej osiem kilodaltonów. Zaciśnij jedną stronę rurki i załaduj nukleoplazmę do rurki.Po załadowaniu lizatu zacisnąć drugi koniec i zanurzyć w czystym szklanym pojemniku zawierającym bufor C z inhibitorami proteazy. Dializuj przez trzy godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przenieś zdializowaną nukleoplazmę ekstraktu jądrowego do probówki i odwiruj pod ciśnieniem 21 000 g w czterech stopniach Celsjusza przez 30 minut.Przenieść trzy 20-mikrolitrowe podwielokrotności ekstraktu jądrowego do nowych probówek do mikrowirówek w celu walidacji frakcjonowania za pomocą western blot. Używając końcówek pipet, które zostały przecięte na końcówce, przygotuj mieszaninę kulek białka A/G dla każdej kontrpróby, łącząc 12,5 mikrolitra objętości kulki białka A Sepharose z 12,5 mikrolitrami sefarozy białka G w probówkach do mikrowirówek. Przemyć mieszaninę kulek białkowych A/G dwukrotnie 300 mikrolitrami buforu IP I. Wirować kulki w temperaturze 1 500 razy g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną minutę i zdekantować bufor.Następnie przygotuj kulki białka przeciwciała A/G. Aby związać przeciwciało z kulkami, dodaj do probówki 300 mikrolitrów buforu IP I i 10 mikrogramów pożądanego przeciwciała. Pozwól, aby mieszanina kulek i przeciwciał kołysała się na nutatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.Teraz należy rozdzielić odpowiednie objętości lizatów jądrowych do probówek wirówek do mikrowirówek o niskiej retencji na jeden miligram białka wejściowego na kontrpróbę. Wirować lizat z prędkością 16 000 g przez 30 minut i przenieść supernatant do nowej probówki. Dodaj jeden mikrolitr benzonazy w ilości 250 jednostek na mikrolitr na każdy miligram lizatu jądrowego i kołysz na nutatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 do 15 minut.Aby przygotować kulki do wstępnego oczyszczenia lizatu, dodaj 12,5 mikrolitra każdego białka A i kulki białka G do 1,5 mililitrowych probówek o niskiej retencji. Przemyć dwa razy buforem do płukania IP I z inhibitorami proteazy. Zdekantować bufor i dodać jeden miligram przygotowanego lizatu jądrowego do kulek.Inkubować, kołysząc się na nutatorze przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odwirować wstępnie oczyszczone lizaty w temperaturze 1 500 g i czterech stopniach Celsjusza przez jedną minutę. Następnie przemyj dwukrotnie kulki białka przeciwciała A lub G buforem IP I z inhibitorami proteazy.Po odwirowaniu w temperaturze 1 500 g i czterech stopniach Celsjusza przez jedną minutę, zdekantować bufor. Teraz przenieś wstępnie oczyszczony lizat jądrowy na kulki białka przeciwciała A lub G. Inkubuj, kołysząc się na nutatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez cztery godziny.Po inkubacji odwirować w temperaturze 1 500 g i czterech stopniach Celsjusza przez jedną minutę. Przenieść supernatant do probówek oznaczonych jako przepływ dla każdej kontrpróby. Przemyć kulki białka przeciwciała A lub G czterokrotnie jednym mililitrem buforu IP II z inhibitorami proteazy.Następnie umyj kulki dwa razy jednym mililitrem buforu IP I z inhibitorami proteazy. Upewnij się, że cały bufor został usunięty po ostatnim praniu. Eluować białko z kulek przez inkubację z 20 mikrolitrami glicyny molowej o pH 2,75 każdy przez 30 minut na nutatorze.Następnie wirować w temperaturze 750 razy g i w czterech stopniach Celsjusza przez jedną minutę i odpipetować supernatant. Powtórzyć tę inkubację z buforem elucyjnym po raz drugi. Po przygotowaniu osadu białkowego należy go ponownie zawiesić 30 mikrolitrami buforu alkilacyjnego SDS.Inkubować próbkę w bloku grzewczym o temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie pozwól mu ostygnąć w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Do każdej próbki dodać 300 mililitrów roztworu UA i 30 mikrolitrów 100-milimolowego TCEP.Załaduj roztwór do filtra odśrodkowego 30K. Po obróceniu filtra odśrodkowego na 21 000 razy g w temperaturze pokojowej przez 10 minut, utrzymuj przepływ na wypadek problemu z filtrem. Po umyciu filtra zgodnie z rękopisem dodać trzy mikrolitry po jednym mikrogramie na mikrolitr lizy C zawieszonej w 0,1 molowym Tris pH 8,5.Napełnij filtry do znaku 100 mikrolitrów 0,1 molowym Tris pH 8,5. Pozostaw do strawienia przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, kołysząc się na nutatorze. Następnie dodaj jeden mikrolitr jednego mikrograma na mikrolitr trypsyny klasy MS.Delikatnie wymieszaj i pozwól trypsynie inkubować się z próbką przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza, kołysząc się na nutatorze. Rano odwirować wiele razy po 21 000 g przez 20 minut, aby wymyć peptydy z filtra do czystej probówki mikrowirówkowej o niskiej retencji. Po odsoleniu peptydów za pomocą kolumn wirujących C18, ponownie zawieś liofilizowane peptydy w siedmiu mikrolitrach 0,1% TFA w 5% acetonitrylu.Sonikować próbkę przez trzy minuty, aby upewnić się, że peptydy zostały ponownie zawieszone, a następnie wirować w dół z prędkością 14 000 g przez 10 minut. Załaduj od 15 do 30% próbki do systemu spektrometrii mas chromatografii cieczowej w celu analizy. W tym badaniu przeanalizowano potrójne immunoprecypitacje z pięciu miligramów ekstraktu jądrowego HeLa, wykorzystując kontrolę tylko z kulkami.Przynęta DYRK1A znalazła się wśród trzech najwyżej wzbogaconych białek w porównaniu z grupą kontrolną, co wskazuje, że przeprowadzony eksperyment IP-MS był wiarygodny. Wykazano wyraźną separację między interaktorami o wysokim poziomie ufności i ponad 95% oczyszczonych białek zidentyfikowano jako niespecyficzne. W przypadku przykładowego zestawu danych DYRK1A partnerzy biorący udział w interakcjach IREF przedstawili wartości FC-A tak niskie, jak 0,45, co oznacza bardzo niskie wzbogacenie w stosunku do kontroli.W związku z tym wiele z tych wcześniej zgłoszonych interakcji to wyniki fałszywie ujemne w tym zestawie danych, spadając poniżej progu FC-A wynoszącego trzy. Obliczona bezwzględna liczba kopii każdej interakcji IREF nie wykazała korelacji z poziomami wykrywania partnera interakcji przez IP-MS. Łączne zastosowanie FC-A większego niż trzy i saint większego niż 0,9 zredukowało listę interaktorów o wysokim poziomie ufności do sześciu białek.Jednak po zastosowaniu punktu odcięcia FC-A większego niż trzy w izolacji, do sieci dodano osiem dodatkowych białek. Najważniejszą częścią tego protokołu jest wybór odczynnika przeciwciał do immunoprecypitacji. Przed zakończeniem tego przepływu pracy zaleca się walidację selektywności metodą Western blot lub Coomassie.Dowody potwierdzające interakcje białko-białko można uzyskać z co-IP western blot zidentyfikowanych interaktorów. Sieciowanie chemiczne białek, choć bardziej złożone, może ujawnić domeny interakcji interaktorów. Korzystając z tej metody, moja grupa badawcza odkryła nowe funkcje DYRK1A, kinazy białkowej niezbędnej do rozwoju mózgu ssaków i powiązanej z neuropatologią choroby Alzheimera.

label-free-immunoprecipitation-mass-spectrometry-workflow-for-large

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Przedstawiamy wariant metody QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown), wprowadzonej wcześniej w celu odróżnienia rzeczywistych od fałszywych oddziaływań białko-białko. Nasze podejście opiera się na znakowaniu metabolicznym 15N , modulowaniu powinowactwa oddziaływań białko-białko poprzez obecność lub brak ATP, immunoprecypitacji oraz ilościowej spektrometrii mas.

Protokół identyfikacji oddziaływań białko-białko w oparciu o znakowanie metaboliczne 15N, immunoprecypitację, ilościową spektrometrię mas oraz modulację powinowactwa

Łącząc natywną i sieciującą immunoprecypitację chromatyny ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości, podejście ChroP umożliwia analizę złożonej architektury proteomicznej modyfikacji histonów, wariantów i białek niehistonicznych synergizujących się w funkcjonalnie odrębnych domenach chromatyny.

Podejście ChroP łączy ChIP i spektrometrię mas w celu zbadania specyficznych dla locus krajobrazów proteomicznych chromatyny

Technologia HaloTag to wielofunkcyjna technologia, która odniosła znaczący sukces w izolacji zarówno małych, jak i dużych kompleksów białkowych z komórek ssaków. Tutaj podkreślamy zalety tej technologii w porównaniu z istniejącymi alternatywami i pokazujemy jej użyteczność do badania wielu aspektów funkcji białek wewnątrz komórek eukariotycznych.

Odkrywanie interakcji białek i charakteryzowanie funkcji białek za pomocą technologii HaloTag

Ustaliliśmy metodę oczyszczania białek interakcji koregulacyjnych za pomocą systemu LC-MS/MS.

Metoda przygotowania białek do wysokoprzepustowej identyfikacji białek oddziałujących z kofaktorem jądrowym za pomocą analizy LC-MS/MS

Tutaj prezentujemy protokoły oczyszczania kompleksów białkowych i ich separacji za pomocą niebieskiej natywnej STRONY, a następnie profilowania korelacji białek za pomocą ilościowej spektrometrii mas bez etykiet. Ta metoda jest przydatna do przekształcania interaktomów w odrębne kompleksy białkowe.

Rozwiązywanie kompleksów białkowych oczyszczonych z powinowactwa za pomocą Blue Native PAGE i profilowania korelacji białek

Przedstawiono wszechstronny protokół krioskalizacji BN-MS z wykorzystaniem mikrotomu do profilowania kompleksomów w wysokiej rozdzielczości.

Profilowanie kompleksomów w wysokiej rozdzielczości za pomocą analizy BN-MS metodą krioslicingu

Opisany protokół zapewnia zoptymalizowaną ilościową analizę proteomiczną próbek tkanek przy użyciu dwóch podejść: ilościowego opartego na znacznikach i bez etykiety. Podejścia oparte na znacznikach mają tę zaletę, że zapewniają dokładniejszą ocenę ilościową białek, podczas gdy podejście bez znaczników jest bardziej opłacalne i służy do analizy setek próbek kohorty.

Kompleksowy przepływ pracy proteomiki próbek tkanek opartej na spektrometrii mas

Protokół proteomiki znakowania bliskości lizosomów neuronalnych jest tutaj opisany w celu scharakteryzowania dynamicznego mikrośrodowiska lizosomów w ludzkich neuronach pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Lizosomalne białka błonowe i białka, które oddziałują z lizosomami (stabilnie lub przejściowo), można dokładnie określić ilościowo w tej metodzie z doskonałą wewnątrzkomórkową rozdzielczością przestrzenną w żywych ludzkich neuronach.

Charakterystyka interaktomu lizosomu neuronalnego z proteomiką znakowania zbliżeniowego

Dane proteomiczne oparte na spektrometrii mas są dostępne w otwartych bazach danych i dostępne za pomocą bezpłatnych narzędzi. Biorąc pod uwagę złożoność przeszukiwania i opisywania baz danych, wielu biologom brakuje wiedzy, aby wykorzystać te zestawy danych. W tym miejscu przedstawiamy przewodnik dotyczący korzystania z bezpłatnych narzędzi do podstawowego wyszukiwania danych proteomicznych.

Poruszanie się po danych proteomicznych opartych na spektrometrii mas przy użyciu bezpłatnych narzędzi obliczeniowych

Przedstawiamy protokół umożliwiający wychwytywanie i identyfikację specyficznych dla choroby interakcji białko-białko z komórek i tkanek rodzimych za pomocą sond chemicznych i spektrometrii mas. Uzyskane zbiory danych interakcji są analizowane za pomocą dedykowanej platformy internetowej, aby ujawnić dynamiczne dysfunkcje sieci oraz zmiany w ścieżkach związane z chorobą.

Mapowanie dysfunkcyjnych interakcji białko-białko w chorobach

Poznaj metodę bezznacznikowej spektrometrii mas immunoprecypitacji do mapowania interakcji białkowych w jądrze komórkowym. Technika ta umożliwia identyfikację endogennych partnerów interakcyjnych o niskiej zawartości.

Bezznacznikowa spektrometria mas immunoprecypitacji do profilowania interaktomii jądrowej na dużą skalę

Przeglądaj więcej filmów